Håndbok i mikroskopi og framstilling av preparater 8200404420 [PDF]

Zitiervorschau

Morten Motzfeldt Laane Thore Lie

Håndbok i mikroskopi og framstilling av preparater

NB Rana Depotbibli

et

Universitetsforlaget Oslo

© Universitetsforlaget AS 1992 ISBN 82-00-40442-0

Det må ikke fotograferes fra denne boken i strid med åndsverkloven og fotografiloven eller i strid med avtaler om kopiering inngått med Kopinor, interesseorgan for rettighetshavere til åndsverk.

Henvendelser om denne boken kan rettes til: Universitetsforlaget Postboks 2959 Tøyen 0608 Oslo Omslag: Astrid Elisabeth Jørgensen Omslagsfoto: Morten M. Laane Produksjon: HS Grafiske Bedrifter AS 1992

Forord

Et moderne industrisamfunn kan ikke eksi­ stere uten mikroskop. Til daglig tenker vi ikke så mye på dette, men faktum er at dette svært allsidige forskningsinstrumentet spil­ ler en veldig viktig rolle. Uten mikroskopet kan ikke legen stille sikre diagnoser for mange sykdommer og det ville lett oppstå omfattende epidemier, luft- og sjøtransport ville bli usikker etter­ som mikroskopet er uunnværlig ved materialkontroll. Også databransjen ville være i store vanskeligheter, jordbruket ville ram­ mes av sykdomsbefengte, dårlige avlinger og vi ville få plantesorter av lav bruks­ kvalitet. I mange europeiske land, særlig England og Tyskland har mikroskopi århundrelange tradisjoner både for profesjonelle forskere og amatører. I Oxford ble «The Royal Microscopial Society» formelt stiftet av Dronning Victo­ ria i forrige århundre og har i dag meget omfattende aktiviteter. I Tyskland er virk­ somheten konsentrert rundt tidsskriftet «Mikrokosmos» i Stuttgart. I internasjonal litteratur fins det en rekke bøker som omhandler mikroskopi og mik­ roskopiske teknikker. Ofte er disse utgitt for mange år siden og vanskelige å få tak i. Ho­ vedproblemet er imidlertid at den uerfarne mikroskopiker ofte gir opp når det gjelder mer «vanskelige» metoder og teknikker. En del fagbøker er dessverre ikke særlig peda­ gogisk anlagt, og det kan være vanskelig å tilegne seg metoder uten praktisk hjelp fra en erfaren forsker.

Denne boken er ment å være en bruker­ vennlig bok. I den løpende teksten er be­ skrevet virkemåten av de optiske systemer og teknikker samt enkle prepareringsmetoder som de fleste kan klare. Mikroskopisk teknikk representerer et felt av meget stort omfang. For å holde bo­ ken på et rimelig nivå, har vi lagt vekt på en del sentrale områder. Innsikt i optikk er ve­ sentlig for å utnytte mikroskopets mulighe­ ter. Ingen preparateknikk gir gode resulta­ ter dersom mikroskopet brukes med feil linsekombinasjoner, gammel immersjonsolje med endrete optiske egenskaper, feil innstil­ ling av belysning eller gal dekkglasstykkelse. Ofte kan bruk av fasekontrast, enkel fluorescensmikroskopi på levende materia­ le eller observasjon av celler og mikroorga­ nismer dyrket direkte på objektglasset, er­ statte de mest kompliserte fikserings- og fargeprosedyrer. Av plasshensyn har vi valgt ut en del sentrale teknikker innen bo­ tanikk, zoologi og medisin. Vi har også tatt med noen eksempler på spesielt egnet mate­ riale for preparatfremstilling. Disse er be­ skrevet i detalj slik at uøvete lesere skal være i stand til selv å fremstille preparater av forskningskvalitet. Med slike øvelser som bakgrunn i tillegg til teksten, er det vårt håp at en del lesere selv skal kunne skaffe seg den intuitive innsikt i prepareringsteknikk som er nødvendig når man gir seg i kast med ukjent materiale. En lang rekke av de teknikker som be­ skrives er basert på mer enn 30 års erfaring i forenkling og forbedring av vanlige labo-

ratorieprosedyrer. Vi har utelatt en rekke metoder og variasjoner i teknikker som er kompliserte og ofte fører til variable resul­ tater. Det er lagt vekt på at metodene skal føre til så få strukturforandringer som mu­ lig i de objektene man vil undersøke. Det er vårt håp at boken vil være til nytte for både profesjonelle yrkesutøvere, for studenter og andre som har behov for mik­ roskop til sine studier, og at den også kan virke som stimulans for interesserte ama­ tører. Boken er et resultat av mange års eksperi­ mentering med mikroskopiske teknikker, samt råd og hjelp fra kolleger i inn- og ut­ land. Blant de mange som bør nevnes er universitetslektor Johan Basberg, som i mange år var bestyrer av Laboratorium for Anvendt Mikroskopi ved Universitetet i

Oslo, og forskningssjef Anton Brøgger, Norsk Hydros Institutt for Kreftforskning, Radiumhospitalet, Oslo. Overlege Tore Hagen ved Patologiskanatomisk avdeling, Fylkessykehuset i Lil­ lehammer, har velvilligst gitt oss tillatelse til å beskrive en upublisert teknikk for tilla­ ging av store plastsnitt for lysmikroskopi. Tegnekontoret ved Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet, Universitetet i Oslo har hjulpet med et tildels vanskelig illustrasjonsarbeide. Vi vil også takke spesielt di­ rektør Tore H. Onstad ved Leica Mikrosko­ pi A/S for faglige råd og Leica Mikroskopie und Systeme GmbH, Wetzlar, for å ha bi­ dratt med illustrasjoner til boken. Morten Motzfeldt Laane og Thore Lie Oslo, september 1992

Innhold

DEL I: MIKROSKOPET 7

Historikk 8 Mikroskopets konstruksjon 13 Mikroskopstativet 15 Virkemåte 18 Lupeforstørrelse 21 Innstilling etter Kohlers prinsipp 22 Numerisk apertur 24 Oppløsningsevne 24 Objektivet 31 Mekanisk tubuslengde 32 Objektivkonstruksjoner 32 Parfokale objektiver 33 Oljeimmersjonsobjektivet 34 Nyttig og tom forstørrelse 35 Optikkens klarhet 35 Dybdeskarphet 36 Linsefeil og optisk korreksjon 36 Sfærisk avvik 36 Dekkglasstykkelse 37 Kromatisk avvik 37 Astigmatisme 38 Bildefeltkrumning 38 Polarisasjonsforstyrrelser 38 Objektivtyper 38 Akromater 40 Fluoritobjekter 40 Planapokromater 40 Ultrafluarobjektiver 40 Fluorescens-, og UV-objektiver 40 Luminarobjektiver 41 Fasekontrastobjektiver 41 Pålysobjektiver 41 Okularer 43 Kompensasjonsokularer 43 Planokularer 43 Måle- og telleokular 44 Kondensorsystemet 45

Mørkefeltkondensor 45 Fasekontrastkondensor 46 Interferenskontrastkondensor 47 Kondensor for polarisert lys 47 Kollektor 47 Mikroskopbelysningen 48 Glødelampe for nettspenning 48 Lavvoltlamper 48 Kullbuelampe 48 Gassutladningslamper 49 Synliggjøring av preparatstrukturer 50 Fasekontrastmikroskopet 51 Mørkefeltmikroskopi 53 Interferenskontrastmikroskopi 55 Optiske forutsetninger for gode mikroskopbilder 57 Mikrofotografering 58 Okularet som projektiv 58 Mikrofotografering uten kamera 58 Mikrofotografering med kamera uten objektiv 59 Mikrofotografering ved lave forstørrelser 62 Fotografering med kamera og uten mikroskopokular 62 Okularprojektivets funksjon 63 Kort fremgangsmåte ved mikro­ fotografering 63 Hvilke feil kan oppstå? 64 Fremkalling og fiksering 65 Film- og videomikroskopi 66 Tegning ved hjelp av mikroskopet 67 Mikroblits 67 Lysmikroskopi uten linser 71 Polarisasjonsmikroskopi 73 Fluorescensmikroskopet 78 Testskjema for nye og brukte mikroskop 81 Stell og pass av mikroskopet 82

DEL II: FRAMSTILLING AV PREPARATER 85 Mikroskoplaboratoriet 86 Orden på laboratoriet 86 Utstyr og hjelpemidler 87 Preparerutstyr 89 Mikroskoputstyr 89 Ekstrautstyr 89 Kjemikalier og varer til mikroskop­ laboratoriet 90 Preparatsamlingen 92 Botaniske objekter 92 Zoologiske objekter 95 Cytogenetiske objekter 96 Fikseringsprosedyrer 97 Forbehandling før fiksering 98 Primærfikseringsmidler 100 Oppskrifter på fikservæsker 102 Parafinteknikker for lysmikroskopi 105 Parafinsnitt og innstøping 108 Mikrotomkniven 110 Snitting av vevet 112 Celloidinmetoden 113 Fargemetoder 117 Prinsipper for farging 117 Klassifikasjon av fargestoffer 117 Oppskrifter på fargeløsninger 118 Farging av snittene 120 Enkle fargemetoder for fluorescens 124 Kvalitetspreparater uten snitting 126 Squash, smear og utstryksmetoder 126 Generelle prinsipper ved kromosomanalyser 127 Meioseanalyse i plante- og dyremateriale 130 Feulgen-squash teknikker 132 Avstøpning med silikonmasse 133 Elektronmikroskopet 135 Transmisjonsmikroskopet (TEM) 135 Scanningelektronmikroskopet (SEM) 135 Linser 136 Observasjon i elektronmikroskopet 137 Oppløsningsevne 137

Preparater for TEM 137 Ultramikrotomen 139 Snitting av plastblokker 140 Farging av elektronmikroskopiske preparater 144 Pådampning av preparatene 145 Preparering for scanningelektronmikroskopi 145 Utvalgte mikroskopiske teknikker 146 Botaniske teknikker 146 Sopp 146 Alger 154 Pollen 158 Noen spesielle fargemetoder for botanisk materiale 161 Zoologiske teknikker 166 Ciliatkulturer 166 Mikroakvariet 169 Amøber 170 Overflatestudier av ugjennomsiktige objekter 173 Svamper og polyppdyr 176 Ormer 177 Krepsdyr, insekter etc. 179 Spyttkjertelkromosomer i Drosophila 179 Medisinske prepareringsteknikker 180 Smittsomme sykdommer og parasitter 180 Noen prepareringsprosedyrer 183 Dissosiasjonsmetoder 186 Noen medisinske fluorescensteknikker 188 Cellekulturer av perifert blod 193 Blodutstryk 196 Bruk av tellekammer 197 Kjønnskromatin 198 Plastsnitt for lysmikroskopi av medisinske vevsprøver 201 Mikroskopering av ventrikkelinnhold 204 Generelt om sterilteknikker 204 Feulgens fargereaksjon 205 Litteraturliste 207 Stikkord 211

Del I: Mikroskopet

8

Historikk

Mikroskopet har vært og er et meget viktig hjelpemiddel i utviklingen av moderne na­ turvitenskap og medisin. Fremskrittene innenfor disse fagområdene har for en stor del hatt sammenheng med den tekniske ut­ viklingen av mikroskopet. Forbedrete in­ strumenter muliggjorde nemlig nye og be­ tydningsfulle oppdagelser. Mikroskopiske undersøkelser utført av Pasteur og Koch i forrige århundre førte til en revolusjon i den medisinske forskningen. I 1870-årene var det ennå omfattende koleraepidemier i Osloområdet. Sykdommer som tuberkulo­ se, difteri og lungebetennelse hørte fortsatt til dagens orden, ofte med dødelig utfall. Mikroskopisk teknikk la grunnlaget for be­ kjempelse av disse og en rekke andre smitt­ somme sykdommer. I tidens løp er en rekke personer lansert som mikroskopets oppfinner. Det moderne mikroskop er imidlertid utviklet gradvis gjennom flere hundre år og gjennomgår stadig forbedringer. Ofte nevnes Hans og Zacharias Janssen som levde tidlig på 1600-tallet i den hol­ landske byen Middelburg, som mikrosko­ pets oppfinnere. De var brillemakere av profesjon. I virkeligheten må vi imidlertid regne med at de første sammensatte mik­ roskopene (med flere linser) ble oppfunnet flere steder omtrent samtidig. I hvert fall bredte kunnskapen om konstruksjonsprinsippet seg ganske raskt og i 1609 bygde Galilei en kikkert som også kunne brukes som mikroskop. Disse første instrumentene led av betyde­

lige optiske mangler. Bildene ble sterkt for­ tegnet og fargespredningen var omfattende. Det ble derfor vanskelig å få skarpe bilder av små gjenstander og de ble omgitt av fargeringer. For å bøte på disse optiske feil søkte man andre utveier. I stedet for instru­ menter med flere linser ble det konstruert enkle énlinsete mikroskop. Linsen hadde en meget kort brennvidde og lysstyrken ble langt større og forvrengningen av bildet mindre. I prinsippet er disse instrumentene ikke mikroskop, men sterkt forstørrende lu­ per. Som vitenskapelige instrumenter ble de brukt et stykke ut i det 17 århundre. I midten av det 17. århundre begynte mikroskopliknende instrumenter å bli al­ minnelig utbredt. De ble raskt forbedret, og allerede i 1665 oppdaget Robert Hooke plantecellene ved hjelp av et selvbygget in­ strument. Dette mikroskopet må ha vært av betydelig kvalitet for sin tid. I sitt verk «Micrographia» har han avbildet instru­ mentet sitt som visstnok hadde små, smel­ tete glasskuler som linser. Mikroskopet kunne fylles med vann (!), antakelig for å øke lysstyrken og kunne gjengi selv ørsmå organismer (Fig. 1). I 1686 fant Eustachio Divini et middel til å redusere den alvorligste linsefeilen i mi­ kroskopet, såkalt sfærisk abberasjon. Sam­ mensatte mikroskop ble allikevel ikke bedre enn de enkle lupemikroskopene på denne tiden. I en særstilling står de enkle mikro­ skopene (Fig. 2) som ble fremstilt av Anton van Leeuwenhoek (Fig. 3). Leeuwenhoek var tøyhandler og hadde bruk for å studere

9

Figur 1 Tegning av loppe fra Hookes «Micrographia» (1665), den mest berømte av alle mikroskopibøker. Gjengitt fra eks. i forf. eie. Figur 2 Replika av et av A. van Leeuwenhoeks ► mikroskoper, bygd i Delft, Holland. En liten glasslinse, ca.2 mm i diameter er montert mellom to sølvplater. Ved hjelp av et skruearrangement kan preparatet som monteres på spissen av skruen ved objektivet bringes i fokus. Enkle instrumenter av denne type kan forstørre inntil 200 ganger.

arcana

Deteéla Ab

Antonio van Leeuwen HOEK.

DELPHIS BATAVORUM. Apud HENRICUM a KROONEVELD. CIO 13 C xcv.

Figur 3 a, b Tittelsidene på Leeuwenhoeks «Archana Naturae» Delft 1648. Boken representerer grunnleg­ gelsen av moderne mikrobiologi. Blodceller, bakterier, infusjonsdyr og spermier ble beskrevet for aller

første gang og dette vakte stor oppsikt.

10 kvalitet på tøyfibrer og tøyets sammen­ setning. Utviklingen av de sammensatte mikro­ skopene, de med flere linser, gikk imidlertid langsomt. I 1685 utgav Johannes Zahn, en premonstratensermunk, en bok kalt «Oculus artificialis teledioptricus» der han be­ skriver sitt eget instrument som var forsynt med fire linser. Utviklingen stoppet imid­ lertid snart opp på grunn av mangel på optiske kunnskaper. Det sammenstatte mikroskopet kunne i virkeligheten ikke forbedres før man fant et middel som hindret fargespredning og bildekrumning. For å oppheve fargespredningen var det naturlig at man tok sikte på å bygge såkalte akromatiske linsesystemer ved å kombinere linser med forskjellig fargespredningsevne. Dette hadde imidlertid selveste Isaac Newton hevdet var umulig i praksis. Chestor Hall, en engelsk adelsmann, lot seg ikke skremme av disse dystre spådommer og konstruerte et kikkertobjektiv sammensatt av en kronglass- og en flintglasslinse. Dette objektivet hadde en meget liten farge­ spredning. Mikroskopobjektiver av tilsvarende kva­ litet er imidlertid vanskeligere å fremstille. Ved sterkt forstørrende objektiver må frontlinsen være liten, i visse tilfeller bare ca. 1 mm. I 1824 kom et vesentlig fremskritt. Jacques-Louis-Vincent Chevalier konstruer­ te et akromatisk mikroskopobjektiv med flere linser skrudd inn etter hverandre. Lin­ sene ble tildels kittet sammen med kanadabalsam, en kvaeliknende og gjennomsiktig substans. Denne objektivtypen ble snart forbedret av Giovanni Amici. Kort tid etter kom de første vitenskapeli­ ge resultater. Robert Brown oppdaget celle­ kjernen i 1831. I 1836 ble de la Tour opp­ merksom på gjærsoppens betydning for gjæringsprosessen. I disse årene ble også cellelæren utformet. Etter hvert ble Amici

klar over at objektiver med en halvkuleformet frontlinse hadde vesentlige fordeler. Dette prinsippet benyttes fremdeles. Ved å plassere vann mellom frontlinsen og prepa­ ratet oppnådde han forbløffende gode re­ sultater. Sin moderne utforming fikk mikrosko­ pet først ved samarbeidet mellom fysikeren Ernst Abbé og mikroskopmakeren Carl Zeiss i Jena i Tyskland. Professor Abbé ut­ viklet en rekke matematiske formler for be­ regning av objektiver. Ved å benytte olje mellom objektivets frontlinse og preparatet fikk man en sterk forbedring i bildekvaliteten. I samarbeid med glasspesialisten Otto Schott ble de såkalte apokromatiske objek­ tiver brakt på markedet i 1886. Disse objek­ tivene inneholdt enkeltlinser av flusspat satt sammen med borat- og fosforholdige glasslinser. I slike objektiver ble det for første gang mulig å samle røde, gule og blå stråler i ett punkt under bildedannelsen. Den sfæriske abberasjon ble samtidig kor­ rigert for to farger. Det var altså i slutten av forrige århundre at de vesentlige teoretiske og praktiske pro­ blemer i mikroskopoptikken ble løst. Sam­ tidig nådde man grensen for mulig forstør­ relse med lys og glasslinser. På grunn av vis­ se fysiske egenskaper ved selve lyset er det ikke mulig å avbilde flere detaljer utover ca. 1250 x forstørrelse i et vanlig lysmikroskop. Det var derfor egenskapene ved selve lyset og ikke kvaliteten på mikroskopet som ble den begrensende faktor for ytterligere for­ størrelse. I det 20. århundre er det først og fremst lagt vekt på å gjøre mikroskopet hendig og praktisk. De fleste forbedringene har vært mekaniske. Bruk av refleksfri optikk og computerberegning av sammensatte objek­ tiver har riktignok ikke økt oppløsningsevnen, men som regel får man oftest et langt mer kontrastrikt bilde med moderne objek­ tiver. Store forskningsmikroskoper har gjerne flere valgbare og innebygde lyskil­

11 der, de har ofte flere kamera og videosyste­ mer og fokuseringen kan være automatisk. Enkelte datastyrte mikroskoper kan til og med gjennomsøke og analysere preparatet uten at operatøren er til stede. Nye optiske systemer som fase- og interferenskontrast gjør det mulig å se detaljer i levende (gjen­ nomsiktige) celler og vev, uten farging. Alle ansvarlige fabrikker konstruerer mikroskop etter byggeklossystemet. Internasjonale mål for objektiver og okularer (se side 39) gjør at disse passer inn i et hvilket som helst instrument uavhengig av fabrikat og år­ gang. Man mente lenge at den eneste farbare vei å gå for å øke forstørrelsen utover 1250 ganger, var å benytte stråler med kortere bølgelengde. Dette fremgår av Abbés' formler. Ved å bruke ultrafiolett lys kan man oppnå en viss forbedring. Ultrafiolette mikroskoper blir imidlertid svært kostbare fordi alle optiske deler må være laget av kvarts. Elektroner kan fysisk sett oppfattes både som partikler og bølger. Med elektronstråling kan man teoretisk sett avbilde struktu­ rer som er omlag 1/1000 ganger mindre enn de minste synlige partiklene i lysmikroskopet. I løpet av 1930-årene ble prinsippene for elektronmikroskopet utviklet i Tysk­ land. Elektronstråler lar seg avbøye i mag­ netfelt, og spesialkonstruerte elektriske lin­ ser kan avbøye elektronstråler på tilsvaren­ de måte som i en lysoptisk linse. Inni mik­ roskopet må det være høyvakuum, ettersom luftmolekyler sprer og absorberer elektronstråling. Moderne elektronmikroskop forstørrer omlag 1 million ganger, og enkeltmolekyler, endog atomer, kan foto­ graferes. Levende objekter kan vanligvis ikke studeres og preparatene må være uhyre tynne (1/10 000 mm). I scanning elektron­ mikroskopet ser man på overflaten av gans­ ke store, tykke preparater. I 1962 ble moderne metoder for elektron­ mikroskopisk prepareringsteknikk introdu­

sert. Cellevev lot seg nå konservere uten strukturendringer selv på det aller fineste strukturnivå. Langt ut i 1980-årene repre­ senterte elektronmikroskop det ypperste in­ nen mikrostrukturell forskning. Ved flere laboratorier var det imidlertid en utvikling i gang mot mikroskoper som ikke arbeider etter vanlige optiske prinsipper. Utvikling av styringssystemer med piezoelektriske krystaller har muliggjort forflyt­ ning av små «spisser og sonder» i et rasterliknende mønster omtrent som TV-strålen beveges på skjermen. Spissene og sondene kan beveges med uhyre presisjon. Rohrer og Binning utviklet på grunnlag av dette det såkalte scanning - tunneling mikroskopet som benytter piezoelektriske krystaller for bevegelsene. Instrumentet avbilder enkelt­ atomer. Spissen (en avbrukket platinanål som har et atom i tuppen) beveges tett inntil og over en metalloverflate. Endringer i elektronstrøm mellom objektet og spissen registreres og computerbehandles til et syn­ lig bilde. Selve instrumentet er på størrelse med en hermetikkboks (se side 70). Også lysmikroskopet har fått sin renes­ sanse. Det viser seg at Abbés formler bare gjelder for store objektfelt. Minsker man flaten linsen avbilder, økes oppløsningsevnen. Følgelig redusereres flaten til en minst mulig lysflekk. Scanner man lysstrålen over preparatet med et såkalt konfokalt optisk system, vil bare skarpe struktu­ rer avbildes. Områder som er ute av fokus blir ikke av­ bildet i det hele tatt. Dette har muliggjort fremstilling av tredimensjonale bilder med stor forstørrelse i lysmikroskopet, noe som før var omtrent umulig. I de siste årene har det vært en rivende ut­ vikling i retning mikroskop som benytter sonder og spisser av ulike slag, enten de fungerer som optiske eller elektroniske de­ tektorer. Man kan trekke ut glasspipetter slik at diameteren i røret er langt mindre enn lysets bølgelengde for synlig lys. I spis­

12 sen plasseres en liten fluorescerende kry­ stall. Med scanningssystem og computerbehandling av signalene kan man lysoptisk avbilde strukturer langt inne på det tidlige­

re arbeidsområdet for elektronmikroskopet. Framstilling av mikroskop som kan lese av basesekvenser langs DNA-molekylet direkte, synes nær forestående.

Tabell 1 Viktige fremskritt innen mikroskopiens historie

1611 Kepler. beskriver sammensatt lysmikroskop 1655 Hooke: beskriver cellevegger i kork

1674 Leeuwenhoek: oppdager protozooer, i 1683 bakterier med primitivt, enlinset mikroskop 1833 Brown: oppdager cellekjernen i orkidéceller 1835 Schleiden, Schwann: celler med kjerner er grunnenhet i alle planter og dyr 1857 Kolliker, beskriver mitokondrier 1876 Abbé: utreder diffraksjon, bildedannelse i mikroskop, konstruksjonsberegninger for optikk 1879 Flemming: utreder dyremitose 1881 Retsius: beskriver ulike vevstyper, med Cajal nye fargemetoder for celler

1882 Koch: bruker anilinfarger på bakteriepreparater, tuberkulose, kolerabakterie påvist, Klebs, Pasteur påviser sykdomsfremkallende organismer, nye hjelpemidler mot infeksjon/epidemier 1886 Zeiss: med Abbés beregninger konstruerer objektiver med maksimal oppløsning - uten bildefeil

1897 Thomson: påviser negativt ladde partikler (elektroner), senere betydning for elektronmikroskopi 1898 Golgi: beskriver «Golgiapparatet», sølvfarging 1924 Lacassagne radioaktive cellemarkører (autoradiografi), de Broglie: elektroner i bevegelse har bølgeegenskaper tilsvarende lys 1926 Busch: elektronstråle kan fokuseres med sylindrisk magnetlinse 1930 Lebedeff: interferensmikroskop 1931 Ruska & al.: bygger elektronmikroskop 1932 Zernike: (senere i samarbeid med E. Leitz Wetzlar) utvikler fasekontrastmikroskopet, 1935 Knoll: scanningmikroskop

1939 Siemens GmbH : første kommersielle elektronmikroskop ( = EM) 1941 Coons: antigen/antistoff fluorescens 1944 Williams & Wyckoff: metall skyggeleggingsteknikk 1945 Porter, Claude, Fullam: osmiumfikserte celler i EM 1948 Pease & Baker: tynnsnitt (0.1 ^m) av celler

1952 Nomarski: differensial interferenskontrast - levende cellestrukturer, Palade, Porter, Sjøstrand, preparermetoder for EM 1953 Porter & Blum: brukbar ultramikrotom 1956 Glauert, Luft : plastinnstøpning for EM 1957 Robertson: finstruktur av cellemembran, Steere, Moore, Muhlethaler: frysebruddteknikker 1959 Brehner & Horne : forbedrer negativ fargeteknikk 1963 Sabatini, Bensch & Barrnett: introduserer glutaraldehyd/osmiumfiksering (stort fremskritt)

1965 Cambridge Ltd.: kommersielt scanningelektronmikroskop 1968 de Rosier & Klug : 3-D rekonstruksjoner for EM 1985 Binning & Rohrer: scanning tunneling mikroskop, atomer avbildes enkelt ca.1985-1990 flere forskere: utvikling av konfokale mikroskop. Oppløsningsevnen for lysmikroskop økes ved ny avbildningsteknikk, 3-D rekonstruksjoner. En rekke nye høytoppløselige lysoptiske instrumenter basert på scanningprinsippet. Computerstyrte mikroskop.

13

Den første halvdelen av boken tar for seg mikroskopets konstruksjon og virkemåte. I den siste halvdelen gjennomgås aktuelle prepareringteknikker. Et visst grunnlag i praktisk optikk vil alltid øke gleden ved mikroskoperingen og sørge for gode resul­ tater.

kopets tubus (13), dessuten for objektbord (5), kondensor (10), objektiver (11) og oku­ larer (14). Mikroskopet kan ha innebygd be­ lysning, se også Fig. 6.

Mikroskopets konstruksjon Fig. 4 og 5 viser enkle mikroskopstativer påmontert de nødvendige deler for generell mikroskopi. Figur 4 viser et mikroskop som består av stativet (4) med feste for mikros-14

-13

-12

-11

-10

-9

Figur 4 Enkelt, monokulart mikroskop egnet for skoleundervisning og amatørbruk. Med kvalitetsobjektiver og okularer kan slike mikroskop gi bil­ der av høy optisk kvalitet. (1) tannstangfeste for mikroskopets tubus, (2) grovskrue, (3) finskrue, (4) stativ, (5) mikroskopbord, (6) preparatklemme, (7) akse for dreining av stativet i vertikalplanet, (8) mikroskopfot, (9) kombinert hul- og planspeil, (10) kondensor, (11) objektiv, (12) mikroskoprevolver, (13) mikroskoptubus, (14) okular.

Figur 5 Klassisk Leitz messingmikroskop fra år­ hundreskiftet (tegnet delvis gjennomskåret). Mik­ roskop av denne typen representerer noe av det yp­ perste innen optisk og mekanisk konstruksjon innenfor en mest mulig enkel konstruksjonsløs­ ning. Okularet er festet til et indre rør i tubus. Røret kan trekkes ut og inn slik at avstanden mellom okular og objektiv kan varieres. Dette gir mulighe­ ter for korrigering av optisk feil (sfærisk avvik) som ikke kan justeres uten spesialutstyr på moderne mikroskop. Kondensor kan forskyves til siden for skråbelysning. Dette øker oppløsningsevnen i en retning av bildet til det doble. Finskruen (mikrometerskruen har direkte overføring og er kraftig fjærbelastet (Oberhausers system). Dette gir ytterst presis fokusering.

14

Figur6 Skjematisk tegning av et Leitz laboratoriemikroskop. (1)foto/videotubus, (2) okularpar, (3) objektivrevolver, (4) objektiv, (5) mikroskopbord, (6) kondensorfeste, (7) kombinasjonsskruer, lavtlig­ gende for kryssbord, (8) feltblende, utgang for mikroskoplampe, (9) blenderegulering, (10) støtte for betjening av mikroskop, (11) kombinasjonsskruer for betjening av fokus, (12) påsatskloss for ulike lampesystemer, (13) strømforsyning forekstra lam­ per (14-15), (16) optisk utgang for påfallende mikroskopbelysning, fluorescens etc.

Preparatet som skal undersøkes ligger på en rektangulær glassplate (objektglasset) som plasseres på objektbordet i to festeklemmer (6). Oftest er mikroskopet forsynt med flere objektiver skrudd inn i en objektivrevolver Ved dreining av revolveren kan ett objektiv av gangen bringes inn i strålegangen. Mange dyrere mikroskoper er kon­ struert slik at hele revolveren med alle ob­ jektivene kan skiftes ut med nye objektivsett i andre revolvere. Avstanden mellom objektivet og objektet reguleres med grovskruen (2) og finskruen (3). Med finskruen kan vi variere fokusavstanden innenfor variasjoner på 1/1000 mm ( = /zm). Slike enkle mikroskoper med et okular ( = monokulart) kan ofte svinges om aksen (7) slik at mikroskoperingen blir mer bekvem. Man ser med bare det ene øyet, omtrent som i en gammeldags langkikkert. Lyset

kastes opp gjennom kondensor ved hjelp av et regulerbart speil (9). Mikroskoper av denne typen er rimelige og egner seg for amatører og til enklere undervisnings­ formål. Dyrere mikroskoper (Figur 6) har spesialtubus for begge øynene og ofte også et ekstra okular for tilkobling av fotoutstyr el­ ler film/videokamera etc. (Er det tre okula­ rer, snakker vi om trinokulartubus. Er det bare to, altså ikke uttak for kamera etc., foreligger en binokulartubus). De dyrere mikroskopene er konstruert etter byggekloss-systemet, man kan lett bytte de fleste delene i ulike kombinasjoner. I stedet for enkle preparatklemmer fins et såkalt kryss­ bord (7) som ved hjelp av lavtliggende betjeningsskruer kan bevege preparatet i x- og y-aksen. Med nonieskalaer kan vi finne igjen posisjoner i preparatet. Grov- og finskrue har kombinert betjening (11), mik­ roskopet har spesialstøtter for hendene under bruk (10) og i selve stativet er det innebygd lavvoltlampe med tilhørende transformator. Stativet kan ha påmontert ulike andre belysningskilder for eksempel kvikksølvlamper for spesialteknikker (12-15). Det er også uttak for belysning av preparatet ovenfra (16). En rekke ulike strømforsyningsenheter og spenningsstabilisatorer (13) kan tilkobles. Mikroskoper av denne typen egner seg godt til forskning og avansert undervisning. Ved hjelp av objektivet får man et reelt, omvendt luftbilde ( se Figur 7), kalt mellombildet, som kan sees uten okular der­ som man anbringer en mattskive i tubus. Ved hjelp av okularet kan man også betrak­ te mellombildet fordi okularet virker som en lupe. Det dannes da et innbilt, forstørret og rettvendt bilde av det reelle mellombil­ det. Bildet er altså omvendt i forhold til den gjenstand som avbildes. Okularet forstør­ rer dermed opp det bildet som dannes av objektivet. Vi skal foreløpig merke oss at mikroskopet forstørrer i to trinn, først i ob-

15

Figur 7 Enkelt diagram som viser at mikroskopets forstørrelse skjer i to trinn. Et lysbildeapparat projiserer et bilde på et lerret (øvre del av figuren). Bildet (A/B) gjengis som A'B på det tenkte lerretet. Stiller vi oss bak lerretet og tenker at vi betrakter bildet som dannes med en lupe foran øyet, har vi samme prinsipp som i mikroskopet (nedre del av bildet). I okularet oppstår det reelle mellombildet (a‘b’) som studeres gjennom okularets øyelinse.

jektivet, deretter i okularet som forstørrer mellombildet ytterligere opp. 1 binokulare mikroskoper (med to okularer) fordeles ly­ set likt til de to okularene ved hjelp av et spesielt prismesystem. Dette er konstruksjonsmesig meget vanskelig og ble ikke løst tilfredsstillende før i 1950-årene.

Mikroskopstativet Vanlige mikroskoper har ofte forskjellig størrelse på grunnlag av stativets utfor­ ming. Oftest er de laget slik at optikk fra ett mikroskop umiddelbart kan brukes på et annet. Dette gjelder også endel tilleggs­ utstyr. De fleste mikroskoper er innrettet slik at objektbordet kan heves eller senkes i for­ hold til objektivet for fokusering. Dette

gjelder mikroskopet i Figur 6. Tubus forblir dermed i samme høyde. Eldre mikroskoper og billigere nyere mo­ deller fokuseres ved å heve eller senke tubus (Figur 4 og 5), mens objektbordet er fast. Disse er stort sett uegnet til mikrofotografering fordi kameraet blir for tung belastning på finskruen. Riktig store stativer har foruten flere innebyggete lyskilder, ofte blant annet mu­ ligheter for komplisert måle- og kamerautstyr, computerutstyr for bildebehandling og er meget kostbare. Både objektiver og okularer har som re­ gel egenforstørrelsen inngravert på fatnin­ gen. Vanlige objektiver er 10 x, 25 x, 40 x, 60 x, 90 x og 100 x. Det samme gjelder oku­ larene som gjerne finnes med egenforstørrelse 5x, 10x, 12,5 x, 15x, 20 x eller 25 x. Kjøpere av mikroskop bør søke kyndig

16 veiledning hos forhandleren. Ettersom ut­ styret er kostbart, bør man satse på aner­ kjente fabrikater og modeller som lar seg utbygge for fremtidige behov. Både optisk og mekanisk kvalitet er viktig. Oftest er det direkte sammenheng mellom pris og kvali­ tet, et «billig» instrument er neppe full­ godt. Spesielt gjelder dette prisene på ob­ jektiver og okularer. De instrumenter og instrumentdeler som

Figur 8 Ultraphot forskningsmikroskop (Zeiss). Denne modellen var i produksjon inntil ganske ny­ lig. Mikroskopet var forsynt med flere belysningskilder, storformatkamera, utstyr for makro- og mik­ rofotografering samt alle tilgjengelige optiske kontrasteringsteknikker. (1) Fotokassett 9 x 12 cm (utbyttbar med 35 mm kamera), (2) justering av projeksjonslengden, (3) binokulartubus, (4) skyveprisme for alternativ strålegang i mikroskopet, (5) «optovar» med 3 ulike forstørrelsesfaktorer og «Bertrand»-linse, (6) hendel for valg av belysning, (7) ut­ gang for påfallende lys, (8) objektivrevolver, (9) justerbart, roterbart objektbord, (10) belysningsjustering, (11) grov- og finfokusering, (12) utgang fra kollekter m. f i Iterholder, (13) trykk-knapper for kamerasystem, (14) feltblenderegulering, Carl Zeiss, GmbH, Oberkochen.

vi har beskrevet i boken er nødvendigvis ikke av siste «modell». De er uansett av høy kvalitet og er valgt ut av pedagogiske årsa­ ker. Flere av komponentene har ikke spe­ sielt brukervennlig design, noe som kunne kreve adskillig teknisk ferdighet for full ut­ nyttelse av instrumentenes muligheter. Nye­ re laboratorie- og forskningsmikroskoper er langt lettere å anvende. Slike modeller kan leveres med omfattende automatisering av viktige funksjoner De store, moderne lysmikroskopene for avansert forskning er blitt kompliserte og kostbare. For de fleste formål kan man imidlertid klare seg med et solid mikroskopstativ som utstyres etter behov. Amatører med interesse for mikroskopi vil uansett kunne greie seg med et eldre mikroskop av god kvalitet og anerkjent fa­ brikat, kjøpt for noen få tusen kroner. Mik­ roskopet kan godt være monokulart med 5x og 10x okularer, og ha akromatiske objekti­ ver 10/0.25, 40/0.65 og 100/1.30. Kondensor bør ha apertur fra 0.90 og oppover. Er mikroskopet forsynt med speil, kan man bruke en vanlig glødelampe med matt 60 W pære som lyskilde til mange formål. Bedre laboratoriemikroskoper får man i prisklassen ca. 20 000 kr (se eksempel i Figur 6). Slike instrumenter har innebygd belysning, binokular tubus, kanskje til og med fasekontrastobjektiver. Profesjonelle forskere må regne med ut­ gifter på ca. 100 000 kroner til et nytt bruk­ bart forskningsmikroskop med de vanligste mulighetene. Ofte kan man ha like stort utbytte av å anskaffe et brukt forskningsmikroskop, el­ ler kanskje instituttet disponerer en modell av eldre årgang. Disse kan ofte oppgraderes og settes i fullgod stand (Fig. 8). Det er ikke bare optikken som er viktig i et godt mikroskop. Mange mikroskopstativ blir for svake, mekanisk sett, når man påmonterer tunge kameraer og annet tilleggs­ utstyr. Man kan lett observere denne effek­

17

ten ved først å innstille skarpt på preparatet med oljeimmersjonsobjektivet. Trykk lett på siden av bæresøylen for tubus med peke­ fingeren. Bildet beveger seg tydelig, mest på mekanisk svake stativer. Bare noen få grams vekt får altså mikroskopstativet til påvisbart å bøye seg. Vi skjønner godt at «bæresøylen» for mikroskopstativet bør være kraftig. Selv med dimensjoner som en jernbaneskinne kan den for visse formål være i svakeste la­ get. Store forskningsmikroskoper har der­ for store dimensjoner (se Figur 8). På de enkleste mikroskopene er det mulig å skyve preparatet frem og tilbake på objektbordet og allikevel finne de objekter

man ønsker å studere. Ved sterkere forstør­ relser er dette vanskelig, for ikke å si umu­ lig. Ved 1000 x forstørrelse vil et kvadrat­ centimeter stort område synes som 100 m2, og innenfor dette skal man kanskje prøve å finne en bestemt struktur på tilsynelatende en millimeter eller så. Med en såkalt kryssfører, eller i mere om­ fattende utførelse, såkalt kryssbord, (Fig. 6) er dette mye lettere. Preparatet er festet i en klemanordning som kan beveges i et rett­ vinklet koordinatsystem. Bedre kryssbord er forsynt med en nonieskala langs X- og Yaksene. Avlesning av posisjoner i preparatet gjelder bare for det bestemte mikroskopet man bruker (Fig. 9).

Figur 9 Stort, Zeiss-Jena objektbord, eldre type. Bordet kan roteres, er sentrerbart (store skruer nederst til venstre og høyre). Kryssføreren (to store skruer lengst til høyre) beveger preparatet i X- og Yaksen. To nonieskalaer angir preparatposisjoner. Carl Zeiss, Jena.

Figur 10 Eldre Seibert kryssfører for påsetning på mikroskop med fast objektbord. Mikroskoppreparatet som er festet i klemmene er forsvarlig merket med etiketter. W.&H. Seibert, Wetzlar.

18

Finner man en interessant struktur i ko­ ordinatene 23.4/122.5, kan denne bare gjenfinnes ved denne innstilling i det sam­ me mikroskopet. Med et annet kryssbord i et annet mikroskop er verdiene kanskje 25.7/130.8. Forskyvningen mellom verdiene på Xaksene og på Y-aksene på objektbordet mellom to mikroskoper vil alltid være den samme.

Vi kan derfor regne ut verdiene for det and­ re mikroskopet etter å ha bestemt X- og Yforskyvningen en gang for alle. I nevnte til­ felle er den x = + /- 2.3, y = +/- 8.3. Vi bør derfor ikke demontere kryssbordene for rensing og reparasjon uten videre. Det er vanskelig å få dem montert igjen slik at vi får samme koordinatverdier som før. De dyreste kryssbordene er sentrerbare, noe som gjør at dette problemet bortfaller. Det fins kryssbord der skruene for X- og Y-aksen er lavtliggende. De befinner seg da i samme høyde som mikroskruene. En del dyrere mikroskop kan forsynes med motorisert kryssbord som gjennomsø­ ker hele preparatet. Bordet styres av en datamaskin som kan programmeres til selv å velge ut interessante strukturer og analy­ sere dem.

Figur 11 Strålegang i vanlig, bikonveks linse. Bare stråler langs den optiske akse er gjengitt. Parallel­ le stråler inn mot linsen vil samles i et brennpunkt med avstand fra linsens sentrum - brennvidden (f). Avhengig av retningen på lyset kan vi snakke om et fremre og et bakre brennpunkt.

Figur 12 Linsens brennpunkt ligger i fokalplanet med avstand til linsens sentrum = brennvidden.

Virkemåte For å forstå hvordan mikroskopet virker kan vi betrakte Figur 11-16. En vanlig bi­ konveks linse er gjengitt i Figur 11. Lys kan treffe linsen fra begge sider. Sender vi paral­ lelle lysstråler inn fra venstre (Figur 12), vil den sentrale strålen praktisk talt passere lin­ sen ubrutt. Stråler mer perifert langs linseradien vil brytes sterkere jo lenger ut fra sentrum de treffer linseflaten. En riktig

Figur 13 Forkortning av brennvidden med to lin­ ser. Denne kombinasjonen er vanlig i mikrosko­ pets kondensor.

19

Figur 14 Nær parallell strålegang fra punktformet lyskilde (glødelampe med tett viklet filament).

Figur 15 Prinsipp for mikroskopets belysningssystem. I lampehuset skaffer et system av to plankonvekse, motsatt vendte linser, en nær parallell bunt av lysstråler. Denne oppfanges av kondensors bunnlinse og fokuseres over preparatet av topplinsen.For å sikre mest mulig parallell stråle­ gang innskytes ofte en ekstra samlelinse mellom kondensor og kollektor («Brillenglas»).

konstruert linse vil samle de parallelle strå­ lene i et brennpunkt. Brennpunktet ligger i det vi kan kalle linsens fokalplan (se Figur 12). Fordi lys kan passere linsen begge veier, kan vi snakke om et fremre og et bakre brennpunkt. Krummes linsens overflate sterkere, (dette skjer i øyet når vi betrakter nærliggende gjenstand) så blir brennvidden (f) kortere. I optiske systemer forkorter man ofte brennvidden ved å kombinere en bikonveks

Figur 16 Objektivet har som regel en plankonveks frontlinse. Plasseres denne over kondensor, har vi i prinsippet et enkelt mikroskop. Denne oppfanger bildet av feltblenden som er plassert rett over kollektors topplinse. Aperturblenden som ligger rett under kondensors bunnlinse begrenser strålevidden (åpningsvinkelen = vinkel mellom optisk akse og ytterste randstråle som treffer objektivet).

(den største linsen ) og en plankonveks linse (den minste) slik som vist i Figur 13. Hvis vi sender lys fra en punktformet lys­ kilde (Figur 14) mot en bikonveks samlelin­ se, får vi nær parallelle stråler. Dette er vik­ tig for å oppnå jevn belysning. Foran mikroskoplampen plasserer man ofte to plankonvekse linser vendt mot hverandre (se Figur 15) for å oppnå mest mulig paral­ lelle stråler. De to linsene utgjør det vi kal­ ler mikroskopets kollektor og den sitter i mikroskopets fot. Over den ytre kollektorlinsen sitter ofte en irisblende, kalt felt­ blenden. Mikroskopets kondensor er plassert over lyskilden som vist i Figur 16. Oftest består den av en bikonveks og en plankonveks lin­ se. Kondensors oppgave er å konsentrere ly­ set på preparatet. Når kondensor er riktig justert, skal det dannes et jevnt belyst bilde av lysfeltet innenfor randen av feltblenden i preparatplanet. Dette er det såkalte Kbhlerske prinsipp (se side 22). Kondensor er ofte forsynt med en egen blende, aperturblenden (se Figur 16). Ut fra kondensor divergerer strålene igjen. Disse kan oppfanges av et nytt linsesystem, ob-

20

virtuelt bilde av objektet

mellombildet av objektet fremre brennpunkt av okularets øyelinse

Figur 17 Strålegangen i enkelt lysmikroskop. Objektet (en pil) er plassert plassert i fokus for det plankonvekse objektivet. Objektivet avbilder pilen som et reélt mellombilde, som kan oppfanges på en skjerm. Mel­ lombildet ligger i fremre brennpunkt av okularets øyelinse (i mikroskopet er brennpunktet inni okularet på okularblendens plass). Okularet forstørrer bildet av pilen ytterligere. Et virkelig (rett) bilde med økt synsvin­ kel dannes på øyets netthinne, øyet ser dette bildet som om det lå i et plan bak objektivet. Bildet er virtuelt (innbildt).

jektivet. Lukker vi aperturblenden blir det bare sentrale stråler som treffer objektivet. Mikroskopets evne til å avbilde små detaljer minsker, men bildekontrasten øker. I Figur 17 ser vi hvordan objektiv og oku­ larer virker sammen. Lettest er dette å for­ stå hvis vi sammenlikner med et vanlig lys­ bildeapparat (se Figur 7). Samlelinsene for­ an lampen i lysbildeapparatet tilsvarer mik­ roskopets kollektor og kondensorsystem. Selve lysbildet utgjør preparatet. Stiller vi oss foran lysbildeapparatet litt bak lerretets plass og betrakter det bildet som skulle vært projisert på lerretet med en samlelinse, har vi en strålegang som er nøyaktig lik mikroskopets. Samlelinsen utgjør for mik­ roskopets okular. Mikroskopet forstørrer i to trinn. Objek­ tivet danner et reelt (virkelig) luftbilde (mel­ lombildet, er omvendt) inni tubus (første trinn). Mellombildet blir betraktet med en lupe (okularet) og forstørres ytterligere opp. Dette forstørrete bildet dannes på netthinnen (annet forstørrelsestrinn). En

prinsipiell, forenklet skisse av strålegangen er vist i Figur 17. Forstørrelsen kan enkelt utregnes ved å multiplisere objektivets egenforstørrelse med okularets. I mange mikroskoper sitter ytterligere optikk inni tubus som har en egenfaktor, ofte 1.25 x. Bruker vi derfor ob­ jektiv 25 x og okular 10 x og egenfaktoren er 1.25 x, blir totalforstørrelsen: 25-10- 1.25 = 312,5 x Det hele er beregnet for at bildet skal sees skarpt i en definert avstand av 250 mm (synsvidden).

Formelen er altså: ^mikroskop — ^objektiv ' ^okular '

E

Fm = Fob • Fok • E

Ved geometrisk konstruksjon av lystrålens brytning i linsesystemet spiller strålens ret­

21

ning ingen rolle. Bringer vi en punktformet lyskilde i linsens brennpunkt, vil strålene som forlater linsen være tilnærmet parallel­ le. Med flere linser kan vi forbedre strålegangen. Vi kan forkorte systemets optiske lengde. Dette gjøres av hjelpelinsene i mikroskopfoten (kollektor) som bevirker at lysstrålene er bortimot parallelle når de treffer den første linsen i kondensor. Kollektorlinsene er beregnet slik at lysbunten skal utfyl­ le hele linseflaten i den første linsen i kon­ densor. Plasserer vi en irisblende nær denne lin­ sen, kan vi avblende randstrålene mer eller mindre. Denne blenden har funksjon som lysfeltblende. Ut fra kondensors topplinse divergerer strålene på nytt. Frontlinsen på objektivet oppfanger disse strålene. Frontlinsen bevirker et omvendt, forstørret bilde av objektet. Vi kan symbolisere objektet med en pil og konstruere bildet av pilen som linsen danner. Hovedstrålen som passerer gjen­ nom linsens sentrum, blir ikke brutt. En stråle fra pilspissen, parallell med den opti­ ske aksen, brytes slik at den passerer gjen­ nom linsens brennpunkt (Fh). Der hvor ho­ vedstrålen og parallellstrålen skjærer hver­ andre, dannes det reelle, omvendte bildet av pilspissen. Objektivforstørrelsen utgjør forholdet mellom optisk tubuslengde To og objekti­ vets brennvidde fobj:

Lupeforstørrelse Et normalt øye kan uten vanskelighet danne et skarpt bilde på netthinnen hvis objektet er 250 mm foran øyets linse. Dette tallet er bestemt ved internasjonal konvensjon. Øyenlinsens «hovedstråle» danner en vinkel med den optiske aksen kalt /3j. Hvis man vil se gjenstanden større, kan man gå nærmere, men dette går ut over øy­ ets evne til skarpinnstilling ( se Figur 18). En linse (lupe) plasseres mellom øyet og gjenstanden som nå befinner seg i lupens fremre brennpunkt. Gjenstanden opptrer på netthinnen under en større synsvinkel /?2. Det foreligger en lupeforstørrelse der­ som synsvinkelen er større enn den man har ved 250 mm avstand. En lupes forstørrelse er derfor forholdet mellom konvensjonell synsvidde (= 250 mm) og lupens brennvidde:

Vlupe = 250 mm / flupe

Har vi en lupe med brennvidde 40 mm, blir forstørrelsen: 250 / 40 = 6.25 x

V = T /f v obj 1 oz 1 obj

Med en mattskive på avbildningsstedet ser vi pilen. Dette er det reelle mellombildet. Vi kan forstørre mellombildet ytterligere ved hjelp av en lupe. Lupen tilsvarer mikrosko­ pets okular.

Figur18 Prinsipp for lupeforstørrelse. Ved hjelp av lupen kan øyet rykke nærmere inn på objektet. Det dannes et bilde på netthinnen med økt synsvinkel (bildet ser større ut). Lupeforstørrelsen er: Normal synsvidde = 250 mm/lupens brennvidde (for ek­ sempel 50 mm = 10 x).

22

Innstilling etter Kohlers prinsipp Det er viktig å bruke lysmikroskopet på en ordentlig og korrekt måte. Hvis mikrosko­ pet er feil innstilt, blir bildene dårlige og uklare. Man bør venne seg til alltid å bruke det såkalte Kohlers prinsipp. Dette gir helt jevnt belyste, detalj- og kontrastrike bilder (Fig. 19).

(1) Bruk blomsterstøv fra tulipan som testpreparat. Dryss det ut på objektglasset. Rør det sammen med en til to dråper vann med preparernålen. Pollenet sprer seg fint. Legg på dekkglasset og fest objektglasset i klem­ mene på mikroskopets preparatholder. (2) Slå på lavvoltlampen. Drei objektivet med den svakeste forstørrelsen i stilling. (3) Bring preparatet i fokus ved å dreie grovskruen forsiktig til objektivet nesten berører dekkglasset. Senk deretter objektbordet langsomt. Iaktta preparatet til det kommer i fokus. Juster ved å dreie på finskruen til preparatet er helt tydelig. (4) Reguler lampen ved å skyve den inn og ut av holderen til det dannes et skarpt bilde av glødetråden i høyde med blenden på kondensor. Dette sees lettest ved å holde et linsepapir i blendens høyde. o

(5) Apne kondensorblenden helt. Lukk lampens blende. Reguler høyden på kon­ densor med skruen. Når lampeblendens la­ meller sees skarpt i synsfeltet sammen med preparatet, står kondensor i riktig høyde. Hvis blendehullet ikke ligger i sentrum, så vri på sentreringsskruene for kondensor til hullet er brakt i midten av synsfeltet. Sentreringsskruene sitter vanligvis på hver sin side av kondensorfatningen. Brukes et

Figur 19 Strålegangen for belysning etter Kohlers prinsipp (venstre figur) og avbildning (høyre figur) i lysmikroskopet. Kollektor befinner seg foran lys­ kilden (S). Kollektor danner et bilde av glødetråden i lampen (S') i høyde med aperturblenden i konden­ sor. Kondensor og objektivets fremre linser danner et nytt bilde av glødetråden i objektivets fokalplan (S"). Et tredje bilde av glødetråden fins i okularets utgangspupille (S"', som ligger omlag i høyde med øyets egen linse. S', S'" og S"" sies å være optisk konjugert, hver er en optisk avbildning av det fore­ gående bildet. Bildet av glødetråden kan vi fange opp med et linsepapir i høyde med aperturblen­ den. Dette hjelper oss til å justere systemet. De bildedannende strålene danner også optisk konjugerte plan. Feltblenden (L) begrenser aperturen for kollektor. Et bilde (L') dannes av feltblenden i høyde med preparatet av kondensors linser. Ob­ jektivet danner et forstørret bilde av preparatet og feltblenden i mellombildeplanet (!_'') som betrak­ tes med okularet som lupe. Det tredje bildet av felt­ blenden og objektet dannes endelig (!_'") på øyets netthinne.(Etter Ernst Leitz GmbH, Wetzlar, Tysk­ land )

23

eldre mikroskop utstyrt med justerbart speil og separat lampe, må speilet justeres i forhold til lampen og kondensor. (6) Åpne lampens blende til blendelamellene akkurat går utenfor synsfeltet. Med svakt forstørrende objektiver er det ikke all­ tid mulig å få utlyst hele feltet på denne må­ ten. Sving da ut, eller skru ut topplinsen (de fleste kondenserer er beregnet til dette).

(7) Lukk kondensorblenden litt til kontras­ ten i preparatet øker. Den bør være 2/3-374 åpen i forhold til synsfeltet. Dette kan man se ved å ta ut okularet og kikke ned i tubus. (8) Sving neste objektiv inn i strålegangen. Etter en liten finjustering skal preparatet nå sees skarpt. Kondensorhøyden må finjusteres slik at lampeblendelamellene er i riktig høyde. Blenden i lampen må lukkes noe. (9) Nå skal vi prøve oljeimmersjonsobjetivet. (Det er merket «oel.imm.», «homog.imm.» eller liknende). Drypp en liten dråpe immersjonsolje på objektglasset (Fig. 20, se også side 34). Sving objektivet inn ved å dreie på revolveren - drei på revolverringen, ikke objektivene! Frontlinsen skal nå stikke ned i oljen. Det er fare for luftblærer. Disse vil gi uklare bilder, og det ser ut som strukturene beveger seg. Luft­ blærer kan forsiktig skyves bort med et til­ spisset filtrerpapir. Nå bør preparatet være praktisk talt i fokus. Rør ikke grovskruen! Klaringen mellom glasset og frontlinsen kan være rundt 1/100 mm! Har vi et eldre objektiv uten fjærende fatning, vil det kost­ bare linsesystemet kunne ødelegges. Mo­ derne objektiver byr ikke på disse proble­ mene. Riktig gamle oljeimmersjonsobjektiver er ikke avstemt i lengde med de svakere forstørrende objektivene. Her er faren for havari meget stor. Øk avstanden til prepara­ tet med grovskruen. Kikk fra siden og skru til frontlinsen på objektivet stikker ned i

Figur 20 Tegning av dobbeltflaske for immersjonsog rensevæske (xylen). Immersjonsoljen befinner seg i den indre, brune sylinderen. Den ytre, klare flasken inneholder xylen.

oljen. Fortsett å dreie finskruen forsiktig slik at objektet nærmer seg frontlinsen til det oppstår et skarpt bilde. Unngå sam­ menstøt med preparatet. Forsøk aldri å starte med oljelinsen først.

Hvorfor alt dette bryet med å stille inn mik­ roskopet når det kan gjøres mye enklere? Svaret er åpenbart om man studerer de fineste detaljene i preparatet. Feil innstilling av lys, blendere osv. har nemlig dramatiske optiske effekter.

Derfor blir de fleste nybegynnere gledelig overrasket over bildekvaliteten i et korrigert mikroskop sammenliknet med det man ser i skole- eller laboratoriemikroskopet. Skik­ kelige preparater (se side 126), pinlig ren­

24 hold (side 82) og korrekt innstilling er helt nødvendig. Resultatet er knivskarpe, fargemettete detaljer i stedet for bleke og utviskete strukturer.

Numerisk apertur Mikroskopobjektivets evne til å gjengi fine detaljer er matematisk knyttet til begrepet numerisk apertur, ofte forkortet til «n.a.». Jo større vinkelen er mellom frontlinsens optiske akse og den ytterste randstråle som kan passere opp gjennom objektivet, jo fle­ re og finere detaljer lar seg avbilde. De matematisk/optiske forhold vedrørende dette er behandlet under bildedannelsen i mik­ roskopet (side 29) og mikroskopets oppløsningsevne (side 28). Vi kan foreløpig defi­ nere numerisk apertur som sinus til denne vinkelen multiplisert med brytningsindeksen for det mediet som befinner seg mellom dekkglasset og frontlinsen. Verdiene for numerisk apertur er et ubenevnt tall. Luft har brytningsindeksen 1.0, og for tørrobjektiver blir den numeriske aperturen direkte verdien for sinus til denne såkalte åpningsvinkelen for objektivet. For immersjonsobjektiver brukes olje med brytningsindeks som er den samme som for kronglass. Da sinus til en vinkel maksimalt kan være 1.0, er den høyeste verdi man kan få for numerisk apertur i en vanlig glasslinse 1.515 ( = brytningsindeks for kronglass/immersjonsolje). I praksis er det umulig å oppnå 90° åpningsvinkel for en frontlinse. Teknisk sett kommer man ikke høyere enn en numerisk apertur på ca. 1.4. Slike objektiver er nesten alltid apokromater. Vanlige akromatiske oljeimmersjonsobjektiver har en apertur på ca. 1.3. De beste tørrobjektivene har en numerisk apertur på ca. 0.95. Objektiv som er beregnet for vann som immersjonsmedium kan ha en apertur på ca. 1.25-1.3. Noen objektiver kan også fungere med glyserol

som immersjonsmedium. Vann og glyserol fungerer ikke med vanlige immersjonsobjektiver, bildet blir uklart. Enkelte anbefaler anisol brukt som immersjonsolje til vanlige immersjonsobjektiver. Anisol fordamper av seg selv og objek­ tivet behøver ikke å rengjøres. Anisol er greitt å bruke til enkle observasjoner. Vi får imidlertid ikke optimale resultater. Anisol bryter lys av forskjellig farge ulikt. «Dispersjonen» er stor (se side 37). I anisol av­ viker den betydelig fra vanlig glass. TEMPERATUREN HAR BETYDNING FOR MIKROSKOPETS OPTISKE FUNKSJONSEVNE

De færreste brukere av mikroskop er klar over at instrumentet er meget følsomt for variasjoner i temperaturen. Optikken er be­ regnet for å fungere tilfredsstillende ved vanlig romtemperatur, det vil si ca. 20°C. Et avvik på ca. 10 °C gir ofte like uklare bil­ der som dem man får med feil dekkglasstykkelse.

Oppløsningsevne «Lys tar den korteste vei mellom utgangs­ punkt og endepunkt». Denne loven ble ge­ neralisert av Fermat rundt år 1600. Lys kan karakteriseres som kvanter, fotoner og elektromagnetiske bølger. Hver kvant fører med seg energien E = h-v (h = Plancks konstant, v = frekvensen for lysbølgene) Lys kan beskrives med kvantefysiske begreper. Lyshastigheten er i vakuum 299 792 458 m/s, men synker i gasser, væsker og optisk transparente objekter. Brytningsindeksen utgjør forholdet mel­ lom lyshastigheten i vakuum og hastigheten til det medium lyset beveger seg i. I diamant er lyshastigheten sunket til omlag det halve.

25

Figur 21 Diagram som illustrerer begrepet optisk oppløsning. To nærliggende bøyningsfigurer (diffraksjonsskiver) dannet fra to nærliggende punk­ ter i preparatet, (a) Bøyningsskivene er tydelig ad­ skilt, (b) enkeltskivene kan ikke lenger skjelnes med sikkerhet, c) bøyningsskivene såpass over­ lappende at de like gjerne kan stamme fra en enkeltstruktur. Etter E. Leitz, GmbH, Wetzlar.

Geometrisk optikk omfatter Fermats sats, refleksjonslovene og Snellius brytningslover. I bølgeoptikk behandles lysets spredning (= diffusjon), bøyning (= diffraksjon) og interferens (= overlagring av to lysbølger). Lys fra en punktformet lyskil­ de danner ikke skarpe konturer.

Vi ser ikke skarpe skygger av gjenstander mellom lyskilden og en plan skjerm. Dette skyldes at lys bøyer litt rundt kanter, såkalt diffraksjon, et fenomen oppdaget av Grimaldi i 1665. En kant kan avbildes med av­ vekslende mørke og lyse striper. I 1826 for­ klarte Fresnel diffraksjonen som et uttrykk for lysets bølgenatur. Ethvert punkt i en lysbølge kan betraktes som utgangspunkt for nye bølger, elementærbølger. Den videre bølgebevegelse oppstår ved interferens mel­ lom elementærbølgene (se Fig. 26). Lys fra en punktformet lyskilde avbildes derfor ikke av en linse som et punkt, men som et diffraksjonsbilde som består av en sentral lysende flekk omgitt av alternerende lyse og mørke ringer . Flekkens størrelse og ringenes avstand er betinget av linsens dia­ meter og lysets bølgelengde. Skal man skille mellom bildene av to punk­ ter, må den sentrale lysende flekken som re­ presenterer det ene punktet ligge utenfor den første mørke ringen til det andre punk­ tet (Fig. 22).

Denne definisjon utgjør Rayleighs kriterium for optisk oppløsningsevne.

Figur 22 Diffraksionsbilder av nærliggende struk­ turer i mikroskoppreparatet. De to øverste struktu­ rene er tydelig innenfor linsesystemets oppløsningsevne. I nederste tilfelle er den sentrale lysflekk i det ene diffraksjonsbilde fra den ene struk­ tur såvidt utenfor den første mørke ring av diffraksjonsbildet til det nærliggende punkt.

Objektivets evne til å avbilde små detaljer (altså oppløsningsevnen) varierer med linsekonstruksjonen. Det er mange fysiske faktorer som virker inn. Blant disse er åpningsvinkelen på frontlinsen, lysets bølge­ lengde, graden av linsefeil og nøyaktighet ved sliping og sammensetning av objekti­ vet. Oppløsningsevne må imidlertid ikke forveksles med begrepet forstørrelse. For­ størrer vi bildet (ved å bruke sterkere okula­ rer enn normalt) utover oppløsningsevnen for objektivet, får vi ikke flere detaljer. Tvert imot virker bildet både tåket og uklart (fig. 23). Ethvert objektiv har et brukbart forstørrelsesområde som det ikke har noen prak­ tisk hensikt å overskride (Tabell 2, Fig. 24).

26

Figur23 Kombinasjonsdiagram som viser anbefalte objektiv- og okularkombinasjoner. Totalforstørrelsen er angitt langs skalaen til venstre. Den skrå skalaen ned mot høyre angir ulike okularforstørrelser. Skala på høyre side av diagrammet angir objektivforstørrelser. Skala på høyre side av diagrammet angir objekt i vforstørrelser med tilhørende numerisk apertur. Bare de kombinasjoner som ligger innenfor det avmerkete rektangelet (fra 500-1000 x n.a.) anbefales for vanlig bruk. Etter Carl Zeiss GmbH, Oberkochen.

27

Figur 24 Sammenhengen mellom totalforstørrelse, nummerisk apertur og aksial oppløsning i ^m. Vi ser at gevinsten i oppløsning for oljeimmersjonsobjektiv med n.a. 1.25 til n.a. 1.40 er temmelig beskjeden. For skrå belysning kan oppløsningsevnen forbedres til ca. 0.16 gm for objektiv med n.a. 1.40. Etter Carl Zeiss, GmbH, Oberkochen.

28 Tabell 2 Sammenheng mellom numerisk apertur, oppløsningsevne, linjer per mm og anbefalt forstørrelse Numerisk apertur A

Oppløsnings­ evne (550nm)

0,04 0,12 0,25 0,50 0,65 0,75 0,95 1,30 1,40

6,9/zm 2,3 1,1 0,55 0,42 0,37 0,29 0,21 0,19

Kikk på fjernssynskjermen med en lupe. Bildet er bygd opp av små fargeflekker. De­ taljer mindre enn avstanden mellom to enkeltpunkter vil ikke kunne sees, uansett hvor sterk lupen er. Fjernsynsbildet har alt­ så en begrenset oppløsning som er avhengig av antall linjer bildet er bygd opp av verti­ kalt (ofte ca. 525) og horisontalt av avstan­ den mellom skarpe punkter. Et amatørvideokamera har som regel mye dårligere vertikal oppløsning enn kringkastingsfjernsyn (bare ca. 200 linjer). Amatørfilmen gir ofte ganske skuffende resultater teknisk sett, sammenliknet med profesjonell sending. Oppløsningsevnen for en fotografisk film avhenger av avstanden mellom de fremkalte sølv- eller fargekorn. Projiserer vi et lysbilde på veggen, ser vi mange flere de­ taljer enn i det tilsvarende fjernsynsbildet. Bildet virker skarpere. Men skarphet er ikke det samme som oppløsning. Skarphet av­ henger også av kontrast mellom nærliggen­ de detaljer. Fordi moderne fotografisk film er så finkornet, blir oppløsningsevnen enormt forbedret. Vi har nå fått en slags oppfatning hva oppløsningsevne er i forhold til forstør­ relse. Oppløsningsevnen defineres derfor som:

500A

1000 A

20 60 125 250 325 375 475 650 700

40 120 250 500 650 750 950 1300 1400

Linjer/mm

145 436 910 1820 2380 2730 3450 4750 5090

Den minsteavstand (målt som lengdeenhet) som kan eksistere mellom to strukturer slik at den sentrale lysflekk i diffraksjonsbildet av det ene punkt ligger utenfor den første mørke ring av diffraksjonsbildet av det nærliggende punkt. Oppløsningsevnen avhenger av lysets fysis­ ke egenskaper. Lys er elektromagnetisk stråling av bølgenatur. Vi kan la lyset passe­ re gjennom en svart glassplate der det er ris­ set inn fine, tettliggende parallelle linjer som er gjennomskinnelige.

En slik glassplate kalles i fysikken for et git­ ter. Avstanden mellom linjenes midtpunk­ ter kalles for gitterkonstanten. I det daglige synes lysstrålene å gå i rette lin­ jer. Lysstråling kan beskrives å være av bøl­ genatur. Er gitterkonstanten liten nok, det vil si noen mikrometer (1 gm = 1/1000 mm), vil vi få såkalte bøyningsfenomener. Meste­ parten av lyset vil passere rettlinjet gjen­ nom gitteret. Men noe vil avbøyes «rundt hjørnet». På grunn av samvirke mellom de tettliggende bølgetog får vi såkalte interferensfenomener. Lyset vil, etter å ha passert gitteret, arrangeres i en rekke flekker på hver side av hovedstrålen, som er den mest intense. Flekkene utover blir stadig svakere. (Se Figur 25 og 26.) Den sentrale flekk kal-

29

1st order Oth order 1st order Rear focal plane of the objective

Figur 25 Gitter med fem gitterspalter. Mot gitteret sendes parallelle vertikalt rettede lysstråler. Noe av lyset fortsetter rett frem ifølge de lover som gjel­ der for geometrisk optikk. Lys av 1. orden oppstår ved interferens mellom bølgetogene som går ut fra gitterspaltene. Objekti­ vet fokuserer dette i bakre fokalplan. Avbøyningen av lysets første orden bestemmes av triangelet ABC (tegnet forstørret til høyre). Avstanden A-C re­ presenterer bølgelengden Å, A-B avstanden mel­ lom gitterspaltene. Etter E. Leitz, GmbH, Wetzlar.

Figur 26 Interferens mellom bølgetog som passererto nærliggende gitterspalter. En enhetlig bølgefront treffer et gitter som består av to spalter. Ut fra åpningene brerto konsentriske bølgetog seg. Dis­ se overlapper hverandre og det oppstår interfe­ rens. Foruten hovedmaksimum av 0-te orden, dan­ nes sidemaksima +1 og -1 (1. orden), og sidemaksima +II og -II (2. orden). Fenoménet kan simule­ res i et kar vann dervannet settes i bølgebevegelse og der bølgefronten treffer vertikalt en plate med to nærliggende spalter. De nye bølgetogene (+l, -I, + II og -II) blir avbøyet ved passasjen gjennom spaltene. Etter Gerlach 1976.

30 les hovedmaksimum, de øvrige strålebunter nummereres som «maksima» av 1. orden, 2. orden, 3. orden ut til hver side. Et slikt gitter representerer et optisk sett svært enkelt mikroskoppreparat. Vi kan nå utføre følgende eksperiment:

(1) Legg et gitter med gitterkonstanten 8 /zm på mikroskopbordet. Slike gitre kan kjøpes forholdsvis rimelig i optiske forretninger. (2) Se i mikroskopet med et objektiv med lav apertur, for eksempel 10/0.25. (3) Lukk aperturblenden nesten helt. (4) Ta ut okularet og kikk ned i mikrosko­ pet. Vi ser en sentral lysflekk som tilsvarer blendehullet (hovedmaksimum av O-te or­ den). Ut til hver side ser vi sidemaksima av -, 2-., 3. orden. Intensiteten av lysflekkene 1. blir stadig svakere ut fra sentrum.

(5) Legg rett over objektivets topplinse en li­ ten skive med et hull i. Hullet må være i lin­ sens sentrum slik at bare hovedmaksimum kan passere. (6) Sett okularet i mikroskopet. Gitterlinjene som før var tydelige, er nå borte. I stedet har vi fått et uklart bilde og linjemønsteret er ikke oppløst. (7) Eksperimenterer vi videre, finner vi at jo flere sidemaksima som kan passere gjen­ nom optikken, desto bedre blir detaljrikdommen i mikroskopbildet. Oppløsningsevnen stiger når sidemaksima av høyere or­ den passerer det optiske systemet.

losevegger som ligger parallelt med jevn av­ stand mellom seg og likner følgelig mye på optiske gitre. Andre gittertyper kan være oppbygd av punkter eller andre elementer. Til enhver gitterform (les preparat) svarer et bestemt bøyningsmønster som dannes rett over mikroskopobjektivet. Ved interferens, eller samvirke mellom de enkelte bølgetog, opp­ står det reelle mellombildet som okularet forstørrer. Strukturen til enkeltheter på grensen av objektivets oppløsningsevne er ikke pålite­ lig. Detaljer som er mindre enn oppløsningsevnen, er ikke til å stole på. Jo mindre gitterkonstanten er, jo større blir avbøyningen av lyset. Vinkelen mellom maksimum - 1 og +1 blir så stor at det kre­ ves et objektiv med stor åpningsvinkel. Aperturen er altså høy. Og dette bare for å oppfange de to innerste maksima. Ettersom det bare er ubøyd lys som ikke gir oppløs­ ning og når sidemaksima ikke kommer inn gjennom objektivet, forblir strukturen uoppløst.

Det er følgende matematiske sammen­ heng mellom oppløsningsevnen = git­ terkonstanten d eller n.d., lysets bølge­ lengde lambda og den numeriske apertu­ ren n.a. :

(1) ved gjennomfallende lys:

n.a. (2) ved maksimalt skrå belysning:

2. n.a.

Objektene som studeres i mikroskopet er ganske små. Optisk sett virker de som gitre for lyset. Sjelden er strukturene parallelle som i vårt optiske gitter. Det nærmeste vi kommer er preparater av trakeideceller i ved av nåletrær. Trakeidecellene har cellu-

Ved skrå belysning kan man altså øke opp­ løsningsevnen til det dobbelte. Vi tenker oss nå et tilfelle der bare hoved­ maksimum passerer (0. maksimum) og +1

31

og -1 såvidt ikke oppfanges. Vi ser ingen synlig struktur i mikroskopet. Vi kan nå sende belysningen inn maksi­ malt på skrå fra en side under kondensor. Foruten 0. maksimum vil vi nå også opp­ fange enten +1 eller -1, men ikke begge. En fortegnet, men synlig struktur opp­ trer nå i mikroskopbildet. Det blir økt opp­ løsning, men bare i en retning. Dette gjør det vanskelig å tolke det mikroskopiske bil­ det. Ved maksimalt skrå belysning øker oppløsningsevnen til det doble, men bare i én retning. Slike mikroskopbilder kan analyseres matematisk ved bildeanalyse. Men dette er en vanskelig prosess. Som standard testobjekt for oppløsningsevne brukes en liten kiselalge, Pleurosigma angulatum. Denne består av to avlange kiselskall som er arrangert omtrent som bunn og lokk i en petriskål (se Figur 27).

»• • • • •

Objektivet Objektivet er den viktigste optiske delen i mikroskopet. Detaljene og kvaliteten av det mikroskopiske bildet bestemmes primært av objektivet. Uansett hvor sterke og gode okularer man har, fremkommer det ikke mer i bildet enn det objektivet har mulighe­ ter for å yte. Både dybdeskarphet, fargekorreksjon, plant bildefelt, randskarphet, bildeklarhet og kontrast bestemmes først og fremst av objektivet. Objektiver fins i ulike kvaliteter og med ulike optiske egenskaper. Store optiske fir­ ma, Leitz, Zeiss fører omlag 100 ulike ob­ jektiver hver til sine mikroskoper. På objek­ tivets fatning er inngravert de viktigste egenskapene. Disse blir angitt som forkor­ tete «koder», dels som serier av tall. Det er viktig å kjenne og forstå disse betegnelsene. Zeiss mikroskopobjektiver har ofte også

♦♦ • /a*/,

* * ♦ • • ***••**» ♦*AV.

• ♦ • ////////**A ///// • • ••/////. »♦♦////// • ••• / U///////••••»« ^.V///‘••**.•/, ?UV*AV////»’ !*//.**/•»•* * * * •*//// *w*

Figur27 Mikrofotografi avdiatoméen Pleurosigma angulatum. Bildene viser finstrukturen i kiselskallene. Med apokromat 63/1.40 (venstre bilde) (forstørrelse 2500 x) ser vi (iallfall) på originalbildet flere detaljer enn med fluoritobjektiv 100/1.30 (eldre type, høyre bilde, forstørrelse 3400 x). Oppløsningsevne er ikke det sam­ me som forstørrelse.

32

en fargekode (farget ring rundt øvre del av objektivfatningen). Vanlige betegnelser for mikroskopobjektiv:

Akromat: oftest et rimelig objektiv kor­ rigert for to farger (rødt og blått) Fluorit, Fluar, Neofluar: bedre fargekorrigert objektiv, men fargefeil for gult Apokromat: kostbart objektiv med fargekorreksjon for rødt, gult,blått Oel eller oil, imm, homog. imm.: betyr at objektivet må brukes sammen med immersjonsolje, ellers virker det ikke. Plan: betyr at objektivet gir et plant (ikke et buet) mikroskopbilde POL eller pol: betyr at objektivet er uten mekaniske spenninger osv. Egner seg for polarisasjonsmikroskopi. m.i. eller iris: objektiv forsynt med irisblende (sjelden) W: objektiv beregnet for vann som immersjonsmedium Korr: objektivet kan korrigeres (dreibar ring for innstilling) for sfærisk avvik oppstått ved feil dekkglasstykkelse Glyz: immersjonsobjektiv beregnet for glyserol som immersjonsmedium Epiplan: objektiv beregnet for påfallen­ de lys (belysning ned gjennom objek­ tivet) HD: objektiv beregnet både for vanlig lysfelts- og mørkefeltmikroskopi D: Objektiv beregnet for mørkefeltmik­ roskopi. Kan også betegne et objektiv som skal brukes til preparater uten dekkglass.

TALLBETEGNELSER

Det første tallet angir egenforstørrelsen (for eksempel 40 x). Det neste angir numerisk apertur (eks. 0.63 se s. 39). Det tredje tallet angir dekkglasstykkelsen (for eksempel 0.17 mm). Moderne objektiv er slik innrettet at der­

som det svakeste (10 x) er innstilt i fokus, vil det neste (for eksempel 40 x) også være så og si i fokus. Dette gjelder også for oljeimmersjonsobjektivet. En slik objektivserie sies å være parfokal. Egenforstørrelsen for objektivet finnes lett av følgende formel:

(E = egenforstørrelse, for eksempel 40 x, T= optisk tubuslengde, oftest 170 eventuelt 160 mm, B = brenn­ vidden for objektivet,- i mm )

Mekanisk tubuslengde Mekanisk tubuslengde defineres som av­ standen mellom øverste rand av tubus som okularet hviler på til ytterkanten for skruevindingene for objektivet i objektivrevolveren. De fleste moderne mikroskop bruker 160 mm som mekanisk tubuslengde. Eldre modeller av Leitz mikroskop har 170 mm tubuslengde, nyere modeller har 170 mm som Zeiss. Sammenblanding av objektiver med forskjellig tubuslengde i samme revol­ ver er uheldig idet noen objektiver da ikke virker tilfredsstillende. I riktig gamle mikroskop kunne man trekke ut tubus. Den hadde en gradert ska­ la. Man kunne således variere tubuslengden. Dette gav muligheter for korreksjon av sfærisk avvik (se Figur 5). Enkelte for­ skningsmikroskop leveres med objektiver konstruert for «uendelig» tubuslengde. Disse er merket «00». Slike objektiver er re­ lativt «ufølsomme» for variasjoner i tubuslengden noe som letter innplassering av eventuell mellomoptikk mellom objektiv og okular.

Objektivkonstruksjoner Mikroskopoptikk skiller seg nokså mye fra vanlig optikk slik vi kjenner den fra foto-

33

apparatet. Et fotoobjektiv med kort brenn­ vidde er skarpt både i det nære og fjerne området. Objektiv med lang brennvidde (teleobjektiv) gir skarpe bilder kun i et be­ grenset område. Mikroskopobjektivene er helt motsatt. De med kort brennvidde som forstørrer mest har også minst skarphetsdybde. Dette skyldes at mikroskopobjektivet danner for­ størrete bilder av motivet. Foto-objektivet derimot danner et forminsket bilde. For begge objektivtyper gir liten blenderåpning større dybdeskarphet. Dybdeskarpheten avtar raskt med økende apertur. For oljeimmersjonsobjektivet (n.a. 1.3-1.4) er den bare noen tusendedels mm. Hvis man nedblender objektivet, min­ sker man aperturen og oppløsningsevnen drastisk. Dette er altså ingen vei å gå. Man må derfor ta hensyn til dette og lage flate preparater. Nettopp dette er et hovedmål med mikroskopisk prepareringsteknikk. Objektet må skjæres i mest mulig tynne ski­ ver, eller presses flate. Det kreves kunnskap og øvelse å danne seg et romlig bilde ut fra det flate mikroskoppreparatet. Med korte brennvidder blir også arbeidsavstanden for objektivene liten. De kan me­ get lett støte bort i preparatet og ødelegges. Et 100 x oljeimmersjonsobjektiv har en arbeidsavstand på bare ca. 0.11 mm. Oljeimmersjonsobjektivene er de mest kompliserte. De kan bestå av 6-14 enkeltlinser. Det benyttes ulike typer glass og flusspat. Smålinsene er noen ganger kittet sam­ men, andre ganger har de et luftlag imel­ lom. Enkeltlinsene er festet i små metallfatninger som er skrudd inn i objektivet. Avstanden mellom enkeltlinsene og sentre ringen av dem er «kritisk» og må være nøy­ aktig på tusendels millimeter ellers fungerer ikke objektivet tilfredsstillende. Slag eller fall av en linse i gulvet, kan ha brakt smålin­ sene ut av justering selv om objektivet ser uskadet ut. En eventuell reparasjon er bare mulig på fabrikken. 2 - Mikroskopi

Immersjonsoljen danner sammen med preparatet, objektglasset og frontlinsen et homogent optisk system (se Fig. 28). Det er derfor optisk sett likegyldig om preparatet har dekkglass eller ikke. Ved immersjonsobjektiver unngår man derfor i stor grad den sfæriske abberasjonen. Immersjonsobjektiv for lavere forstørrelser gir klare, kontrastrike mikroskopbilder av bedre kva­ litet enn tørrobjektiver.

Parfokale objektiver Objektivene til mikroskop fra samme firma er avpasset til hverandre for praktisk bruk. Når objektivet med den svakeste forstørrel­ sen (10 x) er brakt i fokus, er avstanden inn­ stilt også for de øvrige objektivene. Bare en svak justering på mikroskruen er nødven­ dig for å bringe 40 x eller 100 x objektivet i fokus. Objektivene er «parfokale». Denne lengdetilpasningen er karakteristisk for moder­ ne objektiver. På eldre mikroskop var det forholdsvis vanskelig å innstille fokus. Sterkt forstørrende objektiver var ikke av­ stemt i objektivrevolveren med de øvrige, og dette førte ofte til sammenstøt med pre­ paratet. I beste fall knuste man dekkglasset, i alvorligere tilfeller ødela man frontlin­ sen med kostbare reparasjoner som følge. Moderne objektiv er også sikret på andre måter. De som forstørrer sterkere enn 10 x, har ofte fjærende fatning. Som regel skjer det ikke mekaniske skader ved sammenstøt med preparatet. Det kan likevel lønne seg å utvise forsiktighet med apokromater som er særlig sårbare for slag, støt og annen me­ kanisk påvirkning. De svakeste objektivene (for eksempel 2.5 eller 6.3 x) er ofte ikke parfokale og har en spesielt lang arbeidsavstand. Eldre ob­ jektiv kan av og til brukes i samme objektivrevolver som mer moderne, men som re­ gel er de for korte. Flere firmaer (Leitz, Zeiss) leverer mellomringer med korrek-

34

Figur 28 Sammenheng mellom innfallsvinkel fra et punkt i preparatet og objektivets evne ti! å oppfange randstråler. Et tørrobjektiv (luft, brytningsindeks 1.0) kan maksimalt oppfange stråler med innfallsvinkelen (e). Dersom denne overskrides (ca. 41 °) skjer det totalrefleksjon i dekkglassets overflate og strålen når ikke objektivet. N.a. blir i praksis ved konstruksjonen begrenset til 0.90. Har vi vann (brytningsindeks 1.33) mellom preparatet og et vannimmersjonsobjektiv, kan stråler med økt innfallsvinkel treffe objektivet (vin­ kelen e øker). Bruker vi immersjonsolje (brytningsindeks 1.515) kan strålen forlate dekkglasset med en vin­ kel på maksimalt 69,6° (apertur 1,42), i tilfellet ovenfor med vinkel 64,7° (n.a. 1,37). Vinkelen begrenses i praksis av frontlinsens diameter og fokuseringsavstandene.

sjonsoptikk slik at de passer sammen med dem av nyere fabrikat. Man må ikke blande objektiver beregnet for ulik tubuslengde. Det gjelder spesielt eldre Leitz objektiver (tubuslengde 170 mm) med nyere (tubus­ lengde 160 mm) (se også under sfærisk avvik).

Oljeimmersjonsobjektivet Oljeimmersjonsobjektivet er mikroskopets mest ømfintlige del og kan lett ødelegges ved feil bruk. Til dette objektivet er det praktisk å disponere en såkalt «dobbelt-

flaske» (se Figur 20). Den består av en indre sylinder av brunt glass. I sylinderen fins immersjonsoljen, - en seig væske med samme lysbrytning (nd = 1.515) som glass. Sylinderlokket er festet til en liten glasstav som brukes for å hente opp oljen som enkeltdråper. I den ytre, klare delen av dobbeltflasken heller manxy/ew (= rensevæske). Løf­ ter man opp den brune glassylinderen, føl­ ger det med et par dråper xylen på utsiden av den. Rens alltid immersjonsobjektivet etter bruk! Gammel olje blir seigere etter hvert og tørker inn til en hard klump (spesiel gjel­ der dette cederolje). Derved kan frontlinsen

35 bli ødelagt dersom man forsøker å fjerne belegget. Klumpen kan også støte mot pre­ paratet og føre til at frontlinsen blir trykket inn i objektivet når man forsøker å mikro­ skopere. Reparasjon av dyrere objektiver kan koste flere tusen kroner. BRUK AV OLJEIMMERSJONSOBJEKTIVET

(1) Drypp en liten dråpe immersjonsolje på objektglasset. (2) Sving objektivet inn ved å dreie på revol­ veren - drei på revolverringen, ikke objekti­ vene! Frontlinsen skal nå stikke ned i oljen. (3) Det er fare for luftblærer. Disse vil gi uklare bilder, og det ser ut som om struk­ turene beveger seg. Luftblærer kan forsiktig skyves bort med et tilspisset filtrerpapir. Nå bør preparatet være praktisk talt i fokus. Rør ikke grovskruen! Klaringen mellom glasset og frontlinsen kan være rundt 1/100 mm! Har vi et eldre objektiv uten fjærende fatning, vil det kostbare linsesystemet kun­ ne ødelegges. Moderne objektiver byr ikke på disse problemene. Riktig gamle oljeimmersjonsobjektiver er ikke avstemt i lengde med de svakere forstørrende objektivene. Her er faren for ødeleggelse meget stor. Gå da frem som i punkt 4. (4) Øk avstanden til preparatet med grov­ skruen. Kikk fra siden og skru til frontlin­ sen på objektivet stikker ned i oljen. Fort­ sett å dreie finskruen forsiktig slik at objek­ tet nærmer seg frontlinsen til det oppstår et skarpt bilde. Unngå sammenstøt med pre­ paratet. Forsøk aldri å starte med oljelinsen først.

Nyttig og tom forstørrelse Et normalt øye kan skille mellom to punk­ ter som ligger ca. 0.2 mm fra hverandre.

Den optiske avstand til objektet er da 25 cm, hvilket defineres om normal synsavstand. Det har ingen hensikt å øke forstørrelsen i mikroskopet mer enn det de minste struktu­ rene objektivet kan avbilde. Disse ligger alt­ så i en tilsynelatende avstand på ca. 0.2 mm fra hverandre. For det beste oljeimmersjonsobjektivet (apokromat n.a. 1.4) tilsvarer dette en total forstørrelse på ca. 1250 x. Alt utover dette er «tom» forstørrelse uten ny informasjon. Dette gir oss følgende grove «regel»; Vi kan øke okularforstørrelsen inntil den totale forstørrelsen er ca. 1000 x den nume­ riske apertur. Med objektiv 10 x/0.25 kan vi maksimalt forstørre 250 x. Med objektiv 40/0.65 maksimalt 650 x osv. Ser man eks­ tra godt, kan verdien halveres, altså 500 x numerisk apertur. Dette gjelder for vanlig gjennomfallende lys. Bruker vi videokamera og øker kontras­ tene i preparatet elektronisk, kan vi i visse tilfeller, med gunstig resultat, øke totalforstørrelsen vesentlig. I levende celler har man fått frem mikrotubuli på videofilm, selv om de teoretisk sett har dimensjoner mindre enn lysmikroskopets oppløsningsevne.

Optikkens klarhet På tross av høy oppløsningsevne kan man­ ge, spesielt eldre objektiver, gi nokså kontrastløse og «flaue» bilder. Dette skyldes flere forhold. Først i 1950-årene ble det van­ lig med antirefleksbehandling av linsene. Mange mikroskopobjektiver er meget kom­ plisert oppbygd med et stort antall linseelementer og fri glassflater mot luft. Indre reflekser forstyrrer bildet og har en effekt omtrent tilsvarende visning av lysbilder i et delvis opplyst rom. Antirefleksbehandlingen skjer ved pådamping i vakuum av tynne sjikt på linseflatene. Totalt kan indre reflek­ sjoner reduseres med 95 % eller mer. Utvik-

36

ling av moderne glassorter og computerberegning av enkeltlinsenes geometri har ført til bedre linsekonstruksjoner, ofte med fær­ re elementer. Beregningsarbeidet for linsekonstrukjoner ble tidligere utført «for hånd» og var ytterst arbeidskrevende. Ob­ jektiver som inneholder flusspat har oftest færre glassflater («fluoritobjektiver») og utmerker seg ved særlig klare, distinkte mikroskopbilder. Antirefleksbehandlingen, spesielt på in­ dre linseflater, er meget sårbar og kan lett ødelegges. Kohlersk belysning er en forut­ setning for gode, kontrastrike mikroskop­ bilder.

grad og dybdeskarphet. Med moderne tek­ nikker kan man oppnå romlige bilder ved bruk av digitale videokamera og datapro­ grammer som rekonstruerer romlige bilder ut fra optiske «snitt». Man tar serier av enkeltbilder med ulik fokus og med liten dyb­ deskarphet. Datamaskinen velger ut de skarpe områdene fra hvert fokusplan og setter dem sammen til et tredimensjonalt, rekonstruert bilde.

Dybdeskarphet

Mikroskopobjektiver byr på formidable konstruksjonsoppgaver. Målet er å reduse­ re optiske feil mest mulig.

Dybdeskarpheten i mikroskopet avhenger av flere faktorer, blant andre forstørrelsen i mikroskopet, men også av graden av avblending av kondensor, den numeriske apertur for objektivet og ved små forstør­ relser i optiske egenskaper ved selve øyet. En middels nærsynt person (brukt som standard ved beregninger) kan variere øyets akkomodasjon med 3 dioptrier. Ut fra disse forutsetninger (beregnet av professor Abbé) blir dybdeskarpheten for et oljeimmersjonsobjektiv på n.a. 1.4 og belysningsapertur 1.0 (ikke olje på kondensors topplinse) bare 0,9 /un. Preparatstrukturene må altså ligge «helt flatt» med mindre høydevariasjon enn 1/1000 mm om alt skal være i fokus samtidig. Bare enkelte squashpreparater (se side 126) og snittpreparater (s. 201) oppfyller disse kriteriene. I praksis kan man danne seg et bilde av de romlige strukturforholdene i preparatet ved å fokusere opp og ned med mikroskruen ved sterke forstørrelser. For mikro­ fotografering må preparatene være «flate». Dybdeskarpheten øker betydelig med sva­ kere forstørrende objektiver. Ofte må man finne et kompromiss mellom forstørrelses-

Linsefeil og optisk korreksjon

Sfærisk avvik En enkelt bikonveks linse utgjør ikke et full­ godt objektiv. Årsaken er at enkeltlinsen har en lang rekke optiske feil. Teoretisk skal den kunne samle en bunt parallelle stråler i et bestemt brennpunkt. Imidlertid er dette langt fra tilfelle. Randstrålene avbøyes langt sterkere enn sentrale stråler. Brennpunktet blir derfor ikke noe «punkt», men tvertimot et ganske utstrakt område. Linsen danner av den grunn ikke skarpe bildepunkter. Linsefeilen kalles for sfærisk avvik, og denne feilen minskes enklest ved avblending av randstrå­ lene. Bildet blir nemlig vesentlig skarpere hvis lyset bare passerer linsens sentralområ­ de. Men dette skjer på bekostning av både lysstyrken og linsens oppløsningsevne. Vi kan minske det sfæriske avviket ved å gi linsens to sider forskjellig krumningsradius. Slike sfæriske linser er kostbare og vanskelige å lage. Av og til brukes de i mi­ kroskopets kondensor Det sfæriske avviket

37

kan imidlertid også oppheves ved å bruke en kombinasjon av to linser som gjensidig kompenserer hverandres feil. Men det er flere problemer. Sfærisk av­ vik opptrer også i dekkglasset i preparatet. Dette er tatt hensyn til ved konstruksjonen av mikroskopobjektivet. Ettersom feilen varierer sterkt med dekkglasstykkelsen, er det ikke likegyldig hva slags dekkglass vi bruker. De må ha en eksakt tykkelse (fast­ satt ved internasjonal avtale) på 0.17 mm. Det er forutsatt at objektet ligger i kon­ takt med dekkglassets underside. Dette er på ingen måte en selvfølge. I mange prepa­ rater danner innleiringsmediet (kanadabalsam, «Eukitt», «Euparal» etc.) et lag av va­ rierende tykkelse mellom preparatoversiden og dekkglasset. Dette laget fungerer sam­ men med dekkglasset optisk som et svært tykt dekkglass. Resultatet er uklare bilder i mikroskopet. Slike preparater er mindre­ verdige og ganske uegnete til ordentlige mikroskopundersøkelser. Hvor alvorlig sfærisk avvik er, kan man lett overbevise seg om ved følgende eksperiment: Still inn preparatet med objektiv 10 x. Legg et rent objektglass oppå preparatet. Bildet kommer ut av fokus. Prøv nå å skarpstille. Vi ser at bildet som dannes er vesentlig dårligere.

Dekkglasstykkelse Når lyset passerer preparatets dekkglass, oppstår det såkalt sfærisk avvik (se side 36). Dette avviket kan man korrigere ved konstruksjonen av selve objektivet. De fles­ te mikroskopobjektiver av alle fabrikat er korrigert for en standardtykkelse på dekk­ glasset på 0.17 mm. Selv små avvik fra den­ ne tykkelsen gir uklare bilder med sterke tørrobjektiver. Oljeimmersjonsobjektiver er imidlertid lite følsomme for slike tykkelsesvariasjoner. Mer kostbare tørrobjektiver med apertur

over ca. 0.80 har ofte en korreksjonsring med skala som kan dreies inntil bildet blir skarpt. Prinsipielt skal alle preparater ha dekkglass. Bare svakt forstørrende objekti­ ver og noen sjeldne spesialobjektiver virker tilfredsstillende uten. Dekkglasstykkelsen kan enkelt måles med en mikrometerskrue før man lager pre­ paratet. I en vanlig eske er ca. 20-40% av glassene dårlige. Preparater for permanentgjøring (se side 199) bør også stå med messinglodd på under herdingen. Dette sikrer gode optiske forhold. Tabell 3 Toleranse for tykkelsesvariasjon i dekkglass

Apertur

Dekkglasstykkelse

0,40 0,60 0,75

0,17 + /- 0,09 0,17 +/- 0,013 0,17 +/- 0,004

Kromatisk avvik Det er imidlertid flere andre alvorlige linsefeil. Innen små områder på linseflaten bry­ tes lyset som i et mikroskopisk prisme. Rødt lys avbøyes minst, grønt og blått ster­ kere. Lys av ulik farge får derfor forskjellige brennpunkt, brennpunktet for rødt ligger lengst unna linsens sentrum (kromatisk lengdeabberasjon). De ulike brennpunkte­ ne langs den optiske aksen fører til ulik for­ størrelse avhengig av bølgelengden. Bildet fra blått lys er minst, det fra grønt lys noe større, mens det fra rødt lys er størst. Feno­ menet kalles for kromatisk forstørrelsesdifferens. At dette fører til uskarpe bilder, sier seg selv. Ulike glassorter bryter imidlertid lys for­ skjellig. Vi sier glassortene har ulik dispersjon. Flintglass bryter lyset sterkere enn kronglass. Ved matematiske beregninger kan man dermed konstruere et objektiv sammensatt av en kronglass- og en flint-

38

glasslinse som gir et nært akromatisk linsesystem (uten fargespredning). Linsen av kronglass slipes ofte bikonveks (sterk linse), mens flintglasslinsen er plankonkav (svak linse). For visuell betraktning er slik akro­ matisk optikk fullgod. En akromatisk linse er korrigert bare for deler av lysspekteret. Spesielt har svarthvitt fotografisk film annen spektralfølsomhet enn øyet. Svart-hvitt-fotografier avslører derfor linsefeil som ikke uten vide­ re erkjennes av øyet ved vanlig visuell be­ traktning. Ytelsen til akromatiske linser bør derfor forbedres ved bruk av egnet fargefilter. Et kraftig grønnfilter vil ofte forbedre kvaliteten (se side 63).

Astigmatisme Astigmatisme er en linsefeil som er vanske­ lig å korrigere. Punkter utenfor den optiske akse avbildes ikke som et punkt, men som et kors med to akser som ikke er i samme plan. Det trengs minst tre enkeltlinser for å avhjelpe feilen. Fotografiske objektiver med denne korreksjonen kalles anastigmater. Moderne mikroskopobjektiv er korrigert for astigmatisme. I ukorrigerte, ofte eldre objektiv, avslører astigmatismen seg ved at bildets skarphet avtar betydelig ut mot peri­ ferien av synsfeltet.

Bildefeltkrumning En enkeltlinse gir ikke et plant bilde. Gjen­ stander nær linsen avbildes lenger fra den enn gjenstander som er fjerne. Bildefeltet blir altså krumt. Så lenge vi ikke fotografe­ rer, kan vi lett lett kompensere for dette ved å dreie mikroskruen frem og tilbake slik at randpartiene også bringes i fokus. Bilde­ feltkrumningen kan oppheves ved kombi­ nasjon av ulike typer enkeltlinser. Opphe-

ver man bildefeltkrumningen, vil det lett oppstå astigmatisme.

Polarisasjonsforstyrrelser Ved herdingen av optisk glass og innfatning i objektiver kan det oppstå mekaniske spen­ ninger. Dette forstyrrer bruken av objekti­ vet til polarisasjonsoptiske undersøkelser (se side 73). Spesielt utvalgte enkeltlinser og særlig omtanke ved monteringen i objekti­ vet, har muliggjort fremstilling av såkalt spenningsfri optikk. Slik optikk er helt nødvendig til bruk i interferenskontrastmikroskopet (se side 55). Det fins en rekke andre optiske feil i tillegg til dem som er nevnt. Disse optiske feilene spiller en større rolle ved bruk av lysmikroskopet enn man vanligvis er oppmerkom på. Konstruksjon av godt korrigert mikroskopoptikk er følgelig meget vanskelig og involverer kompliserte matematiske beregningen Ofte må man avveie kryssende interesser idet det er nesten umulig å eliminere alle feil samtidig. De fleste kvalitetsobjektiver blir derfor konstruert for bestemte formål. Det kan være nødvendig å ha tilgang på flere ulike objektivtyper. Før i tiden var beregnings- og konstruksjonsarbei­ det oppgaver som kunne strekke seg over år. Med mo­ derne computere kan utregningene nå gjøres ferdig på få dager.

Objektivtyper De fleste firmaer leverer et stort antall ulike objektivtyper. (Figur 29) Til vanlig laboratoriebruk og orienterende undersøkelser kan man godt klare seg med rimelige, såkal­ te akromatiske objektiver. For fargefotografering og for studier på grensen av det optisk mulige, spesielt innen kromosomforskning, vil bruk av såkalte apokromater gi vesentlig bedre resultater. Disse er mye dyrere. I mange tilfeller er det behov for plant bildefelt (planobjektiver), eller for spesialteknikker som polarisasjonsmikro-

39

Figur 29 Klassiske konstruksjoner av ulike okular- og objektivtyper (se side 38-40 for detaljbeskrivelse). Optikken er gjennomskåret slik at arrangementet av de enkelte linselementene er synlig, (a) Huygensokular 15 x bestående av to linser (øyelinse øverst, kol lekt i vl i nse nederst). (B) Kompensasjonsokular 10 x der både øye-og kollektiv! i nse består av to sammen kittete linseelementerfor bedre korreksjon, (C) Planakromatisk objektiv 40/0.65, for dekkglasstykkelse 0.17 mm, (D) Apokromatisk objektiv 10/ 0.30, (E) Apokromatisk objektiv 40/0.95 korrigert for bruk uten dekkglass, (F) Apokromatisk oljeimmersjonsobjektiv 120/1.30, (G) Akromatisk objektiv 10/ 0.30, (H) Akromatisk objektiv 40/0.65 for dekkglass 0.17 mm tykke, (I) Akromatisk oljeimmersjonsobjektiv 90/0.80-1.25, forsynt med irisblende for variasjon av numerisk apertur ved mørkefeltsmikroskopi. (J) Planapokromatisk oljeimmersjonsobjektiv 100/1.32med 14 linseelementer med meget høy grad av optisk korreksjon. (Etter eldre E. Leitz GmbH, Wetzlar og Carl Zeiss GmbH, Jena kata­ loger).

40 skopi, interferenskontrast eller fasekontrast. Det fins spesialobjektiver som er til­ passet et eller flere av disse behovene.

Akromater Dette er ganske rimelige objektiver og dem man finner i vanlige skole- og laboratoriemikroskoper. De gir ganske skarpe bilder med god kontrast og middels bildefeltkrumning. Disse er korrigert for blått og rødt som har samme brennpunkt. De reste­ rende farvefeil fins i fiolett og gulgrønt (særlig tydelig ved skrått innfallende lys, sees som fargerender rundt strukturene i preparatet). Ved gjennomfallende lys og objektet såvidt ut av fokus ser man en svak fiolett tåke over fokusplanet og en gulgrønn under fokusplanet. Jo sterkere denne effek­ ten er, desto bedre er objektivet korrigert for rødt/blått. Hos noen merker er objekti­ vene korrigert for to av spekterets lyse far­ ger og fargefeil for rødt og blått beholdes. Akromater er rutineobjektiver som kan brukes for mikrofotografering. Gode bilder får man som nevnt bare ved bruk av et strengt grønnfilter. Planakromater har forbedret kromatisk korreksjon der bildefeltet er omlag flatt.

Fluoritobjektiver Disse linsene kalles også for neofluarer. I stedet for kronglass inneholder flere av dellinsene optisk flusspat. Kromatisk avvik er forbedret i forhold til akromatiske objekti­ ver. Fordi de inneholder forholdsvis få linseelementer, blir bildet kontrastrikt og svært klart. Man får da ikke korrigert bildefeltkrumningen. Fluoritobjektiver får høyere numerisk apertur enn akromater med samme brennvidde. De er spesielt godt egnet for fasekontrastundersøkelser.

(Plan) apokromater Den 7. juli 1886 demonstrerte professor Ernst Abbé en objektivtype der både kro­ matisk avvik og en rekke andre optiske feil var nærmest eliminert. Disse såkalte apo­ kromater er senere stadig blitt forbedret slik at de nå også gir et flatt bildefelt. De har i våre dager minimalt med indre reflekser. For å oppheve den kromatiske forstørrelsesdifferansen kreves spesielle okularer! (For Zeiss planapokromater, bruk alltid okularer merket KPL!). Disse objektivene representerer det yp­ perste innen moderne optikk og er derfor også meget kostbare.

Ultrafluarobjektiver Dette er spesialobjektiver som kun leveres av Zeiss. De er først og fremst beregnet for bruk i det ultrafiolette området av spekte­ ret. Lys helt ned til ca. 200 nm bølgelengde kan passere gjennom objektivet som har enkeltlinser av kvarts. Objektivene er kon­ struert slik at de kan fokuseres i synlig lys. Deretter kan man fotografere i det ultrafio­ lette området. På grunn av den korte bølge­ lengden for UV har de omlag den dobbelte oppløsningsevnen av vanlige mikroskopobjektiver. Alle optiske deler i mikroskopet må være av kvarts. I tillegg trengs en ultra­ fiolett lyskilde og en såkalt monokromator (også i kvarts) for å velge ut ønskete deler av spekteret for belysning. Instrumentomkostningene løper derfor meget lett opp i milli­ onklassen. For selvbygging av et «rimelig» instrument se s. 67.

Fluorescens- og UV-objektiver Dette er spesialobjektiver som hovedsakelig brukes til fluorescensmikroskopi. Objekti­ vene har ingen, eller meget svak egenfluorescens, men skiller seg ellers ikke så mye ut

41 fra vanlige akromatiske-, eller fluoritobjektiver. I mange eldre objektiver var det spe­ sielt linsekittet (blant annet kanadabalsam) som forårsaket kraftig egenfluorescens. Også enkelte glasstyper fluorescerte merk­ bart og gav en forstyrrende bakgrunn med kortbølget lys. E. Leitz, Wetzlar produserte en tid en del objektiver med et gulfarget sperrefilter montert fast foran frontlinsen. Disse objektivene fungerte bare med gjennomfallende eksitasjon. Vanlig glass slipper ikke igjennom strå­ ling med kortere bølgelengde enn ca. 300 nm. Såkalte UV-fluorescensobjektiver har bedret transmisjon for kortbølget lys. Disse må ikke forveksles med ekte objektiver i kvarts for UV-området som er beregnet for fotografering i ultrafiolett lys. Ekte kvartsobjektiver er ofte uegnet til fluorescensformål.

Luminarobjektiver for fotografering uten okular Dette er spesialobjektiver som passer til store forskningsmikroskoper. De er egnet for forstørrelser i området 2 x - 20 x og gir vesentlig bedre bilder enn med tilsvarende kameraobjektiv og belguttrekk. De gir også bedre resultater enn tilsvarende objektiv og okularkombinasjoner. Dette forstørrelsesområdet er optisk sett det mest problemati­ ske innen mikroskopien.

Såkalt positiv fasekontrast er det vanlig­ ste (strukturer med høy brytningsindeks blir mørkere enn omgivelsene). Negativ fa­ sekontrast gir den omvendte effekt. Det fins også objektiver med spesielt tykke faseplater for påvisning av meget små brytningsforskjeller i preparatene.

Pålysobjektiver I mikroskopet studerer vi vanligvis lysgjennomskinnelige preparater. I den dagligdag­ se verden ser vi stort sett det reflekterte lyset fra objektene. Med pålysobjektiver kan vi belyse preparatet ovenfra. For noen pålys­ objektiver er strålegangen for belysningen separat gjennom innebygde ringspeil. Det fins også pålysobjektiv der belysningen sendes ned gjennom det ordinære linsesystemet. (Figur 30) Overflaterefleksjoner, indre linserefleksjoner og liten dybdeskarphet for mikroskopoptikk gjør det vanskelig å oppnå til­ fredsstillende resultater med pålysobjekti­ ver. Enkelte er immersjonsobjektiver og disse medfører mindre problemer. De optis­ ke vanskene er størst for tørrobjektiver på omlag 80 x. Pålysobjektiver brukes ofte til studium av plane metallflater, plastflater eller andre jevne gjenstander. For biologiske objekter er teknikken lite utnyttet. Det eksisterer lo­ vende muligheter for studium av medisin­ ske og biologiske objekter.

Fasekontrastobj ektiver

UNNGÅ REFLEKSER VED PÅLYSMIKROSKOPI

Før eller siden vil man få bruk for et sett med fasekontrastobjektiver (se side 46). Denne objektivtypen har en innebygget fasering som man lett kan se med øyet når ob­ jektivet betraktes ovenfra. Det fins fase­ kontrastobjektiver både i akromatisk, fluorit- og apokomatisk kvalitet, til dels også som planobjektiver.

Mikroskopering i påfallende lys er vanske­ lig, spesielt når det gjelder biologiske og medisinske preparater. Det lyset som reflek­ teres fra blad- eller hudoverflaten, er ofte svakere enn refleksene fra indre linseflater i pålyskondensoren og/eller objektivet. Uklare, tilslørte bilder er resultatet. Løsningen er bruk av polarisert lys. I på-

42

Figur 30 Strålegang i pålyskondensor med objektiv utstyrt med speilkondensor. (A) ved vanlig lysfelt, (B) ved mørkefelt. I vanlig lysfelt kan det lett oppstå sjenerende reflekser fra preparatet. Med mørkefelt skiller man belysnings- og avbildningsstrålegangen. (1) Feste til mikroskopets tubus, (2) pålyskondensor, (4) feste for objektiv, (6) objektiv, (7) skyver med glassplater for lysfelt og mørkefelt, (8) sentreringsskrue, (9) lysfeltblende, (10) filterholder, (11) feste for aperturblende, (12) aperturblende, (13) samlelinse, (14) planglass- eller ringspeil, (15) mørkefelt - hulspeil.

lyskondensoren sendes lyset inn fra siden mot objektivet. Der reflekteres det ned mot preparatet ved hjelp av et speil (se Figur 30). Man må ha et varmefilter (eks. Jena BG 38 og KG 1), eller en liten kuvette med varmeabsorberende væske (sterk kobbersulfatløsning) foran lampen. Foran varmeabsorbsjonsfilteret plasserer man polarisasjonsfil-

teret. Det er en planglassilluminator («Becksches skråspeil») i pålyskondensoren. Foran objektivets frontlinse plasserer man en glimmerplate (eller en Å 1/4 folie). Glimmerplaten/folien må være av en optisk kva­ litet som ikke forstyrrer bildet. Lyset må nå passere gjennom glimmerplaten to ganger. Dels går det ned mot objektet, dels passerer

43

det reflekterte lyset platen på vei opp igjen. Det passerer speilet og fortsetter opp mot okularet. Her sitter analysator. Det lys som reflekteres fra linsene, har imidlertid sin opprinnelige svingningsretning og kan nå ikke passere analysator og ut av okularet. Glimmerplaten skal være orientert 45° i forhold til polarisasjonsfilterets svingningsplan.

andre for rensing). Feltlinsen har størst dia­ meter. I brennplanet for øyelinsen fins synsfeltblenden. (Her kan man plassere okularmikrometeret). I mikroskopet skal man betrakte bildet med uakkomodert øye. Øyet skal være inn­ stilt på «uendelig» avstand. Det innbilte mikroskopbildet man ser er egentlig «uen­ delig stort og fjernt». I praksis derimot de­ finerer man at bildet ligger i 25 cm (250 mm) tydelig synsvidde fra øyet. Okularets forstørrelse finnes derfor av formelen: 250 B

Okularer Okularene er av langt enklere konstruksjon enn objektivene. De fungerer som en lupe som man bruker til å betrakte det reelle mellombildet i mikroskopet. Okularsystemet må bygges av to linser av optiske grun­ ner hvis synsfeltet skal bli stort nok. En en­ kelt samlelinse kan nok fungere som lupe og øke synsvinkelen, men mellombildet den forstørrer opp får optiske feil. Et énlinset okular er upraktisk ved bruk av objektiver med korte brennvidder. Vi ser ikke bildet ordentlig uten å stå i stor avstand fra okularlinsen. De to okularlinsene skal stå i en bestemt avstand fra hverandre. Denne avstanden er beregnet slik at fargespredningen akkurat oppheves. Linsen som vender nærmest ob­ jektivet, kalles for okularets feltlinse eller kollektivlinse, den andre, som er nærmest øyet, kalles for øyelinsen. Denne relativt enkle okulartypen repre­ senterer et såkalt Huygensokular. Slike okularer gir fine og skarpe bilder i midten av synsfeltet. Ut mot randen blir bildet merkbart dårligere. Huygensokularer er ri­ melige i pris og egner seg til rutinebruk. Både øye- og feltlinse er nær plankonvekse linser. Linsen skal være vendt slik at den konvekse siden vender ned mot objektivet (husk dette dersom okularet tas fra hver­

Har okularet brennvidden 25 mm, så blir altså egenforstørrelsen 250/25 = 10 x. Brennpunktet for Huygensokularer lig­ ger inne i selve linsesystemet. Slike okular kan ikke brukes som lupe for å studere gjen­ stander utenom mikroskopet. Huygens­ okular passer best for svakt forstørrende objektiver (inntil 40 x).

Kompensasjonsokularer Dette er bedre okularer som er korrigerte for diverse rester av linsefeil. Både øyelinse og synsfeltlinse kan være satt sammen av flere linser. Kompensasjonsokularer skal brukes sammen med apokromatiske objek­ tiver.

Planokularer Dette er spesialokularer som har forbedret optisk kvalitet, spesielt når det gjelder bil­ dets skarphet mot randen av synsfeltet. Sammen med såkalte planobjektiver får man et flatt bildefelt som er helt skarpt mot randen. Vidvinkelokularer og periplanokularer gir også plane bildefelt og har delvis overlappende optiske egenkaper.

44 PROJEKSJONSOKULARER OG FOTOOKULARER

Det fins spesielle okularer for fotografering og projeksjon. En del fabrikker lager ikke lenger slike okularer idet det hevdes at van­ lige serieproduserte okularer er gode nok. Spesielt fotookularer av eldre type (som ble fremstilt av Leitz og Zeiss) kan være meget nyttige for mikrofotografering. De er såkal­ te ortoskopiske, beregnet for projeksjon av bildet og kan ikke brukes til å se mikroskopbildet med. De kan innstilles på arbeidsavstanden til filmplanet ved å dreie øyelinsen. En liten gradert skala angir avstanden. Brukt med de tilhørende objektiver er bildefeltkrumningen stort sett opphevet. Til bruk for projeksjon av mikroskopbildet til 16 mm filmkamera og til formatet for CCD-brikker i videokamera fremstilles spesialokularer med egenforstørrelsen 1 x.

MERK: Det er viktig å bruke korrekte oku­ larer til de objektivtypene man disponerer. Mikroskopfabrikkene og forhandlerne dis­ ponerer brosjyrer og instruksjonsbøker som gir opplysninger om dette. De fleste mikroskopobjektiver krever en bestemt type okular. Feil kombinasjon gir redusert bildekvalitet. Bland ikke objektiver og okularer av ulike fabrikat.

Figur 31 Bilde av objektmikrometer (bredt gradert skala) slik det sees i et mikroskop med okular som er utstyrt med okularmikrometer (smalt gradert skala). I dette eksemplet faller 70 delestreker på okularmikrometeret nøyaktig sammen med 40 de­ lestreker på objektmikrometeret. Avstanden mel­ lom de to nærmeste strekene på objektmikromete­ ret er 10 /im. Når vi måler, lar vi okularmikrometeret sitte i mikroskopet. Med samme optikk vil avstan­ den mellom to okularmikrometerstreker være 400/70 = 5.714 Mm.

Måle- og telleokular Som nevnt kan man legge inn en liten glassskive med mikrometerskala på synsfeltblenden i Huygensokularet (se Fig. 31). Fi­ nere måleokularer har justerbar avstand mellom synsfeltblenden og øyelinsen slik at skalaen sees skarpt. Riktig dyre måleokular er forsynt med en mikrometerskrue med nonieskala for presisjonsmålinger.

HVORDAN SKILLE HUYGENSOKULARER FRA KOMPENSASJONSOKULARER?

Hold okularet mot lyset. Kikk i øyelinsen og se på randen av synsfeltblenden. Har randen blålig farge, dreier det seg om et Huygensokular. Er den orangegul eller rød­ lig, er det sannsynligvis et kompensasjonsokular.

45

Kondensorsystemet Mikroskopets kondensor samler lyset i preparatplanet. Innstiller vi etter Kohlers prin­ sipp, avbilder kondensor det jevnt belyste planet avgrenset av mikroskopets feltblende nøyaktig i høyde med preparatet. De enkleste kondensortypene som bru­ kes for lysfeltmikroskopi består av bare to linser. Systemet minner mye om et omvendt mikroskopobjektiv. Snur vi objektivet opp ned, fungerer det som en ypperlig og godt korrigert kondensor. Eldre mikroskop had­ de en fatning som ble montert i kondensorfestet til bruk for objektiv som kondensor. Den øvre linsen i en vanlig kondensor, topplinsen, er ofte plan på utsiden, mens undersiden er meget sterkt krummet. Den minner sterkt om en forstørret utgave av mikroskopets frontlinse. Topplinsen kan ofte skrues av. Dermed får man en enlinset kondensor med lavere apertur. Festet for kondensor er oftest regulerbart i høyden med en skrue og en tannstangmekanisme. Dyrere kondenserer kan også sentreres slik at de står presist i den optiske aksen for mikroskopet. En vanlig kondensor er ikke korrigert for kromatisk avvik, den er heller ikke aplanatisk (korrigert for sfærisk avvik). For vanli­ ge kondensorsystemer er aperturen ofte ikke over 1.0, og for mange formål er 0.9 til­ strekkelig. Man får ikke utnyttet linsesystemets yte­ evne dersom kondensor har lavere apertur enn objektivet. Dette betyr at immersjonsobjektivet (som ofte har en apertur på ca. 1.30) krever en kondensor med samme apertur. Aperturen er inngravert på topp­ linsen i kondensor. Med luft imellom preparatglassets underside og kondensors topplinse, blir belysningsaperturen maksi­ malt 1.0. Dette er noe lavt. For høyoppløsningsstudier skal det derfor anbringes immersjonsolje (nd 1.515) mellom kondensor-

topplinsen og preparatets underside. Dette fører i praksis til mye søl og ubehag under mikroskoperingen. Et alternativ er å bruke vann (nd 1.34).

Mørkefeltkondensor Dersom vi avblender de sentrale strålene i belysningsstrålegangen, vil bare perifere stråler belyse preparatet. Kommer de inn fra siden under stor nok vinkel, kan det hende at den direkte strålingen ikke opp­ fanges av objektivet. Bare reflektert lys fra preparatet passerer opp gjennom linsesystemet. Preparatet fremtrer med «selvlysen­ de» kanter mot en mørk bakgrunn. Indre deler av cellene er bare synlige i randpartier (membraner). Det er oppstått et såkalt mørkefelt. For svakere forstørrende objektiver, opp­ til ca. 40 x, kan man oppnå mørkefeltbelysning på ganske enkel måte. I filterholderen legges en liten mynt sentralt. Den ligger best oppå et gjennomsiktig mikroskopfilter. Diameteren på mynten må utprøves. Den skal være akkurat så stor at det direkte lyset blir sperret. Som nevnt er det først og fremst randpar­ tier som blir opplyst. De indre strukturene forblir usynlige, eller fortegnet. Med mørkefeltbelysning kan man også påvise par­ tikler som er ca. 3 x mindre enn de minste synlige ved vanlig lysmikroskopi (det vil si ned til ca. 0,006 gm). Det kreves enormt kraftig lys. For mer kritisk bruk er det utviklet egne mørkefeltkondensorer (Fig. 32). Vanlig fasekontrastkondensor har en innstilling (D) med egen blende for mørkefelt opptil 40 x objektiv. De avanserte mørkefeltkondensorene benytter buete speil i linsesystemet. Det kan oppnåes høy apertur. Dersom aperturen er over 1,0, må det alltid brukes immersjonsolje. Maksimal apertur for en mørkefeltkondensor er omlag 1,33.

46

Mørkefeltkondensor er vanskelig å inn­ stille og sentrere (se Figur 33 og 34). Hvis objektivets apertur er større enn den hos mørkefeltkondensoren, virker ikke systemet. Objektivets apertur må da nedblendes. Dette kan skje ved at objektivet blir utstyrt med en egen irisblende, eller ved en spesiell rørformet blende som stikkes inn i objektivet.

Fasekontrastkondensor Selve fasekontrastsystemet er gjennomgått på side 51. Den vanligste fasekontrastkondensoren (konstruert etter Zernike) kjennes igjen på en dreibar skive med ulike faseplater (Figur 35) som en ad gangen kan bringes inn i den optiske aksen. En faseplate svarer til et bestemt objektiv. I tillegg fins det en innstilling for vanlig lysfelt med tilhørende irisblende. Det fins også en innstilling for mørkefelt ved lave forstørrelser. Kondensor for varia­ bel fasekontrast har lett gjennomskinnelige Figur 32 Strålegangen i en mørkefeltskondensor. Øverst sees en immersjonskondensor, nederst en tørrkondensor. Strålene treffer reflekterende, bue­ te overflater som sender skrått lys inn mot prepara­ tet. Ikke noe direkte lys når objektivet. Fra E. Leitz, GmbH, Wetzlar.

Figur 33 Skjema som viser sentrering av mørke­ feltskondensor. Den ringformete, sentrale lysflek­ ken (direkte lys) bringes til sentrum ved hjelp av sentreringsskruene (b). Kondensorhøyden varie­ res til lysflekken blir minst mulig (c) og ( mest in­ tens). I en viss høyde er det direkte lyset helt borte. Bare bøyd lys (av 1. og 2. orden ) når inn i objektivet (Figur 34).

Figur 34 Strålegang i mørkefeltkondensor. Direk­ te lys (0-te orden) passerer utenfor objektivet.

47

faseringer som er polarisasjonsfiltre. Med et dreibart polarisasjonsfilter over feltblenden kan man variere graden av faseplatens virkning i strålegangen. Fasekontrastkondensor etter Heine ble

for en tid produsert av Leitz og gav variable muligheter for overgang mellom lysfelt, fasekontrast og mørkefelt.

Interferenskontrastkondensor etter Nomarski (DIK) Den vanligste typen har såkalt Nomarski system (DIK). Den likner til forveksling på en fasekontrastkondensor. Noen typer har plater både for fasekontrast- og interferenskontrast. Denne kondensortypen er svært kostbar. I stedet for faseplaten fins det for hvert objektiv et såkalt Wollaston prisme. Foran prismet er det en egen irisblende. Sel­ ve linsesystemet i kondensor og mikrosko­ pet forøvrig må være spenningsfritt. Dette oppnåes gjerne lettest i planakromater. Ofte er kondensors topplinse merket«pol» eller liknende.

Kondensor for polarisert lys Det fins egne spenningsfrie kondensortyper for bruk i polarisert lys. En vanlig mikroskopkondensor kan brukes til enkle polarisasjonsstudier, men ikke til målinger og svakt dobbeltbrytende objekter. Slike kon­ denserer er spesielt merket «pol» etc.

Kollektor Figur 35 Prinsippet for fasekontrastmikroskopi. Ringblenden (RB) sitter i en dreibar skive under kondensor (Kd). Lys passerer gjennom blenden opp mot objektet (Ob). Mikroskopobjektivet er for­ synt med en faseplate som samvirker på ringblen­ den på en slik måte at faseforskjeller som oppstår i objektet grunnet forskjeller i brytningsindeks blir omsatt til forskjeller i amplitude. Den ringformete faseplaten i objektivet er pådampet lysabsorberende og faseretarderende materiale. Avhengig av hvordan faseplaten er konstruert kan strukturer med høy brytningsindeks enten avbildes lysere el­ ler mørkere enn omgivelsene.

Linsesystemet foran mikroskoplampen kal­ les for kollektor. Det består av en eller flere linser som skal sørge for en parallell eller svakt fokusert strålebunt inn i mikrosko­ pets kondensor. Den ene linsen i kollektor kan være etset matt på en flate for å gi jev­ nere belysning (viske ut bildet av glødetråden i lampen ). I enkle mikroskoper kan kollektor være av dårlig kvalitet, noe som gir ujevnt belyst bildefelt med optiske for­ styrrelser. Foran kollektor skal det sitte en

48

irisblende av god kvalitet. Denne blir opp­ varmet av lampen ved bruk og bør av og til smøres med litt fin maskinolje. Ellers kan blendelamellene sette seg fast i hverandre og ødelegges.

Mikroskopbelysningen Eldre mikroskop forsynt med speil under kondensor kan brukes med dagslys som lys­ kilde. Det er best å stille speilet inn på over­ skyet himmel. Direkte sollys må under in­ gen omstendighet komme inn i mikrosko­ pet. Skyfri, blå himmel egner seg heller ikke. Er belysningen ujevn, kan dette av­ hjelpes ved å legge et mattfilter inn i filterholderen for kondensor. For mikroskopering i felt er det ofte nødvendig å benytte dagslys.

Glødelampe for nettspenning Lys fra en alminnelig matt pære 40-60 W kan brukes. Det er viktig at lyset ikke blen­ der. Primitive mikroskoplamper kan lages på denne måten. En naturlig fargegjengivelse får man ved å legge et svakt blåfar­ get filter i filterholderen. Glødelamper for nettspenning gir for svakt lys til mer avan­ serte mikroskopiske teknikker. Dette skyl­ des at glødetråden er fordelt over en for stor flate, en punktformet lyskilde gir bedre ut­ nyttelse av lyset i mikroskopet.

Lavvoltlamper Disse opererer med lav spenning 6-12 V, av­ hengig av type. Glødetråden kan vikles tet­ tere og dekker en 2-4 mm2 flate. Lavvoltlampene forsynes med spenning fra en spesiell transformator. Lysutbyttet ca. 1000-3000 stilb. Enklere transformatorer

har faste utgangsspenninger, man kan velge mellom ulike verdier (2.5, 3.5, 4.5, 6 og 8V). Bedre transformatorer har kontinuerlig regulerbar utgangsspenning og er forsynt med ampere- eller voltmeter. For mindre, enklere mikroskoper holder det med en 15 W lavvoltlampe. Større laboratorie - og forskningsmikroskoper trenger lavvoltlampe på 60 W eller 100 W. I halogenlamper kan glødetråden vikles ennå tettere. Inni lampene er det joddamp, og de tåler forhøyet spenning uten at glø­ detråden brenner over. Dette øker lysutbyt­ tet til omlag det dobbelte. Metall som for­ damper fra glødetråden, forbinder seg med joddamp. Der glødetråden blir tynnest, øker temperaturen og nytt metall bygges opp fra metall-halogendampen i dette om­ rådet. Dette øker levetiden betraktelig for filamentet. Halogenlamper har kolbe av kvarts. De må ikke berøres med fingrene. Svette eller fettstoffer vil brenne seg inn i kvartsglasset, og pæren ødelegges etter kort tid. De skal holdes i den medfølgende hyl­ sen ved montering. Halogenlampene får en svært høy temperatur. Eldre mikroskop­ lamper for vanlige lavvoltspærer kan lett bygges om til halogenlamper, men det kre­ ver økt lufttilførsel (flere luftehull må borres). Eventuelle plastdeler i nærheten kan smelte. Det kan representere en brannfare. Halogenlamper gir tilstrekkelig intenst lys for enkle fluorescensundersøkelser.

Kullbuelampe Dette var lamper som gav meget høyt lystetthet (16 000 stilb) og på mange måter var fordelaktige til mikroskopiske spesialun­ dersøkelser. Dessverre er lampene praktisk talt ikke lenger i produksjon på grunn av dannelse av nitrøse gasser og ozon. Dette krevde at luften som passerte lampen måtte ledes bort i et eget avsug. Kullbuelamper kan muligens fremdeles skaffes fra det opti-

49 ske firmaet Spindler og Hoyer, Gottingen, Tyskland. Kullbuelampen kan drives enten med vekselstrøm eller likestrøm. Fordi elektrodene forbrenner, må de være forsynt med en egen fremdriftsmekanisme. Kull­ buelampen er velegnet til formål som mikroprojeksjon av preparater på lerret til forelesnings- og foredragsformål. Den sen­ der ut kraftig UV- og IR-stråling.

Gassutladningslamper Det fins en rekke typer til ulike formål. Kvikksølvdamplampen består av to elek­ troder smeltet inn i en kvartskolbe. Foruten de to elektrodene for lysbuen kan det fins en ekstra tennelektrode (Fig. 36). Ved å set­ te høyspenning (10 000 V eller mer) på tennelektroden kan man få metallet til å for­ dampe slik at det oppstår en lysbue mellom de to ordinære elektrodene. Dermed bygges det opp et meget høyt indre trykk i lampen samtidig som lysbuens intensitet stiger enormt. Dette tar 2-3 minutter. Høytrykkslampene har utpreget linjespektfum (254 nm, 365 nm, 405 nm etc.) som er nær dis­ kontinuerlig mellom resonanslinjene for kvikksølvdamp. De egner seg derfor ikke for vanlig mikroskopi. Med egnete filtre kan man velge ut spesielle spektrallinjer for bruk i fluorescensmikroskopi. Kvikksølvlampene er risikable i bruk. De eksploderer med sikkerhet dersom man slår av en varm lampe og raskt forsøker å tenne den igjen. Resultatet kan blant annet være ødelagte kollektorlinser etc., og en repara­ sjon på noen tusen kroner. Lampehuset for kvikksølvlamper er spesielt solid, og kon­ struert for å kunne motstå slike eksplosjo­ ner uten at brukeren skades. Når lampen har vært brukt en tid, blir det et mørkt metallbelegg på innsiden av kvartsglasset. Dette fører til at temperaturen i utladningslampen stiger dramatisk, noe som over tid gjør at den eksploderer. Kvikksølvdamp-

Figur 36 Eksempel på spesiallampe for mikrosko­ pi (kvikksølvhøytrykkslampe). To hovedelektroder og en sideelektrode er innesluttet i en liten kolbe av kvartsglass. I kolben fins en liten rest kvikksølv. Lampen tennes ved først å sette en kort puls med høyspenning mellom bunnelektrode og sideelek­ trode. Sideelektroden kan mangle.

lamper av høytrykkstypen skal ikke brukes mer enn ca. 200 timer til sammen. Lyset er meget intenst (ca. 100 000 stilb eller mer). Sikker driftstid er angitt på pakken. Lam­ pen kastes selv om den tilsynelatende fort­ satt er i god orden og til tross for den høye prisen. Superhøytrykkskvikksølvdamplampen har indre trykk på 100-130 at­ mosfærer og vesentlig økt lysutbytte. I lø­ pet av 1993 vil det komme i handelen nyut-

50

viklete utladningslamper for bilbruk i stedetfor de vanlige halogenlampene som brukes nå. Disse lampene har meget lang le­ vetid. De vil med sikkerhet få innpass i mikroskopien og kan være vel verd å prøve ut, spesielt for fluorescensformål, ettersom lysutbyttet er 2-3 doblet i forhold til halogenlamper med samme watteffekt. Kvikksølvlavtrykkslamper har nesten utelukkende emisjon i bølgeområdet 254 nm. Direkte lys fra denne lampen, såvel som fra høytrykkslampen, skader øynene ved direkte betraktning og kan føre til mid­ lertidig synstap. Spektrallamper fins i en rekke utgaver og er konstruert for å emittere en smal del av det elektromagnetiske (synlige) spekteret. Xenonlampen har høyt indre trykk også i kald tilstand. Den gir et kontinuerlig spektrum og meget høy lysintensitet. Xe­ nonlampen er å foretrekke dersom man ønsker høyt lysutbytte og den allsidighet vanlig glødelampe har. Lystettheten er fra ca. 23 000 stilb til 55 000 stilb. Ved uforsik­ tig behandling kan xenonlampen også eksplodere i kald tilstand. Den må kun skif­ tes ut når man benytter solide beskyttelsesbriller og egne, tykke, skinnbeskyttete han­ sker (se det medfølgende instruksjons­ heftet). Med unntak av kvikksølvlavtrykkslampen må alle lampene som nevnt i dette ka­ pitlet ha spesielle strømforsyningsenheter. Noen krever også likeretter og spenningsstabilisator. Dette er ofte meget kostbart utstyr.

Synliggjøring av preparatstrukturer Biologiske og medisinske objekter har i seg selv liten kontrast i lysmikroskopet. Ved sterkt nedblending kan man riktignok se cellekjernen, kromosomer, cellevegger og cytoplasmapartikler. Tidligere var man i høy grad henvist til å måtte fiksere og farge materialet. I 1932 beskrev sveitseren Fritz Zernike teorien for fasekontrastmikroskopet som kom i praktisk bruk ca. 10 år sene­ re. Det ble nå mulig å studere ytterst fine detaljer i levende celler der forskjeller i lysbrytning (som fører til endring i lysbølgenes fasetilstand) omsettes optisk til for­ skjeller i amplitude ved hjelp av spesialkon­ struerte blendere i objektiv og kondensor. Forbedringer i prepareringsteknikk med muligheter for fremstilling av mikrotomsnitt under 1 gm tykkelse (se side 141) repre­ senterer nær ideelle optiske forhold for denne observasjonsmetode. Alle «kanter» i preparatet, grenseområder der det eksiste­ rer lysbrytningsforskjeller, er imidlertid omgitt av en såkalt «halo» - en sjenerende lysende grenselinje som forstyrret observa­ sjonen. Halovirkningen øker med prepara­ tets tykkelse og over 4-5 gm tykke prepara­ ter egner seg ikke for fasekontrast. I senere år er derfor en annen teknikk, såkalt interferenskontrast, kommet i allmenn bruk. Det vanligste interferenskontrastsystemet er DIK (differensial interferenskontrast et­ ter Normarski) som er basert på bruk av polarisert lys. Grenseområdene i preparatet fremtrer her i relieff slik at hele preparatet får en slags tredimensjonal karakter. DIKsystemet er egnet også for forholdsvis tykke preparater, dybdeskarpheten er meget be­ grenset, og det er mulig å lage «optiske» snitt gjennom ganske tykke preparater. Mens fasekontrastoptikk er forholdsvis ri­ melig er DIK betydelig dyrere og ligger utenfor rekkevidden for de fleste amatører.

51

Fasekontrastmikroskopet Til fasekontrastmikroskopet trenger man minst 3 spesialobjektiver (Ph 10 x, Ph 40 x og Ph 100 x oel.), en såkalt innstillingskikkert og en spesialkondensor. I avanserte forskningsmikroskop kan fasekontrastsystemet være innebygd. I kondenseren sitter en skive med ringformete blendere som kan dreies inn i strålegangen, én for én. Det er en bestemt blende som tilhører et bestemt objektiv. Blenden består som regel av en glasskive med et metallag som er dampet på på slik at det fremkommer et ringformet, metallfritt område (Fig. 35). Tilsvarende faseplate i objektivet er delvis gjennom­ skinnelig og består av en nedfelt, pådampet ring. Kondensor må sentreres svært presist i forhold til objektivet. Dette utføres for hver enkeltblende med to sentreringsskruer som dels kan settes inn i kondensor, dels være innebygget i selve kondensoren. Til sentreringen benytter vi oss av innstillingskikkerten som er slik konstruert at man kan se begge blendere på en gang. Innstillingskikkerten settes på okularets plass under sentreringen og erstattes med okularet et­ terpå. Har man først fått sentrert systemet, er det sjelden det må justeres om igjen. Rin­ gen i objektivblenden skal nøyaktig dekke det metallfrie området i kondensorblenden. Bruken er forholdsvis enkel. Det er som re­ gel angitt på kondensor hvilken blende som skal plasseres i strålegangen for hvert ob­ jektiv. Squashpreparater (se side 132) som ikke er for tykke kan gi utmerkete bilder, det samme gjør levende cellekulturer. Pre­ parater som det ikke er lykkes å farge til­ fredsstillende kan ofte med fordel undersø­ kes i fasekontrast. Fasekontrastmikroskopets virkemåte er komplisert. Fig. 37-38 forklarer strålegan­ gen og hva som skjer ved faseforskyvningen av lysbølgene. Vi skiller mellom amplitudeobjekter og faseobjekter:

AMPLITUDEOBJEKTER

Lys som har passert utenfor en liten struk­ tur i mikroskopet har amplituden (A) og er direkte lys av 0-.orden. Det utgjør det ve­ sentligste av belysningen. Litt av dette lyset faller på objektet. Objektet absorberer lys uten å forandre fasen. Det gjennomfallende lyset får altså en mindre amplitude (B). Ifølge Abbés teori oppstår mikroskopbildet ved interferens mellom direkte og avbøyet lys. Hvis alt avbøyd lys fører til avbildning, blir bildet objekttro. Bølgetogene i mellombildeplanet tilsvarer amplitudeforholdene og fasetilstanden i objektplanet. Det avbøyde lyset kan konstrueres punkt for punkt på «sinuskurven». Yb = Ya + Yc dvs. Yc = Yb - Ya Bøyningslyset representeres av bildet - lys av O.-orden. Det avbøyde lyset blir, som vi ser 180° faseforskjøvet i forhold til direkte lys.

FASEOBJEKT I LYSFELT

Et lite gjennomsiktig objekt er optisk tette­ re enn omgivelsene (lyskurve B). Bøynings­ lyset får ikke forandret amplituden av dette objekter. Det absorberer ikke lys, men har høyere brytningsindeks. I stedet skjer en faseforskyvning i forhold til lyset som passe­ rer omgivelsene. Det direkte lyset (kurve A) går utenom objekteL Også her kan vi kon­ struere bølgetoget for bildet av objektet (kurve C). Vi ser at det avbøyde lyset (kurve C) er 90° faseforskjøvet i forhold til det di­ rekte lyset (kurve B).

FASEOBJEKT I FASEKONTRAST

Forskyver man fasen for det direkte lyset 90° til høyre, får vi kurver som i nederste bilde. Også her dannes bildet av objektet (kurve C) ved interferens av (A) og (B). Vi

52 får i samme situasjon som tilfellet med amplitudeobjekter. Faseforskyvningen av det direkte lyset 90° fører til et synlig amplitudeobjekt. Kontrasten øker om man svekker ytterligere det direkte lyset. Amplitudebildet oppstår med høy kon­ trast mot lys bakgrunn. Mange har problemer med å få et tilfreds­ stillende fasekontrastbilde. Følgende ar­ beidsprogram kan være til hjelp:

(1) Still mikroskopet inn som for vanlig lys­ felt. Blendeskiven i kondensor skal være i «normalposisjon», det skal ikke være noen faseblende sjaltet inn i strålegangen. De forskjellige posisjonene er markert med symboler på blenderingen (H, J eller O). (2) Pass på at kondensor er sentrert som for Kohler. Den optiske aksen må være rett. Kondensor skal stå i høyeste posisjon, øverst mot preparatet.

(3) Det objektivet man ønsker å benytte har inngravert på fatningen et symbol eller tall som tilsvarer en bestemt markering på kon­ densor blenderingen. Objektivet kan for

Figur 37 Strålegangen for et faseobjekt. Nederst på figuren : Lyset kommer inn i kondensor som en hul kjegle fra den ringformete blenden under kon­ densor. Objektet fører til lysdiffraksjon. Et faseob­ jekt forflytter fasen A f = 90° sammenliknet med en utenforliggende stråle. I et amplitudeobjekt er Af = 180°. Faseringen som befinnerseg i fokalplanet til objektivet tillater belysningsbunten å kom­ me 90° på forskudd, samtidig som at amplituden blir redusert. Diffraksjonslyset sprees ut over hele fokalplanet, det er i praksis ikke påvirket av fase­ ringen. På samme måte som for amplitudeobjekter vil belysende stråler og diffraksjonsstråler samvir­ ke i mellombildeplanet og danne det mikroskopi­ ske bilde. A f - 180°. Det har nå samme verdi som et amplitudeobjekt. E. Leitz, GmbH, Wetzlar.

53 eksempel være markert med symbolet Ph2, Phl eller Ph3. Innstill blenderingen i kon­ densor på dette symbolet.

Amplitude object

(4) Hvis faseblenden var sentrert korrekt vil bildet nå forandre seg. Preparatet fremtrer på en lys grå bakgrunn og cellestrukturene viser ulike grader av grå til helt svarte toner. Hvis fasekontrastbildet er «flaut» eller kontrastløst, er blenden ikke riktig sentrert.

(5) Ta forsiktig ut preparatet (hvis objekti­ vet svinges ut, sving det tilbake i posisjon). Ta ut det ene okularet. Sett innstillingskikkerten og juster den til begge faseblendene sees skarpt, den i objektivet og den i kon­ densor. Drei forsiktig på de to justeringsskruene for kondensors faseblende. På noen kondensorer er dette vanskelig å få til ordentlig. Blenden forskyves langs to skråttstilte, uli­ ke akser. Prøv å få kondensorblenden til presist å dekke det lyse området i objektivblenden. Man merker dette straks på at ly­ set gjennom mikroskopet blir mye svakere. Erstatt innstillingskikkerten med okularet. Nå burde systemet være bra. En slik juste­ ring kan være nødvendig første gang for alle tre objektiver.

phase object in brightfield

phase object in phase contrast

27788 - 512 R

Figur 38 Forskjell mellom amplitudeobjekt (øverst), et faseobjekt (i midten) begge i gjennomfallende lys, og et faseobjekt i fasekontrast (nederst). For amplitudeobjektet (øverste kurve) oppstår bildet ved summen av direkte lys (Ya) og avbøyd lys (Yc) (innsatt bilde med svart bakgrunn, ny lysbølge er B). Lys gjennom faseobjektet i midten fører til faseforskyvning i forhold til direkte lys. Forskyver vi det direkte lyset Vi bølgelengde (nederste kurver) fører faseforskyvningen til amplitudeendring når kurvene summeres (innsatt bilde med svart bak­ grunn). Den nye lysbølgen er B.

Enkelte har vanskeligheter med å bruke inn­ stillingskikkerten. Fokus på denne er justerbar. Man må endre fokus til man ser beg­ ge blendere knivskarpt. Hvis bildet er helt mørkt (svart): Kondensors aperturblende skal være helt åpen, den har ingen optisk funksjon i fasekontrastmikroskopet.

Mørkefelt (dunkelfelt) mikroskopi Dette er den eldste optiske kontrasteringsteknikk som beror på at lyset sendes under så stor vinkel mot preparatet at bare avbøyd (ikke direkte) lys passerer videre gjennom

54

objektivet (se s. 46 for detaljer). For svakere forstørrende objektiver (10 x - ca. 40 x) kan man lett oppnå mørkefelteffekter ved å plassere en liten mynt, eller en sirkulær pappskive sentrert i filterholderen på en vanlig kondensor. Man må prøve seg frem hvor stor diameteren skal være for optimal resultat. Mørkefelt krever forholdsvis mye lys. Mange fasekontrastkondensorer har en slik enkel mørkefeltblende som kan brukes til enklere undersøkelser. Objektene sees nå mot kullsvart bakgrunn, cellemembraner lyser opp, mens indre strukturer stort sett forblir mørklagt. Mørkefeltkondensorer er ypperlig for studium av levende bakterier, små partikler, cilier og flageller på protozooer etc. Partikler også mindre enn mik­ roskopets oppløsningsevne er fullt ut synli­ ge hvis lyset er kraftig nok, men ikke deres struktur, de fremtrer som små såkalte «diffraksjonsskiver». Partikler med en lang og en kort akse (nåleformete krystaller) kan identifiseres ved at de sees som blinkende punkter. Med ekstremt kraftig lyskilde kan man identifisere partikler ned til ca. 0,01 /zm («ultramikroskop»). Bedre mørkefelt får man med spesialkondensor. For objektiver opp til ca. 60 x bru­ ker man en tørrkondensor. For immersjonsobjektivet må man ha en speilkondensor med indre apertur ca. 1,20. Denne er kost­ bar. Bruken av immersjons mørkefeltkon­ densor er vanskelig, og man må være nøy­ aktig. Objektglass og dekkglass må være helt rene. De må ikke pusses eller vaskes på vanlig måte. Det er best å bruke en liten holder og va­ ske dem i en vanlig husholdningsoppvaskmaskin og oppbevare dem under destillert vann. Sett dem på høykant, støvfritt, og la dem lufttørre rett før bruk. Gjør man ikke dette, kommer det frem fine lysende flek­ ker, striper, risser og streker som helt øde­ legger bildet. Drypp på celler eller partik­ ler, legg på dekkglass. Ha olje på toppen av mørkefeltkondensor (hvis immersjonslinse

skal brukes). I immersjonsobjektivet skal det plasseres en spesialblende som reduse­ rer aperturen ned til ca. 1.10. Blenden ser ut som et rør. Det fins også spesialobjektiver med irisblende. Sett preparatet i mikrosko­ pet og hev kondensor så det er oljekontakt mellom kondensortopplinsen og prepara­ tets underside. Man kan først bruke et svakt tørrobjektiv. Oftest er det nok lys tilstede til å fokusere på strukturer i preparatet. Hev og senk forsiktig kondensor slik at man ser en lysende «flekk» skarpt. Nå er kondensor i riktig høyde. Sentrer nå kondensor ved å skru på sentreringsskruene slik at flekken står i sentrum av bildefeltet. Ha olje på dekkglasset. Sving inn immersjonsobjekti­ vet. Hev og senk kondensor forsiktig (!) til bildet blir lysest mulig. En svak ettersentrering kan være nødvendig. Det kan komme luftbobler i oljen på kondensor, noe som ødelegger mørkefeltet. Tørk oljen av og ha på nytt. Ved bruk av så­ kalte «Rheinberg» filtre kan man farge op­ tisk mørkefeltpreparater i to kontrastfarger, én for bakgrunnen og en for selve objektet. I overgangssoner kan det oppstå mellomfarger. Denne teknikken har mer estetisk verdi enn vitenskapelig og benyttes ofte i fotokonkurranser og til reklamebilder.

Praktiske råd for mørkefeltmikroskopi

Dersom bare én side av partiklene blir opp­ lyst i mørkefeltet, så er kondensor feil sen­ trert. Ved svake forstørrelser er det vanske­ lig å bringe den lille lysflekken nøyaktig i synsfeltets sentrum. En glassplate med trådkors på som legges på okularblenden kan hjelpe innstillingen. Ensidig belyste partikler kan også forekomme dersom lam­ pen er galt sentrert. Hvis partiklene ikke blir skikkelig godt opplyst og virker blasse, så er høydeinnstillingen på kondensor gal. Noen ganger er det ikke mulig å få innstilt belysningen presist. Dette kan skyldes feil tykkelse på objektglasset, tykkelsen må

55 ikke overstige 1 mm. Noen ganger er ikke bakgrunnen helt svart. Det kan være ure­ gelmessige, lysegrå striper og flekker. Objekt- og dekkglass er da ikke fullstendig rene. Selv de minste partikler og det tynne­ ste skikt med fett, olje eller såpe på glasset umuliggjør skikkelig mørkefeltmikroskopi.

Med svært kraftig belysning og stor nok forskjell på brytingsindeksen mellom det omgivende medium og objektet kan man i ekstreme tilfeller påvise partikler helt ned til 40Å (0,004 /zm). De fremtrer for oss som små diffraksjonsskiver. Men vi kan ikke på­ vise deres struktur. Bestemmelse av brytingsindeks med mørkefeltkondensor

Innen støv- og partikkelforskning har be­ stemmelser av brytningsindeks stor betyd­ ning. Kjenner vi brytningsindeksen til en gjennomskinnelig partikel, kan den ofte identifiseres. En partikkel som har samme brytningsindeks som det omgivende medi­ um, forsvinner i mørkefeltet. Enkeltpartikler i prøver kan derfor identifiseres ved å suspendere dem i ulike medier med kjent brytningsindeks. Slike medier kan kjøpes ferdige, eller tillages selv. Brytningsindek­ sen kan bestemmes helt nøyaktig med et så­ kalt refraktometer.

Interferenskontrastmikroskopi Bruk av interferenskontrastmikroskopet krever en del praktisk øvelse og innsikt. Selv om mikroskopet ble levert fra forhand­ leren med spenningsfri optikk, er det slett ikke sikkert at instrumentet har sin opprin­ nelige optikk intakt. Dette er første punkt man bør sjekke. Vanligvis er objektivene merket, med tegn for at de er spenningsfrie (et (-) tegn inngravert hos Zeiss, kun planakromater, Zeisskondensor skal ha rød

skrift på topplinsen). Det fins et polarisasjonsfilter (under kondensor) og et analysatorfilter (over objektiv). Hvis eventuell an­ nen optikk mellom polarisasjonsfilter og analysator ikke er spenningsfri, virker ikke mikroskopet tilfredsstillende. Kondensor som minner om en fasekontrastkondensor har tre såkalte Wollastonprismer i stedet for faseblendene, et prisme til hvert objektiv. Enkeltobjektivene kan ha et Wollastonprisme innebygd. Det kan være et justerbart Wollastonprisme - enten i en stor justerbar og felles sleide for alle objektivene i selve tubus (eldre Zeiss) eller et lite prisme i en miniatyrsleide innstukket i en egen påskrubar ring over hvert objektiv (yngre Zeiss). Teorien bak interferenskontrastmikrosko­ pet er vanskelig. Virkemåten er forklart i Fig. 39. Ufargete, transparente objekter kan bli synlige i interferens-kontrast. Det opp­ står et overordentlig plastisk bilde med relieffvirkning. Bildet representerer på ingen måte geometriske profiler. Objekter med optiske bølgelengdeforskjeller på Å / 10 til X er best egnet. Interferenskontrast utgjør i praksis en mellomting mellom fasekontrastmikroskopi og vanlig lysfeltmikroskopi. Leitz-interferenskontrastinnretning er ba­ sert på tostråle interferensprinsippet. Wollastonprismene består av to, sammenkittete, dobbeltbrytende prismer med krystallografiske akser i rett vinkel (se under polarisasjonsmikroskopi). I Figur 39 ligger den ene i papirflaten, den andre rett på. Begge akser er parallelle til inn- og utgangsflate på dobbeltprismet. Faller en lysstråle rett på Wollastonprismet, spaltes den i to lod­ drett polariserte stråler på hverandre. Skjer dette i midten av skilleflaten, der begge prismer er like tykke, kommer de utgående stråler i fase. Er stedet forskjøvet, oppstår en gangforskjell mellom de to vinkelrett på hverandre, polariserte delstrålene. Bringer man dobbeltprismet mellom to polarisatorer, får man i monokromatisk lys en serie

56

27838-512R

Figur 39 Leitz interferenskontrastinnretning: 1 = analysator, 2 = øvre Wollastonprisme, 3 = bakre brennplan for objektivet, 4 = objektivet, 5 = objektet, 6 = kondensor, 7 = nedre Wollastonprisme, 8 = brennplan for kondensor, 9 = lambda/4 plate, 10 = polarisator. (P - polarisator, O = objekt, E = bølgetog, Ob = objektiv, WP = Wollastonprisme, A = analysator, Ok = okular).

med rettlinjete interferensstriper. I hvitt lys er disse interferensstripene farget. O er objektet som en lysbølge faller vin­ kelrett på. Gjennom objektet blir bølgen deformert. Den nye bølgefronten er E. Wollastonprismet bak objektivet Ob spalter bølgen i begge delbølger El og E2. Ved hjelp av analysator A interfererer de med hverandre. I mellombildeplanet kommer intensitets- og fargeforskjeller til syne. Den­ ne mekanismen forutsetter at vi bruker me­ get liten belysningsapertur. I praksis benyt­ tes derfor en anordning, slik vist i figuren til høyre. Her behøver man ikke innskrenke belysningsaperturen. Lyset, som kommer fra en vanlig lyskilde, blir lineært polarisert av polarisator. Den

lineært polariserte strålen blir oppdelt i to polariserte delstråler av samme intensitet og som står på hverandre i 90 °. De diverge­ rer fra hverandre. Divergenspunktet ligger i brennplanet for kondensor. Vinkeloppspaltningen i Wollastonprismet blir til lateral oppspaltning i objektrommet. Delstrålene treffer objektet i to ulike punkter og blir påvirket av faseforskjeller. Oppspaltningen er valgt slik at den ligger under mikrosko­ pets oppløsningsevne. Vi ser altså ikke noe dobbeltbilde i mikroskopet. Objektivet bringer begge delbilder sammen i bakre brennplan. Der ligger også det andre Wolla­ stonprismet som fører begge delstrålene sammen. De går nå gjennom analysator og kan bringes i en felles svingningsretning -

57 de interfererer. Interferensfargen og intensi­ teten av hvert bildepunkt avhenger av faseforskjellen på de to delstrålene, og dermed av tykkelse og brytningsindeks for begge objektpunkter. Retningen på bildeoppspaltningen fremkommer som et relieff (på samme måte som ved skjev belysning).

(1) Første betingelse for maksimal kontrast er at polarisator og analysator er stilt vin­ kelrett på hverandre. Se uten objektiv og Wollastonprismer, drei polarisator til lyset forsvinner. Sving inn ønsket objektiv og velg riktig Wollastonprisme på kondensor. (2) Drei nå på øverste Wollastonprisme (over objektivet) til det oppstår maksimal kontrast (kraftigst relieffvirkning).

I motsetning til fasekontrastkondensoren vil man ved lukking av aperturblenden få økt kontrast. Hvis kontrasten er svak, kan dette skyldes preparatet eller at Wollastonprismet ikke står i «diagonalstilling» (45 °). Dette kan være vanskelig å få til uten hjelp fra en person kyndig i mikroskopisk op­ tikk. For noen fabrikater kan man ikke gjø­ re dette selv uten spesielt verktøy. Slike feiIjusteringer oppstår ofte ved «amatørreparasjoner». Med videokamera, kretskort for datamas­ kin (minst 40 MB eller mer, 2 MB RAM el­ ler mer), DIK-interferenskontrast og et eget dataprogram kan man lett konstruere tredi­ mensjonale lysmikroskopiske bilder ved en­ hver forstørrelse. Med elektronisk bildeforsterkning kan interferens-kontrastmikroskopet synliggjøre fenomener i cellestrukturer som har dimensjoner mindre enn tradisjonell oppløsningsgrense for lysmikroskop (polymerisasjon av mikrotubuli osv.).

Optiske forutsetninger for gode mikroskopbilder Skal man utnytte kapasiteten til oljeimmersjonsobjektivet, er det viktig å disponere en god immersjonsolje. Oljen skal ha: Brytningsindeks på nd = 1.518 ved 23 °C og dispersjon på v = 43

Gammel olje kan avvike fra dette. Oljen må ikke herde eller fordampe. Hvis den avviker fra disse kriterier, vil optikken ikke virke til­ fredsstillende. Med oljeimmersjonsobjektivet spiller det mindre rolle med avvik i dekkglasstykkelse. Hvis brytningsindeksen for dekkglasset av­ viker, er dette mer kritisk. Er for eksempel brytningsindeksen 1.522, får man en synlig kvalitetsforringelse. Mange er ikke klar over dette. Hvis det ligger en gammel hinne med olje på objektivet og man drypper på ny, får man såkalte (optiske) schliereneffekter. Dette svekker bildekvaliteten. Hva de fleste ikke vet, er at romtemperaturen også spiller en rolle. Oljeimmersjonsobjektiv har størst yte­ evne ved 22-23 °C. Selv små temperaturavvik fører til be­ tydelig dårligere bilde. Bildekvaliteten for­ verres kraftig. Spesielt fører varme fra mikroskoplampen til lokale, optisk uaksep­ table temperaturforhøyelser. Bruk et varmefilter.

God yteevne på mikroskopet får man ved: (1) ren optikk, fri for støv og belegg (2) riktig dekkglassty^Æe/se og glassÆvø/ztet (0,15-0,17mm) (3) ny olje på immersjonsobjektivet med riktig brytningsindeks og dispersjon (4) riktig romtemperatur (5) jevn belysning innstilt etter Kohler

58 (6) at preparatet har rene overflater og lig­ ger riktig vei (7) god sentrering av de optiske kompo­ nentene

I mange laboratorier syndes det mot ett el­ ler flere av disse punktene. Dette svekker interessen for mikroskopi som fag og hobby.

Mikrofotografering Fotografering i mikroskop av preparatet og preparatdelene tjener som viktig dokumen­ tasjon for det man observerte. Ikke alle slags preparater egner seg for mikrofoto­ grafering. Både lysforholdene, bildets dybdeskarphet og kontrast i mikroskopet er spesielle og avviker vesentlig fra de optiske forhold man har ved fotografering i daglig­ livet. I en del litteratur, spesielt av engelsk og amerikansk opprinnelse brukes ordet fotomikrografi om bilder tatt i mikroskop. Vi vil her bruke den opprinnelige tyske beteg­ nelsen mikrofotografi. Dette er fotografier av mikroskopisk små gjenstander. I engelsk og amerikansk litteratur brukes dette begre­ pet om forminskete fotografier, ned til 1 mm eller mindre, som tradisjonelt har vært brukt til arkiv - og etterretningsformål.

ikke oppfanges på noen skjerm. Lysstrålene fra et punkt i objektet forlater okularet som parallelle stråler som brytes i øyelinsen til et skarpt punkt på netthinnen. Vi kan bringe objektivet nærmere prepa­ ratet med mikroskruen. Det reelle mellom­ bildet ryker dermed oppover. Det ligger nå i en høyde ovenfor okularblenden inni oku­ laret. De strålene som forlater okularet er ikke lenger parallelle, de spres (divergerer). Yngre mennesker kan innen visse grenser akkomodere øyelinsen for dette, men mikroskopbildet blir ubehagelig å se på. For en nærsynt person (uten bruk av briller) repre­ senterer dette imidlertid den normale inn­ stillingen av mikroskopet. Vi kan imidlertid øke avstanden mellom preparatet og mikroskopet. Det reelle mel­ lombildet flyttes nå ned under okularblen­ den. Strålene som forlater okularet er ikke lengre parallelle, de konvergerer og møtes i en viss avstand fra okularets øyelinse. Her dannes et nytt reelt bilde av mellombildet. Okularet fungerer nå som et projeksjonsobjektiv. Bildet kan oppfanges på en mattskive, eller på en fotografisk film. I forhold til objektet blir det projiserte bildet rett­ vendt. Har vi en kraftig nok mikroskoplampe, er et ingen kunst å vise dette bildet i et mørklagt rom. Best går dette ved lave for­ størrelser.

Mikrofotografering uten kamera

Okularet som projektiv Det bildet man ser i mikroskopet er det reel­ le mellombilde. Dette dannes av objektivet og er et omvendt, reelt og forstørret bilde av preparatet. Bildet sees gjennom okularet som optisk sett virker som en lupe. Det bil­ det som dannes på netthinnen, er et innbilt, forstørret og rettvendt bilde. Øyet er innstilt på uendelig avstand. Det bildet vi ser, kan

Egentlig trenger vi ikke noe fotoapparat for å ta mikrofotografier. Dersom vi kan be­ skytte filmen mot falsk lys og plassere den plant i riktig høyde over okularet, og dess­ uten har en anordning for fokusering og re­ gulering av lysmengden, kan vi lett lage mikrofotografier. Det er ikke vanskelig å tilpasse selv en gammel stol, trekasse eller krakk med passende lange ben og plan toppflate til å fungere som mikroskop-«ka-

59

mera». I topplaten bores det et hull noe mindre enn filmformatet. Et papprør kan sprayes med matt svart maling og tilpasses som en lyssluse mellom okularet og filmplanet. Mikroskopet stilles vertikalt under «fotoapparatet». En matt glassplate (matt side mot oku­ lar) legges over hullet og bildet fokuseres på platen. For nøyaktig fokusering kan man hjelpe seg med en liten lupe. Lyset slukkes i rommet og mattskiven byttes ut med en fo­ tografisk glassplate på 6 x 6 eller 6x9 cm. Mikroskoplampen tennes i et visst antall se­ kunder for eksponeringen. Etter fremkal­ ling og fiksering ser man om eksponeringen var vellykket. Man må prøve seg frem når det gjelder eksponeringstid. I eldre tid fantes profesjonelle oppstillin­ ger av et slikt system. «Fotoapparatet» be­ sto av en meget lang horisontal belg plas­ sert på en optisk benk som igjen sto på en solid vogn av metall, utstyrt med ratt for høyderegulering, justering i vater osv. Mik­ roskopet sto på en annen optisk benk med tilhørende vogn og kullbuelampe med transformatorer. Hele arrangementet fylte et vanlig laboratorierom. Den dagen Pro­ fessoren mikrofotograferte, måtte persona­ let bokstavelig talt liste seg rundt på sokke­ lesten.

Mikrofotografering med kamera uten objektiv Konstruksjonen av fotoapparatet har rela­ tivt liten betydning for den optiske kvalite­ ten av mikrofotografiene. Prinsipielt er det mikroskopets optikk som skal danne bil­ det, eventuell optikk i kameraet kan ikke forbedre dette og fører snarere til en forrin­ gelse av bildekvaliteten. Valg av kameratype avhenger av arbei­ dets art. For cytologiske studier er som re­ gel formatet 24 x 24 mm eller 24 x 36 mm tilstrekkelig. Fordelen ved småbildeformatet

ligger i enkel betjening og lave omkost­ ninger. Det er langt billigere å kjøpe et «amatørkamera» enn de spesialkameraer som tilbys av de fleste mikroskopfabrikanter. Valg av kamera bør utelukkende skje ut fra vitenskapelige kriterier. Det bør være et systemkamera, gjerne enøyet speilrefleks. Hvis søkeren er utskiftbar, er dette en fordel. Mattskiven bør kunne byttes ut med en klarglasskive med trådkors. Dette skyldes at mikroskopiske bilder generelt er meget lyssvake. De synes ikke på mattskiven ved høye forstørrelser. Kan man ikke få tak i, el­ ler skifte ut mattskiven, går det an å gjøre den klar sentralt ved å kitte inn et sirkulært dekkglass (bruk Eukitt, se side 205). I det sentrale området kan man nå fokusere helt skarpt for mikroskopiske formål, samtidig som kameraet fremdeles lar seg bruke til or­ dinære formål. Man bør kjøpe et kamera som er godt innarbeidet på markedet. Enkelte fabrikker endrer sine modeller stadig, og det kan opp­ stå vanskeligheter med vedlikehold og repa­ rasjon. Likeledes har det vist seg at mikro­ skopets spesialutstyr ikke passer ved ut­ skiftning til nyere modeller, og tusenvis av kroner kan nedlegges i utstyr man får liten anvendelse for. En rekke nyere fotoapparater til amatørbruk er nå utstyrt med autofokus, innebygd motor og adskillig elektronikk. Ofte er ap­ paratene forsynt med et kamerahus i hardplast i stedet for metall. Plasthuset er imid­ lertid langt mer ustabilt og unøyaktig enn de eldre metallkameraene. Autofokusobjektivet er totalt overflødig og må i alle til­ feller fjernes. Motoren kan lage mekaniske vibrasjoner. Ofte er heller ikke mattskiven utskiftbar, og hva skal man med innebygd blitz i kamerahuset for mikrofotogra­ fering? Et av de mest allsidige kameraer som har vært laget til teknisk fotografering, var mo­ deller av Exakta Varex systemet som ble

60

Figur 40 Klassisk Exakta system kamera fra Ihageé, Dresden. Dette var verdens første speilreflekskamera. Forskjellige modeller ble produ­ sert inntil midten av 1960-årene. Kameraet hadde utskiftbar prismesøker som kunne erstattes med spesialsøker for mikrofotografering, lysmåling, hadde avtagbart bakstykke, innebygget kniv for kutting av eksponerte filmlengder, tilleggsutstyr for stereofotografi, makrofotografi, ulike typer av belger og mellomringer tilpasset mikroskopbruk og spesialutstyr som kolposkop etc. Det fungerer også som kamera i mikroskop i ultrafiolett lys et­ tersom det ikke er absorberende glassflater fra okularet til filmplanet.

Figur 41 Snitt-tegning gjennom enklere kamerautrustning for mikrofotografi. Prismet (8) deler lyset fra okularet til søkeren for presis fokusering og til filmplanet. (1) Leica 35 mm kamera, (2) mellomstykke, reduserer forstørrelsen til 1/3, (3) justeringsring, (4) I u kkeri n n st i 11 i ng med blitssynkronisering, (5) korreksjonsring for søker, (6) blende med skive som viser bildeutsnitt, (7) sentrallukker, (8) utsvingbart prisme, (9) festeskrue til mikroskoptubus, (10) okular i mikroskop. E. Leitz, GmbH, Wetzlar.

produsert av Ihageé i Dresden (Fig. 40). Produksjonen er nå innstilt og slike kame­ raer i god stand er vanskelige å skaffe. Pentax ME (super) var i mange henseender en modernisert utgave av det gamle Exakta sy­ stemet. Dette kameraet er stadig ettertraktet og omsettes på bruktmarkedet. Første betingelse er altså at objektivet skrues av kameraet. Selve kamerahuset fe­ stes til mikroskopet ved hjelp av et eget mellomstykke, eller en uttrekkbar belg for re­ gulering av projeksjonsavstanden (Fig. 41). I Exaktasystemet kan man uten videre bytte ut mattskiven med en klarglassskive. Skiven er forsynt med et innrisset kors og settes i en egen holder på lyssjaktens plass. I en andre enden av holderen kan man mon­ tere kameraobjektivet som nå benyttes som

lupe (Fig. 42). Gjennom kameraobjektivet kan man nå fokusere selv uhyre lyssvake bilder. Speilreflekskameraer uten muligheter for montering av klarglass eller innmontering av et sirkulært dekkglass for oppklaring av bildet i sentrum, krever i tillegg egen fokuseringsoptikk. Denne er meget kostbar. Den består av et mikromellomstykke med kikkert/prismesøker. Mikroskopkameraet må stilles opp solid og vibrasjonsfritt. Her syndes det mye. Helst bør tyngden av apparatet bæres av et eget stativ (reproduksjonsstativ med lodd­ rett søyle). Det bør ikke foreligge mekanisk kontakt mellom kamera og mikroskopet. For å unngå falsk lys kan man benytte en lyssluse.

61

Figur 42 Klassisk arrangement for enkel mikrofotografering. Et speilreflekskamera er montert på en egen søyle og er ikke i mekanisk kontakt med mikroskopet. Kameraet fungerer uten eget objek­ tiv. Avstanden fra okularet til filmplanet kan varie­ res ved hjelp av en uttrekkbar belg. Okularet skal heves noen millimeter for korreksjon av sfærisk av­ vik. Kameraet er en eldre Exakta Varex med utskiftbart søkersystem. Kameraets objektiv kan monte­ res i søkeren og virker som innsti11ingslupe. Kame­ raets speil projiserer bildet gjennom søkersystemet. Ved denne oppstillingen minskes vibrasjoner som kan forringe bildekvaliteten. Eksponeringen utføres best ved å åpne lukkeren først uten mikroskoplampen på, deretter ekspone­ res bildet ved å tenne lampen (tid for påsatt lys) og så stenge kameraets lukker.

Mange speilreflekskameraer har såkalt gardinlukker. Sammen med bevegelsen av speilet, kan dette forårsake forstyrrende vi­

brasjoner under fotograferingen. Dette gjør seg særlig gjeldende i området 1/1000 s - 1/5 s ved forstørrelser over 100 x. Mikro­ skopet forstørrer også vibrasjonene, noe som helt kan ødelegge bildet. Rystelser er den «mystiske» årsaken til at man ikke kla­ rer å få skarpe mikrofotografier ved de første egne forsøkene. «Korte» eksponeringstider er et umulig område for eksponering innen mikrofotografi uten spesielle tiltak. Man opererer derfor med ganske lange eksponeringstider, opptil 2 minutter ved de aller største for­ størrelsene, slik at speilets bevegelser og lukkerens vibrasjoner gir mindre eller ingen utslag. Sentrallukkere er til gjengjeld vibrasjonsfrie, men ved kortere belysningstider får man ikke jevn belysning. Slike sentral­ lukkere kan kjøpes løse og monteres inn i strålegangen (belgen etc.). Først åpner man lukkeren på speilreflekskameraet. Deretter eksponerer man med sentrallukkeren. Til slutt stenger man lukkeren på speilrefleks­ kameraet. Til høykvalitetbilder blir formatet 24 x 36 mm for lite. Det trengs et spesialkamera, for eksempel platekamera. Det er nyttig når det gjelder oversiktsbilder (enkeltbilder) for utstillingsformål, fotokonkurranser, kon­ gresser. Slike kameraer er dyre i bruk og nokså urasjonelle. Man kan få et eget bakstykke for Polaroid film til slike kameratyper. Med Polaroidfilmen kan man eksperi­ mentere med belysning, filtre og innstillin­ ger til man har det perfekte bilde i farger. Vanlige selensulfidmålere er ikke følsom­ me nok til lysmålinger på et vanlig mikroamperemeter. Fullt skalautslag må da kun­ ne være 1 /z eller mindre. Hvis man dispone­ rer et «gammeldags» speilgalvanometer (meget kostbart), får man med selensulfidcellen en ytterst følsom og nøyaktig lysmåler. Selencellen kan kobles direkte til galvanometeret. Det bør ha en følsomhet på minst 0.3 nA/mm. Kadmiumsulfidceller, eller andre lysføl-

62

somme sensorer brukes nå som lysfølsomt element i mange fotoapparater. Kadmiumsulfidcellen er billig i innkjøp, koster bare noen få kroner. Belyses den, synker den in­ dre motstanden som en funksjon av lysin­ tensiteten. Dette tar noe tid, men er nøyak­ tig og reproduserbart. Ferdige CdS-målere foreligger i handelen til mikroskopbruk. Disse er ofte dyre, det holder med en sensor til ca. 10 kroner og et vanlig multimeter (Volt, Ampere, Ohm). Man kobler CdS-cellen til multimeteret og stiller inn på motstandsmåling. Velg det ohm-område som gir passende utslag. Lysmengden måles ved å holde fotocellen rett over okularet. Man bør forsøke seg frem med ulike typer prepa­ rater og belysninger og lage seg en eksponeringstabell, se også side 65. Moderne amatørkameraer har ofte inne­ bygd elektronikk for eksponeringskontroll, men denne kommer oftest til kort ved de lange eksponeringstidene som er aktuelle innen mikrofotografien.

Mikrofotografering ved lave forstørrelser Fotografering ved lave forstørrelser medfø­ rer spesielle problemer. På tross av at objek­ tet ser bra ut i søkeren, blir det ferdige bil­ det høyst uskarpt. Dette skyldes at øyet ved disse forstørrelsene akkomoderer slik at skarpheten blir galt innstilt. Problemet kan løses på følgende måte:

(1) Still skarpt med eller uten brille på trådkorset i innstillingskikkerten (drei på ringen til frontlinsen i søkeren). (2) Still en ordinær teaterkikkert (!) på uen­ delig. (Se for eksempel på en fjern antenne, murpipe etc. utenfor vinduet. Avstanden skal være > 200 meter). (3) Hold teaterkikkerten mot innstilling­

skikkerten. Se på mikroskopbildet gjennom dette kompliserte søkersystemet.

(4) Bring mikroskopbildet i fokus ved hjelp av grovskue/mikroskrue. Selv ved meget lave forstørrelser får man nå et absolutt skarpt bilde. SPESIELLE PROBLEMER

Enkelte preparater er hel uegnete for mikro­ fotografering. De er rett og slett for tykke. Strukturer kommer utenfor fokus og objek­ tet er så komplisert at det er vanskelig å danne seg noe tredimensjonalt bilde. Det kan være vanskelig å bruke tegnespeil fordi det blir for mange detaljer og tettliggende strukturer. Problemet løses ved å lage en rekke lys­ bilder i ulike fokalplan. Monter bildene nøyaktig i rammer. Projiser bildene med lysbildeapparat mot en stor tegnekartong (ca. 1 m2) på veggen. Jo større format, jo bedre! Ved å bruke et «batteri» av fargeblyanter kan man nå avtegne de skarpe partiene for hvert bilde. I ro og mak kan man bygge opp den tredimensjonale struktur ved å tegne inn, i tur og orden, de skarpe partiene av hvert bilde. Metoden krever noe øvelse og er meget god og nøyaktig. Fotografer skalaen på mikrometeret. Tegn den inn på det proji­ serte bildet.

Fotografering med kamera og uten mikroskopokular Tar vi vekk okularet, har vi muligheter for å ta svært kontrastrike bilder. Det fordrer at tubus i mikroskopet har ganske vid diame­ ter. Man dreier grov- og mikroskrue til det dannes et bilde i filmplanet. For sterkt for­ størrende objektiver oppstår optiske mang­ ler. Ved svakere forstørrende objektiv kan man neppe se noen degradering av bildet. Fotografering uten okular kan være gunstig

63 fordi en rekke forstyrrelser forårsaket av rusk og støv på og i okularet forsvinner. Enkelte optiske firmaer kan være behjel­ pelig med å slipe korreksjonslinser for de optiske feil som oppstår når man fjerner okularet (se Spindler og Hoyer side 210).

Brennvidden regnes ut som forholdet mellom synsvidden (250 mm) og egenforstørrelsen. Er egenforstørrelsen 5 x, blir brennvidden 250/5 = 50 mm. Tubusforlengelsen ved 200 mm projeksjonsavstand blir: 502 /200 = 12.5 mm.

Okularprojektivets funksjon Ved mikrofotografering og projeksjon er avstanden mellom objektivet og preparatet økt. Vi har derfor ikke lenger det reelle mel­ lombildet i synsfeltblendeplanet for okula­ ret. Det ligger i alle tilfeller noe under dette. Bilder som er projisert på kort avstand får en uskarp blenderkant, på lengre avstand er forholdet mindre påfallende. Okularet vir­ ker ikke lenger etter de optiske forutsetnin­ gene som det er konstruert for. Det er ikke normale arbeidsforhold for objektivet heller. Dette er beregnet for en bestemt tubuslengde (avstanden fra objek­ tivet til mellombildet). Under fotografering arbeider mikroskopet med for kort tubus­ lengde. Dette fører til sfærisk avvik. Ved bruk av objektiver med høy apertur får man en merkbar nedsettelse av skarpheten. Det ble tidligere fremstilt spesielle foto­ okularer. Avstanden mellom øye- og feltlinse kunne endres ved å dreie øyelinsen. En skala angav avstanden i millimeter fra øye­ linsen til filmplanet. Fordi korreksjonen i okularet endres ved forandring av avstan­ den mellom felt- og øyelinse, måtte øyelinsesystemet være kromatisk korrigert. Foto­ okularer fremstilles ikke mer og det sies at moderne okularer er fullverdige. Ved bruk av disse får man ikke gode re­ sultater uten å øke tubuslengden. Forlengel­ sen beregnes etter følgende formel:

T = — P (T = øking i tubuslengde, B = okularets brennvidde, P = projeksjonsavstand)

Vi må altså heve okularet 12.5 mm for å få et skikkelig bilde.

Dette kan gjøres ved å trekke det litt ut av tubus og feste det med tape.

Kort fremgangsmåte ved mikrofotografering (1) Still mikroskopet etter Kdhlers prinsipp. Hvis det er vanskelig å få jevn belysningsbakgrunn, kan en mattskive i filterholderen på kondensor gjøre underverker. (2) For svart/hvitt fotografering: bruk en langsom - middels, finkornet film, ikke over 100 ASA. Plasser et grønnfilter (for eksempel Jena VG 9) i filterholderen i kon­ densor. (3) Still trådkorset i søkerlupen skarpt. Det­ te skjer ved å dreie på fokuseringsringen på søkerlupen. Hvis man bruker briller, må man ikke ta dem av under det videre ar­ beidet. (4) Fokuser preparatet. Hvis objektbordet eller kameraet kan dreies prøver man å «komponere» bildet. Dette skjer ved å ar­ rangere langstrakte strukturer parallelt med bildeformatets lengdeakse. Dette gir et mye penere bildeutsnitt som gjør det lettere se­ nere å sammenstille delbilder i plansjer. Mikroskop der man ikke kan dreie kamera/objektbord er ofte lite rasjonelle for å oppnå gode mikrofotografier.

64

Hvilke feil kan oppstå når vi mikrofotograferer? (1) Bakgrunnen har farge (rød/blå/) Fargetemperaturen på belysningen har vært gal. Bruk korreksjonsfilter. Øk om mulig lampespenningen. Er lampen slitt, feil filmtype? (2) Bakgrunnen har farge (grønn/magenta) Gal filmtype, emulsjon kan være endret i ny fabrikasjonsserie. Kjøp flere filmer fra samme produksjonsserie. Grønt fjernes med magenta filter, rosa med grønt filter.

(3) Fargegjengivelsen er dårlig, fargene vir­ ker «unaturlige» Svake lysstyrker gir gale målinger. Øk ek­ sponeringstiden 0.8 x - 0.25 x for lys bak­ grunn, 1.25 - 4 x for mørk bakgrunn. (4) Dårlig kopi fra fargebilde Laboratorieteknikeren kjente ikke virkelig farge på objektet. Bruk ikke negativ far­ gefilm, lever dias til kopiering!

(5) Polaroidfilm Gal fargetemperatur gir dårlig fargegjengivelse. Romtemperaturen, alder på fil­ men virker også inn. I det hele er Polaroidfilmer vanskeligere å bruke enn vanlige fargefilmer. Polaroidfilm ødelegges meget lett ved lagring under dårlige forhold. Det er imidlertid lett å eksperimentere seg frem til riktig eksponering, lys og filter med Polaroidfilm ettersom man ser resul­ tatene med en gang. (6) Uklare bilder (svart - hvitt/farge) Bildet ikke presist fokusert. Feil innstil­ ling på søkerokular eller mikroskopokularet. Vibrasjoner i mikroskopet. Preparatet har beveget seg under eksponeringen. Ved lave forstørrelser kan akkomodasjonsevnen til øyet gjøre det vanskelig å finne en korrekt innstilling.

(7) Bildet er i fokus, men det er ikke skarpt Gal kombinasjon av objektiv og okular. Okularet forstørrer utover mikroskopets oppløsningsevne. Kondensor galt innstilt. Irisblende kan være for åpen, eller for luk­ ket. Dekkglasstykkelsen er gal. Bruk dekkglass med tykkelse 0.17 mm! Prepa­ ratet var for dårlig farget (kan i noen tilfel­ ler rettes opp med fasekontrast).

(8) Tåkete bilder Korreksjonsfatningen på objektivet (hvis tilstede) kan være galt innstilt. Objektivet er beregnet for preparater uten dekkglass. Partikler eller fett-liknende film på linseflater eller på preparatet (det siste er me­ get vanlig). Hold mikroskop og preparater pinlig rene! (9) Immersjonslinsen gir dårlige bilder Det mangler immersjonsolje. Gal immersjonsolje er brukt. Luftblære i oljen. Romtemperaturen er gal. Preparatet er for tykt. (10) Hele rullen med svart/hvitt film er ikke skarp Gammel film, gal filmtype, overeksponering, gal fremkalling etc.

(11) Korn i kopiene Det er brukt for hurtig film. Gal film har vært brukt. Kopiene er for mye etterforstørret. (12) Skygger på bildene Mikroskopkondensor galt justert. Linser ikke justert langs optisk akse. Feltblenden for mye lukket. Det er støvpartikler i linsesystemet. Det er skjedd statiske utlad­ ninger ved håndteringen av filmen. (13) Reflekser på bildene Falsk lys kommet inn gjennom søkersystemet. Blend av rommet.

65

(5) Hvis ikke automatisk eksponering, må­ les lyset slik: Hold en vanlig CdS-fotolysmåler over (foran) søkerlupen. Den skal være så følsom at den gir utslag på selv svakt lys i mikroskopet. Vi kan selv lage lysmåleren av en vanlig CdS-celle (Claes Ohlsson, Oslo) og et multimeter med skala for motstandsmåling (fullt utslag ca. 50-100 jzA. Med en vanlig fotolysmåler (dyr) stiller vi inn filmhastigheten og leser av eksponeringsverdien for blender f 2. Det er ikke noen vanlig blender i mikroskopkameraet. Vi bruker eksponeringstiden ut for f 2 på lysmålerskalaen. Denne verdi pas­ ser i de fleste tilfeller godt (også for farge­ bilder) med normale 35 mm kamerasystemer. Hvis ikke må man prøve seg frem til det «blendeverditallet» man skal avlese eksponeringstiden fra. (6) Eksponer bildet med kameraets lukker hvis den er av den moderne, stille typen. Husk at tiden må overstige 1 s, ellers gjør rystelser seg gjeldende. Eller still lukker på «B» eller «T». Belys med lampen riktig tid. Lukk kameraets lukker og trekk frem til neste bilde. (7) Hvis man vil bruke fargefilm, anbefales en moderne filmtype, f. eks. Fujichrome 100 ASA for dias. Negativ fargefilm er vanskelig å bruke. Man får akseptable bil­ der forutsatt at mikroskopet har halogenlampe. Svakt gul bakgrunnsfarge kan fjer­ nes med et svakt blåfilter i filterholderen. Man må her prøve seg frem. Lampen må brenne med full amperestyrke. Hvis lyset er for sterkt, kan det dempes med et nøytralfarget gråfilter (mikroskopforretning).

Fremkalling og fiksering Svart-hvitt film fremkalles i fremkallertank på samme måte som for vanlig amatørfilm. Mikrofotografier får forbedret kontrast ved 3 - Mikroskopi

bruk av spesielt fremkallerbad. For svart/hvitt arbeider lager vi væskene selv.

Hardt arbeidende filmfremkaller (må stå noen dager før bruk) Løsning (A) Hydrokinon 25g Kaliummetabisulfitt (K2S2O5) 25g KBr 25g Vann 1000 ml Løsning (B) Vann KOH

1000 ml 50 g

Bland like deler før bruk. Fremkalleren er god for strekreproduksjoner, kromosombilder etc. Det er få nyanser.

Finkornfremkaller: Agfa-type Metol (Metatyl) 4.5 g Natriumsulfitt (anhydr.) 85g — Hydrokinon Soda (vannfri) lg — Borax KBr 0.5g Vann 1000 ml Fremkallingstid 12-15 min ved 20° C Papirfremkaller Fremkallertype bløt

Metol (metatyl) Natriumsulfitt Hydrokinon Pottaske Soda Bromkalium Vann til Fortynning ved bruk

Kodak D-76 2g

100g 5g 2g — 1000 ml 12-15 min

normal

hard

15g 75g — 75g — 2g 1000 ml

lg 13g 3g 26g lg 1000 ml

5g 40g 6g 40g 2g 1000 ml

1:4 (5)

-

—

66 Fremkallingstiden er ca. 2 min. ved 20°C. Kontaktpapir fremkalles I-/2 min. Fremkalleren gir en nøytralsort tone. Fikserbad Natriumsulfitt Kaliummetabisulfitt Vann

250 g 25 g 1000ml

Lag separate fikserbad til film og papir. Derved unngår man papirfibre på filmoverflaten.

Film- og videomikroskopi Tidligere var man henvist til bruk av smalfilmkamera (8, super-8 eller 16 mm) for opptak av cellebevegelser, vekstfenomener, krystalldannelse og andre fenome­ ner i mikroskopet. Det er for tiden vanskelig å skaffe film til 8 mm kameraer. Når det gjelder 16 mm film, er den så kostbar at den i praksis bare brukes til profe­ sjonelle opptak. Moderne kamera for smalfilm (Leitz, Bolex-Paillard, Arriflex) gir gode resultater, men det er store problemer med å unngå vibrasjoner. Dette gjelder spesielt høye forstørrelser. Dessverre er 8 mm formatet så lite at det medfører optiske problemer med å projisere et fullgodt bilde inn på den lille filmflaten. Med 16 mm utstyr går dette bra. Vibrasjonsproblemene krever ofte at kameraet fastmonteres på stålskinne på betongvegg, mekanisk separat fra mik­ roskopet! Med prøving og feiling må man regne med at omkostningene er ca. 1000-2000 kr per minutt brukbart filmopptak. 16 mm film brukes som negativ fargefilm. Fra den negative råfilmen lager man positi­ ve kopier. Dette arbeidet kan man få utført hos firma som fremkaller film for profesjonelle filmprodusenter. Med smalfilm er det enkelt å redigere opptakene og redigeringsutstyret koster forholdsvis lite. Tilpasningen til mikroskopet er vanskelig. Man kan filme mellombildet (altså uten okular) og kameraobjektiv. Dette gir akseptable resultater i endel tilfel­ ler og man får projisert det meste av mikroskopets bildefelt på filmruten. Et svakt forstørrende, vidvinklet okular brukes dersom man beholder kameraets ob­ jektiv. De aktuelle filmkamera har alle speilreflekssøkere som letter innstillingen av bildet. Med gråfiltre reguleres lysmengden som enkelt kan måles med en CdS-lysmåler over okularet. Videoutstyret er langt lettere å bruke og medfører ikke vibrasjonsproblemer. Men selv høyoppløsningskamera gir langt dårligere detaljgjengivelse enn et 16

mm filmkamera. Videofilm er billig (ca. 1/100 av ut­ giftene til smalfilm). Problemene kommer når man skal redigere filmen. Utstyr for videoredigering er me­ get kostbart. Det samme gjelder leie av et profesjonelt redigeringsstudio. Har man ikke spesielle krav, kan redigeringsustyr for amatører være tilfredsstillende. For ca. 20 000-30 000 kr får man brukbart utstyr. Video­ kamera til mikroskop er ofte uten objektiv. I fatnin­ gen kan skrues en adapter med såkalt «C-gjenge». tå­ gjengen er standardgjenge også for 16 mm smalfilmobjektiver. Adapteren er ofte tilpasset mikroskopet slik at mikroskopbildet projiseres direkte fra objekti­ vet (ikke okular) inn på CCD-brikken. Endel amatørkamera er like gode elektronisk sett. Mangelen er at kameraobjektivet ikke kan skrues av uten videre. I noen tilfeller kan man montere kame­ raet på et vanlig videostativ og projisere bildet fra okularet inn i videokameraet. Zoomobjektivet skal stå i teleposisjon (på «uendelig»). Kameraets objektiv må ha en avstand til mikroskopokularet på omlag 25 cm. Dette kan gi meget gode videoopptak. Ofte er imid­ lertid kameraobjektivet uegnet (for stor diameter), bildefeltet blir for lite og det opptrer underlige reflek­ sjoner og andre forstyrrende optiske effekter på bilde­ ne. Man må derfor prøve seg fram til egnete kombina­ sjoner av okular og kameratype. Ettersom lyd regi­ streres, kan man under opptakene kommentere hva som skjer. Billigst er et svart-hvitt «overvåkingskamera». Noen typer har «C-gjenge» for 16 mm filmobjektiv. I C-gjengen kan man skru inn en overgangsfatning til mikroskopet. Denne leveres av de fleste mikroskopfirmaer. Videokamera av kringkastingskvalitet koster noen hundre tusen kroner, men oftest aksepteres re­ sultater fra langt billigere opptaksutstyr. TIME-LAPSE FILM

Mange prosesser er for langsomme til å kunne regi­ streres direkte i mikroskopet. Ved å ta enkeltbilder med jevne intervaller kan bevegelsesfenomener kom­ me tydelig frem ved projisering av film eller avspilling av videoopptak. Det er enklest å bruke smalfilm til time-lapse opp­ tak. Bedre kamera har utløser for enkeltbilder for pro­ duksjon av tegnefilm, trickopptak etc. I samarbeide med et mekanisk verksted kan man nokså rimelig få bygd seg en utløsermekanisme for opptak med jevne intervaller. Vanlige videokamera egner seg ikke så godt til timelapse.

STROBOSKOPEFFEKTER

Bevegelsesfenomenene kan også være for raske til at det er mulig å registrere dem med øyet. Dette gjelder blant annet bevegelser i svinghår, cilier og flageller. Under gitte omstendigheter kan disse bli synlige for øyet. En roterende vifte med 3 vinger montert mellom

67 kollektor og kondensor kan fungere som et primitivt stroboskop. Omdreiningshastigheten reguleres ved å variere spenningen til motoren. Avanserte stroboskop krever blitslampe og er kostbare.

Tegning ved hjelp av mikroskopet Det er ofte umulig å fotografere preparatet på en skikkelig måte. Med øvelse kan man istedet lage gode (romlige) tegninger uten noe hjelpemiddel. Dette er et felt det lønner å øve seg på. Fine eksempler på mikroskoptegninger fin­ ner man spesielt i eldre lærebøker. Som hovedprinsipp skal tegningene være enkle og illustrere det vesentligste. En teg­ ning kan aldri bli objektiv, men ettersom også mikrofotografier kan bli høyst misvi­ sende, er det viktig at det man presenterer er karakteristisk for preparatet. Den endelige tegning skal være i svart tusj på hvitt papir. Før den publiseres bør den rentegnes av en profesjonell teknisk tegner. Hvis man tegner på «frihånd», er det en fin hjelp å bruke et okular som har en glassplate med et innrisset rutenettverk. Tilsvarende rutenettverk risses opp på tegnearket med blyant og linjalen. Dette hjelper til å oppnå riktige proporsjoner på tegningen. Spesielle tegneapparater kan leveres til de fleste mikroskop. Disse projiserer bildet fra tegnearket inn i selve mikroskopbildet. Man følger bare konturene av objektene med blyanten. Disse tegneapparatene kos­ ter ofte like mye som resten av mikroskopet.

Mikroblits Bruk av elektronblits for mikrofotografering er av og til en nødvendighet. Dette gjelder spesielt levende pre­

parater. Blitsen kan plasseres mellom feltblenden og kondensor etter innstilling av bildet med den vanlige mikroskoplampen. Vanlige blitsapparater for fotoamatører er brukbare. Vibrasjonsproblemer utelukkes og opptakene blir skarpe. Blitsrøret kan bygges inn i strålegangen for lampen. Noen få firmaer leverer profesjonelt utstyr. Lyset kan dempes med gråfiltre. Ved høye forstørrelser og fase­ kontrast blir det ofte lite lysutbytte. Bruk da hurtig film. Blitsbilder får ofte svak kontrast. Grønnfilter forbedrer kontrastforholdene.

Ultrafiolett mikroskopi Bruk av ultrafiolett stråling representerer en utvidelse av lysmikroskopets muligheter. Den synlige delen av det elektromagnetiske spektrum strekker seg fra 400 til ca. 700 nm. Ultrafiolett mikroskopi er i praksis mu­ lig ned til ca. 240 nm, kanskje til nesten 200 nm. Optiske elementer i vanlige lysmikroskop slipper ikke igjennom stråling som har kortere bølgelengde enn ca. 300 nm og selv her er de optiske forholdene dårlige. Et ultrafiolett mikroskop bruker linser av kvarts, og det kreves spesielle objektiver, speil, objektog dekkglass,immersjonsmedium og lyskilde. Etter­ som vi ikke kan se noe bilde, må mikroskopet også ha muligheter for fokusering. Et fullt utbygd UV-mikroskop koster langt over en million kr. Det er imidlertid mulig å tilpasse et instru­ ment selv av eksisterende, dels kasserte deler, samt et minimum av optikk. Ez trenger : (1) 1 stk. Zeiss Standard mikroskop

(2) Ultrafluarobjektiv 100/1.25 glye. (3) Projektiv i kvarts (5 x)10 x

(4) Kondensor akromat i kvarts med irisblende, n.a. 0.8 (fungerer også som et objektiv med fokuslengde 6.2 mm, forstørrelse 29.5 x ved 280 nm). (5) Gammelt Beckmann spektrofotometer for UV og synlig lys. Beckmanninstrumentet har et lampehus forsynt med en lavvoltslampe (6 V, 30 W) og en deuteriumlampe som gir lys i UV-området. Lampen har en spesiell spenningsforsyning. UV-utbyttet er forholds­ vis stort og tilstrekkelig for vårt formål. Ytre flater av instrumentet gjøres grundig rene, ofte har det hatt en kummerlig tilværelse på laboratoriet. Skru ikke fra hverandre selve kassen med UV-optikken, det hele kommer lett ut av justering og kan skades. Deuteriumlampen er ofte slitt og bør skiftes. Merk hvordan den var plassert i holderen i lampehuset, monter den nye lampen på samme måte. Utenpå lampehuset sitter justeringsskruer slik at UV-strålen kan justeres korrekt i forhold til den opti­ ske inngangen på monokromatoren.

68 Det er viktig å koble de 3 elektrodene riktig, lampen er kostbar. Kvartsglasset tørkes av med en ren klut fuktet i sprit, ellers brenner fingermerker seg inn i kvartsen som ødelegges. Det er absolutt nødvendig å bruke briller/beskyttelsesbriller og hansker (gummihansker holder) når man justerer lampen og lampehuset er «åpent». UV-strålingen er farlig for synet og er kraftig mutagen. Lampen tenner etter noen sekunder, først oppvar­ mes den av en glødetråd. Se ikke direkte på den! Er den først slått på, bør den brenne en stund, leve­ tiden er ca. 500 t og det koster omlag 10 kr timen. Merk: Det må ikke være annet enn kvartslinser i strå­ legangen, ellers virker systemet ikke.

(6) Exakta mikrofotograferingsutstyr (7) Mikroskopbord som sveises sammen av solide skinner og stålplater. Monokromatoren på spektrofotometeret løsnes og monteres vertikalt med utgangsåpningen i et utborret hull i bordplaten. Mikrosko­ pets feltblendeinnsats fjernes. Plasser mikroskopet sentrert slik at hullet i mikroskopfoten står i monokromatorens optiske akse. På bordplaten monteres strømforsyninger for deuteriumlampen (UV-lys) og synlig lys. Preparatet stilles skarpt i synlig lys (grønt eller blått) gjennom lupesøkeren i Exaktakameraet. (UV-lys er farlig for øynene!) Vi fotograferer etter å ha sjaltet over til UV. Ekspo­ neringstiden må utprøves. Et bilde som sees skarpt i grønn belysning er nær skarpt også i UV-området.

(8) Preparatene skal lages på kvarts objektglass (spesialglass fra Zeiss). De taes omhyggelig vare på, på grunn av høy pris. Dekkglassene er 0.35 mm tykke og har altså andre optiske spesifikasjoner enn vanlige dekkglass. Som innleirings- og immersjonsmedium skal brukes vanlig eller vannfortynnet glyserol.

Praktisk bruk av instrumentet: (1) Still bildet inn i grønt/blått lys (sett venderen på lampehuset på glødelampen). Det er hensiktsmessig å ha et par vanlige objektiver for innstilling ved lave for­ størrelser. (2) Snu venderen på UV og still inn ønsket bølgeleng­ de. Ikke se i mikroskopet! (3) Eksponer på «tid». Med en 16° DINs film er ek­ sponeringstiden mellom 5 s til 60 s avhengig av prepa­ ratet. Kondensoren bør også stå i glyserol og være inn­ stilt litt utenfor Kbhlerpunktet, ellers vil bildet av spalten sjenere og man får ikke full utlysning av syns­ feltet.

(4) Celler fra vanlig bakergjær er fine testobjekter.

Fikser dem i 2% glutaraldehyd, drypp på 30% glyse­ rol og legg på kvartsdekkglasset. Etter en tid er vannet fordampet, og preparatet ferdig. Man kan forsøke å fotografere ved ulike bølgeleng­ der. Merkelig nok absorberer cellekjernen ikke mye UV ved 254 nm, dette skyldes de ørsmå mengdene DNA og at andre forstyrrende kjemiske faktorer er tilstede. Preparater av store plantekromosomer er gunstige (se side 164) dersom de er farget med aceto-orcein. UV-strålingen blir absorbert, og man kan nå utnytte den økte oppløsningsevnen for å se finere kromosomdetaljer. Dette er et lønnsomt eksperimenteringsfelt som ikke har vært utnyttet på mange år. Det fins fremdeles ingen tilfredsstillende metoder for studium av squashpreparater i elektronmikros­ kop. Kvartsobjekt/dekkglass kan renses forsiktig i enzymløsning og brukes på nytt. Vi oppnår forbedring i oppløsningsevnen som øker med omlag en faktor 2 x. Også dybdeskarphet, fokus og forstørrelse endres når vi går ned i det ultrafiolette området. Den økte oppløsningsevnen kan være gunstig for kromosomstudier, men spiller ellers nokså liten rolle. Det ble drevet omfattende UV-undersøkelser på slutten av 1930-tallet, senere er feltet kommet i skyg­ gen av elektronmikroskopien. Moderne tekniske mu­ ligheter tilsier at forskningen på dette feltet bør inten­ siveres.

Scanning probe mikroskoper (Fig. 43-45) Disse instrumentene er av flere typer og inneholder ikke klassisk optikk. En fin spiss, - ofte bare et atom tykk, beveges over prøven i et rasterliknende mønster. I scanning tunneling mikroskopet (selve instrumentet er på størrelse med en termos) beveges metallspissen i x - y retningen ved hjelp av en piezoelektrisk krys­ tall. Avstanden til prøven holdes konstant, for eksem­ pel 8 A og utgjør en feed-back elektronisk krets. Mik­ roskopet har ekstremt høy vertikal oppløsning. Ved hjelp av den såkalte tunnelingeffekten passerer elekt­ roner mellom prøven og spissen. Hvis avstanden til prøven bare endres 1 Å, øker tunnelingeffekten med en størrelsesorden. Ved hjelp av feed-backkretsen blir oppløsningen vertikalt så liten som 0.1 Å. Det er lett å lage en spiss med et atom i tuppen (man klipper skrått av en platinatråd). Ved det piezoelektriske sy­ stemet oppnåes en horisontal oppløsning på ca. 1 Å. Det synlige bildet bygges opp av en vanlig datamas­ kin. Instrumentet egner seg for faste, ledende flater. I den senere tid har man oppnådd bilder av biologiske objekter, DNA, virus etc. Instrumentet er forholdsvis lett å bruke og koster ikke mer enn et vanlig, velutbygget lysmikroskop. Gerd Binning og Henrich Rohrer konstruerte dette instrumentet i 1980-1981, noe de se­ nere ble tildelt Nobelprisen for sammen med Ernst Ruska (medoppfinner av elektronmikroskopet). Scanning force mikroskopet (SFM) er basert på et

69

Figur 43 Jodatomer avbildet i scanning tunnelig mikroskop. Jodatomene er adsorbert til en platinaoverflate og scannet i luft. Merk at et atom mangler! (Nanoscop II STM).

70 Data arbeidsenhet

Kontrollenhet

Mikroskop

640x480x8 Display

Høyhastighetsdigitalsignal prosessor

140 Megabyte Harddisk 4 Megabyte RAM 32 Bit 80386 Mikroprosessor

Figur 44 Prinsipp for oppbygning av scanning tun nei ig mikroskop. Selve mikroskopet er vist til høyre. For virkemåte se teksten.

vektarmprinsipp. En ørliten, enarmet vektstang har et distalt speil (på yttersiden). På den andre siden av vektarmen (på undersiden av speilet) fins en fin spiss. La­ serstrålen reflekteres av speilet til en fotodetektor. Når spissen scannes over overflaten, vil den beveges opp og ned, idet den følger de lokale forandringene i høy­ de. På samme måten som med scanning tunneling mikroskopet bygger en computer opp det synlige bil­ det. SFM egner seg spesielt for ikke-ledende overfla­ ter. Dette instrumentet har også en oppløsning på noen få atomdiametre.

Optiske pinsetter I vår daglige verden har lys for praktiske formål ver­ ken masse eller vekt. En folkevogn som står i sollyset veier høyst noen nanogram mer enn en som står i skyggen, en neppe målbar forandring i trykket mot underlaget. Får lyskilden tilstrekkelig intensitet og be­ veger vi oss ned i den mikroskopiske verden, blir for­ holdet annerledes. En bakterie, eller et kromosom har en vekt som er av samme størrelsesorden som trykket eller «vekten» av en fokusert laserstråle. På grunn av partikkelens ujevne form vil de krefter som virker på den føre den inn i den sentrale delen av strålen. En la­ serstråle kan altså brukes som en slags «pinsett», man kan holde fast på en partikkel og forflytte den i cellen. Brukes langbølget laserlys, vil det ikke oppstå stor temperaturstigning i fokusområdet, bare et par grader

C, på tross av den enorme intensiteten på lyset. Med kortere bølgelengder kan man kutte, eller skjære i organeller. Ved valg av passende bølgelengder kan man altså også operere på innsiden av cellen uten å ødeleg­ ge cellemembranen. Slike optiske «pinsetter» er nå under utvikling for kommersielt bruk. Det er mulig­ heter for å kutte ut stykker av kromosomer i levende celler og bruke dem til genteknologiske formål.

Infrarød mikroskopi I motsetning til ultrafiolett mikroskopi kreves lite ut­ styr for å studere preparatene i det infrarøde området. Et vanlig mikroskop med kamera og noen spesialfiltre er tilstrekkelig. I tillegg trengs infrarød følsom film. Lys med lengre bølgelengde enn 800 nm trenger lett gjennom vanlig glass. Akromatiske objektiver kan brukes, men de er ikke helt gode i det infrarøde områ­ det. Apokromater gir bedre bilde. Man mikroskoperer med et strengt rødfilter. Dette skal slippe igjennom lys med lengre bølgelengde enn 700 nm. Mellom projektivet og kamera innsetter man et fiolett filter som lar infrarød stråling mellom 800 nm og 1200 nm passere uhindret. Vi stiller skarpt i det røde området og fotograferer gjennom fiolettfilteret. Med apokromater er det minimale fokuseringsforskjeller mellom rødt og infrarødt område. Vanlige glødetrådslamper produserer rikelig infrarød stråling.

71

Figur 45 Prinsipp for scanning «lys»mikroskop. Detektoren er en fin pipettespiss som beveges piezoelektrisk som hos STM.

Man må passe på at ikke linsesystemet oppvarmes unødig. På grunn av den økte bølgelengden blir oppløsningsevnen for objektivet betydelig svekket. Fordelen med et infrarødt fotografi er strålenes evne til å trenge inn i tilsynelatende ugjennomsiktige objekter som kitinskall hos insekter, tann- og tremateriale etc. Infrarød film må oppbevares kjølig og fremkalles rett etter eksponeringen.

Lysmikroskop uten linser I forbindelse med utvikling av det konfokale mikroskoper er det skaffet tilveie omfat­ tende kunnskap om bruk av laserlys i for­ bindelse med en rasterliknende avsøkning av preparatet. I vanlig lysmikroskopi der man benytter linser, er oppløsning i lateralplanet sterkt begrenset. Som vi har sett er den avhengig av lysets bølgelengde. Ethvert

punkt i preparatet representeres av konsen­ triske diffraksjonsringer. Minimalstørrelsen er omlag en halv bølgelengde for det ly­ set vi bruker. Påfallende lys mot preparatet vil imidlertid bli brutt i både homogene og ikke-homogene bølger. De ikkehomogene bølgene inneholder informasjon om strukturer som er vesentlig mindre enn bølgelengden for det lys vi bruker. Slike ikke-homogene bølgetog fins bare i nærfeltet, som de ikke kommer ut av. Hvis vi senker en liten detektor ned i dette nærfel­ tet, kan denne informasjonen oppfanges. Detektoren må stå i en avstand som er mindre enn lysbølgelengden. Prinsippet for dette har lenge vært kjent. Proble­ mene med å oppfange slike bølger ble ansett for å være nær uoverstigelige for praktisk mikroskopi. De­ tektoren består av en glasspiss med et hull i tuppen. Glasspissen er pådampet metall. Radius i spissen kan lages så liten som 10 nm. Slike spisser fins i ulike ut­ forminger, noen er laget ved å trekke ut mikropipetter.

72 Disse kan eventuelt forsynes med en fluorescerende krystall i spissen. Man kan oppnå en oppløsning i lateralplanet på 20-30 nm. Detektoren beveges piezoelektrisk, og signalet fra detektoren bygges opp som et synlig bilde på en dataskjerm. Slike mikroskop vil i lø­ pet av kort tid å få stor betydning ved studiet av fin­ struktur i kromosomer.

Konfokale mikroskoper (Fig. 46) Når lyset fra kondensor passerer gjennom preparatet i et vanlig lysmikroskop oppstår det en rekke forstyr­ relser i det optiske bildet. Hvis preparatet er tykt, blir bildet uklart. Ved lysbrytningen dannes det en rekke bilder både over og under fokalplanet for objektivet. Informasjonen sammenblandes, og for å unngå dette pleier vi å lage preparatene tynnest mulig. Professor Abbé formulerte i 1873 og 1884 sin be­ rømte optiske lov for mikroskopet, som sier at opp­ løsningsevnen avhenger både av aperturen for objek­ tivet og for kondensor: d - 1,22 / X (Naobj + Nacond) d er altså den minste avstanden mellom to diffraksjonsbilder fra to preparatpunkt som mikroskopet kan avbilde. Denne formel gjelder for oppløsning i flaten, altså lateralplanet. Den aksiale oppløsningsevnen følger en annen for­ mel (Francon 1961). Definerer vi : 3 som innstillingsnøyaktigheten (det vil si det om­ rådet man kan variere finfokus uten synlig forandring i objektet) så er

2/3 = X / (4 Na • sin2 (u/2)) der u er vinkelen for halve strålebunten som går inn i objektivet. Vi ser at aksial oppløsning øker med kvad­ ratet av numerisk apertur i motsetning til den laterale som bare avhenger av aperturen i første potens. I konfokale mikroskop belyses bare en liten del av synsfeltet, gjerne et lite «punkt». Punktet beveger seg over bildefeltet i et rasterliknende mønster, omtrent som på T V-skjermen. På dataskjermen oppbygges det synlige bildet. Bare lys fra belysningspunktet detekte­ res til ethvert tidspunkt. Dette oppnår vi med bruk av blendere som består av små hull. Blenderhullet for be­ lysning og blenderhull for detektor fins i optiske, kon­ jugerte fokalplan, (se Fig. 46). Detektoren registrerer fortrinnsvis lys fra det preparatpunktet som til enhver tid belyses, ikke fra plan ute av fokus. Ideelt sett kan man med dette systemet øke den laterale oppløsning­ sevnen med en faktor av 2 x. I hvert fokalplan avbildes bare punkt i fokus. Lys fra andre fokalplan passerer ikke opp gjennom blendehullet for detektor. Data­ maskinen bygger opp tredimensjonale bilder ut fra et sett enkeltbilder i ulike høyder i preparatet.

Figur 46 Arrangement for laser scanning konfokalt mikroskop. Ved hjelp av et bevegelig delespeil beveges en tynn lysflekk over preparatet. Begge hullblendere (for belysning og detektor) er arran­ gert konfokalt. Derved avbildes bare strukturer i fo­ kus. Lys fra utenforliggende strukturer vil ikke pas­ sere hullblenden til detektor. Etter E. Leitz, GmbH, Wetzlar.

Kommersielle konfokale mikroskop er basert på to ulike scanningprinsipper. Noen mikroskoper er basert på en roterende skive (Nipkows skive) med hullsett ar­ rangert i en såkalt Arkimedes spiral. Skiven roterer med en bestemt hastighet. Andre mikroskoper benyt­ ter vibrerende speil.

Tredimensjonale bilder uten konfokale mikroskop Ved hjelp av et ordinært digitalt videokamera, et van­ lig lysmikroskop, et passende dataprogram og en ordi­ nær IBM-kompatibel eller Apple datamaskin, kan

73 tredimensjonale mikroskopbilder nå rekonstrueres ut fra utydelige enkeltbilder i tykke preparater fra ulike fokalplan. Ifølge brukere er resultatene sammenlikn­ bare med dem man får fra konfokale mikroskoper. Denne teknikken representerer beskjedne investe­ ringen

Tenker vi oss en lysstråle av vanlig upolarisert lys, foreligger det svingninger i alle plan vinkelrett på strå­ len. Dersom slikt lys treffer på en dobbeltbrytende krystall (anisotrop krystall), deles strålen vanligvis i to (Fig. 48). De to nye strålene får svingeplan vinkelrett på hverandre og de er forskjellige. Den ene strålen passerer gjennom krystallet med konstant brytnings­ indeks:

Polarisasjonsmikroskopi Sin

d

/ sin

3

^-(ordenllig stråle)

’ ti

Polarisasjonsmikroskopet gir oss en mulighet til å an­ alysere preparatene på ultrastrukturnivå uten å bruke elektronmikroskop. Innen geologi er polarisasjons­ mikroskopet et viktig forskningsinstrument av uvur­ derlig betydning for studium av mineralsammensetning i bergarter og andre formål. Innen biologi og medisin spiller det mindre rolle for målinger og analy­ ser. Polarisert lys inngår imidlertid i optiske kontrasteringsmetoder og for påvisning av visse cellestrukturer. Bruk av polarisert lys muliggjør såkalt optisk farging med slående resultater vel egnet til fargefotografering.

uansett hvilken innfallsvinkel den har. Den andre strålen har varierende brytningsindeks med innfallsvinkelen (overordentlig, stråle). Treffer den innfallende strålen krystallet med en viss, karakteristisk innfallsvinkel, vil den ikke spaltes i det hele tatt, men passere gjennom krystallets optis­ ke akse (Fig. 47). Dersom den overordentlige strålen brytes sterkere enn den ordentlige, er krystallet nega­ tivt dobbeltbrytende.

Figur 47 Strålegangen i et polarisasjonsmikroskop med dobbeltbrytende objekt i normalposisjon mellom kryssete polfiltre (se også Fig. 48). Ly­ set fra polarisator svinger parallelt til en eller beg­ ge svingningsretninger i objektet (for eksempel parallellt til y1). Vi får full utslukning av lyset. E. Leitz, GmbH, Wetzlar.

Figur 48 Det dobbeltbrytende objektet er i diagonalposisjon (se Fig. 47). Ettersom de to stråler brer seg med ulik hastighet gjennom objektet, oppstår en gangforskjell T = Å. E. Leitz, GmbH, Wetzlar.

74 Dobbeltbrytningen (= «birefringence») er for­ skjellen mellom brytningsindeksen til de to strålene:

B = ne-n0

(e - overordentlig, o = ordentlig stråle)

Sammenhengen mellom brytningsindeks og innfalls­ vinkel kan uttrykkes i et såkalt indikatrixdiagram. Indikatrix er en romlig, ofte elliptoidisk figur. Fra et sentralt punkt utgår to vinkelrette akser. Disse illu­ strerer oppspaltningen av den innfallende strålen mot en dobbeltbrytende krystall. De ulike akselengdene er proporsjonale med de respektive brytningsindeksene på ordentlig og overordentlig stråle. Vi tenker oss inn­ fallsvinkelen variert fra enhver retning. Den romlige figur som endepunktene på de to oppspaltete strålene beskriver er nettopp indikatrix. For et positivt enakset objekt oppstår en «slank» indikatrix, for et negativt enakset objekt en sammentrengt indikatrix. I et iso­ tropt objekt oppstår bare den ordentlige strålen (n j som følgelig beskriver en kule. For biologiskmedisinske undersøkelser med polarisasjonsmikroskopet er det nok å bestemme retningen for den største og minste brytningsindeksen og sløyfe mellomverdie­ ne. Man konstruerer ikke en fullstendig indikatrix, men et kors med proporsjonalt lengdeavstemte akser. Hvis lineært polarisert lys passerer gjennom en dobbeltbrytende krystall, kan svingeretningen falle sammen enten med den for den ordentlige eller for den overordentlige strålen. Lyset som kommer ut, blir da påvirket slik at det får svingeretning ut av krys­ tallet. Hvis ikke det påfallende lyset har en av disse svingeretningene, blir det oppdelt i begge de mulige svingeretninger. Hver av de nye strålene er også lineært polariserte, og de to svingeplan står i rett vinkel på hverandre. Lyset går saktere gjennom et medium med høy brytningsindeks enn gjennom luft. Jo større bryt­ ningsindeksen er, desto lavere blir lyshastigheten. I dobbeltbrytende krystaller fins det to ulike brytningsindekser og dette fører til ulik hastighet og ulik bølge­ lengde gjennom det anisotrope mediet. Dette fører til en såkalt gangforskjell. Gangforskjellen er lik for­ skjellen mellom den største (ny) og minste (na) bryt­ ningsindeksen multiplisert med tykkelsen av det dob­ beltbrytende objektet. Differansen i brytningsindeks uttrykkes ofte som styrken av dobbeltbrytning og er konstant for et bestemt materiale:

gangforskjell på 1/8 X fører til en faseforskyvning på 45 °. Tegner vi dette opp som to faseforskjøvete sinuskurver vinkelrett på hverandre, kan dette kombineres slik at alle punkter ligger innenfor en ellipse. Vi har fått såkalt elliptisk polarisert lys. Er gangforskjellen 1/4 X, blir faseforskyvningen 90°, og dette resulterer i sirkulært polarisert lys. Ved å sammenlikne fasene for begge sinuskurver og ut fra konstruksjon fra akse­ korset kan man finne svingningsmønsteret for enhver gangforskjell. Når lys kastes tilbake fra blanke overflater, vil det bli polarisert. Dette gjelder for eksempel glass, men ikke metallflater. I fototeknikken er det vanlig å fjerne speiling i overflater med et såkalt polarisasjonsfilter. Filteret dreies til det sperrer for det polariserte lyset.

T = d • (ny - na)

oø O ø0 o

Fordi de utgående strålene har svingeretninger vinkel­ rett på hverandre kan de ikke interferere på vanlig måte. Måten de forener seg på kan konstrueres. En

Figur 49 Ved dreining av objektbordet 360° mel­ lom kryssede polfiltre vil et dobbeltbrytende ob­ jekt utvise fire posisjoner med full utslukning og fire posisjoner med full lysgjennomgang. E. Leitz, GmbH, Wetzlar.

28389 550 R

75

a =b =c a = 0 = y = 90°

Is o tro p

Kubisk :

Hexagonal:

ai = a2 = a3 t c a = $ = 90°; •/ = 120°

ai = a2 = a^

a\ = ai = «3

90°

E n a k se t

Rhomboedrisk :

Tetragonal:

a = b #= c a = 3 — y = 90°

a =# b + c a = ■? = y = 90°

Monoklin:

a * b ic a = y = 90°; £ * 90°

_________________ T o a k s e t

Rhombisk :

Triklin: a =# b / c a t 3 * y t 90°

I

Figur 50 Oversikt over atomarrangement og akseforhold i isotrope, enaksete og toaksete krystallsystemer. E. Leitz, GmbH, Wetzlar.

76

Figur 51 Dobbeltbrytende, kileformet objekt (såkalt kvartskjegle), brukes for målinger mellom kryssete polfiltre i diagonalposisjon. (a) - (c) i monokromatisk lys. Mørke striper opptrer ved gangforskjeller på 0, 1X, 2 X, 3 X, 4 X. Lyse striper opptrer ved gangforskjeller på 1/2,3/2 X, 5/2 X. Øker vi bølgelengden (fra blått mot rødt), øker avstanden mel­ lom stripene, (d) i hvitt lys oppstår partier med karakteristiske interferensfarger som er relatert til bestemte verdier for gangforskjellene. E. Leitz, GmbH, Wetzlar.

77 Moderne polarisasjonsfiltre er fremstilt av stoffet herapatitt. Oftest er dette en celluloidhinne som inne­ holder tallrike herapatittkrystaller med aksene ordnet i samme retning. Ved undersøkelser i polarisert lys anbringes objek­ tet mellom to polarisasjonsfiltre. I mikroskopet plas­ seres det ene under kondensor (polarisator), det andre over objektivet (analysator). Etter å ha passert polari­ sator er lyset polarisert. På filtrene er angitt med en strek svingeplanet for lyset som kan passere. Analysator vil tillate passasje for lys som er i samme svingeplan som polarisator. Dreier vi analysators svingeplan 90° i forhold til polarisator, vil ikke lys komme ut av mikroskopet. (Finere mikroskoper er forsynt med dreibar, gradinndelt filterholder). Setter vi inn et glasstykke mellom filtrene (objektglass), vil det nå være usynlig. Inneholder preparatet en dobbeltbrytende struktur (stivelseskorn etc.), vil svingeplanet bli påvirket og dreies. Dreiningens stør­ relse avhenger av preparattykkelsen og graden av dobbeltbrytning. Dreiningen av svingeplanet varierer for ulike lys-

B1

BH

H

1 i

O

bølgelengder. Lysbølger av en farge som dreies 90° bort fra polarisators svingeplan vil utslukkes (Fig. 49). Det lyset som passerer analysator, er blandingsfargen av det spektrum som er blitt tilovers. De to bølgerekkene som fremkommer ved dobbeltbrytningen i preparatet, kan i noen tilfeller ha en slik faseforskjell ved ankomst til analysator at de utslukkes ved interfe­ rens. Dette fører også til blanding av de resterende farger. Enkle polarisasjonsunderøkelser kan utføres i et vanlig mikroskop dersom man har to polarisasjons­ filtre og helst en såkalt kompensator. For nøyaktigere undersøkelser kreves spesialoptikk. Den er såkalt spenningsfri, dessuten kreves et dreibart objektbord med gradskala og nonius, samt en dreibar analysator med gradskala. Plasserer vi en kompensator (en glimmerkrystall av bestemt tykkelse mellom analysator og polarisator, så får hele synsfeltet en rød farge av såkalt 1. orden. Der­ som nå objektet forårsaker bare en liten dreining av svingeplanet, vil fargen på det endres til blåfiolett el­ ler gult. Ofte brukes såkalt ortoskopi ved betraktning av mi-

1

1 1

te

■

■

■

■

* Ved 1/4 k - Gimmerplate opptrer svarte punkter istedetfor svarte buesegmenter

Figur 52 Eksempler på bestemmelse av optisk karakter av en- og toaksete kystaller. Karakteristiske konoskopiske bilder er vist, disse endres med dreiningsposisjonen av kompensatorplaten.

78 neraler. Man fjerner okularet og betrakter karakteris­ tiske bøyningsbilder som sees over objektivet (konoskopi). Mange polarisasjonsmikroskoper er forsynt med en såkalt Amici-Bertrand linse over objektivet som fungerer som et hjelpeobjektiv og gir et svakt for­ størret bilde av bøyningsmønsteret (Fig. 52). Ved hjelp av polarisasjonsmikroskoper kan vi måle gangforskjeller i dobbeltbrytende objekter. Gangforskjellene kan uttrykkes optisk som karakteristiske in­ terferens farger. Disse utgjør et spesielt mønster og er sammenstilt i en interferensfargetabell etter MichelLevy. Interferensfargene er inndelt i grupper fra 1 til 4 orden. Med øvelse kan man meget nøyaktig bestem­ me gangforskjeller innenfor snevre intervaller på noen nanometer (se også Fig. 51). (For detaljer vedrørende måleteknikker henvises til spesiallitteraturen (for eksempel Patzelt, W.J. (1974) Polarisationsmikroskopi. Grundlagen, Instrumente, Anwendungen. E.Leitz, GmbH, Wetzlar).

Fluorescensmikroskopet Bestråler vi visse stoffer med energirikt lys (eksitasjonsstråling), vil de selv kunne sende ut lys av lengre bølgelengde (luminiscens). I noen tilfeller fortsetter lysemisjonen et­ ter at eksiteringslyset er slukket (fosfores­ cens). Fosforenscensen kan vare fra et se­ kund til flere måneder avhengig av materia­ let som eksiteres. Det luminiscensfenomen som opphører idet eksiteringslyset slukkes, kalles for fluorescens. I fluorescerende stoffer vil elektronene i de eksiterte moleky­ lene gå til til baner med høyere energinivå, for så å «falle» tilbake i sin opprinnelige bane. Ved overgang til det lavere energinivå­ et utsendes lyskvanter (fluorescenslys) med lengre bølgelengde enn eksiteringslyset. Med fluorescensmikroskopet kan man påvise ytterst små strukturer eller ansam­ linger av biokjemisk interessante molekyler i cellen. Fluorescensteknikker medfører økt følsomhet i forhold til de vanlige fargeteknikkene man bruker for biologisk og medisinsk materiale. Ved å koble fluoresce­ rende fargestoffer til karakteristiske anti­

stoffer kan man med den såkalte immunfluorescensteknikken påvise antigener i cel­ ler og vev. Fluorescensteknikker har også vært av betydning innen kromosomstudier. Moderne fluorescensmikroskoper har avansert optikk. Det er en tendens til fluorescensfenomener i substansen som kitter linsepar sammen, dels i visse glassorter. Bare visse objektiver egner seg til fluorescensmikroskopi,oftest er dette fluoritobjektiver som gir særlig klare bilder på grunn av få linseflater. En rekke biologiske stoffer som blant andre klorofyll og oljer viser egen fluores­ cens. De fleste objekter som studeres i fluo­ rescensmikroskopet mangler denne. Dette gjelder bakterier, andre celler og cellevev. Ved farging med visse fluorescerende farge­ stoffer, fluorokromer, kan disse cellene el­ ler deler av dem bringes til å fluorescere. Fluorochromene brukes ofte i meget svake konsentrasjoner. Det gjør det mulig å fluorescensundersøke ufiksert, tildels levende cellemateriale. Optisk sett kan fluorescensmikroskopet være basert på to ulike prinsipper. Det enkleste er såkalt gjennomfallende fluores­ cens. Foran mikroskoplampen (kvikksølv-, xenon-, eller en halogenlampe) plasseres eksiteringsfilteret. Dette slipper bare igjen­ nom lys i UV-området eller det blå (noen ganger grønne) området. Vi behøver ikke optikk av kvarts, ettersom vanlig glass i de optiske delene slipper igjennom stråling fra ca. 300 nm og oppover. Denne strålingen er energirik nok for de fleste fluorescensformål. Ofte brukes et UV-filter (eks. Jena UG 5) eller et blåfilter (Jena BG 12). Mikrosko­ pet kan ha en ordinær lysfeltkondensor, el­ ler bedre en mørkefeltkondensor. Med sist­ nevnte blir det nesten bare det emitterte fluorescenslyset og lite av eksitasjonsstrålingen som passerer opp fra preparatet gjennom objektivet. Over okularet, eller i tubus over objektivet, plasseres et sperrefil-

79

ter som absorberer all stråling under ca. 470 nm. Filteret har en gulaktig farge og må ikke ha egen fluorescens. Fluorescensen kan til nød sees uten dette filteret. Gjennomfallende fluorescens er kraftigst ved svake forstørrelser. Dersom vi trenger bare å bruke objektiv 10 x eller 20 x, er gjen­ nomfallende fluorescens å foretrekke (Fig. 53). Ved det andre systemet sendes eksite-

Eksiteringsfilter

ringslyset inn fra siden. Et skråstilt speil (i 45° vinkel) sender lyset ned gjennom ob­ jektivet. Dette speilet er et såkalt dikroitisk delespeil der bare en smal del av spekteret reflekteres ned mot preparatet, øvrig strå­ ling passerer gjennom det og absorberes i tubusveggen (Fig. 54 og 55). Selve objektivet fokuserer eksiteringslyset ned mot preparatet. Optisk sett fungerer objektivet altså som kondensor. Det emit-

27640-512 R

Figur 53 Prinsipp for eksitering ved gjennomfallende bestråling. Lys som har passert eksiteringsfilteret sendes mot preparatet gjennom mørkefeltkondensor. Direkte lys når stort sett ikke inn i objektivet. Fluorescenslyset passerer gjennom objektivet og rester av eksiteringslyset absorberes i sperrefiIteret. Lysstyrken er størst ved lave forstørrelser (lav objektivapertur). Systemet er mindre egnet ved sterke forstørrelser/høy objektivapertur. E. Leitz, GmbH, Wetzlar.

80

Okular

Sperrefilter 1

Sperrefilter 2

(innebygd)

Dikroitisk

delespeil

Eksiteringsfilter

Objektiv

27639-512 R

Preparat

Figur 54 Prinsipp for eksitering i påfallende lys. Fra eksiteringsfiIteret sendes lys ned mot preparatet gjen­ nom objektivet som optisk sett fungerer både som kondensor og objektiv. Sperrefiltre tar vekk uønsket reststråling fra eksiteringslyset. Systemet gir sterkest fluorescens med objektiver med høy apertur/forstørrelse. Er mindre egnet for svake forstørrelser. E. Leitz, GmbH, Wetzlar.

terte lyset passerer andre veien opp gjen­ nom objektivet, via delespeil og sperrefilter til okularet. Ved påfallende eksitering har altså objektivet en funksjon både som kon­ densor og objektiv. Kondensor blir altså her presist sentrert i fokus. Systemet er ut­ viklet til fulkommenhet av hollenderen J.S. Ploem. Ved påfallende eksitering er fluorescen­ sen sterkest ved bruk av objektiver med høy apertur. I moderne fluorescensmikroskoper leve­ res de tre filtrene (eksitasjonsfilter, dele­

speil og sperrefilter) ferdig kombinert i en liten «kassett» som kan monteres inn i strå­ legangen. Disse plasseres ofte i en «revolverfatning» der man lett kan veksle mellom forskjellige filter kombinasjoner (se Fig. 55). Fluorescens i påfallende lys kan lett kombi­ neres (i transmisjon) med fasekontrast eller andre optiske kontrasteringssystemer. Flu­ orescens kombinert med konfokal mikros­ kopi er et særlig lovende felt som for tiden er i sterk utvikling.

81

Figur 55 Prinsipp for PLOEMOPAK. Lys fra kvikksølvlampen passerer varmeabsorberende filtre og eksiteringsfiltre. Systemet har roterbar revolver med fire, valgbare, faste filterkombinasjoner. Hver kombinasjon er tilpasset en bestemt fluorescensteknikk. E. Leitz, GmbH, Wetzlar.

Testskjema for nye og brukte mikroskop, sett (x) Generell tilstand'. Nytt instrument ( )

Brukt instrument ( Alder ( ) år

Serienummer stativ: Serienummer optikk: Objektiv: Objektiv: Objektiv: Objektiv: Annen optikk:

Pent behandlet ( ) Middels behandlet, noe slitt ( ) Stygt behandlet, må repareres ( )

Stativets stødighet: God ( ), middels ( ), dårlig ( )

)

Stativets ytre tilstand: Er det støv ( ), riper ( ), skader etter slag og støt ( ), rester av farge ( ), immersjonsolje ( ), innleiringsmidler ( )? Generell synlig slitasje ( )?, slitasje på objektbord ( )?. Løse skruer ( )?, merker etter ukyndige repara­ sjoner ( )?, spor/riper etter bruk av feil verktøy ( )? Objektivenes tilstand: Er metallkappene rundt frontlinsene på objektivene rene ( )? Er metallkappen matt ( )?, tegn på etseskader ( )?, riper ( )?

82 Hvis riper i metallkappen, undersøk frontlinsen spesielt i en binokularlupe. Er det tegn til riper ( ) el­ ler andre skader ( ) på frontlinsen? Er det fingeravt­ rykk ( )?, rester av immersjonsolje ( ) eller andre av­ setninger ( )? Skru ut objektivene, hold dem mot lyset. Er det tegn på oppsprekking, forvitring, eller luft i kittet mellom enkeltlinsene ( )? Dette sees som skygger eller lysbrytende strukturer. 1-2 luftblærer kan godtas i apokromater. Er det mange luftblærer ( )?

tyder dette på generelt dårlig behandlet instrument. Hvis utsvingbar topplinse, - er det mye støv, glassbiter fra knuste objekt -, dekkglass? Ja ( ), nei ( ). Sist­ nevnte tyder på alvorlig feilbruk. Andre forhold: Er irisblendene i orden? Ja ( ), nei ( ). Grunnet varme fra lampen tørker ofte oljen i feltblenden ut. En «fastlimt» blende går istykker om den forsøkes beveget med makt.

Hvis 5 feil eller flere, kjøp ikke mikroskopet.

Okularenes tilstand, optikkens sammensetning: Støv på innsiden av okularer ( )? Riper ( )? Hører de optiske delene sammen, hører de til sam­ me mikroskop ? Ja ( ), nei ( ). Optisk akse, stativets sentrering/ tilstand: Bevegelsen på grov- og finskrue: Virker de «løse» eller slarkete ( )? Må man bruke stor kraft for å kunne be­ vege dem ( )? Er bevegelsen myk, jevn ? Ja ( ), nei ( ) Virker objektfører/kryssbord tilfredsstillende ? Ja ( ), nei ( ). Kan okularene beveges mykt i tubus ( )?, eller er det slark ( )? Med slark menes at okularene kan forskyves ca. 0.5 mm i sideretningen. Still inn mikroskopet etter Kdhler. Er det problemer med innstillingen ? Ja ( ), nei ( ). Er det tegn som ty­ der på at det er vanskelig å få sentrert delene langs den optiske aksen (skjevt lampefeste ( )? gal sentrering av innebygd speil ( ), skjevheter i mikroskopfot ( ) etc.)? Still en preparatstruktur midt i synsfeltet med 10 x objektivet. Ligger strukturen fremdeles i sentrum med 40 x og 100 x objektivet ? Ja ( ), nei ( ). Er objek­ tivene parfokale? Ja ( ), nei ( ). Er et gnisselyder? Ja ( ), nei ( ), eller ujevn kraft som brukes? Ja ( ), nei ( ), når objektivrevolver dreies?. Hvis ja, mulig feil i kulelager. Bruk et blodutstryk som testpreparat. Er detaljer i randen av synsfeltet skarpe når de fokuseres? Ja ( ), nei ( ). Still skarpt med immersjonsobjektivet. Vent 10 mi­ nutter. Er bildet fremdeles i fokus? Ja ( ), nei ( ). Synker objektbordet ? Ja ( ), nei ( ). Dette kan umuliggjøre mikrofotografering. Hvis synkingsfenomener, - er det muligheter for å stramme opp skrue­ ne? Ja ( ), nei ( ). Dødgang i mikroskruen ? Ja ( ), nei ( ). Maksimal toleranse +/- 2 jxm.

Binokulartubus'. Hvordan er fatningen, er det slepet støpegods? Ja ( ), nei ( ), eller herdet metall? Ja ( ), nei ( ). Støpegods tyder på dårlig, generell kvalitet. Er binokulartubus i orden? Ja ( ), nei ( ). Støt, slag eller fall på gulvet kan ha brakt prismene ut av justering. Kondensors tilstand: Er det skader i topplinsen? Ja ( ), nei ( ). Hvis skade,

Stell og pass av mikroskopet Lysmikroskopet er et kostbart presisjonsinstrument som man kan ha glede av hele livet ved riktig stell og bruk. Instrumentets hovedfiender er etsende kjemika­ lier, samt støv og rusk som kan lage riper eller andre skader på optiske flater. Dersom mikroskopet står ubeskyttet på laboratoriebenken i lengre tid, vil det uvegerlig støve ned. Det skal alltid beskyttes med en solid plasthette når det ikke er i bruk. Små mikrosko­ per som bare brukes av og til, har det best når de lag­ res i den medfølgende kassen. OPTIKKEN

Mikroskopets optikk kan lett skades av støv. Feil pro­ sedyre for renhold fører uvegerlig til små, nesten usynlige riper i optikkoverflaten. Disse skader linsens yteevne. Større støvpartikler kan blåses av. Faren er at de trenger inn på innsiden fra ytre linseflater.

Pass av oljeimmersjonsobjektivet Vi har allerede såvidt stiftet bekjentskap med oljeim­ mersjonsobjektivet under innstillingen av tulipanpreparatet. Oljeimmersjonsobjektivet er mikroskopets mest ømfintlige del og kan lett ødelegges ved feil bruk. Til dette objektivet er det praktisk å disponere en såkalt «dobbeltflaske» (se Figur 20). Den består av en indre sylinder av brunt glass. I sylinderen fins immersjonsoljen, - en seig væske med samme lysbrytning(n.d. = 1. 515) som glass. Sylinderlokket er festet til en liten glasstav som brukes for å hente opp oljen som enkeltdråper. I den ytre, klare delen av dobbeltflasken heller man xylen (= rensevæske). Løfter man opp den brune giassylinderen, følger det med et par dråper xylen på utsiden av den. Rens alltid immersjonsobjektivet etter bruk! Gam­ mel olje blir seigere etter hvert og tørker inn til en hard klump (spesielt gjelder dette cederolje). Derved kan frontlinsen bli ødelagt dersom man forsøker å fjerne belegget. Klumpen kan også støte mot preparatet og føre til at frontlinsen blir trykket inn i objektivet når man forsøker å mikroskopere. Reparasjon av dyrere objektiver kan koste flere tusen kroner.

83 Rens linsen på følgende måte: (1) Tørr forsiktig av oljedråpen med et rent linsepapir. Bruk ikke makt. (2) Ta et nytt linsepapir. Drypp på 1-2 dråper xylen fra dobbeltflasken. Tørr raskt over linsen med papiret. Den skal nå være helt ren. (3) Snu objektivet opp/ned (linseflaten opp). Hold det på skrå mot en vanlig bordlampe slik at lampen speiles i linseflaten. Kikk på linseflaten med en liten håndlupe. (4) Linseflaten skal synes helt blank og ren, uten tegn til riper eller andre skader. Er det kommet skader på flaten, må objektivet repareres. Fatningen rundt frontlinsen skal også være helt ren og blank. Er det tegn til riper, matthet (skyldes etseskader, saltvann, syre) er dette et tegn på tidligere feil bruk som også kan ha medført optiske skader.

(5) Vi kan altså lett studere linsens tilstand ved å la lampelyset reflekteres i frontlinsens ytre flate. Dyrere linser med feil lar seg reparere på fabrikken. En del moderne objektiver (sterkere tørrobjektiv), har kon­ kav frontlinse. Disse kan ikke rengjøres på vanlig måte. Følgende metode anbefales: (1) Forsøk først å fjerne harde partikler med en mårhårspensel. Lykkes dette, kan linsen rengjøres med isopor (halvstiv skumplast brukt i innpakningsmateriale).

(2) Brekk av en passende isoporbit slik at det blir en fri bruddflate. På isoporflaten stikker det frem halvkuleformete partier. (3) Trykk forsiktig en halvkule inn i det konkave om­ rådet på objektivet. Drei forsiktig. Fett- og oljebelegg forsvinner. Bruk ikke makt, heller ikke xylen (løser isopor). Til særlig gjenstridig belegg kan brukes en dråpe tynt såpevann (oppvasksåpe). Linseflaten skal være helt blank og blålig skinnende. Fotoforretninger fører spesialrensemiddel for fotoobjektiver (for ek­ sempel Kodak Lens Cleaning Solution). Pass på at vann ikke trenger inn forbi den ytre linsefatningen.

Skru aldri fra hverandre immersjons- eller andre ob­ jektiver. Det er umulig å få linsene korrekt sentrert igjen uten optisk måleutstyr. Øvre objektivlinseflate kan renses for støv med en «ørepinne» (pinne omviklet med bomull, fåes på apotek). Svært ofte er objekti­ ver med konkave frontlinser tilsmusset.

Okularer Vi kan uten problemer skru okularene fra hverandre for rensing. Dermed kan støvbelegg også fra indre linseflater fjernes. Merk at det er flere muligheter for feil sammensetning.

STATIVET

De fleste verktøyforretninger fører i dag spesialverk­ tøy i små plastkasser for vedlikehold av presisjonsmekanikk. Prisen på verktøyet har sammenheng med kvaliteten. Verktøyet bruker man i nødsfall, kvalitetsmikroskop går ved riktig bruk aldri i stykker. Selve mikroskopstativet kan holdes rent med for­ siktig tørring med en ren, lett fuktet og støvfri klut. Rester av immersjonsolje kan fjernes med litt vatt fuktet med xylen. Alkohol må aldri brukes som rensevæske for mikroskop. Dels kan lakken oppløses, dels kan det opptre skader i kittet som holder enkeltlinsene i mikroskopets optikk sammen. Objektbordet blir ofte tilsmusset og bør jevnlig gjøres rent. En grundig rengjøring kan medføre at man må demontere kryssbordet. Gni hele stativet inn med ørlite grann maskinolje på en vattdott. Instrumentet skal ikke virke fuktig, bare «rent og nytt». Dette beskytter stativet effektivt mot eventuelle rustangrep. Tannstenger og skruer skal gli med jevn bevegelse, verken for lett eller for tregt. Må man bruke makt for å dreie noe rundt, er det helt sikkert galt. Tyktflytende olje i sleider og tannstenger kan tørke inn og det kan oppstå skader dersom man forsøker dreie den tilhø­ rende skruen. Man kan fylle en vanlig injeksjons­ sprøyte med maskinolje og dryppe en dråpe eller to fra kanylen mot det aktulle problempartiet. I løpet av noen timer mykner smøringen og skruen løper lett igjen. Unngå å smøre mikroskopets mikroskrue, dette er arbeid for spesialist.

Del II: Framstilling av preparater

86

Mikroskoplaboratoriet Mikroskoplaboratoriet bør ha god belys­ ning og god ventilasjon. En del forskningsbygg og laboratorier fra 1970-årene er for­ synt med «frisk»luftsanlegg for ventilasjon og oppvarming. Gjennom utblåsningsventilene strømmer som regel et rikt utvalg av støv-, sot- og andre partikler. Et vattfilter i utblåsningsventilen kan ofte være til bety­ delig hjelp. Filteret fanger opp det meste av uvedkommende partikler, også pollen og sporer. Vinduene i laboratoriet bør vende mot nord. Det bør ikke bli for høye temperatu­ rer om sommeren, og laboratoriet bør hol­ de vanlig romtemperatur om vinteren. Ek­ streme temperaturer kan umuliggjøre ana­ lyser. En til to vasker er nødvendige, likele­ des adgang til destillert vann. Celle- eller vevskulturer forutsetter at vannet renses i jonebyttersøyle. For enklere undersøkelser kan det klare seg med en stor beholder med destillert vann. Arbeidsbenken må være solid og stødig. Selve benkeplaten må være kjemikalieresistent, for eksempel «Respatex». Apparater i tilstøtende rom kan forårsake kjedelige vi­ brasjoner og gjøre mikrofotografering umulig, likeledes ulike typer målinger. Dis­ se må fjernes. Laboratoriet bør ha minst to uttak for gass, eventuelt propananlegg, og minst åtte jordete uttak for elektrisitet (220 V vekselstrøm). Moderne kjøleskap forårsaker støy på elektrisitetsnettet. Dette forstyrrer mange typer elektronisk apparatur. Fjern kjøle­ skapene eller erstatt dem om mulig med gammeldagse absorbsjonsskap.

Et funksjonelt mikroskoplaboratorium er vist i Figur 56.

Orden på laboratoriet En grunnleggende forutsetning for å kunne utføre godt mikroteknisk arbeid er gjen­ nomført orden på laboratoriet. Ofte ser man avskrekkende eksempler på forskningsog undervisningsinstitusjoner hvor mikro­ skopene er utsatt for saltvann, syredamper, støv og skitt. Det beste instrument kan rui­ neres i løpet av kort tid. Rot i laboratoriet gir upålitelige resulta­ ter. Både en selv og medarbeidere kan på­ dra seg kroniske eller akutte helseskader, arbeidsplassen blir utrivelig og epokegjø­ rende oppdagelser kan gå hus forbi. Kjemikalier skal vekk fra benken der det store forskningsmikroskopet står. Brennbare kjemikalier oppbevares i ildsikkert skap, stoff med helseskadelige dam­ per som formalin i avtrekk. Kjemikalier kan hensiktsmessig ordnes i grupper: farge­ stoffer for seg, fiksermidler i egen gruppe, særlig giftige stoffer i eget skap osv. Alle flasker skal ha etiketter med angivel­ se av innhold. Kasser alt med hard hånd som ikke har noen vitenskapelig eller undervisningsmessig funksjon. Lag to separate preparatsamlinger, både av preparater som brukes i forskning og sli­ ke som kan ha spesiell undervisningsmessig verdi. Merk preparatene skikkelig med eti­ ketter. Bruk helst skrivemaskin, pen håndskrift går også an. Det finnes spesialskrivemaskin med liten skrift til etiketter,

87

Figur 56 Praktisk arrangement ved innredning av mikroskoplaboratoriet. Det lønner seg å disponere en egen, solid benk til mikroskopet. Benkens høyde må være tilpasset slik at man ikke sitter anstrengt. Okula­ rene skal være i øyenhøyde når observatøren har svakt bøyd rygg. På benken monteres det minst åtte jorde­ te uttak for 220 V vekselstrøm. En liten vask er fordelaktig for utstyr som trenger kjølevann. På mikroskopbordet skal det ikke plasseres kjemikalier! Hvis sjenerende vibrasjoner, monter skumgummi eller tykk gummi under bordbena, legg skumgummimatte under mikroskopet (pass på det ikke velter). Laboratoriebenken/kjemikaliebenken vendermot vindu. Lys fravindu må kunne avblendes. Mikrotomen skal kunne stå på et eget bord. God ventilasjon er meget viktig. Kjemikalier som avgir farlige damper må stå i eget avtrekksskap og ikke oppbevares inne på mikroskoplaboratoriet. Syredamper må i særdeleshet holdes unna de optiske instrumentene.

eller man kan lage dem på datamaskinen. Preparatene skal oppbevares i eget skap. Beste lagringsmåte er flate preparatmapper med lokk. Innleiringsmidlet flyter da ikke utover. Mikroskopesker der preparate­ ne står på høykant, er uoversiktlige. Gode preparater er klenodier som bør taes godt vare på. Til mikroskoplaboratoriet hører en skik­ kelig laboratoriejournal. Journalen skal beskrive fremgangen i forskningen og er en juridisk dokumentasjon på virksomheten. Ofte neglisjeres dette punktet. I denne dagboken noterer man forskningsresultater systematisk, forsøk og prosedyrer for hver eneste dag man arbeider. En slurvete ført dagbok kan få alvorlige konsekvenser. Ret­

telser og overstrykninger må ikke fore­ komme.

Utstyr og hjelpemidler Mikroskoputstyr er svært kostbart dersom man ønsker å disponere et fullt utbygd la­ boratorium. De mest avanserte lysmikroskopene kan koste rundt 2 millioner kroner og er i samme prisklasse som elektronmikroskop. Innen lysmikroskopi kan man like­ vel ofte oppnå betydelige resultater med be­ skjedne midler. Man kan komme langt innenfor en ramme på ca. 20 000 kroner. I listen over anbefalt arbeidsutstyr er spe-

88

V

89

sielt kostbar apparatur merket med *, (inn­ til 10 000 kroner), ** (fra 20 000 kroner 100 000 kroner), *** (over 100 000 kroner).

Preparerutstyr (se Fig. 57) Disseksjonsnåler og holdere til disse (rustfrie insektnåler) Begerglass 25, 100, 250, 500 ml, 5 av hver størrelse Erlenmeyerkolber 25, 100, 250, 500 og 1000 ml, 5 av hver størrelse Fikserutstyr, 500 glasstuber 5 ml med kork (dramsglass er bra) Glasstrakter, 3-4 stykker Termometere, ulike typer, for måling ved hydrolyse, innsmeltning av parafin osv. Målesylindre 10, 25, 50, 100, 500, 1000 ml, 2 av hver størrelse Sylinderglass til farging av preparater (Coplin jars), 25 stk. med lokk Objektglass, flere esker, dekkglassesker 18 x 18 mm, 24 x 32 mm, 24 x 50 mm (0.17 mm tykke) Mikrometer (for måling av korrekt dekkglasstykkelse) *Objektglass i kvarts 10 stk, dekkglass i kvarts 5 stk. 0.35 mm tykke Petriskåler i glass, 9 cm i tverrmål, 50 stk Pipetteflasker 25 ml med plastpipette (fåes på apotek) 1 flat pinsett med endeflate ca. 3 mm 3 låsbare kirurgiske pinsetter 2 rustfri,spisse pinsetter med tverrmål ca. 0.5 mm 2 urmakerpinsetter, rustfrie, med klemring av gum­ mi (én med krum spiss) Pasteurpipetter 500 stykker 2 platinanåler for utsåing av sporer etc. 1 liten preparersentrifuge, inntil ca.1000 G 1 saks, kirurgisk, rustfri, ca. 12 cm 1 saks, kirurgisk, rustfri, ca. 4 cm (type som benyt­ tes for øyenkirurgi) 2 skalpeller med utskiftbare blad 4 spatier, forskjellige typer Til skriving på glass: 2 urmakerdiamanter, diverse markerpenner

Mikroskoputstyr **1 mikroskop med binokular fototubus (trinokulartubus), kryssbord med nonier, 4-5 delt revolver, ob­ jektiver 10, 40, 100 x (oljeimmersjon), okularer 10 x, et fotookular, innstilling ved heving/senking av objektbord, muligheter for regulering og sentrering av kondensor, lawoltlampe innebygd for Kbhlersk belys­ ning (prisanslag ca. 20 000 kr). Brukte instrumenter i denne kvalitet kan fåes for ca. 5000 kr. *1 monokulart (gjerne gammelt slitt) mikroskop til preparerbruk og rutineobservasjoner med akromatobjektiver 10, 60 100 x, okular 12 1/2, kryssbord og lawoltlampe. *(**) 1 stereomikroskop 20-50 x med påmontert lawoltlampe og transformator (nye kvalitetsinstrumenter er svært dyre, - man kan klare seg med en frimerkelupe, bordlupe 10 x, til ca. 150 kroner)

Ekstrautstyr **1 apokromatisk objektiv 63/1.40 1 fasekontrastobjektiv 10 x 1 fasekontrastobjektiv 40 x 1 fasekontrastobjektiv 100 x /l.30 1 Huygensokular 5 x 3 kompensasjonsokularer 10 x 1 kompensasjonsokular 20 x 1 okular for mikrofotografering («fotookular») 10 x (vanskelig å skaffe) 1 aluminiummikroskopspeil for feste i mikroskopfoten 1 fasekontrastkondensor 1 filtersett (polarisator, analysator, Ål/4 plate) for enkel polarisasjonsmikroskopi *1 kondensor n.a. 0.80 m. irisblende (kvartskondensor) m. holder **(**♦) Ultrafluarobjektiv(Zeiss) 100/ 1.25 for UVabsorbsjonsmikroskopi eller tilsvarende *(**) 1 spesialobjektiv 40 x/1.25 (vann, glyserol, olje) for fluorescensmikroskopi (Zeiss) eller tilsvaren­ de *1 lavvolt mikroskoplampe på stativ m. transfor­ mator, helst med dobbeltkollektor for elektronblits (Zeiss)

Figur 57 Enkelt preparerutstyr til mikroskopiske formål. A-C, ulike typer av pinsetter. C er en urmakerpinsett med svært fin spiss. D, liten kirurgisk saks, E, spesialsaks for disseksjon av små objekter, F-G, små lansettformete kniver, H-K, ulike pirke- og skjæreinstrumenter, L, linjal, M, liten prøveflaske med kork (NB! visse kjemikalier oppløser gummikorker), N, spritlampe (rødsprit kan brukes), O, dryppeflaske med glasskork for fargeløsninger, P, dobbeltflaske for bruk avoljeimmersjonsobjektiver, Q, ferdig preparatglass, R-S ulike typer av objekt- og dekkglass, T, flat eske for oppbevaring av preparater, U, skalpellblad for dissek­ sjon, V, standard skaft no.4 for skalpellblad. Det lønner seg å kjøpe kvalitetsvarer fremfor billige utgaver. Saksene bør være av rustfritt stål, pinsetter av urmakerkvalitet. Urmakerpinsetter med forgylt spiss ruster ikke i syreløsninger.

90 1 lysfeltkondensor, n.a. 1.40 m. immersjonstopp og separat topplinse, n.a. 0.90, helst utsvingbar for ob­ servasjon ved lave forstørrelser 1 vannstrålepumpe med tilbakeslagsventil + 2 m vakuumslange, vakuumflaske *1 projektiv 10 x/450 mm i kvarts (Zeiss) 1 speilreflekskamera med belgutstyr. Nye modeller med autofokusobjektiv er lite egnet. Bra kamera til mikrofotografering og nærfotografering er Pentax ME om det fremdeles kan skaffes. *(**)1 fokuseringsenhet for speilreflekskamera (eks. Zeiss Grundkorper II) 1 fotoreproduksjonsstativ, regulerbart i høyden og med bunnplate for mikroskopet Separat CdS-lysmåler (man kan lage en selv billig) 1 forstørrelsesapparat for kopiering av svart/hvitt fotografier *(**) et storformatkamera for Polaroid bilder (far­ gebilder på papir). Zeiss modell er bra, den billige som føres av Polaroid er mekanisk ustabil). mørkeromspærer rød, grønn 1 hårhygrometer 20 - 100% relativ fuktighet 1 kjøleskap m. fryseboks (hvis mulig kjøp absorbsjonsskap, skap med motor forstyrrer elektronikk) *(♦**)] autoklav, billig «trykk-koker» til hushold­ ningsbruk til enkle eksperimenter ***(**)! rotasjonsmikrotom for parafin- og semitynne plastsnitt For preparering til elektronmikroskopi er dessuten nødvendig: 1 magnetrører med varmeplate 1 milliosmolarimeter 1 pH-meter 1 rystemaskin ***(**♦*) 1 ultramikrotom, kan evt. lånes på EMlaboratorium FOR PREPARERING AV SNITTPREPARATER BÅDE LYS- OG ELEKTRONMIKROSKOPI 1-2 varmeskap, regulert med termostatbryter 30-200°C. Hvis man kan få tak i et gammelt skap med vannkappe rundt, er dette mye sikrere enn mo­ derne modeller.

Kjemikalier og varer til mikroskoplaboratoriet (De viktigste er merket med *. Disse bør finnes på et enklere mikroskoplaboratorium)

Aceton Agar-agar for bakteriologisk bruk Akridin-orange Aktivt kull Alizarinviridin Anilin

1000 ml (brennbar/eksplosiv!)

500 g * 20 g (NB! Mutagent) * 1000 g 15 g 100 ml

Anilinblått W. S. Araldit (sett for innstøpning totalvolum Auramin 0 (NB! mulig mutagen) Aquawax (Gurr) eller PEG 2000 Azokarmin Bariumhydroksid (Ba(OH)J Basisk fuxin, flere glass på

25 g

1000 ml

10 g polyethylenglycol PEG 1000 & 2 å 500 g 10 g

100 g (Giftig!)

10 g (varierer i kvalitet,forsøk ulike fabrikat) * Blycitrat 100g (NB! meget giftig) Borsyre 100 ml * Bromodeoxyuridin (BrdU), minste forpakning (NB! farlig mutagen!!) Kalsiumklorid (CaCL 4H;O) 250 g Kanadabalsam 250 ml (nøytral) Karmin 10g * Cederolje 100 ml * Celloidin (helst «Cedukol») 1-2 små flasker (NB! eksplo­ siv, brannfare) Cellulosetape, gammeldags type, gjennomsiktig. * Celluloselakk,klar, liten boks,fargehandel * Colchicinum = colchicin ampuller av O.lg 10 stk., eller hetteglass med 1 g, 1 stk.* (NB! ytterst giftig, inhalering av pulver dødelig! Kjøp krever politiattest) Coumarine 5 g CrO3 kromsyre, hygroskopisk, p.a. 100 g. (NB! organiske stoff i kontakt med pulveret kcxH antennes) * Crystal violet (Gentiana violet kan brukes) 10 g * CuSO4 kobbersulfat (til varmefilter og fjerning av vann i sprit) * 500 g Dammarharpiks 250 ml DEAE - cellulose til immun fluorescens Dextran 110 100 ml (til immunfluorescensteknikk) EDTA (ethylendiaminotetraeddiksyre), 5 g Epon (sett for innleiring/innstøpning, totalvolum 1000 ml) Etanol 96%, 100% (NB! private får ikke kjøpe ren etanol. Rødsprit kan bru­ kes etter kjemisk avfarging og rensing) *

91 1000 ml (NB! ytterst brannfarlig/eksplosiv temp, ikke over 25 °C. Må ikke oppbevares i kjøle­ skap, unngå gnister, damp) 150 g Ethylenklorid 100 ml * Eukitt 100 ml * Euparal 10 g Fast-Green FS 1000 ml (NB! meget giftig) Fenol (Phenol) 50 g FeSCh jernsulfat Fiksersalt for fotografisk bruk * 10 g Floroglucinol Fluoresceinisothiocyminste forpakning anat (FITC), Formalin 40 TV 1000 ml, også parafor1000g * maldehyd 100 g Formvarpulver Fosfomolybdat 25 g Gelatin (plater for 2-3 pakker * husholdningsbruk) Giemsas fargeløs(kjøpes ferdiglaget på flaske) * ning Gjærekstrakt til 500 g * bakteriologisk bruk 1000 g * Glucose (dextrose) 250 ml (25 >). R. spathacea var. concolor fra Belize er en bivalentdannende strukturell homozygot. Periplanata americana (2 x = 33/34). Kromosom dissosiasjons/assosiasjons heterozygositi

Notoscordum inodorum (= N. fragrans) (4 x = 19 = 13 V + 2 i + 1(4 V)), Lycoris aurea (2 x = 12(10 V + 2 i), 13 (9 V + 4 i), 14 (8 V + 6 I), Polygonatum hybrider (2 x = 19) (P.multiflorum, 2 x = 18 x P.odorum, 2 X = 20). Delesjons- og duplikasjons-heterozygositi

Delesjon, Hyacinthus orientalis (Grace Darling) (2 x = 16, delesjon i den korte armen av middelstort kro­ 4 - Mikroskopi

4 x - 1, Hyacinthus orientalius (Dr. Streseman - Sir Winston Churchill). DYR:

Mange insekter, spesielt tovinger, bananfluer, gress­ hopper. Pattedyrkromosomer, f.eks. Muntjak 2n = 6.

Fikseringsprosedyrer Med fiksering forstår man en behandling av vevet med kjemiske reagenser som best mulig bevarer cellens strukturelle egenska­ per slik de var i fikseringsøyeblikket. Skjæ­ rer man et stykke vev ut av en organisme, vil det snart gjennomgå visse forandringer dersom det ikke utsettes for konserverende

98 behandling. Det vil kunne tørre ut og skrumpe inn om det får ligge i luften. Leg­ ges det i en oppløsning, vil det kunne svelle eller skrumpe avhengig av væskens osmoti­ ske konsentrasjon. Det er også utsatt for angrep av mikroorganismer som snart vil bryte ned vevets strukturelle elementer til ugjenkjennelighet. Selv om man tar hensyn til disse faktorer, viser det seg snart at vevet kan dekomponeres av sine egne enzymer og gjennomgå en autolyse. Hvis man ønsker å bevare de finere strukturer i vevet, må det behandles med kjemikalier. Vevet må da be­ handles med en væske som ikke skrumper eller sveller cellene, som ikke virker som et oppløsningsmiddel, og som stanser vekst av mikroorganismer og nedbrytende enzymprosesser. Det fins ikke noe slikt idealfiksermiddel. Det er da heller ikke mange kjemiske forbindelser som kan komme i be­ traktning. Noen av dem er typisk koagulerende forbindelser, andre ikke. Som regel er ikke bruk av en enkelt kjemisk forbindelse tilfredsstillende. De fleste primærfiksermidler har uheldige egenskaper, som man forsøker å oppheve gjensidig ved å bruke kombinasjoner i blanding. Det er meget vanskelig å finne en fikservæske som egner seg godt både for cytoplasma- og kjernestrukturer. For kromosomanalyser er det ofte en fordel å benytte en god kjernefikservæske som i stor grad ødelegger cytoplasmastrukturene. Slike strukturer virker ofte forstyrrende på det mikroskopiske bildet. Et «rent» cytoplasma uten strukturelle ele­ menter er derfor i mange tilfeller å fore­ trekke. Det fins adskillige hundre fikservæsker for mikroskopi. I praksis kan man klare seg med noen ganske få. De oppskrifter som er tatt med dekker til sammen et vidt spekt­ rum av materiale. Noen væsker egner seg for innsamling i felten, andre kan benyttes for meget avanserte undersøkelser i labora­ toriet. En vesentlig forutsetning for en god fik­

sering er at væsken trenger hurtig inn i ve­ vet. Mange blandinger, slik som NavashinKarpechenko, Carnoy og andre er ustabile og vil etter kort tid miste sine fikseringsegenskaper. Plantemateriale er ofte luftholdig og celleveggene hindrer rask gjennomt­ rengning av væske. Det kan også være and­ re barrierer slik som tykk kutikula på celle­ overflaten. Luften kan til en viss grad drives ut ved at man anbringer fiksertuben med fikservæsken og vevet i en vakuumflaske og så driver luften ut ved hjelp av en vannstrålepumpe. Lufttrykket bør ikke bli så lavt at væsken koker ved vanlig værelsestemperatur. Metoden er bare egnet for mikrotomfikseringer. Vevet kan også skjæ­ res istykker med skalpell, eller man kan stikke forsiktig i det med en tynn nål, slik at væsken trenger hurtigere inn. Carnoyfiksering skjer så hurtig at spesiell behand­ ling sjelden er nødvendig. Bruk av vakuumflaske er ikke ufarlig. Det er fordel­ aktig med tykke skinnhansker og briller i tilfelle flas­ ken imploderer, hvilket kan hende om den har fått ris­ ser eller små sprekker. 1 åpningen bør det sitte en solid gummi eller silikonkork. Vær oppmerksom på even­ tuelle tilbakeslag av vann fra vannstrålepumpen. Det­ te kan skje selv om pumpen har såkalt tilbakeslagsventil. Dette unngåes ved å vri av korken etter vakuumbehandlingen før man skrur igjen vannkranen.

Gjennomgående bør vevsstykkene være så små som mulig. Til lysmikroskopi bør de helst ikke være over 1 cm2, helst mindre. Jo raskere fiksering, jo bedre resultat.

Forbehandling før fiksering Det er viktig at vevet man undersøker er i best mulig fysiologisk tilstand. Det er liten sjanse for å få brukbare preparater av dyr og planter i dårlig form eller dårlig vekst. Sult, tørke eller vannmangel gir ofte dårlige resultater spesielt ved kromosomundersøkelser. Tiden på dagen kan være av betyd­ ning. Plantemateriale kan med fordel van­

99

nes godt og settes i kjøleskap ved +4°C i ca. 24 timer for fiksering av rotspisser. Ved denne forbehandling får man kromosomkontraksjon og et stort antall kjerner i metafase. FORUNDERSØKELSE

Vevet kan pilles i stykker og man lager en suspensjon i vann eller 45 % eddiksyre. Inspiser prøven i mikroskopet. Er den karak­ teristisk? Inneholder den det fenomen eller de strukturer vi er på jakt etter?

En slik forundersøkelse er veldig viktig. Mye unødig arbeide kan unngåes ved å sløyfe prøver som ikke har faglig interesse. Bare relevant materiale bearbeides videre. Til forundersøkelser i felten kan vi bruke et lite, enkelt transportabelt mikroskop. (For­ handles av Claes Ohlson, Oslo, eller av Kosmos-Verlag, Stuttgart)

Neste punkt er å «rense» prøven for alt uvedkommende materiale. Dette gjøres ved hjelp av pirkenåler, skalpell og andre in­ strumenter, om nødvendig under binokularlupe. Det er særlig viktig å fjerne harde partikler som jord, sandkorn og liknende som kan umuliggjøre senere preparering.

Noter nøye i laboratoriejournalen, gi prø­ ven et fiksernummer og lag en merkelapp i papir med blyantskrift som følger med fik­ seringen ved videre prosedyrer inni fikserglasset. Skriver man med kulepenn, kan det skje at de møysommelig preparerte prøver snart har merkelapper helt uten synlig skrift. Ved kromosomundersøkelser må vi forbehandle før fikseringen. Mange kjemikalier som brukes for forbe­ handling av kromosomer har vansker med å trenge inn i cellene. Vi kan tilsette litt DMSO (ca. 1/10 volummengde) til forbehandlingsvæsken. DMSO er ikke et gift­ stoff, men en slags «bærevæske» som øker

gjennomtrengning av andre kjemikalier. Colchicinløsninger med DMSO i er ek­ stremt farlige å få på huden. KJEMIKALIER FOR FORBEHANDLING

Acenapthene Brukes mest i mettet, vandig løsning. Begrenset bruk, hovedsakelig for kromosomspredning i pollenslanger.

Aesculine Løses til metning i vandig løsning (0.04 %). Kombine­ res med nedkjøling til 4 - 10 °C.

Colchicin (= Colchicine) (Colchemid er et derivat med liknende virkning.) Me­ get kraftig cellegift, delvis løselig i vann. For de van­ ligste sorter materiale er en standardoppløsning 0.1 % passende. Brukes i konsentrasjoner fra 0.05 % - 2 %. Er det mest spesifikke kjemikalium for forbehandling av kromosomer idet cellens spindelfunksjon lammes. For analyser av dyr bør colchemid brukes, da det er mindre toksisk. Symptomene på forgiftning inntrer først etter flere timer. Det er sentralnervesystemet som lammes, hos dyr får man ofte en karakteristisk lammelse av under­ ekstremitetene. Ved letale doser inntrer døden etter 2-3 døgn under store smerter. Det er mest humant og avlive forsøksdyret etter at kromosommaterialet er tatt (benmarg, blodprøve). For tillaging av standardløsning løses innholdet i en ampulle (O.lg) i 100 ml vann. Unngå å veie pulver, det er livsfarlig å puste inn selv ørsmå mengder. Stoffet må behandles ytterst forsiktig (munnbind, avtrekk, laboratoriehansker). Søl må ikke forekomme.

Coumarin (o-cumarsyre-lacton) Benyttes mest i mettet, vandig oppløsning, løseligheten er ca. 0.02 %. Det er særlig virksomt i enfrøbladete planter. I arter med høyt kromosomtall ser man ofte lite spesifikk virkning.

Gammexane (gamma-hexa-chlorocyclohexan) Benyttes mest i vandig oppløsning. Er sterkt virksomt ved lav temperatur.

8 - hydroxyquinoline Brukes ofte i konsentrasjonen 0.02%. Temperaturen bør ikke være over 16 °C. Man får ikke typisk spindellammelse som ved colchicin, men kromosomene lar seg likevel lett spre. Centromerområdet blir ekstra ty­ delig. Ofte kommer spiraliseringen i kromosomene ekstra tydelig fram. Dette er det mest effektive forbehandlingskjemikalium ved siden av colchicin. Hvis behandlingen blir for kraftig, trekker cellekjerner og kromosomer seg sammen til små «klumper». Be­ handlingstiden må da reduseres, og løsningen må for­ tynnes til det halve eller mer. Man kan også forsøke

100 colchicin og oxyquinoline i blanding (for eksempel 0.01 % colchicin +0.01M oxyquinoline).

Isopsoralen Kan gi utmerkete resultater i plantegrupper som tidli­ gere har vist seg umulige eller vanskelige å analysere. Konsentrasjonen må utprøves på det aktuelle mate­ rialet.

Kloralhydrat Kan benyttes i 0.1 % vandig oppløsning i tilfeller der colchicinbehandling har slått feil. Meget effektiv i vis­ se plantearter. Umbelliferone Kan være effektiv i plantearter med høyt kromosomtall. Benyttes i mettet, vandig oppløsning. Overstående kjemikalier benyttes nesten utelukkende for squashpreparater. For mikrotomi benyttes ofte nedkjøling (planter).

Primærfikseringsmidler Et primærfikseringsmiddel utgjør en av de virksomme bestanddelene i en fikservæske. Det er av betydning å kjenne til deres kje­ miske og fikseringsmessige egenskaper. De kan inndeles i to hovedgrupper etter sin evne til å koagulere celleinnholdet. KOAGULERENDE FORBINDELSER

Etanol (C2H5OH) Fargeløs væske, blandbar med vann i alle forhold. Er ikke jonisert, oksidasjonspotensialet er 0.45 V. Koa­ gulerer ikke nukleoproteiner. Feller mukleinsyrene, men fikserer dem ikke. Løser svakt lipider og feller glycogen. Moderat penetrasjonsevne. Vevet skrumper sterkt og blir hardt. Stabil i løsning med HgCL, for­ malin og eddiksyre. Kromtrioksid (CrO3) Brunrøde krystaller med sur reaksjon i vann. Løses ekstremt lett. Må ikke blandes med organiske stoffer, herunder alkohol (eksplosjons- eller brannfare). I vann dannes kromsyre (FLCrOJ som ikke kan isole­ res. Mesteparten joniserer som dikromat (Cr2O7) ", resten som hydrogenkromat (HCrOJ - med tilstrek­ kelig hydronium-konsentrasjon til å gi en 1 °7o oppløs­ ning en pH på 1.2. Kraftig oksidasjonsmiddel, oksidasjonspotensial LIV. Dikromatjonet reduseres lett til Cr + + + , eller til kromoksid (Cr2O3). Har kraftig koagulerende virkning på proteiner som albumin, in­ klusive nukleoprotein. Fikserer ikke gelatingeler.

DNA felles i uoppløselig form. Penetrerer sent. Vevet skrumper betydelig, blir ikke særlig hardt, cytoplasma blir grovt koagulert, kjernen godt preservert. Spe­ sielt bevares kromosomene utmerket.

Kvikksølvklorid (HgCL) Fargeløse krystaller. Inntil 7% løses i vann. Meget giftig forbindelse. I løsning foreligger det delvis jonisering i Hg Cl4 , Hg , og hydroniumjoner. Sterkt oksidasjonsmiddel. Oksidasjonspotensialet er på 0.75V. Svak felning av nukleinsyrer. Svak skrumping av vevet, som får en moderat hardhet. Gir svarte uttel­ linger som kan fjernes med jodjoner. Blandbar og sta­ bil med alle øvrige primærfiksermidler.

IKKE-KOAGULERENDE FORBINDELSER

Eddiksyre (CH3COOH) Fargeløs væske med sterk, stikkende lukt. Krystallise­ rer ved ca. 16 °C. Meget svak syre, o.p. 0.77 V. Koagu­ lerer ikke de fleste proteiner. Feller DNA fra løsnin­ ger. Meget rask penetrasjon. Sveller cellen, vevet for­ blir meget bløtt. Stabil med alle andre primærfikse­ ringsmidler.

Eormaldehyd (CHOC) Fargeløs gass, lett løselig i vann som HO (H2CO) • nH. Monomeren dominerer ved svake kon­ sentrasjoner. I formalin, handelsvaren er gassen løst i vann. Løsningen inneholder noe metanol. Høypolymeren, paraformaldehyd (n = 100 eller mere) felles lett som bunnfall. Meget svak jonisering ved dannlse av hydroniumjoner. Oksideres av atmosfæren til maursyre (ikke bra for preparatene). Kan reduseres til me­ tanol, men oksidasjonspotensialet er meget lavt (0.23 V). Penetrerer raskt og har svelningseffekt. Vevet blir hardt. Koagulerer ikke nukleoproteiner. Ypperlig bevaring av cellens cytoplasmastrukturer (også for elektronmikroskopi). Blandbar og stabil med etanol, kvikksølvklorid og eddiksyre. Reduserer langsomt OsO4 og kaliumdikromat, men rask redusering av kromtrioksid.

Kaliumdikromat (K2Cr2O7) Orangerøde krystaller, løselig i vann inntil 10 %. Sam­ me joner dannes som ved kromtrioksid. Sterkt oksi­ dasjonsmiddel, o.p. 0.79 V. Koagulerer ikke proteiner inklusive nukleoproteiner. Det er pH-verdien i løsnin­ gen som eventuelt bevirker ulike egenskaper fra CrO3. Løser DNA på alkalisk side av pH. Fikserer visse lipider. Vevet forblir meget bløtt. Cellen bevares relativt bra. Kaliumdikromat er ubrukelig som fiksermiddel for kromosomer hvis fikservæsken ikke er sur. Osmiumtetroksid (OsO4) Blekt gule krystaller som løses langsomt, inntil 7% i vann. Smeltepunktet er 42 °C. Krystallene sublimerer allerede ved romtemperatur og avgir ytterst farlige damper!! I løsning forligger H2OsO5 samt hydroni-

101 umjoner. Middels oksidasjonsmiddel, oksidasjonspotensial 0.64 V. Koagulerer ikke albumin, proteine­ ne ikke lenger koagulerbare av etanol. Protein i løs­ ning omdannes til gelform. Feller ikke DNA fra løs­ ninger. Penetrasjonstiden varierer, synker med tiden fra fikseringens begynnelse, - i alle tilfeller relativt lav. Nakne celler fikseres imidlertid på sekunder av damper (kan gi øyenskader!). Bevarer cellen struktur meget godt (fin for elektronmikroskopi og kvalitet­ sarbeider). Stabil overfor HgCL, CrO? og kaliumdikromat. Reagerer med etanol og formaldehyd. Krystal­ lene fåes på glassampuller til ekstremt høy pris (varie­ rer, inntil ca. 2000 kroner per gram). Ampullene skal vaskes under springen så etiketten fjernes fullstendig. Med diamantblyant eller glassfil risses ampullen på midten og plasseres inni et håndkle. Den brekkes for­ siktig i to inni avtrekksskapet. Pass på at krystaller ikke slipper løs. Ampullehalvdelene med krystallene i slippes opp i ren flaske med oppløsningsmiddel ut­ styrt med glasskork. Settes i kjøleskap ved 4°C. Os­ mium er en gift i klasse med blåsyre. Man må ikke pu­ ste inn damper eller skjære seg på glassampullen. Det må ikke forkomme noen former for søl. Utsettes man til stadighet for ørsmå mengder osmiumdamper, kan dette gi dødelig sykdom.

Glutaraldehyd (OCH-CH2 CH2 CH2 CHO Glutaraldehyd er et fremragende fiksermiddel. Leve­ res oftest som vandig oppløsning med 25 % aldehyd. Oksiderer lett til glutaminsyre (det kan lønne seg å oppbevare den over bariumkarbonatpulver). Det fåes ferdige ampuller med 2 ml glutaraldhyd som holder 70%.

Kaliumpermanganat (KMnOJ 1-2% løsning i buffer (helst veronalbuffer) fikserer små vevsstykker. Permanganat er et kraftig oksida­ sjonsmiddel og fikseringstidene må være korte (30-60 minutter) ved 0-1 °C. Alle cellebestanddeler unntatt fosfolipidmembraner ødelegges. Den egner seg derfor bare til spesialstudier. Sammen med andre fikseringsprosedyrer er kaliumpermanganat nyttig. ANDRE FORBINDELSER

Eter (diethyleter, C2HS - O - C2HS) Brukes av og til som bestanddel i fikservæsker og til bedøvelse. Svakt blandbar med vann, lett blandbar med alkoholer. Kan brukes til fjerning av fett og oljeliknende substanser i cytoplasmaet. Lavt kokepunkt. Dampene er eksplosive. Oppbevares på flasker på mørkt, kjølig sted. Eterflasker og eterbehandlet mate­ riale må ikke legges i kjøleskap på grunn av eksplo­ sjonsfare. Skulle strømmen svikte, stiger temperatu­ ren og damptrykket kan presse korken ut. Eteren for­ damper og hele skapet kan eksplodere ved den minste gnist. Slike eksplosjoner har forekommet her i landet. Bar flamme, må ikke forekomme i forbindelse med bruk av eterholdige væsker.

Kloroform (CHCI3) Kloroform er ikke egentlig et fiksermiddel. Fargeløs væske med søt lukt, svakt løselig i vann. Utsettes den for luft og lys, oksiderer den til det uhyre giftige carbonylklorid (= fosgen). Fosgen dannes også dersom kloroformdamp kommer i forbindelse med gassflam­ me. Brukes i fikseringsvæsker til oppløsning av fett og voksavsondringer i vevet.

Methylalkohol ( = metanol, CH,OH) Fargeløs væske som minner om etanol. I motsetning til etanol (= ethylalkohol) bevirker den svelling av kromosomene og brukes derfor ofte som erstatning i fikservæsker. Den er en kraftig gift med dødelig virk­ ning. (Motgift er etanol!). Kan blandes med vann i alle forhold. Bør ikke blandes med oksidasjonsmidler da den i så fall oksyderes til maursyre.

Pikrinsyre (2-4-6-trinitrofenol) Gule krystaller med bitter smak. Løselig i varmt vann og eter samt alkohol og xylen. Brukes ofte i kromosomfikseringer. Man får kraftig utfelning av protei­ ner, lett skrumping av kromosomene. Pikrinsyrefikserte vev bør ikke utvannes, men føres direkte over i 70% etanol. Pikrinsyrekrystallene skal alltid oppbe­ vares under vann. Metallsalter av pikrinsyre, og i uheldige tilfeller pikrinsyren selv, er meget kraftige sprengstoff. Det er ikke nødvendig å oppbevare større mengder pikrinsyre i laboratoriet. Pulveret skal hol­ des konstant fuktet med vann! Pikrinsyre kan også oppbevares som vandig løsning. Kast fiksertuber som har inneholdt pikrinsyreholdige fikservæsker (OBS! selvantennelige, eller eksplosive). Propionsyre (C2H5COOH) Brukes nå meget til kromosomfikseringer i stedet for eddiksyre. Er en fettsyre med vond, stram lukt, bland­ bar med vann, etanol, eter i alle forhold. Meget god erstatning for eddiksyre, har noe langsommere penetrasjon og sveller ikke kromosomene så meget. Godt for fettrikt vev. Er problemene med fettinnhold meget store, kan man forsøke melkesyre.

102

Oppskrifter på fikservæsker Bare noen få fikseringsvæsker er valgt ut, men de nevnte skulle passe til nesten alle slags organismer. Hvis anvisningene i bo­ ken følges nøye, medfører ingen av væskene umiddelbar helsefare. Unngå damper, sprut og søl på huden. De fikservæsker som fungerer for «dyr» fungerer også for hu­ mant vev.

sering da virkningen er meget kraftig. Eddiksyren er nødvendig for cellenes evne til etterpå å kunne farges. Behandlingstiden er i alminnelighet 10 minutter. Planteceller bør fikseres en times tid. Osmiumfikseringer egner seg normalt kun for mikrotomi. Særlig godt fungerer de med egnet innleiring i plast og snitting på spesialmikrotom. Heitz har utviklet en nå nesten glemt tek­ nikk som er basert på Flemming-Bendas fikservæske (se s. 172).

OSMIUMHOLDIGE FIKSERVÆSKER

Damper av osmium kan gi fremragende fikseringer av celleutstryk og enkeltceller. (1) Løs 0.2 g osmiumtetroksid i 10 ml dest. vann. (2) Tilsett 1 dråpe 1 To kromsyreoppløsning per 10 ml osmiumsyre for stabilise­ ring. Oppbevares på ren glassflaske med glasskork. Damping av materialet skjer ved at ferske utstryk eller pådryppete celler straks settes i et kammer (glassbeholder) med osmiumdamper fra et kar i nærheten (i avtrekk!). Cellene strykes ut på samme måte som ved blodutstryk (side 183) eller ved hjelp av en skalpell. Dampene lar man virke fra 2 til 5 minutter. For lang behandling minsker cel­ lenes evne til å farges etterpå. Osmiumfikservæsker som inneholder eddiksyre er helt uegnet. Man får preparater fiksert med «elektron-mikroskopisk» kvalitet. Flemming - Benda (dyrevev, planter, snitt, utstryk) 15 ml 1 To kromsyre (løs kromsyrekrystallene i dest. vann) 4 ml 2 To osmiumsyre 2 dråper iseddik

Bland i ovenstående rekkefølge. Løsningen er ubegrenset holdbar i ren glassflaske med glasskork. Bare små mengder er nødvendig for fik­

ANDRE FIKSERVÆSKER

Carnoys fikservæsker (bakterier, alger, sopp, planter, dyr, kun utstryks - eller squashpreparater) Iseddik 98-100 To 1 volumdel Abs.etanol 3 volumdeler (valgfritt:Kloroform 1 volumdel) Alternativ variant:

Propionsyre 100 To Abs. alkohol (Melkesyre

1 volumdel 3 volumdeler 1/50 volumdel)

Disse fikservæskene egner seg for kromosomstudier etter squashmetoden. For cellekulturer av pattedyr erstattes ofte etanol med metanol. Man kan også ut­ prøve andre volumforhold. Propionsyre gir mindre svelling av kromosomene enn ed­ diksyre. Materialet kan oppbevares i lengre tid på fikseringsvæsken ved -18 °C. Det holder seg enda bedre om man erstatter fikservæsken med 70 To etanol etter en time. Oftest er vevet fiksert etter ca. 10 minutter. Visse typer prøver bør stå et døgn eller mer. Enkelte sopp bør stå noen uker. Fin for både plante- og dyremateriale. Stort sett er Carnoy uegnet for mikrotompreparater. Carnoy-fiksering kan ikke brukes til transmisjonselektronmikroskopi da alle cyto-

103 plasmastrukturer ødelegges. Kjernekromosomstrukturer oppbevares ganske bra. Ostergren-Heneéns fikservæske 20 ml Destillert vann 60 ml Metanol 30 ml Kloroform 1 gram Kvikksølvklorid 1 gram Pikrinsyre (trinitrofenol) 1 gram 2,4 Dinitrofenol

Må blandes i nevnte rekkefølge. NB! Ikke søl da fikservæsken trenger gjennom beskyttelseshansker selv i plast.

Denne fikservæsken kan brukes i stedet for Carnoy til squash-preparater. Fikserløsningen er meget giftig og inneholder dessuten sprengstoffer i væskeform! Fikserglass med inntørket fikservæske vil selvantenne/ eksplodere ved den aller minste berøring el­ ler rystelse. Gir bedre kjernefikseringer enn Carnoy og langt mere strukturdetaljer på kromosomene. Navashin-Karpechenko (Miintzings formel) (Snitt, plantemateriale, oppbevaring av prøver) Består av to deler som må oppbevares på to forskjellige, mørke flasker.

Kromsyre og etanol direkte sammen kan eksplodere!! Helt ufarlig ved blanding i oppskriftens rekkefølge.

a) Kromsyre (CrO3) Iseddikk Dest.vann b) Formalin (40%) Etanol (96%) Dest.vann

1 g 10ml 85ml 30ml 10ml 55ml

Like volumdeler a) og b) blandes rett før bruk. Materialet er ubegrenset holdbart på

fikservæsken, men det bør beskyttes mot sterkt lys. Den trenger langsomt inn og større vevsdeler kan bli ufullstendig fiksert dersom man ikke forfikserer for 60 s i Car­ noy 3:1. Ofte er det nok å dyppe vevet i Car­ noy først, rense i 70% etanol og så fiksere i Navashin-Karpechenko. Ofte kan man få best resultater ved å skjære vevet i mindre deler før fikseringen. Luft i vevet kan drives ut med en vakuumflaske (god metode). Kun for mikrotomi. Kun for plantevev.

Levitsky (snitt, plantemateriale, røtter, oppbevaring)

Består av to deler som oppbevares på se­ parate, mørke flasker a) Kromsyre 1 % i destillert vann b) Formalin 10% a) og b) blandes umiddelbart før bruk i forholdet 8:2. Materialet kan oppbeva­ res på blandingen. Egner seg best til ana­ lyser av rotspisser. Kun for plantevev.

Bouin (dyr, planter, anatomi) Mettet vandig oppløsning av pikrinsyre 15 ml Formalin (40%) 5 ml Iseddikk 1 ml Materialet kan oppbevares på fikseringsvæsken. Egnet både til plante- og dyrevev. Tåler ikke utvanning, men føres direkte til 70% etanol. God for rotspissmitoser og delingsstadier i testikler.

Zenker (dyrevev) a) Iseddik b) Destillert vann Kvikksølvklorid Kaliumbikromat Valgfritt Na2SO4

5 ml 100 ml 5g 2,5g 1g

104

Iseddik tilsettes rett før bruk. Fikseringstiden er flere timer, fulgt av vasking 24 timer i rennende vann. Meget god fikseringsvæske for dyrevev. Kvikksølvutfelninger kan fjernes i 0.5 % J i 70% etanol.

FAA (Formalin-aceto-alkohol) Rutinefikservæske for botanisk jekter.

ob­

Brukes i mange varianter.

50 eller 70% ethylalkohol Iseddik Formalin (40%)

Palades fikservæske (for elektronmikro­ skopi, dyr, planter) Na-veronal/Na-acetat buffer 0.14M : 5 ml + n ml 0.1N HC1 (n av­ henger av ønsket pH, for pH 7.2 brukes 5 ml) 12.5 ml 2% OsO4 Dest. vann til 25 ml

90 ml 5 ml 5 ml

Egnet for all slags plantemateriale til an­ atomiske studier. Ubrukelig for kromosomanalyser.

Schaudinns væske Er spesielt egnet til protozooer og lik­ nende celleformer. Også god til plante spermatozooider og zoosporer samt en del encellete alger. Hvis man varmer den til + 70 °C får man raskere fiksering. Tilsett 10 ml absolutt ethylalkohol til en mettet vandig oppløsning av kvikk­ sølvklorid. Rett før bruk tilsettes like mye destil­ lert vann og eddiksyre til 2%. Fikseringstiden er flere timer. Vask ut med 50% etanol som er tilsatt spor av jodjoner for å fjerne eventuelle kvikksølvkrystaller.

Fikservæsken lages rett før bruk. Vevsbiten må ikke være større enn 1 mm3, helst ve­ sentlig mindre. Vevet bør innleires i plast. Fine fasekontrastbilder etter snitting på ultramikrotom. Plastsnittene kan farges i uli­ ke farger (se side 203). Veronalbufferen lages på følgende måte: Natriumacetat ■ 3 H;O Natriumveronal Dest. vann til

9.714 g 14.714 g 500 ml

Til 100 ml bufferløsning pH 7.2 taes 20 ml stamløsning, 22 ml 0.1N HC1 og dest.vann til 100 ml. Glutaraldehydfiksering (til elektronmik­ roskopi, dyr, planter) Denne fikseringen er den beste vi idag kjenner til. Fikseringen er bortimot ene­ rådende innenfor elektronmikroskopi. Er meget god også for lysmikroskopiske formål. Finstrukturen av praktisk talt alle celleelementer bevares i naturtro til­ stand.

(1) 2-4 % glutaraldehyd løses i 0.5 M Nacacodylatbuffer (Na-cacodylat, giftig! i vann + n ml IN HC1). Glutaraldehydet kan renses i aktivt kull før bruk, sentri­ fugeres og filtreres gjennom milliporefilter. (2) Fikseringen skjer ved romtempera­ tur, 2-4 timer. Såkalt postfiksering er vanlig.

105 (3) Flytt vevet over i cacodylatbuffer 24 timer. (Det kan også oppbevares i kjøle­ skap lengre tid i bufferen). Som ved alle fikseringer for finstruktur må vevsbitene være ytterst små. Ofte skjer postfikseringen i 2% osmiumtetroksidløsning også i 0.1 M Na-cacodylatbuffer.

Osmiumtetroksyd kommer som små kry­ staller i glassampuller. Ampullen files på midten, helt rundt flere ganger, med glassfil. Legg ampullen på et tykt frottéhåndkle i avtrekket. Fil en tydelig risse på midten. Ampullen må være helt ren utenpå (vask den om den er skitten). Hold ampullen inni håndkleet, brekk den forsiktig over. Slipp de to delene forsiktig ned i en glassflaske (helt ren med bufferen). Sett slepen glass­ kork på. Sett i kjøleskap inni en annen, luk­ ket beholder.

Parafinteknikker for lysmikroskopi Mikrotomen De fleste biologiske og medisinske prøver blir for tykke til å kunne studeres tilfreds­ stillende i et vanlig lysmikroskop. Struktu­ rene overlagrer hverandre optisk, og det blir ikke noe tilfredsstillende og skarpt bilde. Gjennom lang tid er det derfor utviklet me­ toder (mikrotomt) der man lager tynne, gjennomskinnelige snitt av materialet. Med en skarp kniv eller et barberblad er det mulig for hånd å lage tilfredsstillende snitt ca. 50-100 ^m tykke for orienterende undersøkelser forutsatt at materialet man snitter er forholdsvis stivt. Spesielt egnet er visse plantedeler (stengler, blad). Med noe øvelse kan man her lage brukbare prepara­

Figur58 Vanlig håndmikotom. Objektet klemmes fast i mikrotomen med skruen på siden. Dreining av bunnskruen hever objektet (intervaller 10 pim) Med en barberkniv som hviler mot glassplaten kan man få akseptable snitt av botaniske objekter som stengler, blad, røtter osv.

ter. Ennå bedre blir resultatene med en bar­ berkniv og såkalt håndmikrotom (Fig. 58). Oftest må man imidlertid både fiksere vevet og gjennomtrenge det med parafinvoks, plast eller andre stoffer gelatin, celloidin) for å oppnå brukbare preparater. Det er spesielt parafinmetoden som er meget omstendelig og langvarig. Av utstyr trengs spesialapparatur, blant annet en såkalt mikrotom som fins i en rekke utførelser. Både parafin- og plastteknikker er nå vanlig brukt for lysmikroskopiske undersø­ kelser der man bruker snittykkelser fra ca. 1-35 fim. Med relativt kort opplæringstid behersker de fleste lysmikroskopiske mikrotomteknikker med akseptable resultater. Parafinmikrotomen er et presisjonsinstrument som må behandles like forsiktig som mikroskopet. Det foreligger to hovedtyper mikrotomer som egner seg for lysmikrosko­ pi; sledemikrotomer og rotasjonsmikrotomer (Fig. 59 og 60). Sledemikrotomene eg­ ner seg ypperlig der man har behov for en-

106

Figur 59 Klassisk mikrotom etter Minot. Dreining av hjulet (A) bevirker automatisk fremføring av ob­ jektet (D) mot kniven (B) ved hjelp av fremføringsmekanismen (G). Kniven er festet stasjonært i knivholderen (F). Objektet (D) beveger seg frem mot kniveggen automatisk med jevne intervaller (= snitt tykkelsen). Denne reguleres med skruen (E). Enkeltsnittene danner et sammenhengende bånd som oppfanges av båndfremføringen (C). Reichert, Wien.

keltsnitt til anatomiske studier, rotasjonsmikrotomen der det kan trengs snittserier, dels for å kunne studere snittnivå i et organ, dels for å kunne foreta romlige rekonstruk­ sjoner av anatomiske detaljer. Sledemikrotomene er mekanisk sett de enkleste. De har som hovedprinsipp at mikrotomkniven beveger seg langs en rettlinjet glidebane. Objektet heves for hvert snitt ved dreining av en mikrometerskrue. Sledemikrotomer kan være tungvinte å håndtere, men gir muligheter for å snitte meget store snittflater (flere cm sidekant). Med spesialutrustning kan de fungere ypperlig ved snitting av materiale innleiret i plast (snitt 1/2-2 /zm tykke). Rotasjonsmikrotomen er på en måte en avansert sledemikrotom. Objektet beveger seg langs en glidebane mot kniven når mikrotomens hjul roteres. Hjulet kan dreies for hånd eller ved hjelp av en elektromotor. Enkeltsnitt kleber sammen i snittkantene til

Figur 60 Klassisk sledemikrotom. Kniven (A) er skråstilt og festet i holderen (C). Knivholderen sitter på festeklossen (G) (er såvidt synlig) som føres frem og tilbake langs glidebanen (B). Objektet (D) er festet i objektholderen (E) som er regulerbar i ulike posisjoner. Fremføringsmekanismen (F) sørger for snitttykkelsen. R. Jung, Heidelberg.

107 lange, sammenhengende remser hvilket er rasjonelt ved kompliserte anatomiske studier. Begge typer mikrotomer krever vedlike­ hold og riktig stell. Ofte følger det med uli­ ke typer olje for de forskjellige delene. Man er vel tjent med å følge fabrikkens instruk­ sjoner til punkt og prikke. Paraffinrester og smuss på glidebanene kan raskt ødelegge selv den beste mikro­ tom. Man må selvfølgelig ikke pusse glide­ banene med smergelpapir og liknende om de skulle vise antydning til rust. Enkelte typer rotasjonsmikrotomer skal oljes daglig. Mikrotomen må kunne gi snitt tykkelser fra 1-40 /j.m. For vanlige lysmikroskopiske arbeider er det som regel snakk om snittykkelser på 10-20 gm, for fasekontrastundersøkelser ca. 1/2-1 /zm. Det er fordelaktig at mikrotomen er stor og kraftig bygd (passende vekt er ca. 40 kg) slik at den har stor mekanisk stabilitet. Den bør stilles opp på solid underlag og flyttes minst mulig. Rotasjonsmikrotomer må ikke holdes i hjulet om de flyttes. Mikroto­ men bør jordes for avledning av statisk elektrisitet. Temperaturen i arbeidsrummet bør være ca. 20°C. Den relative fuktighe­ ten er av betydning og bør være forholdsvis høy (70 %) under snittingen (bruk eventuelt elektrisk luftfukter). Særlig vil vev fiksert i pikrinsyreholdige fikservæsker indusere kraftig statisk elektrisitet under snittingen, snittene vil fare vekk fra mikrotomkniven og lar seg ikke håndtere på vanlig måte. Det foreligger ulike typer av mikrotomkniver. Til vårt bruk skal den være av stål og en såkalt C-kniv. Nye kniver skal renses forsiktig med en klut dyppet i xylen. FRYSEMIKROTOMEN

Noen ganger kan det være viktig å lage snittpreparatene raskt. Det kan gjelde en diagnose eller man ønsker å studere morfo­ logiske prosesser mens et eksperimentet på­ går. I andre tilfeller kan man ha behov for

rask fremstilling av et større antall snitt til undervisningsformål. Dette er mulig med frysemikrotomi som er en relativt primitiv metode. Det dannes iskrystaller i vevet, og finere strukturer i cel­ len blir alltid mer eller mindre ødelagt. For mange formål er imidlertid denne teknik­ ken tilstrekkelig. Det finnes spesielle mikrotomer til dette formålet. Kniven beveges skjærende i en bue, men man kan få like gode resultater med både rotasjonsmikrotom og sledemikrotom. Problemet er at snittet ofte faller, eventuelt rives fra hverandre, grunnet over­ flatespenninger i vannet. Det er ingen innstøpningsubstans som holder cellene, vevet og celleinneholdet på plass. Selve vevsprøven nedfryses på preparatholderen på mikrotomen. Tidligere brukte man mest CO2 fra en gassflaske til dette. Gassen strømmet med høyt trykk ut gjen­ nom små ventilhull under preparatholderen. Ved gassekspansjonen sank temperatu­ ren kraftig. Arbeid med denne typen «gass»mikrotom er neppe sunt. Laboratoriet fylles opp med store mengder CO2 som legger seg langs gulvet. Moderne mikrotomer bruker Peltierelementer istedet. Disse kjøles ned elektrisk til en overflatetemperatur på -16 °C eller kaldere. Da det kreves strømtilførsel, kjølevann osv. med diverse ledninger, er det fordelaktig at preparatholderen står i ro. Systemet fungerer derfor best på en sledemikrotom. De beste resultatene får man med et ekstra Peltierelement på kniven for temperaturregulering også av denne. (Denne apparatur kan man delvis bygge selv, og spare betydelige beløp, se Figur 75). Vevet fikseres nesten utelukkende i 10 °7o formalin. Stykker på 4-5 mm må fikseres minst 24 timer. Haster det svært, kan man nedfryse direkte, men da faller snittene ofte helt fra hverandre. Etter fiksering skylles vevet kort i vann. Legg biten på preparatholderen og start

108

nedkjølingen. Drypp noen vanndråper rundt for ytterligere mekanisk støtte. Fikser ikke for lenge i sterk formalin. Det hemmer fargingsegenskapene, og ikke minst snittbarheten. Skal vevet oppbevares i lang tid, overføres det til 2-3 % formalin. Ved snittingen skal mikrotomkniven stå svakt på skrå. Nedkjølingen reguleres lett med varia­ sjon av strømstyrken på strømforsyningen. Best er rask nedfrysing (max antall ampe­ re), deretter snitter man toppen av objektet slik at det oppstår en ren snittflate. Fordi objektet nå er «overfrosset» går vevsbitene i stumper og stykker. Man minsker nå strømstyrken forsiktig inntil vevet ikke len­ ger går i stykker. Dette gir de optimale tem­ peraturforholdene. Snittene «fiskes» opp med en liten, helt tørr malerpensel (nr. 2). Om sommeren kan det lett bli kondensert iskrystaller på de kal­ de delene av mikrotomen. Snitt som legger seg på kniven, kan man få til å falle ned på et objektglass ved å dryppe vann på knivseggen uten å berøre den. Snittene ruller seg ofte sammen. De kan rettes ut med to små (nr.l) mårhårspensler. Trenger man mange snitt, lar man dem falle ned i en liten skål med vann. Denne teknikken krever øvelse, og man må ofte selv prøve seg fram til de beste tek­ niske detaljer for det aktuelle materiale.

Parafinsnitt og innstøping Vi skal først se på lysmikroskopiske mikrotomteknikker (1) Fikser små vevsstykker, helst ikke over 5 mm sidekant, i en egnet fikservæske. Plantevev kan by på spesielle problemer

og kan ha en hydrofob overflate. Dette fører til at fikservæsken blir isolert fra cellene med en luftblære. Dypping i Carnoy 3:1 (noen sekunder, rens i 70% etanol) kan av­ hjelpe dette. Gode øvelsesobjekter er rotspiss av løk eller purre, fra dyr lever eller testes. Det er overmåte viktig at vevet er mest mulig friskt. Ofte kan det lønne seg å gjøre en for­ eløpig undersøkelse ved å studere en liten fersk prøve i lysmikroskopet (skjær av en tynn skive, press ut en tynn bit under dekkglasset) for å se om materialet har de ønskete egenskaper. Mye arbeid kan her spares ved at man unngår å preparere ueg­ net materiale.

(2) Rens i vann (utvanning) etter fikse­ ringen. Tiden avhenger av fikseringstype og mate­ riale) må vevet som regel utvannes (dette gjelder ikke for Bouin). For meget små vevsstykker er det tilstrekkelig å skifte vann 2-3 ganger i løpet av et døgn, større vevs­ stykker utvannes best i rennende vann. Man kan lage seg små kurver av finmasket netting der vevet forblir under transporten til de ulike kjemikaliebadene. (3) Dehydrer (fjern vannet) gradvis. Vannet skal erstattes av en annen væske, som regel etanol. Isopropanol, butylalkohol eller aceton kan også brukes. Flytt vevet over i bad med stadig stigende konsentra­ sjoner. For etanol brukes ofte trinnene 30%, 50%, 70%, 80%, 96% og 100%. Behandlingstiden er minst én time i hver konsentrasjon. Dyrevev (testes etc.) be­ handles på akkurat samme måte. I plantemateriale oppstår det lett luftbobler også mellom cellene inni vevet noe som forhindrer diffusjon ut og inn av ulike væsker. Luften kan fjernes ved evakuering (sett fiksertuben i en vakuumflaske og pump forsiktig luften ut med vannstrålepumpen. «Koking» bør unngåes).

109 (4) Flytt over i intermediet. Fra 100% skal det nå fullstendig vannfrie vevet flyttes over i en væske blandbar med parafinintermediet. Som intermedium bru­ kes ofte xylen (= xylol) som er mindre gif­ tig enn mange andre intermedier. Xylendamper gir ved kronisk eksponering med sikkerhet løsemiddelskader over tid (bruk avtrekk). Ved den gradvise dehydreringen har man unngått at vevet skrumper. I man­ ge tilfeller ser det ut for at den vesentligste skrumpningen skjer ved overgangen 50-70% etanol. (En ytterst skånsom dehydreringsmetode er inndamning av en vandig polyethylenglycolløsning 1500 ( = Aquawax Gurr). Ufiksert vev kan legges rett i løsningen som inndampes ved ca. 55 °C. Til og med enzymaktivitet kan bevares ved denne metoden. Aquawax kan snittes som parafin. Snittene «tåler» imidlertid ikke vann, de oppløses og er derfor mye vanskeligere å håndtere.) Hvis man legger vevet direkte i xylen fra absolutt etanol, vil det lett kunne ødeleg­ ges, også her er en gradvis overføring nød­ vendig. Som regel er tre ulike alkohol-xylen blan­ dinger tilstrekkelig, vanligvis benyttes ba­ dene: (a) (b) (c) (d)

3 (vol.deler) abs. etanol: 1 xylen 2 abs. etanol: 2 xylen 1 abs. etanol: 3 xylen Ren xylen

Behandlingstiden er 1-2 timer i hvert bad. Både plante- og dyrevev kan bli unødig hardt og sprøtt i xylen og bør ikke ligge alt for lenge. Xylen skal nå erstattes av parafin. Vanligvis overfører man mateialet til et åpent kar med like deler xylen og parafin (m.p. 60 °C) og plasserer det hele i et termostatskap. Man innstiller først temperaturen på 50 °C og øker den langsomt (etter et par timer til 60°C). (Stiger temperaturen over dette, kan vevet bli ødelagt).

Xylenet vil vanligvis dampe bort i løpet av noen døgn og vevet blir liggende gjennomtrukket (infiltrert) i ren parafin. Xylen avgir brennbare damper og det advares mot å bruke varme- eller termostatskap som ikke er tilstrekkelig eksplosjonssikret. Skapet bør være laget i stål og forsynt med regulerbar termostatbryter. Det bør være en smeltesikring for overoppheting over 65 °C. Kan skje ved termostatfusk. Varmeelementet må ikke ligge åpent til­ gjengelig for dampene. Skapet bør utluftes den første tiden ved at døren står på gløtt.

(5) Når det ikke lenger merkes xylendamper fra skålene, flyttes vevet over i skåler med ren, smeltet parafin og materialet får ligge der en time. (6) Vevet skal deretter innstøpes. Flytt skå­ len over til en elektrisk varmebenk (vanlig varmeplate for kaffekjele eller liknende) som er regulert ned til 60 °C overflatetem­ peratur ved en reguleringstransformator el­ ler en lysdimmer («triac»). Brett til et rek­ tangulært kar av aluminiumsfolie og sett det på platen, legg vevet i, og fyll karet med smeltet parafin. Rotspisser skal ordnes slik at 5 og 5 ligger parallelt og tett sammen med spissene i samme høyde (gjelder for kromosompreparater). Annet materiale kan arrangeres på passende måte.

(7) Flytt karet ned i en skål med kaldt vann (bare bunnen skal stikke ned i vannet). Der­ ved fester vevsbitene seg i parafinen. (8) Blås forsiktig på overflaten til det har dannet seg en fast hinne, hele karet senkes så raskt ned i vannet. Her skal det ligge til parafinen er blitt helt hard.

(9) Riv aluminiumsfolien av og blokkene

110

oppbevares inntil snittingen. I dette stadi­ um er materialet ubegrenset holdbart.

Parafininnleiringen omfatter altså følgende arbeidsprogram:

Sch liffart A = stark plankonkav,

(1) Fiksering (ofte 12-24 timer) (2) Utvanning 3-24 timer.

Ikke for Bouinfiksert materiale, - dette skal direkte til 70% etanol. Elektronmikroskopiske prøver skal ligge i buffer. (3) Dehydrering: 30% etanol, 50% etanol, 70% etanol, 80% etanol, 96% etanol, 2 ti­ mer i hvert bad, 100% etanol natten over bør skiftes en gang. (4) Intermedium: 3 deler 100% etanol: 1 del xylen 2 timer, like deler 100% etanol: xylen 2 timer, 3 deler xylen: 1 del etanol 2 timer, ren xylen 2-4 timer, bør byttes en gang. (Annen prosedyre for elektronmikroskopi, et godt alternativ for lysmikroskopi er teritær butylalkohol for dehydreringsprosedyrene.)

(5) Infiltrering: like deler xylen: parafin, inndampes 3 døgn, først ved 50 °C, så ved 60 °C (6) Ren parafin: 1 time (7) Støping og snitting:

Mikrotomkniven

(se Fig. 61 og 62)

Mikrotomkniven er vanligvis av spesialstål for lysmikroskopiske formål, noen ganger brukes såkalt glasskniv der bruddflaten på et spesielt tilvirket glasstykke danner eggen. Mikrotomkniver i stål slipes i fire typer (A) sterkt plankonkav, (B) plankonkav, (C)

Schliffart C — keilfdrmig,

Schliffart D = hobelmesserférmig. Figur 61 Ulike former for knivegg til lysmikrosko­ piske snitt. (A), sterkt plankonkav, (B) plankonkav, (C) kileformet, (D) høvelformet. E.Leitz, GmbH, Wetzlar.

kileformet og (D) «hobelmesserformig». Eggens mekaniske styrke øker fra type (A) til (D). Typene (A) og (B) blir på grunn av formen på eggen skarpere enn de øvrige. Type (A) og (B) må på grunn av den tynne eggen alltid stå i såkalt skråstilling, knivs­ eggen er skrå i forhold til objektet (deklina­ sjon større enn 90°). Disse knivtyper egner seg for mykt, elas­ tisk materiale slik som ved celloidinpreparater. Plankonkave kniver egner seg også for snitting av friskt materiale (plantestengler, røtter, en del zoologisk materiale). Slike kniver vibrerer lettere enn type (C) og (D). Knivtype (C) foretrekkes for parafinsnitt,

111

Figur 62 Prinsipp for fremstilling av glasskniver. Spesialglass kjøpes som lange stykker ca. 30 mm høye, 5-6 mm tykke og 30 cm lange. Det brukes overflatepolert speilglass. Med en glasskjærer (med stålhjul) kuttes glasslistene i 30 x 30 mm store stykker (Figur nederst til venstre og øverst til høyre). Man tegner opp en sjablong (på papp) som aksediagramet helt til venstre. Glasskvadratene risses diagonalt ved å plassere dem på sjablongen slik at øvre kant stikker 1 (en) mm over x-aksen. Ved oppbrekkingen (man kan bruke en tang for standard oppbrekking av fliser til bad, kjøkken osv.) oppstår kn i vstykket (1) og trimmekniven (2) for tilspissing av plastblokken. Etter E. Leitz, GmbH, Wetzlar.

ved og lær. Kniver av type (D) brukes for svært harde materialer (bløtt metall og knokler. Alle mikrotomkniver har eggen slipt i fasett. Knivens stilling er viktig. Man skiller mellom dens deklinasjon (vinkelen mellom eggen og bevegelsesretning) og skråstilling. Skarpheten av kniven er sterkt avhengig av knivens inklinasjon, d.v.s. skråstillingen av kniven mot blokkoverflaten. Inklinasjo­ nens optimale verdi varierer hos forskjellige kniver. Sliping og vedlikehold av mikrotomkni­ ver er komplisert.

Walther (1961 s.12-13) har gitt en veiledning for enklere klargjøring. Før bruk skal kni­ ven «settes opp» ved skjerping, den trekkes i en viss vinkel langs en spesielt preparert lærflate. Dette er ganske vanskelig å lære og sløyfes (dessverre) derfor ofte i de fleste la­ boratorier.

Vanligvis er man henvist til å sende knivene til fabrikanten for vedlikehold. De appara­ ter som fra tid til annen selges i handelen for sliping av mikrotomkniver, har hittil vist seg å være av liten verdi. Mikrotomknivens egg (forsiktig!) kan

112

undersøkes i binokularlupe ved lav forstør­ relse. Har den hakk eller tydelige risser, kan den ikke lengre gi snitt av tilfredsstillende kvalitet og må slipes om. Etter sliping har knivene vanligvis en ganske grov fasett og blir først topptrimmet etter ovennevnte «skjerping». I de fleste mikrotomer kan man justere vinkelen mellom knivseggen og snittflaten. Vinkelen må tilpasses det vevet man ønsker å snitte og er avhengig av vevets og parafinens hårdhet. Man må prøve seg fram. Enkelte firmaer leverer holdere for innmontering av barberblad, men barberblad er ofte ikke kraftige nok for snitting av vanskelig materiale. Skikkelige mikrotomer skal ha to solide festeskruer for kniven slik at vibrasjoner unngåes under snittingen. Etter bruk skal knivene tørkes forsiktig med en tynn, ren tøyfille fuktet i xylen. Mikrotomkniven er en livsfarlig gjenstand, mye farligere enn en gammeldags bar­ berkniv.

Snitting av vevet Bruken av parafinmikrotomen er forholds­ vis enkel. Vevsstykkene skjæres ut av parafinblokken slik at man får et rektangel med absolutt parallele kanter. Ca. 1 mm paraffin bør omgi vevet på hver side. Blokken skal så festes til mikrotomens objektholder som er av metall. En skalpell med litt para­ fin på holdes over spritflammen til parafi­ nen smelter, og strykes raskt over objektholderen. Deretter varmes skalpellen pånytt, holdes mot objektholderens overflate mens undersiden av objektblokken plasse­ res på skalpellens overflate. Parafinen vil smelte litt, og ved å trekke skalpellen raskt ut og presse blokken fast mot objektholderen vil den klebe. Litt smeltet parafin kan legges langs hver sidekant for bedre feste,

og objektholderen med blokken kjøles så under springen. Knivholderen reguleres nå frem mot blokken til den er ca. 1/2 mm fra, deretter festes den med festeskruen. Man snitter først ca. 40 p.m små sledemikrotomen ved å trekke klossen mot seg hver gang og føre den tilbake til utgangsstillingen. For hvert snitt må man dreie mikrometerskruen det ønskede antall gm. På rotasjonsmikrotomen oppnår man dette ved hver omdreining av svinghjulet.

Idet snittene begynner å komme, reguleres snittykkelsen ned til 10 gm som passer i de fleste tilfeller. Snittene vil nå ligge som små rektangler, det øverste festet med sidekan­ ten langs kniveggen. Neste snitt vil klebe til dette langs sidekanten, slik at snittene sam­ let danner et bånd med lengde lik summen av enkeltsnittenes sidekanter (se Fig. 63, neste oppslag). (Parafinbåndet som dannes er ikke ulikt en bendelorm hvis vi forestiller oss at hvert enkeltsnitt tilsvarer et ledd på ormen.) Når det ønskete antall snitt er oppnådd, løftes båndet forsiktig fra mikrotomen ved hjelp av to mårhårspensler og legges på et stykke svart papir. Med en skalpell skjæres båndet i lengder på like mange snitt, ca. 35 mm lange. Et rent objektglass gnies inn med eggehviteglyserol (ca. 1 dråpe per glass, helst mindre, hvis snittene faller av si­ den har man hatt for mye på).

Tilsett destillert vann. Dette flyter nå ut­ over glasset i en jevn hinne. Man kan nå overføre snittremsene til glasset ved hjelp av en pensel fuktet i spissen. Båndet kleber av seg selv til penselen. Båndet legges i pa­ rallelle rader på objektglasset som overfø­ res til varmebenken som nå er regulert ned til + 55 °C. Dermed vil snittene strekke seg og bli ret­ tet ut. Det er viktig at de ikke smelter ved denne behandlingen. Etter at snittene har

113 rettet seg ut - det kan ta innpå et minutt heller man vannet forsiktig av ved å holde objektglasset på skrå. Så retter man forsik­ tig snittrekkene med penselen, og hele glas­ set legges til tørring i varmeskapet ved + 35°, i minst 24 timer. Snittene sitter da helt fast i objektglasset. I dette stadium ér preparatene holdbare i meget lang tid. Den neste hovedprosess som gjenstår er fargingen. En rekke vanlige feil vil kunne observeres under snittingen:

(1) Det dannes bånd, men de buer til den ene eller den andre siden. Parafinblokkens lengdekanter har da ikke vært parallelle. Dette kan lett rettes på ved at blokken taes ut og skjæres til pånytt. (2) Snittene krøller seg og henger ikke sam­ men. Parafinen har da for høyt smelte­ punkt, eller snittene er for tykke. Romtem­ peraturen må økes, eller vevet innleires på­ nytt i parafin av lavere smeltpunkt (det er tilstrekkelig å legge blokken direkte i et nytt smeltet bad).

(3) Det dannes bånd, men det er huller i snittene og vevet faller ut. Dette kan komme av at parafinen ikke har trukket skikkelig igjennom. Ofte er årsaken luft som ikke er drevet ut under fikseringen, eller en ufull­ stendig dehydrering. Hele arbeidet må utfø­ res på nytt. (4) Striper i snittene. Striper skyldes ofte hakk i kniveggen. Kniven må da flyttes et stykke parallellt med snittflaten. Årsaken kan også være for harde bestanddeler i vevet.

se vevstyper i dyr og mennesker (se senere) og i de tilfeller der man ønsker store enkeltsnitt for anatomiske forhold. Som alter­ nativ har man brukt innstøpning i nitrocellulose (= «skytebomull») etter en ganske komplisert prosedyre. Nitrocellulose er både brennbar og eksplosiv og har vært be­ nyttet både til militære formål og som basis i gammeldags kinofilm. Over tid eldes nitrocellulosen om den oppbevares tett og i store mengder og gjennomgår kjemiske re­ aksjoner som ofte fører til selvantennelse. Til mikroskopbruk selges nitrocellulosen som «celloidin» i plater, eller oppløst i vannfri blanding av etanol og eter som «cedukol». Man bør utvise strenge forsiktig­ hetsregler ved bruk av nitrocellulose i labo­ ratoriet. Skal man oppløse platene selv, bør man sette seg nøye inn i den medfølgende bruksanvisningen. Det tar lang tid, ofte fle­ re dager, før alt er oppløst. Celloidinmetoden er morsom, men ar­ beidskrevende og kan gi svært fine resulta­ ter. Selve cellulosematerialet løses ikke ut av snittet, men blir værende der. Har man behov for store, relativt tykke, enkeltsnitt gjennom centimeter store objekter er celloi­ dinmetoden å foretrekke. Følgende prosedyre er vanlig:

(1) Fikser vevsprøven, fikservæske velges et­ ter behov og formål med undersøkelsen. For dyrevev kan nøytral formalin (2-4%) være brukbart. Formalinen nøytraliseres ved å oppbevare en stamløsning med terningstore biter av marmor på bunnen (fjer­ ner maursyre). (2) Utvanning dersom fikservæsken var vannholdig, 12-24 timer.

(3) Dehydrering, som vanlig, over alkoholtrinn.

Celloidinmetoden

(4) Abs.alkohol/eter 1:1 (vannfri), 1 dag.

En del materiale egner seg ikke for innstøpning og snitting i parafin. Dette gjelder vis­

(5) Celloidin eller cedukol 2%: 2-8 dager.

114

Objektene ordnes i innstøpningskaret før parafinen størkner

En parafinblokk med flere objekter kan opp­ deles etter det angitte mønster

Preparatholder

a) Figur 63 Innstøping (63a) av parafinninnleiret materiale. Merk at ordnet plassering av objektene i paraffinblokken letter senere oppdeling og montering på preparatholderen. I 63b er demonstrert ulike snittplan for et pattedyrfoster (A). I (B-D) ser vi hvordan fosteret er orientert i forhold til kniveggen (to parallelle linjer) og snittbåndene og utseendet av enkeltsnittene som dannes. Det ferdige preparat er gjengitt i (E).

115

116 (6) Celloidin eller cedukol 4%: 2-8 dager.

(2) Flytt over til kloroform 24 timer.

(7) Celloidin eller cedukol 8%: 8-14 dager. Er stykkene store, tar det hele fire uker!

(3) Dehydrer pånytt i 90% etanol i 24 timer.

(8) Flytt over vevsstykkene med 8 % celloi­ din eller cedukolløsning i åpne porselensskåler til en eksikator med H2SO4 eller P2O5 som tørremiddel.

(9) Celloidinløsningen «fortykkes». Dette skjer ved at løsningsmidlene damper av i eksikatoren. Det hele blir seigere og seigere og man venter til mengden er minket til ca. halve volumet. Konsentrasjonen av nitrocellulose er nå 16 %. Viktig: Unngå all form for fuktighet! Selv fra laboratorieluften til­ trekkes vann. (10) Nå kan celloidinet herdes. Konsisten­ sen blir dermed nokså fast (halvstiv). Herdingen kan utføres på tre ulike måter. Man får prøve seg frem til den metoden som pas­ ser best.

(a) Med kloroformdamper:

(1) Sett preparatskålen i en glassbeholder (vær rask!) som har 3-5 mm kloroform på bunnen. Legg lokk på glassbeholderen så fort som mulig. Vent 24 timer. (2) Skjær ut med skalpellen den endelige blokken (objektet med litt celloidin rundt). Flytt den over i 70% etanol.

(3) Blokken kan nå snittes med pådrypping av 70% alkohol på snittflaten (se under). (4) Enkeltsnittene farges i en liten skål, dehydreres og innleires. (b) Med Apathys oljeblanding:

(1) Snitt ut den endelige blokken.

(4) Legg i Apathys oljeblanding (se under), bytt bad to ganger, hvert etter ca. 24 timer. Apathys oljeblanding: Kloroform Origanumolje Cederolje Abs. etanol Fenol

4 2 4 1 1

deler deler deler del del

(5) Flytt over i terpineol 24 timer.

(6) Bytt dette badet for 24 timer 2-3 ganger. Blokken kan oppbevares i terpineol. (7) Snitt materialet «tørt». (8) Deretter farging og innleiring. (c) Herding med alkohol:

(1) Flytt den halvstive blokken til 70% etanoldamp i en tett beholder. Det vil dannes en overflatehud. Innleiringsskålen skal stå i en 10 cm høyt preparatglass med 70% eta­ nol i bunnen. (2) Når blokken er herdet, skjær ut forma­ tet på det som skal snittes (objekt med noen mm celloidin rundt). (3) Flytt over i 70% etanol for 24 timer. Snitt med pådrypping av alkohol på kni­ ven. (4) Farging og innleiring Generelt om snittingen: Celloidin kan brukes til så store objekter som 30 x 40 mm. Disse snittes best på en vanlig sledemikrotom. Enda større objek­ ter krever en særlig solid mikrotom.

117

(Leitz «Grundschlittenmikrotom» 1300, snitter objekter 90 x 112 mm)

Våte snitt kan komme ned i 8-10 /zm, ved «tørrsnittmetoden» kan man i heldige til­ feller oppnå snitt på 5 /zm. Kniven skal være plankonkav (type A eller B). Kniven må stå ekstremt skrått («sagende bevegelse»). Det er spesielt viktig med skarp egg, den minste feil vil vise seg som en stygg ripe i snittene. Celloidinsnittene kan farges og innleires omlag som parafinsnitt. Enkeltsnittene kan være vanskelige å håndtere der de svømmer rundt i de ulike badene. Best er det å bruke små kar til de ulike løsningene og å «fiske» opp snittene med en kunstmalerpensel nr. 1-3.

Anilinfargestoffer utvinnes etter destilla­ sjon av kulltjære. Anilin er et mellompro­ dukt i fargestoffproduksjonen. Mange av disse syntetiske fargestoffene er nyttige for mikroskopiske formål.

Klassifikasjon av fargestoffer Navngivningen på fargestoffer har vært usystematisk og gir få opplysninger om den kjemiske strukturen. På samme fargestoff kan det eksistere flere navn. Fabrikat under samme navn kan også variere i kjemisk inn­ hold. Ved tillaging av Feulgenvæske (s. 205) oppdager man at basisk fuxin varierer i kvalitet.

(1) Nitrosofarger (kinonoximer).

Fargemetoder

Dannes ved virkning av salpetersyre på fenolforbindelser Eksempel: naftol grønt B

Prinsipper for farging

(2) Nitrofargestoffer:

Celler og cellestrukturer kan tydeliggjøres i mikroskopet etter farging med visse farge­ stoffer eller metallforbindelser. De kjemi­ ske og fysiske fenomenene ved fargeprosessen er ofte kompliserte og lite forstått. Far­ ging av celler og cellebestanddeler er et praktisk tiltak for å synliggjøre mikrosko­ piske strukturer, og de fleste metodene er kommet istand ved prøving og feiling. De første fargestoffene som ble brukt for mikroskopiske formål var endel naturstoffer. Dette gjelder spesielt karmin (coccinille), en praktfull rødfarge, som utvinnes fra en skjoldlus som lever på fikenkaktus. Hematoxylin utvinnes fra veden av et tre («logwood»). Ekstraktet er ikke i seg selv en far­ ge, men etter oksidasjon dannes et stoff kalt hematin. Blandes hematin med visse aluminium- eller jernsalter, dannes dypt blå eller svarte salter «lake». Metallene ut­ gjør det vi kaller en fargebeis som sørger for at fargen binder til cellestrukturene.

Eksempel:

pikrinsyre

(3) Azofargestoffer

Eksempler: orange G (sur), kongorødt (sur), trypanblått (sur), janusgrønt B(basisk) Sudan III, Sudan IV (svakt basiske) (4) Kinoniminfarger Eksempler: methylenblått (basisk) azur A, B (basisk) thionin(basisk) nilblåttsulfat(basisk) nøytralrødt (basisk) safranin O(basisk) azokarminG (basisk) induliner(sure, basiske)

118

(5) Fenylmethanfarger

Eksempler: krystallfiolett ( = gentianafiolett), basisk methylgrønt, anilinblått, vannløselig type (surt), fast green FCF (surt), light green SF gul type (surt), basisk fuxin (basisk), syrefuxin (surt). (6) Xanthenfargestoffer

Eksempler: eosin, ulike typer, erythrosin (ulike typer), phloxin B (surt), fenolftalein (indikator), bromkresolpurpur (indikator), fenolrødt (indikator). (7) Antrakinonfargestoffer

Eksempler: alizarin rødt S (surt).

gen kan tilsettes spor av jernacetat - gir mørkere farge. Krystallfiolett (= Gentianafiolett) (kun paraffinsnitt) Krystallfiolett eller gentianafiolett Dest. vann

1 g 100 ml

Kokes til all farge er oppløst, filtreres ved romtemperatur. Nigrosin (helst squash)

Løses i 70% etanol. Kan brukes til farging av spyttkjertelkromosomer i Drosophila.

Heidenheins jernhematoxylin

Oppskrifter på fargeløsninger «Eddiksyrefargestoffer» egner seg best til såkalte « squashpreparater» (se s. 128), men kan i noen tilfeller brukes til mikrotomsnitt. Kun kjernefarging. Tre ulike farger er egnet: karmin, orcein og lacmoid. Best far­ ging får man med orcein.

karmin, orcein- eller lacrnoidpulver 2 g Iseddikk 45ml Dest. vann 55ml Er fargen for sterk, lages 1 % oppløsning. Tilsett vannet forsiktig til iseddiken og varm opp til koking. Tilsett fargepulveret foriktig (pass øynene!) og kok til fargestof­ fet er løst helt, helst med tilbakeløpskjøler på kokekolben. Orcein syntetisk fra Merck løses uten koking. Avkjøl til romtempera­ tur, filtrer og fyll på dryppeflasker å 25 ml. Fargekorn bunnfeller når løsningen får stå i ro og den bør derfor filtreres med jevne mellomrom. Dryppeflaske med plastpipetter er best for oppbevaring. Karminløsnin-

Oppløsninger: (a) Jernalun, ammoniumferrisulfat 3 % i vann. Fungerer som fargebeis ved full styrke, uttynnet som differensierings væske. (b) 5% haematoxylin i 96% etanol 10 deler, destillert vann 90 deler (c) som kontrastfarger brukes: 1 % eosin i 90 % etanol eller 0.5 % orange G i 90 % etanol.

Haematoylinoppløsningen kan ikke brukes før den er «moden». Dette skjer langsomt i luften og tar flere dager. Jevnere modning oppnåes ved tilsetning av 0.2g natriumjodat per g av haematoxylin.

Hansens jern trioxyhaematin

Oppløsninger: (a) Jernalun (ammonium ferri sulfat) 10 g (NH4)2SO4 1.4 g Destillert vann 150 ml

119 Løs opp ved forsiktig oppvarming

(b) Haematoxylin (Gurr) Destillert vann

1.6 g 75 ml

Løs opp ved oppvarming

vann. Fargen endres fra rødblå til blå. Hvis for sterk farge, sett snittet i 30 % alkohol til­ satt 0.5% HC1. Skyll i springvann, før gjennom alkoholrekken og xylen til kanadabalsam. Mallorys trippel farge

Avkjøl oppløsningene. Hell oppløsning (b) i en avdampningsskål av porselen. Tilsett løsning (a) til denne (ikke omvendt!), rør kontinuerlig. Varm langsomt til kokepunk­ tet uten å røre. Avkjøl raskt ved å la skålen flyte på et bad med kaldt vann. Den dypt fi­ olette fargen skal nå ha endret seg til mør­ kebrun uten å vise grønnskjær. Filtrer ned på en tett korket glassflaske. Oksydasjon må unngåes. Hvis det er lite luft over væ­ sken, kan den holde seg omlag et halvt år. Etter bruk dekanteres løsningen tilbake på flasken.

(a) Midlertidig beis: Mettet HgCl2 i vann + 5 % edikksyre

Annen variant (Hansen):

Egentlig anilinblått består av en blanding av basiske fargestoffer som ikke kan løses i vann. Anilinblått W.S. har gjennomgått «sulfonering» og sure fargetoffene er vannløselige. Anilinblått W.S. kan variere i kva­ litet fra ulike firma.

Denne er lett å bruke, egner seg for de fleste preparater.

(1) Løs 1 g haematoxylin i 10 ml abs. etanol.

(b) Syrefuxin, 1 % i destillert vann (c) Fosfomolybdensyre, 1 % i destillert vann

(d) Mallorys farge: Anilinblått W.S. (Gurr) Orange G Oxalsyre Destillert vann

0.5 g 2g 2g 100 ml

Heidenhains azan farge

(2) Løs 20 g KJ i 200 ml dest. vann ved svak oppvarming. (3) Løs 1 g kaliumpermanganat (KMnO4) i 16 ml destillert vann.

(a) 0.1 % azokarmin G (Gurr) eller GX i de­ stillert vann. Kok fargen. Etter avkjøling filtrer gjennom et bløtt filtrerpapir. Tilsett 1 ml iseddik per 100 ml oppløsning.

Neste dag:

(b) Anilin, 1 ml, 90% etanol 1000 ml

(4) Hell løsning (2) i (1), ikke omvendt!

(c) Iseddikk, 1 ml, 96% etanol 100 ml

(5) Tilsett 6 ml av (3), kok blandingen i 60 s. Kjøl hurtig ned på vannbad.

(d) 5 % fosfowolframsyre i destillert vann, nytillaget

Oppløsningen er holdbar hvis den oppbeva­ res på tett korket flaske. Fargetiden er fra 1/2 til 4-5 minutter. Skyll etterpå i spring­

(e) Anilinblått W.S. Gurr Orange G Destillert vann

0.5 g 2.0 g 100ml

120

Tilsett 8 ml iseddik. Kok litt. Filtrer etter avkjøling. Fortynn til dobbelt volum med destillert vann. Azokarmin G er ganske uoppløselig, og etter avkjøling vil blanding (a) bli delvis en suspensjon. Denne omdannes til en oppløs­ ning ved oppvarming. Azokarmin B kan være et alternativ.

Methylenblått (helst squashpreparater) Absolutt etanol Methylenblått 1 To KOH Destillert vann

30 ml 3g 1 ml 99 ml

Egnet farge til kromosomer fra cellekul­ turer. Fargeoppløsning for plast - tynnsnitt (lysmikroskopi) Bland like deler: 1 To Methylenblått i 1 To borax og 1 To Azur II i destillert vann. Snittene som er tørret og strukket på ob­ jektglasset ved 60 °C, behandles 5 minutter med 1 To perjodsyre, skylles i destillert vann og farves 1-3 minutter i ovennevnte løsning i varmeskap (må ikke tørre ut). Skylles i de­ stillert vann, tørres i varmeskap og innleires i Eukitt.

Methylgrønt

(squash- og snitt preparater)

Methylgrønt Destillert vann. Iseddikk

1 g 100 ml 1 ml

Farger kjerner og kromosomer tydelig, men best i preparater som er fiksert i ikkesyreholdige fikservæsker.

Haematoxylin

(Heidenhain, etter Delafield parafinsnitt) Ammoniumalun Haematoxylin Abs.etanol Dest. vann Glycerol Metanol

10 g 1 g

6ml 100ml 25ml 25ml

Løs ammoniumalunet i destillert vann til mettet løsning. Løs haematoxylinet i abso­ lutt etanol. Tilsett sistnevnte løsning til førstnevnte. Eksponer for lys og luft en uke. Filtrer. Tilsett 25 ml glyserol og 25 ml meta­ nol. Utsett for lys til fargen mørkner. Filt­ rer, oppbevar på lukket beholder. Løsnin­ gen må stå en måned før bruk. Feulgens reagens, se side 205.

Farging av snittene Selve fargeprosessen beror på at cellene ut­ settes for fargestoffer som binder mer eller mindre spesifikt til cellestrukturer og organeller. De kjemiske reaksjonene som finner sted er bare delvis forstått og ofte kompli­ serte. Fargeteknikkene er utviklet ved prø­ ving og feiling gjennom mange årtiers ek­ sperimenter. Enkelte fargemetoder, slik som for DNA eller immunreaksjoner koblet til fargestof­ fer er svært spesifikke og kan brukes til dels for kvantitative målinger. Farging av snittpreparater kan være om­ stendelig og komplisert, men oftest får man utmerkete resultater. Først må parafinen fjernes. Under fargeprosessene føres objektglassene gjennom en rekke bad med forskjellige oppløsninger. Sylindriske glass med glasskork er mest brukt (Coplin jars er fine). Hvert lokk er tilpasset sitt spesielle fargeglass og må ikke ombyttes. I enkelte

121

bad skal preparatene stå lenge, og det er da fordelaktig å benytte glass med innvendig støtteribber med plass for 5-10 objektglass av gangen. For nøyaktigere arbeider er det best å be­ handle ett og ett preparat. Til rutinebruk foreligger det spesielle plastholdere som tar 5 objektglass som lar seg behandle som en enhet og kan flyttes samlet fra bad til bad. Parafinen må først fjernes ved at snittene plasseres i ren xylen. De er ikke ordentlig deparafinerte før etter 15 minutter. Best er det å benytte to xylenbad for fjerning av eventuelle rester oppløst parafin i xylenet. Xylenet skal så erstattes med absolutt eta­ nol i neste bad (helst 2 x absolutt etanol), deretter blir snittene behandlet i omvendt rekkefølge sammenliknet med dehydreringen. Man bruker konsentrasjonene 96 To, 80 To, 50 To, 30 To og destillert vann. Ca. 1-2 minutter i hvert bad er tilstrekkelig. Snitte­ ne som nå er helt rehydrerte, farges etter uli­ ke metoder.

Heidenhains Jern - Haematoxylin: (dyr, humant vev, planter) (1) Bring snittene ned gjennom alkoholrekken og vask grundig i destillert vann.

ler, legg en glassplate på objektbordet). Først forsvinner bakgrunnen, i zoologiske og humane preparater bindevev, deretter ulike cytoplasmatiske partikler, så typer av muskelceller og de røde blodcellene. Tilslutt bleker kromatinet i cellekjernene). Korrekt differensiering krever øvelse.

(7) Vask i destillert vann, dehydrer. (8) Kontrastfarg, om nødvendig (for eksem­ pel eosin) 1-5 minutter, differensier i 90 To alkohol. Dehydrer og innleir i Eukitt evt. nøytral kanadabalsam.

Etter bruk blir haematoxylinoppløsingen svart grunnet jernalunet, dette betyr ikke noe og fargen kan brukes mange ganger. Hansens jern trioxyhaematin:

(1) Bring snittene ned til vann. (2) Farg progressivt, fargeintensiteten tiltar langsomt til passende styrke (1-10 mi­ nutter).

(3) Vask under springen, 15-30 minutter. (4) Kontrastfarging.

(2) Beis i 3 To jernalun i 30 minutter-24 timer. (3) Vask raskt i destillert vann.

(4) Farg i haematoxylin 30 minutter-24 ti­ mer. Preparatet skal nå se tusjfarget ut.

(5) Skyll i destillert vann. (6) Differensier i 1.5 To jernalunløsning. Bruk egen oppløsning til dette og ikke beisebadet. Under differensieringen tapes far­ ge. Helst bør prosessen følges under mik­ roskopet. (Bruk et utrangert instrument da oppløsningen fremmer korrosjon av metal­

Ulike kontrastfarger kan prøves. Mange bruker anilinblått og/eller orange G. Gå fra trinn (3) i Heidenhains Azanfarging eller stadium (6) i Mallorys fargeprosedyre. Frisk farge gir kraftig farging av kjerne­ ne, mens cytoplasmaet er nærmest farge­ løst. Eldre fargeoppløsninger ka gi en brun­ lig cytoplasmafarge. Brunfargen forsvinner ved differensiering i 2To H2SO4.

Mallorys trippel farge

Dette er en av de vakreste og mest informa­ tive fargemetoder innen mikroskopi. Kun for humane, zoologiske preparater.

122

(1) Bring snittene ned til vann. (2) Beis i HgCF-eddiksyre i 10 minutter.

(3) Rens i destillert vann. (4) Plasser i syrefuxin 15 sekunder. (5) Differensier ved å vaske i destillert vann i 10 sekunder eller lenger etter behov. (6) Plasser i fosfomolybdensyre i 60 sekun­ der (Unngå kontakt med metallpinsetter, de kan beskyttes med et parafinlag påsmeltet).

av fuxin i noen strukturer, hjelper avfarging av kollagen. Oxalsyre forsterker anilinblått W.S. farging. I blandingen av sure farge­ stoffer vil både orange G og anilinblått W.S. utelukke den andre fra de vev hver far­ ge bindes til. Kjerner blir røde, muskelceller og cytoplasmaorganeller røde, nervesystem blir lil­ la, kollagen blir mørkeblått, slimstoffer, bindevev og øvrig hyalin substans blir blå, kitin blir rød eller noen ganger blå, plommemasse gul til orange.

Gentianafiolettmetoden:

(7) Vask i destillert vann i 10 sekunder. Hell væske av objektglasset.

(8) Plasser i Mallorys farge for 75 sekunder. Tørr av baksiden av objektglasset. (9) Skyll i destillert vann i 10 sekunder. Tørr av baksiden av glasset. (10) Differensier i Anilinblått W.S. i 90% etanol for 10 sekunder eller mer etter behov

(planter, kjernefarge, best etter NavashinKarpechenko eller Levitsky fiksering)

(1) Farg snittene i gentianafiolett 1-3 timer (0.5 % i vann). (2) Skyll 30 s i rennende vann. (3) Jodbehandles 30s i JKJ (1 g KJ i 100 ml 50% etanol). Snittene får nå en brun til brunsort farge.

(11) Rens i absolutt etanol for 10 sekunder. (12) Monter direkte i Euparal, eller via helt ren xylen eller benzen (giftig, farlig).

Standardisering av prosessene er viktig. Sy­ refuxin farger raskt - beveg preparatet en gang frem og tilbake i karet. Det samme gjelder vaskeprosedyrene. Tidene varierer mye for ulikt materiale. Man må prøve seg fram. Ved sterk syrefuxinfarging kan man erstatte destillert vann med springvann, differensieringen går ras­ kere. Syrefuxinet er sterkt vannløselig, sær­ lig i vann som er svakt alkalisk. I nøytral al­ kohol er fuxinet varig. Anilinblått W.S. lø­ ses opp raskt i vann og langsommere i 90% etanol. Fosfomolybdat forsterker fargingen

(4) Rask skylling 8 sekunder i 80%, 96%, 100% etanol (så fort som mulig) deretter i nellikolje. Det er av vesentlig betydning at snittene beveges i hvert bad. I alkoholen trekkes fargen raskt ut, i nellikoljen lang­ sommere. Når preparatene virker svakt gjennomskinnelige, er svakt blåfargete, fø­ res de til:

(5) Xylen 1 (kraftig skylning). (6) Xylen 2 (kraftig skylning). (7) Xylen 3 (står minst 15 minutter).

(8) Preparatet innleires i Eukitt eller cederolje.

123

Etter xylen 3 kan man legge dekkglasset forsiktig på og kontrollere styrken av fargingen. Er fargingen for sterk, behandles (differensieres) lengre i nellikolje, er den for svak, føres snittene ned til vann og de farges pånytt. Ofte er det bare nukleolene som far­ ges sammen med kromosomene - dette er utmerket dersom kromosomene sees mørkt blå til blåsorte mot glassklart cytoplasma. Noen ganger er det vanskelig å få farget materialet skikkelig. Dette kan rettes på ved å behandle preparatene før pkt. 1 med 1 % kromsyre i 6 timer. Skyll dem deretter i renende vann og farg 12-24 timer i gentianafiolett.

ter viser røde cellekjerner og kromosomer. Nukleoler og vev ellers er ufargete.

Feulgens reaksjon for snittpreparater:

Videre prosedyrer:

Mer spesifikk farging av kromosomene får man med Feulgens reaksjon. Osmiumfikserte preparater er uegnet. Det er bare DNA-holdige strukturer som farges.

(1) Stopp hydrolysen ved å overføre objekte­ ne til kaldt vann. (Squash-materialet flyttes med pasteurpipetten eller pinsetten. Hvis det haster, så tøm hele innholdet av dramsglasset i beholderen med det kalde vannet). Snittpreparatene må forflyttes me­ get forsiktig til et ribbeglass med kaldt vann.

(1) Før snittene ned til vann, plasser i 1 N HC1 ved 60°C i varmeskap. Bruk et glass som kan lukkes tett, saltsyredamper kan ødelegge termostatskapet! Det skjer en hy­ drolyse av DNA-molekyet og det dannes frie aldehydgrupper som fargen kan binde seg til. Tiden må prøves ut. Den er relativt lang, ca. 25-30 minutter etter kromsyrefikseringer. Skyll i kaldt vann etter hydrolysen.

Hydrolysetiden for snittpreparater avhen­ ger da sterkt av fikseringen: Formalin Helly Susa Zenker Flemming Navashin-Karpechenko

ca. 10 3 18 5 16 ca. 22

min min min min min min

Snittpreparatene må stå i et oppvarmet ribbeglass. Det varme ribbeglasset avgir etsen­ de saltsyredamper. Best er det å ha det i et større syltetøyglass med tettsluttende lokk.

Farging: Feulgenfargen regenereres meget langsomt.

(3) Skyll snittene i 0.5 % K2S2O5 + 5 % IN HC1.

(2) Flytt materialet over i fargekaret (må ha tett kork/lokk). Sett det hele mørkt, kjølig. Etter 2-4 ti­ mer er fargen generert. Rotspisser ser ut som små fyrstikker med rød «tupp». Dette skyldes at cellekjernene ligger tett samlet i dette området.

(4) Før snittene gjennom et bad av like deler absolutt etanol og iseddikk til ren absolutt etanol. Innleiring i Euparal. Man kan også føre preparatene over fra absolutt etanol til xylenbad 2 x og så til Eukitt. Gode prepara­

(3) Snittpreparatene innleires i Eukitt via dehydrering, absolutt etanol og xylenbad. Squashpreparatene innleires i Euparal med frysemetoden. Denne fungerer meget godt med Feulgenteknikken. Hvis Feulgen-

(2) Plasser snittene i Feulgens fuxin 2-3 ti­ mer i mørke.

124 fargen viser seg å være svak, kan man etterfarge med aceto-orcein rett etter squashingen. En fargedråpe tilsettes langs dekkglassranden og får trekke inn mot cellematerialet.

Heidenhains azan farge: (1) Før snittene ned til vann. (2) Farg i azokarmin 45-60 minutter ved 56-60°C i en lukket beholder (hvis fargen allerede er varm, er 30 minutter nok).

(3) Rens i destillert vann. (4) Differensier i anilin alkohol under mik­ roskopet. Kjerner skal være rosa, andre de­ ler gråaktige.

(5) Stopp differensieringen ved å skylle i eddiksyreoppløsningen, 0.5-2 minutter. Objektglassene kan stå i kort tid på dette stadium. (6) Beis bindevev i 5 To fosfowolframsyre 1-3 timer.

(7) Vask raskt i destillert vann. (8) Farg i anilinblått-orange G-eddik blan­ ding, 1-3 timer.

(9) Vask kort (noen sekunder) i vann. Anilinblått W.S. forsvinner fort. Tiden her må være kortest mulig, vasking kan sløyfes. (10) Differensier i 96 To alkohol. (11) Før gjennom absolutt alkohol og xylen, monter i kanadabalsam. Man får pen, sta­ bil og kraftig farging. Cellekjerner blir røde, erytrocytter og neuroglia røde, muskelceller røde til oran­ ge, slimmateriale blått, collagen og retiku-

lært bindevev skarpt blått, cytoplasmatiske partikler røde, gule eller blå.

Enkle fargemetoder for fluorescens For enkle fluorescensreaksjoner er det ofte viktig med ufiksert vev eller ufikserte celler. Man kan enten studere materialet direkte uten mikrotomi, eller man kan fiksere for snitt eller utstryk. Glutaraldehydfiksering er et alternativ, men i endel tilfeller mister man mye av den spesifikke fargebindingen til visse celler og celledeler. Fargetiden er ofte meget kort i forhold til vanlige fargeprosedyrer. Akridingult egner seg til påvisning av tuberkelbakterier. Akridinorange kan diffe­ rensiere mellom DNA (grønn fluorescens) og RNA (orangerød fluorescens) i celle­ kjernen under visse betingelser. Fargen er meget effektiv til å påvise bakterier og soppvekst (eks. bedervet kremkake fra bak­ eri). Berberinsulfat er også fin for cellekjer­ ner. Coryfosin 0 kan brukes for cellekjer­ ner, blodceller og cellevegger i planter. Euchrysin er fin for vedceller. FITC og TRITC brukes i antigenantistoff reaksjoner. Det samme gjelder lissamin-rhodamin B. Pararosanilin (Feulgens reaksjon) er ytterst føl­ som som fluorescensteknikk, og selv ørsmå mengder DNA kan påvises kvantitativt. Primulin 0 er også god for vedceller, QM brukes for påvisning av båndstrukturer langs kromosomarmene. Tetracyclin kan brukes for merking av bensubstans. Når det gjelder immunfluorescenstester, fins idag en mengde reagenser å få kjøpt (SIGMA, AEDRICH) for påvisning av antigener/sykdomsforhold. Blant disse er FTA-ABS som påviser syfilis, toxoplasmose-IFT, candida-test (mykose/soppsykdom), AMA (som påviser antistoffer mot «mitokondrier»/leversykdom/gallechirro-

125 se, ANA for lupus erythematosus og ASMA test ved ulike leverlidelser. ATA bru­ kes mot thyroideasykdommer, Microtrac påviser trachom (smittsom øyensykdom), HSV I og II ulike herpes vira (både munn­ sår og genital herpes). Ulike fluorochromer har vært brukt for å merke antistoffer. De fleste av disse er ba­ sert på stoffet fluorescein, spesielt fluorescein isothiocyanat. Fluorescensen på konjugatet er som regel grønn. Konjugater mel­ lom protein og rhodaminderivater som brukes i immunfluorescens, har hovedsake­ lig rød-orange fluorescens. Umerkete celler eller deler av dem farges ofte med et kontrastfluorochrom. Til dette brukes Rhodamine B, Evans blått eller Kongorødt. Eriochrom svart undertrykker grønn, ikke spesifikk fluorescens og har in­ gen egen emisjon. Det er godt mulig å farge samtidig med flere fluorochromer. Flere substanser kan da påvises samtidig i cellen. FITC og TRITC kan kombineres med methylgrøntpyronin, og med stilbenthiosulfonsyre (SITS), og med FITC og ethidiumbromid. Fluorescensen kan også kombineres med fasekontrast for å identifisere ikke-fluorescerende enkelttrukturer i preparatet. Hvis fluorescensen er svak, kan dette skyldes flere forhold. Preparatet er ikke friskt, eksitasjonsstrålingen har bleket fluorescensfargen, objektivet eller kondensor har for lav apertur, det er for stor okularforstørrelse, eller mikroskoprommet er for lyst. Hvis bildet har for liten kontrast, kan eksitasjonslyset være for bredspektret, man kan ha ikke-spesifikk farging eller innleiringsmidlet og optikken kan ha egenfluorescens. Autofluorescens eller ikke-spesifikk flu­ orescens kan skyldes forurensninger i pre­ paratet, men det kan også sitte ubrukelige objektiver i mikroskopet. Hvis fluorescenslyset plutselig blir borte, skyldes dette oftest bleking. Blekingen er betydelig svakere med

Tabell 4. Fluorochrom Emisjon

DAO (diaminofenyloxydasol) 460 nm DANS (1-dimethylaminonaftalen5 sulfonsyre) 525 nm 5-hydroxy tryptamin (5-HT) 530 nm SITS (stilbenisothiosulfonsyre) 460 nm Aurofosfin G 580 nm Berberinsulfat 550 nm Cathecolamin 470 nm Euchrysin 540 nm Primulin 0 550 nm Pyronin 540 nm Quinacrine mustard (QM) 510 nm Tetracyclin 560 nm Thioflavin S 550 nm Akridingu It 550 nm Akridinorange 530/560nm Auramine 550 nm Coryfosfin 0 575 nm Fluoresceinisothiocyanat (FITC) 525 nm Fosfin 3R 565 nm Lissaminrhodamin B200 (RD200) 595 nm Magdalenarødt 570 nm Pararosanilin («Feulgen») 625 nm Rhodamin B 625 nm Syrefuxin 630 nm Thiazin rødt R 580 nm Tetramethyl rhodamin isothiocyanat (TRITC) 570 nm

Eksitasjon 280 nm

340 nm 400 nm 365 nm

450 nm 430 nm

410 nm 430 nm

410 nm 410 nm 440 nm 390 nm

430 nm 470 nm

470 nm 460 nm 460 nm 490 nm 465 nm 575 nm 540 nm 570 nm

540 nm 50 nm

510 nm

540 nm

126

halogenlampen enn med kvikksølv- eller xenonlamper. Rød bakgrunnsfarge skyldes ofte at man har glemt å bruke BG 38 filteret i strålegan­ gen. Ujevnt lys skyldes oftest feil lampejustering, blafrende lampe (Farlig !! må straks utskiftes, NB! etter avkjøling), eller feil sentrering av kondensor. Blir mikroskopbildet plutselig borte, kan dette skyldes vandring av preparatet. Er det umulig å fo­ kusere i fluorescensmikroskopet, kan front­ linsen være skitten. Dersom QM fluorescens gir uskarpe kromosomdetaljer slik at båndene er utydelige, skyldes dette oftest at objektivet har for høy apertur i forhold til kondensor (eller belysningssystem). Bruk et objektiv med irisblende.

Tillaging av fluorochromer:

De fleste fluorochromer skal løses i vann el­ ler buffer. Løsningene er vanligvis svært tynne (1:500 til 1:30 000). Noen få dråper fenol eller et par krystaller med thymol for­ hindrer vekst av mikrober. Akridin-orange er begrenset holdbar og virker best som frisk løsning.

Kvalitetspreparater uten snitting Ofte kan man lage fine mikroskoppreparater med ytterst enkle metoder. Det er lett å spre enkeltceller på objektglasset ved ulike slags utstryksteknikker. Særlig er blod egnet for dette, men slike teknikker kan også fungere med endel andre bløte vev som bakteriesuspensjoner og sekreter. Andre eksempler er melk, pollen, sæd, puss, avføring og protozooer. Det kan kre­ ves øvelse og håndlag før man får det hele ordentlig til. Dyrker man cellene direkte på objekt- eller dekkglass i et tynt sjikt med

næringsmedium, kan man ofte få fremra­ gende preparater. Noen ganger er det best å dyrke cellene på ordinært medium i petriskåler. Dette gjelder spesielt endel sopp. Vi kan lage fine preparater av det ytterste cellelaget ved å legge et tynt limsjikt på dekkglasset og å presse det forsiktig ned mot kolonien. Det blir et enlaget sjikt med hyfer og sporer som rives av. Glasset fikseres og farges og prepa­ ratene blir like tynne som de beste mikrotomsnitt man får med parafinmikrotomen. Denne avrivningsmetoden fungerer godt for mange materialer med tørr overflate, men fungerer dårlig i «fuktige» tilfeller. Det er også mulig å isolere, pirke - eller rive cellevev fra hverandre ved hjelp av fine disseksjonsnåler under binokularmikroskopet. Dette blir ofte utført i forbindelse med teknikker for kromosomstudier der cellene presses mest mulig flate («squash»). Andre ganger kan man oppdele og kutte ve­ vet i en hurtigmikser og studere celletyper i suspensjonen. I en egen gruppe står metoder som innvolverer disseksjoner og injeksjoner i en­ keltceller med fine glassonder eller laser­ stråler. Sistnevnt er av stor praktisk interes­ se for bioteknologiske formål. Det lønner seg for mange problemstillinger å bruke fle­ re ulike mikroskopteknikker som supplerer hverandre. Svært mange metoder er basert på fikser­ te, døde celler. Vi må derfor ikke glemme de mange mulighetene som eksisterer for å dyrke celler direkte i mikroskoppreparatet. Slike teknikker representerer muligheter for eksperimentering og studium av prosesser over tid i levende celler. Forbedrete dyrkingsmetoder og optiske teknikker har økt våre muligheter vesentlig på dette området.

Squash, smear og utstryksmetoder Disse teknikkene har fått en stadig økende betydning og blir stadig mere raffinerte.

127

Som vi ser (s. 105) er mikrotomteknikker omstendelige og langvarige, men har den fordel at de er lette å lære. Enhver kan etter opplæring oppnå rutinemessig gode resul­ tater. Såkalte squash- og smearmetoder krever derimot et spesielt håndlag og kan bokstavelig talt best sammenliknes med «kokekunst innen det franske kjøkken». Alle kan etter opplæring beherske en rekke standardretter som «fiskeboller, hvit saus og kjøttkaker», mens raffinerte retter som «pekingand, crépes Suzette etc.» krever langvarig øvelse og innsikt om kvaliteten skal bli god. Noen squashteknikker er så vanskelige at de bare kan utføres av noen få nålevende forskere.

Tilfredsstillelsen over å lykkes med slike vanskelige og spennende prepareringsprosedyrer kan være stor. En nyutviklet tek­ nikk føre til oppsiktsvekkende vitenskape­ lig ny informasjon, - ja som totalt endrer utviklingen på visse forskningsområder. Et klassisk eksempel er Jo Hin Tjio og Albert Levans publikasjon over menneskets kromosomtall i det svenske tidsskriftet «Hereditas» i 1956. Ved å behandle huma­ ne celler i deling med giftstoffet colchicin og deretter svelle dem i hypoton saltløsning fikk man for første gang fastslått mennes­ kets normale kromosomtall til 2 n = 46. Dette la grunnlaget for den moderne utvik­ ling av medisinsk genetikk som i disse da­ ger har kuliminert i arbeidet med å kartleg­ ge det komplette genom for mennesket som art. Svensken Theodor Casperssons utvik­ ling av såkalte båndfargeteknikker, oppda­ get i 1967, er et annet eksempel. Titusener av vitenskapelige artikler har fulgt i kjøl­ vannet på disse to oppdagelsene. Squash- og smearmetodene har sin vik­ tigste betydning når det gjelder kromosomanalyse, cytogenetikk, kreftforskning og biologisk systematikk.

Generelle prinsipper ved kromosomanalyser Kromosomene er bare synlige i mikrosko­ pet under cellekjernens deling. I det biokje­ misk aktive stadier («hvilekjernen») er kromosomtrådene utstrukne og kan bare i be­ grenset omfang studeres med vanlige mik­ roskopiske metoder. Vi må altså finne de vevspartier som er i aktiv deling, eller dyrke celler i kunstig medium og få dem til å dele seg. I planter finner man vev i deling i de så­ kalte meristematiske vev: «vekstpunkter» (rotspiss, bladanlegg), i kambium og meiotisk vev. Hos dyr fins mitoser i benmarg, epitelceller (herunder hornhinneepitel), i hår- og fjærsekkceller og i ulike former for sykt vev (cancer). Meioser kan man finne i testikler og egg­ stokker. Cellekjernens deling vil undertrykkes el­ ler mangle fullstendig hvis ikke individet er i god helsetilstand ved fikseringen eller prø­ vetakingen. Vevet må fikseres raskt. På få minutter kan prøven bli helt ubrukelig. I enkelte sopp tar anafasestadiet bare 20-30 s, og kjernene går i restitusjon eller interfase lenge før fik­ seringen er ferdig. PLANTEMATERIALE

I blomsterplantene er det en delingssone i rotspissene ca. 0.5 mm fra tuppen. Her lig­ ger delingsplanet vinkelrett på rotspissens lengdeakse. I lengdesnitt av roten ser vi mitosestadiene fra siden. Dette er fordelaktig for studium av selve forløpet av mitosen. Likeledes for å se såkalte kromosombroer indusert av stråling eller kjemikalier. For analyser av kromosomtall og kromosomenes morfologi lager man derfor tverrsnitt. Squasher vi cellene (d.v.s. banker dem fra hverandre med makt), vil vi fremdeles som oftest se kromosomene fra siden. De enkel­ te kromosomer kan ikke studeres nærmere.

128 Spindelapparatet - et fint nett av proteintråder - holder dem sammen slik at de ikke kan sprees og cytoplasmaet i cellen er for hardt til å presses utover. For å lage gode preparater må vi derfor ha en passende forbehandling, riktig fikse­ ring samt bløtgjør ing av vevet slik at kom­ ponentene kan sprees mest mulig ved squas hi ngen. Det er cellekjernene og kromosomene som kjemisk sett er de mest bestanddige de­ ler av cellematerialet. Vi kan derfor ty til temmelig «dramatiske» behandlingsmeto­ der selv om disse ikke kan brukes for studi­ um av selve cytoplasmaet. Eddiksyre er en sentral komponent under fremstilling av kromosompreparater. I de fleste tilfeller skal styrkegraden være omlag 45%. NB! Eddiksyre med denne styrken er sterkt etsende. Det er meget farlig å få sprut i øyet, dette kan gi rask blindhet el­ ler varige ødeleggelser av hornhinnen. Man bør alltid bruke en form for briller under arbeidet med eddiksyre og liknen­ de væsker. Normalsynte personer kan kjøpe et par billige briller med vindusglass. Dette gir god beskyttelse i de fleste situasjoner.

Koking eller oppvarming av fiksert vev i ed­ diksyre, eller bedre oppvarming til 60 °C mineralsk syre (styrke omlag 1 N) bløtgjør vevet. Uvedkommende cytoplasmastrukturer blir som regel borte. Dette er fordelaktig så lenge man bare vil studere kromosome­ ne. Disse får til gjengjeld bare meget små, eller ingen synlige strukturelle skader av syrebehandlingen. Innsamling av prøver i felt medfører stor risiko for feil og dårlig kvalitet på prepara­ tene. Det beste er å innsamle levende plan­ ter som dyrkes for en tid i veksthus i blom­ sterpotter. Etter en tid er det utviklet nye

rotspisser langs potteranden. Planten kan «bankes» ut av potten. Gode rotspisser er hvitgule og ser «friske» ut. Røtter med guleller brunskjær vokser ikke og har ingen mitoser. Mange planter har så tynne rot­ spisser at de ikke sees ordentlig uten binokularlupe. Disseker ut, eller plukk direkte av med (urmaker)pinsetten. Spissene skal være 1-2 cm lange og legges i et hetteglass med vanlig vann.

Rotspissene kan forbehandles i:

0.02% colchicin 4-5 timer (eller 0.001 M 8-hydroxyquinoline, temperatur ikke over + 16 °C), evt. kombinert med 0.02% colchicin.) Hvis det er få mitoser, kan pottene settes i kjøleskap natten over ( + 1 °C). Antallet metafaser per rotspiss øker betraktelig. Flytt over i nedkjølt colchicinløsning 0.02%. Fikser etter 30 minutter i Carnoys løs­ ning. Et alternativ er Ostergren-Heneéns løsning. Sistnevnte er svært giftig og brann­ farlig og krever spesiell forsiktighet. Dam­ per av eddiksyre virker høyst skadelig og ødelegger kromosomstrukturene. Vevet må komme i væskefasen øyeblikkelig.

Kromosompreparater uten fiksering Karmineddiksyrepreparater: (for fremstilling av fargen se side 118)

Hvis det kommer spor av jern i karmineddiksyren, blir fargingen av kjerner og kro­ mosomer betydelig mørkere. Ofte tilsetter man jernacetat til løsningen, men det har lett for å bli utfellinger. Utfellingene har form og størrelse som gjør at de kan for­ veksles med kromosomer! Det er bedre å benytte gamle pinsetter og preparernåler. Disse avgir tilstrekkelige mengder jernjoner.

129

(1) Legg friske rotspisser i en liten porselensdigel. Drypp 9 dråper karmineddiksyre og 1 dråpe 1 N HC1 oppi (dråpeteller). Varm forsiktig over spritflammen. Hold åpningen av porselensskålen vekk fra an­ siktet, bruk briller. Det hele har lett for å støtkoke. La det boble 5 sekunder. Sett skå­ len på benken. La det kjøle ned. Husk at syredamper er meget skadelige for mikro­ skopene. (2) Legg rotspissene opp i en dråpe 45 % ed­ diksyre på et rent objektglass. Se på i binokularlupen. Kutt dem av ca. 3 millimeter fra spissen. Behold det ytterste stykket, kast resten. Vær nøye med at det ikke fins sand­ korn eller harde partikler i preparatet! (3) Flytt rotspissen over på et nytt objekt­ glass i en dråpe karmineddiksyre. Legg på dekkglass. Bruk helst dekkglass av størrel­ sen 24 x 36 millimeter. Væskemengden må være slik at dekkglasset ikke flyter.

(4) Bank forsiktig med neglen rett over rot­ spissen. Den skal nå falle fra hverandre i sine enkelte celler. Banker man for mye, går enkeltcellene i stykker, banker man for lite vil ikke celler og kromosomer spres utover. (5) Snu preparatet slik at dekkglassiden vender ned. Legg det ned mot et dobbelt filtrerpapir som hviler på en tykk (15-20 millimeter) speilglassplate. Press jevnt med begge tommelfingre (dekkglasset må ikke gli). Kan man bruke hele kroppsvekten (50-90 kg), er det bra. Cellene er nå «squashet». (6) Preparatet kan nå inspiseres i mikrosko­ pet. Hvis det hele er gått bra, ser man man­ ge «hvilekjerner» og en god del kjernedelingsstadier. Preparatet er holdbart for noen timer. Hvis man vil gjemme det til neste dag, kan det legges i en lukket petriskål med filtrerpapir fuktet med 45 % ed­ diksyre i bunnen. 5 - Mikroskopi

Prosessen er identisk for direkte farging med orcein-eddiksyre. Man skal ikke tilset­ te jernacetat til orcein. Det har vært hevdet at karminfarging er mer varig enn med orceinfarging. På side 199 er beskrevet hvordan man lager varige preparater med orcein som ikke bleker.

Karmin er en god farge, men det kan bli samtidig svak rødfarging av cytoplasmaet. Orcein er det fargestoff som gir mest kon­ trastrike kromosompreparater. På samme måte kan man preparere små vekstpunkter (skuddspisser, bladanlegg). Her vil stivelses- og klorofyllkorn forstyrre det optiske bildet.

PROBLEMER SOM KAN OPPSTÅ

(1) Svak, eller ingen farge. Mange planter har innholdsstoffer i cellene som forhindrer eller svekker fargereaksjonen. Det kan også ha vært for mye saltsyre i fargeblandingen. Kjerner og kromosomer blir ikke intenst rødfargete. Istedet blir de svakt rosa og kan ofte knapt sees. Proble­ met kan også oppstå ved koking. Eddiksyren har ikke trengt inn og den tykke rot­ spissen ble kokt i sin egen vevsvæske. Der­ med er alle strukturer ødelagt. Kutt vevet i mindre biter først. Svak fargereaksjon kan også unngåes ved at man hydrolyserer ved romtemperatur i 6 N HC1 (se side 151). Dette synes å fjerne forbindel­ ser som hemmer fargereaksjonene.

(2) Cellene lar seg ikke banke ut eller spre. Skyldes ofte gammel rotspiss. Gamle rot­ spisser er brunlige i farge. De vokser ikke og har ingen mitoser. Se også etter eventuelle sandkorn og dekkglass splinter (vanlig) som er kommet inn i preparatet. Kast, be­ gynn pånytt.

130 (3) Det er ingen mitoser. Kan skyldes at man ser på feil type vev. Det er bare ca. 500 nær spissen det fins cel­ ler i deling. Planten kan også ha sturet grunnet manglende vanning, eller den er i en hvileperiode.

(4) Mange ganger har man en kombinasjon av ovenstående problemer. Husk også at mange planter har små kromosomer, de kan være vanskelig å få øye på. Fint øvelsesmateriale er rotspisser fra husholdningsløk (Allium cepa) eller purre (Allium porri).

Meioseanalyse i plante- og dyremateriale Meioseanalyser i plantemateriale med squashmetoden kan gi verdifulle opplysninger som det ikke er mulig å oppnå på annen måte. Under meiosen danner kromosompar og enkeltkromosomer karakteristiske geometriske konfigurasjoner som kan ana­ lyseres. Opplysningene man får sier adskil­ lig om planten eller dyrets genmateriale. Som regel er det forholdsvis enkelt å prepa­ rere meiosen i planter og dyr med squashteknikken, og man kan klare seg med for­ bausende enkelt utstyr. Intet annet felt av mikroskopien gir så mye fakta i forhold til arbeidet man nedlegger i prepareringsprosedyrene. Endel vanskelig materiale bør imidlertid suppleres med mikrotompreparater. I frøplanter finner man meioser i knop­ per som skal utvikle seg til blomster. Som regel analyserer man delingene som finner sted i de cellene som skal utvikle seg til pollenkorn, - pollenmorceller (= PMC). Hvert støvbæreranlegg inneholder som re­ gel et stort antall pollenmorceller som deler

seg synkront. Enten finner man altså meiose i knoppen, eller så har man for seg utviklingsstadiet før eller etter meiosis. Meiosen varer omlag 24 timer. Som gene­ rell regel gjelder at en knopp som er ca. 1/7 del av totallengden for fullt utsprunget blomst (blomsterbeger iberegnet) kan ha meiosestadier. Tillaging av meiosepreparater i planter er morsomt, men krever øvelse. Det er spesielt viktig å kjenne igjen formen på vevet som blir til pollenmorceller og fer­ dig pollen. Dette vevet befinner seg sentralt i støvbæreranleggene. I tidlige stadier kle­ ber cellene seg sammen og er lite fargbare. Enkeltcellene avrundes etterhvert og får form som et hønseegg, altså nær elliptisk. Meiosen, unntatt i mange orkidéer, finner sted akkurat idet cellene løsner fra hver­ andre. Dette er karakteristisk for pollen­ morceller som er i meiosestadier. Pollenmorcellene skiller seg fra andre celler i plan­ ten ved celleveggens form og tykkelse.

Vi gjør nå noen enkle forsøk: (1) Åpne en blomsterknopp med to insekts/ disseksjonsnåler under binokularmikroskopet. En glimrende art å øve seg på er Ornithogalum virens. Den har bare tre kromo­ somer. (Frø kan skaffes fra botaniske hager.)

Man kan også klare seg med en enkel lupe, for eksempel en frimerkelupe med ben. Pirk ut anleggene til støvbærerne på et ob­ jektglass. Er knoppene i det riktige, eller nær det riktige stadiet, så er de gulhvite el­ ler grønnaktige. Gul eller annen farge på støvbærerne tyder på at de inneholder pol­ len, og man prøver da med en ny knopp. (2) Prøv å åpne støvbæreren med disseksjonsnålene. Dette kan være ganske vanskelig for små blomster, og det gjelder å være stø på hen­ dene. Med litt trening går det hele greitt.

131

(3) Press forsiktig ut innholdet i hver støvbærer. (4) Drypp straks på 2 dråper 45 % ed­ diksyre). Som regel får man nok materiale fra 1-3 støvbæreranlegg. Cellene må \kke tørke. Fjern alt unødig vev (tomme støvbæreran­ legg etc.). (5) Drypp på 2 dråper aceto-karmin eller aceto-orcein. Legg på dekkglass.

(6) Inspiser i mikroskopet med 10 x eller 20 x objektiv. Det kan lønne seg å bruke et gammelt, slitt mikroskop fordi syredampene er uhel­ dig for instrumentet. Prøv å finne pollenmorcellene. I meiosestadiet (unntak orkidéer) er de hønseeggformete. Kromosomer og kromosomkonfigurasjoner farges alltid intenst i dette stadium, selv i planter der mi­ toser er vanskelige å studere grunnet svak fargingsreaksjon.

(7) Nå kommer det vanskelige. Før preparetet inn i spritflammen (dekkglasset skal her såvidt svømme løst oppå). Varm (2-5 s) til temperaturen er ca. 60°C. Legg baksiden av preparatet mot hånd­ flaten. Man kan såvidt tåle denne tempera­ turen uten å svi seg. Legg det forsiktig un­ der mikroskopet. Studer preparatet med 10 x objektivet. Oppvarmingen har svellet pollenmorcellene. Cytoplasmafargingen er nesten for­ svunnet og kromosommaterialet er langt tydeligere. «Korn» og partikler i cytoplas­ maet som før forstyrret det optiske bildet av kromosomene er nå borte.

(8) Varm en gang til og inspiser. Hvis prepa­ ratet virker ennå bedre, varm pånytt. Fort­ sett til det ikke er noen tydelig bedring (var­ me 5 s, inspiser i mikroskop).

Hvis man trykker på dekkglasset, eller forstyrrer preparatet på annen måte, får man ikke til denne effekten. I vellykte pre­ parater får pollenmorcellene minst dobbelt diameter. Ettersom væsken fordamper, avflates cellene av seg selv og kromosomene sprees nydelig utover (se fargebilder), i et forstørret arrangement. Kromosomene be­ holder stort sett sine innbyrdes opprinneli­ ge posisjoner i cellen, de forflyttes ikke i forhold til hverandre.

(9) Snu tilslutt snur preparatet opp-ned og press det forsiktig opp/ned mot filtrerpapir som ligger på en speilglassflate. Bruk ikke makt, et svakt trykk er nok. Har man ut­ ført dette riktig, er det oppnådd et preparat som er det rene mesterverk av cytogenetisk informasjon. Et godt pollenmorcellepreparat kan inneholde flere tusen celler med analyserbare kromosomarrangement.

Permanente preparater: Gode squashpreparater kan gjøres perma­ nente (varige) ved å innleires i Euparal.

(1) Hell 25 ml av følgende væskeblanding i en glass petriskål: 12.5 ml abs. etanol 12.5 ml iseddikk

(2) Skjær to glasslister fra et objektglass. Dette gjøres ved å risse ca. 5 mm parallelt innenfor endeflaten med en diamantblyant. Brekk av. Legg glasslistene diametralt mot­ satt i bunnen av petriskålen. (3) Legg preparatet opp-ned slik at endefla­ tene på objektglasset hviler på hver sin glasslist. Vent til dekkglasset løsner og fal­ ler av. (4) Overfør dekkglass og objektglass hver for seg (forsiktig) til en skål med abs. eta­ nol.

132

(5) Vent et minutt. (6) Legg objektglasset med cellene opp på et filtrerpapir. Drypp på 1-2 dråper Euparal. Legg på et nytt dekkglass. Ikke rør prepara­ tet nå. (7) Ta et nytt objektglass, legg det på filtrer­ papiret. Drypp 1-2 dråper Euparal på mid­ ten. Ta dekkglasset med cellene, legg det med cellesiden ned mot Euparaldråpen.

Det krever noe øvelse å unngå luftblærer i preparatet. Hold dekkglasset på skrå ned mot dråpen med urmakerpinsetten. Euparalen bør ikke være for tykk (kan tynnes med abs. etanol). (8) Når preparatene er halvtørre, settes små messinglodd på, ca. 40 g. De kan lages av en sylinderformet messingstav som kuttes i 2-3 cm lange biter. Loddene presser dekk­ glasset ned mot cellene og bevirker et mest rmilig flatt preparat uten sfærisk abberasjon. Over tid vil disse preparatene blekne. Dette skyldes syrerester og sen dehydrering. Når dekkglasset løsner, faller erfaringsmessig mange celler av og blir borte for alltid. Denne teknikken kan forbedres vesentlig ved bruk av følgende metode:

(1) PMC utdissekeres i 45 °7o eddiksyre og tilsettes en dråpe aceto-orcein. Dekkglass på. (2) Hvis meiosedelinger, legg preparatet i en lukket petriskål med filtrerpapir fuktet med 45 % eddiksyre på bunnen. Dekkglasset skal «svømme» oppå uten at det søles. Vent 24 timer. Alle cellene er nå grundig farget. (3) Varm forsiktig i spritflammen, inspiser i mikroskopet. La cellene ekspandere ved

gjentatt oppvarming/svelling Squash forsiktig.

som

sist.

(4) Legg preparatet med dekkglasssiden ned på et Peltier fryseapparat (se Figur 75). Vent til væsken i preparatet er frosset. Van­ ligvis tar dette ca. et minutt. (5) Vipp av dekkglasset med et skalpellblad og la både objektglass og dekkglass straks «falle» ned i et kar med 100 % etanol. Dette krever litt øvelse. Preparatet splittes i to i frossen tilstand uten at noen celler løsner. (6) Monter dekkglass og objektglass hver for seg med nytt objekt- henholdsvis dekkglass i Euparal. Sett lodd på når prepa­ ratet er halvtørt. Det beste er å la preparatetene ligge på to smale, parallelle trelister slik at bare en liten del av objektglasset er i kontakt med under­ laget. Dette forhindrer mye søl. Man må ikke røre på de fuktige dekkglassene så len­ ge de er dekket av en alkoholfilm. Når den­ ne damper av, blir de tørre uten at Euparalen trekker rundt kanten og søler dem til. Loddet settes best på etter ca. 24 timer. Pre­ paratene bør stå med lodd 2 -3 uker før de er tilstrekkelig herdet. Med denne metode bleker verken orcein- eller karminfarge. In­ gen celler går tapt.

Feulgen-squash teknikker Riktig brukt er Feulgenfargen (s. 205) spesi­ fikk for DNA i cellekjernene. Ved syrebehandling går noe av DNA-dobbelthelixen i stykker, og det oppstår fri ender på mole­ kylet med aldehydgrupper. Den avfargete Feulgenvæsken (leucobasen) reagerer kje­ misk med disse. Under reaksjonen regene­ reres en synlig, dypt blåfiolett farge. Reaksjonen er kvantitativ. DNA-meng-

133 den i en cellekjerne kan derfor måles optisk ved såkalt fotometri dersom man har refe­ ranseverdier fra celler farget på nøyaktig samme vis. Den regenererte farge kan være svak dersom DNA-mengden per arealenhet er lav. Ved bestråling med grønt lys, oppstår det imidlertid kraftig fluorescens. I fluorescensmikroskopet kan vi derfor se og måle ytterst små DNA-mengder, for eksempel i en bakterie i en soppkjerne eller i et mitokondrion (Laane/Lies metode). Fluorescensmetoden kan påvise DNA-konsentrasjoner som anslagsvis er 1/1000 av dem vi kan se med synlig lys. Essensielt for Feulgenteknikken er syrebehandlingen. Bruk små dramsglass med plastkork. Hell i hvert glass 10 ml IN HC1. Sett dem i et vannbad (vannet må ikke nå opp under korken!) som holder nøyaktig 60 °C! Kontroller temperaturen både i van­ net og syren med et termometer. Et bedre arrangement er å bygge selv et stabilt varmeapparat. Det borres hull til hetteglassene i en passende aluminiumblokk slik at de stikker godt nedi. Blokken settes på en elektrisk, regulerbar varmeplate og var­ mes undenifra. Varmeplaten kan lett reguleres med en elektronisk termostat (nøyaktighet ca. + /-0.2°C, forhandles hos Claes Ohlsson, Oslo). Liknende appa­ rater forhandles også til bruk i DNA-teknologien til vesentlig høyere priser.

(1) Carnoyfiksert vev, eller vev fiksert med Ostergren-Henéens metode legges i syrebadet. Hvis små biter, flytt med en pasteurpipette, større biter med en urmakerpinsett. Metallet i urmakerpinsetten ruster lett når den kommer i syrebadet! Har man råd, kan man bruke en spesialpinsett med ekte gullspisser eller forgylte (brukes i elektronmikroskopi).

(2) Etter nøyaktig 10 minutter flyttes vevsbitene over i kaldt vann. Her teller sekunde­ ne. Enkelte ganger kan det lønne seg å helle innholdet i dramsglasset i det kalde vannet. For de fleste materialer passer 10 minut­ ters hydrolyse bra. Tiden kan variere og far-

gingen kan bli mer intens med andre tider. Dette bør prøves ut.

Feulgen fluorescensmetode for squashpreparater Metoden krever et fluorescensmikroskop utstyrt for pålysfluorescens i det grønne området av spekteret. (Eksiteringsfilter BP 546 nm, delespeil FT 580 nm, absorpsjonsfilter LP 590 nm, kvikksølvlampe HBO 100).

(1) Kutt materialet i 1-2 mm3 store biter. Legg det i Carnoy 3: 1 i 4 minutter. (2) Hydrolyser ved romtemperatur i 5 N HC1 i 5 minutter. (3) Rens i destillert vann 1 minutt.

(4) Farg i Feulgens reagens 10 minutter. Det bør ikke overfarges (5) Rens i 3 bad med SO2 vann. (6) Squash i 45 % eddiksyre. (7) Innleir i Euparal, eller via xylen til Eukitt.

Bruker vi fortynnet Feulgen-reagens, ser vi omtrent ingen farging i lysfelt. I fluorescensmikrokopet fremkommer kjerner og kromosomer svært tydelig ved pålysfluo­ rescens. Fluorescensfargen er orangerød.

Avstøpning med silikonmasse Silikongummi, helst den svarte typen har mange enestående egenskaper for mikros­ kopiske formål. Med silikongummi lager vi lett avstøpninger av de fineste strukturer i

134

kompliserte overflater. Vi kan bruke den type som selges til bil- og bygningsformål. Svart silikongummi har minst overflatereflekser og kan brukes i et pålysmikroskop. Gummien herder ved vanlige laboratorieforhold i løpet av et døgn. Avtrykk av blad:

(1) Legg litt silikonmasse på objektglasset (2) Press bladets overflate mot masse med jevnt trykk

(3) La preparatet ligge 8-10 timer. Det gjør ikke noe om bladet visner etterhvert (4) Riv av bladet og mikroskoper avtrykket

Vi får egentlig en «negativ» avstøpning. Den kan fungere som støpeform for «posi-

Figur 64 Strålegangen i et klassisk transmisjons elektronmikroskop (Siemens Elmiskop 1). Søylen er forsynt med mekaniske justeringsanordninger. I nye mikroskop er justeringene tildels automati­ sert. Siemens - Halske, AG. (1) Justering av elektronkanonen (2) Katode (3) Blende (4) Anode (5) Justeringsdrev (6) Kobberspoie, kondensorlinse 1) (7) Kobberspoie, kondensorlinse 2) (8) Justering, kondensorblende (9) Preparatsluse (10) Objektpatron (11) Objektbord, objektfører (12) Aperturblende, justering (13) Stigmator (14) Kobberspoie, objektiv (15) Kobberspoie, mellomlinse (16) Mellomlinseblende (17) Mellomlinsespeil (18) Mellomlinse bildeskjerm (19) Pol sko revolver, drev (20) Kobberspoie projektiv (=«okular») (21) Fluorescerende bildeskjerm (22) Platekamera (23) Vannkjøling

135

tive» avtrykk. Kjøp litt celluloselakk og legg på et lakklag med en fin pensel. Lak­ ken stivner etter 10-15 minutter og lar seg lett rive av.

Elektronmikroskopet Transmisjonsmikroskopet (TEM), Fig. 64 Hovedbestanddelene i transmisjonsmikro­ skopet er vakuumkammeret, elektronmikroskopsøylen, katode- og anodesystem og et elektronoptisk system som projiserer bil­ det på en fluorescerende skjerm eller en fo­ tografisk film. Trykket inni søylen er omlag 1 x 10 4 Torr eller mindre. Elektronene ak­ selereres ved hjelp av en akselerasjonsspenning mellom det oppvarmete katodefilamentet og anoden. Anoden er ofte jordet, mens katoden holder en høy negativ spen­ ning. Katoden er isolert fra resten av mik­ roskopet ved hjelp av glass eller keramikk. Linsesystemet består av elektroniske kobberspoler og virker analogt med en optisk linse. Kondensorlinsesystemet konsentrerer strålen på preparatet, og objektiv- og projektorlinsesystemet danner et forstørret bil­ de av preparatet på den fluorescerende skjermen eller filmen. Innretningen av det optiske systemet er ikke så ulikt lysmikroskopets. Da det er upraktisk å observere bildet på toppen av­ en lang søyle, har man «snudd» mikrosko­ pet 180°. Kondensorlinsene er derfor øverst på søylen, «okularet» =projektivet nær søy­ lens bunn. Objektet beveges ved hjelp av et kryssbord som er en mer presis utforming av det man finner i lysmikroskopet. Preparatet kan taes ut og inn gjennom en preparatsluse.

Preparatslusen er laget slik at den kan av­ stenges fra resten av søylen. Dermed er det ikke nødvendig å lufte ut hele mikroskopet hver gang man skifter preparat. Man kan tilføre slusen luft og pumpe den fri for luft, uavhengig av resten av vakuumsystemet. Likeledes er det mulig å avstenge fotoappa­ ratet fra resten av vakuumsystemet. Mik­ roskopet er forsynt med elektroniske spenningsstabilisatorer både for høyspenningen til katoden og for den langt lavere linsestrømmen. Mikroskopet har minst to pumpesystemer for at det skal kunne oppnåes tilstrek­ kelig vakuum, dels en vanlig rotasjonspumpe (forvakuumpumpe), dels diffusjonspumpe(r) for å oppnå høyvakuum. Diffusjonspumpen og oftest også linsene må kjøles med kjølevann. Man bør sette seg nøye inn i operasjonen av det mikroskop man har til rådighet. Fabrikkinstruksjonen bør følges nøye!

Scanningelektronmikroskopet (SEM), Fig. 65 Scanningelektronmikroskopet bruker lin­ ser til å konsentrere en tynn elektronstråle ned på preparatet. Ved hjelp av avbøyningsspoler (omtrent som i et TV-bilderør) kan strålen beveges i et rasterliknende mønster over preparatoverflaten som ofte er pådampet et tynt metallag i vakuum. Fra metallflaten kommer sekundære elektroner som oppfanges av en detektor. Signalet forster­ kes elektronisk opp og gjengies som et syn­ lig bilde på en skjerm. SEM har altså ikke linser i vanlig forstand til bildedannelsen. SEM egner seg for alle slags prøver med fast overflate. De kan være store, av centi­ meters størrelse og tykkelse, men kan ikke være vannholdige. Biologisk materiale kan etter fiksering dehydreres og tørres uten skrumpning ved såkalt kritiskpunkt be­ handling. Aceton erstattes av flytende CO2

136 KJØP OG DRIFT AV ELEKTRONMIKROSKOP

Et elektronmikroskop representerer en investering i millionklassen, det er plasskrevende og forutsetter omfattende innredning av et spesiallaboratorium. Elektronmikroskopet er dyrt i drift og forutsetter år­ lig vedlikehold og service. Daglig drift av et elektron­ mikroskop er arbeidskrevende og krever at man dis­ ponerer heldags teknikerstilling. Det er også nødven­ dig med kostbar tilleggsapparatur som vakuumpådampningsanlegg, en til to ultramikrotomer, avansert fotolaboratorium etc. I motsetning til lysmikroskopet som (i prinsippet) nærmest er uslitelig og kan ha en le­ vetid på 50-100 år om det stelles pent, utrangeres elektronmikroskopet i løpet av få år. Investerer man i et elektronmikroskop, bør det faglige utbyttet per år minst representere en «verdi» av 250 000 kr om det skal lønne seg. Enkeltforskeren er best tjent med å låne brukstid på et instrument ved et sentralt laboratorium. Her i lan­ det fins et stort antall instrumenter ved de fleste uni­ versiteter og større forskningsinstitutter. Amatørmikroskopikeren kan kanskje få tilbud om et gratis in­ strument blant dem som ofte utskiftes og «kastes».

Linser

Figur 65 Strålegang i et Jeol scanning elektronmikroskop. Elektronstrålen konsentreres ned mot preparatet ved hjelp av kondensor- og objektivlinser. Ved hjelp av avbøyningsspoler scannes strå­ len over preparatet. En detektor oppfanger strøm­ men av sekundære elektroner. Signalet forsterkes og vises på en bildeskjerm. Jeol, Tokyo, Ltd.

som oppvarmes i en trykkbeholder. Ved det «kritiske punkt» (ca. 31 °C) går carbondioksidet direkte over fra væskeform til gass. Gassen slippes langsomt ut og de overflatespenningene som ellers ødelegger materialet ved tørringen, unngåes. Pådampning av metall og kritiskpunkt-tørring utføres best av laboratoriets tekniske per­ sonale.

Elektronmikroskopets linser består av en kobberspole som skjermes av en kappe av bløtt jern. Jernkappen dekker også den in­ dre flaten i spolen med unntak av en ring­ formet åpning. Magnetfeltet blir konsen­ trert i denne åpningen og man kan oppnå fokallengder på noen centimeter. Åpningen kan reduseres ved å bygge inn polsko av bløtt jern. Hvert stykke har en utboring på få millimeter og har omtrent samme av­ stand som diameteren av hullet. De to styk­ kene holdes fra hverandre av en messingring. For at magnetfeltet skal vise perfekt rotasjonsymmetri, kreves ytterst stor meka­ nisk presisjon på polskostykkene. Jernmassen må dessuten være mest mulig homogen. Fokallengden er omtrent som hos det beste oljeimmersjonsobjektivet, ca. 2 mm. Det er viktig at overflatene i nærheten av polskoen ikke skrapes opp, de må holdes pinlig rene. Som i lysmikroskopet er det innebygd blendere i forbindelse med linsesystemet. I

137

elektronmikroskopet må blendene ofte jus­ teres og renses. Linsene i elektronmikroskopet viser også linsefeil, akkurat som for lysmikroskopets vedkommende. Det dreier seg dels om sfæ­ risk avvik, dels om buet bildefelt (spiller li­ ten rolle da bare ytterst små områder avsøkes og dybdeskarpheten er stor), dels om astigmatisme og kromatisk avvik. Man sø­ ker å korrigere disse feilene ved konstruk­ sjonen av mikroskopet. De fleste mikrosko­ per har muligheter for korreksjon av astigmatismen. Det er vesentlig den kortbølgete strålingen som gir den fremragende oppløs­ ningen i elektronmikroskopet, optisk sett er linsesystemet langt mere primitivt og ufull­ komment enn i lysmikroskopet.

Observasjon i elektronmikroskopet Man bør sette seg nøye inn i bruken av det instrumentet man har til rådighet. For at mikroskopet skal yte sitt beste, er det viktig at det er godt sentrert. Sentreringen var komplisert på eldre instrumenter og måtte læres av en erfaren elektronmikroskopbruker. Mange moderne mikroskoper har au­ tomatisert og elektronisk styrt sentrering. Bildet på skjermen dannes på en noe annen måte enn i lysmikroskopet. Det fremkom­ mer ved at ulike deler av objektet viser differensiell elektronspredning. «Absorbsjon» av elektronene kommer mest på tale for «tykke» objekter. Mørke steder på skjermen viser hvor elektronene ikke kom­ mer fram. Fokuseringen er vanskeligere enn for lys­ mikroskopet. Ved riktig innstilling har bil­ det lav kontrast og høyest oppløsning. Ved fremkalling av fotografier tatt i elektronmikroskop brukes stort sett samme frem­ gangsmåte som for ordinær film. Fotogra­ fiene viser langt flere detaljer enn det er

mulig å se på den fluorescerende skjermen. Det er fotografiene som er det dokumenta­ riske materialet ved elektronmikroskopi. De ferdige preparatene kan nok gjemmes eller arkiveres, men over tid forfaller de gradvis og blir helt ubrukelige.

Oppløsningsevne Abbés formel for oppløsningsevne gjelder også for elektronmikroskopet. Elektroner kan oppfattes både som partikler og bølger. Bølgelengden er vesentlig mindre enn for synlig lys. Regner vi på dette og tar hensyn til redusert apertur på grunn av den sterke avblendingen, finner vi at oppløsningsevnen blir en faktor omlag 1000 x bedre enn o for lysmikroskopet (ca. 1 A). Mange større atomer kan derfor direkte avbildes i elek­ tronmikroskopet. De fleste instrumenter forstørrer ikke mere enn 100 000 x på fil­ men, ved etterforstørring ser man nye detal­ jer opptil 1 000 000 x. Hvis det optiske sys­ temet var fullt ut korrigert, kunne man oppnå forstørrelser opptil 80 000 000 x. (Jordkloden forminsket med samme faktor vil ha størrelse omtrent som en badeball).

Preparater for TEM Istedetfor objektglass brukes tynne sirkelformete metalltrådnett, såkalte grids (se Fi­ gur 66). Enkle grids har bare et hull ca. 1 mm i tverrmål. Over hullet ligger en tynn hinne av stoffet formvar. På denne hinnen skal de tynne plastsnittene man lager med ultramikrotomen ligge. Andre gridtyper som har tette trådnett krever ofte ikke formvarhinne, snittene som legges på er likevel stabile. Finere grids er laget av gull eller pla­ tina. En vanlig gridtype er mesh 200. Stør­ relsene på hullene er ca. 85 /zm. Slike hull er velegnet for oversiktsbilder og snittserier.

138

oo

med vann. Hvis alt går bra, vil formvarfilmen løsne og flyte på overflaten. Grids kan nå legges på rekke og rad på formvarfilmen med urmakerpinsetten. (5) Føres et fuktig filtrerpapir under filmen, så kan det hele fiskes opp. Legg formvarfil­ men med grids og filtrerpapir i en petriskål til tørring. Legg lokk på for senere oppbe­ varing.

Preparering for TEM:

Figur 66 Eksempler på kobbergrids som er vanlig brukt i elektronmikroskopi. Øvre rekke viserenkelthullgrids (0.8 og 2 millimeter). Disse krever formvarfilm. De øvrige typene med ramme- eller nett­ verk av ulik størrelse kan brukes til snitt uten formvarhinne.

Tillaging av formvarhinnene er ikke så vanskelig. Tilsett 0.2 % formvar til vannfri dioksan.

NB! Hvis blandingen ikke er vannfri, blir det ørsmå huller i filmen. Det samme kan skje i fuktig luft. Ha løsningen på en flaske med tettsluttende kork.

(1) Dypp objektglasset ned i flasken i noen sekunder. (2) Still det på skrå til lufttørring på et støv­ fritt sted! Hvis den relative fuktigheten i luften er for høy, blir filmen ødelagt. (3) Når glasset er tørt, skjæres lang sidene på objektglasset med et helt skarpt bar­ berblad.

(4) Senk glasset fra enden ned i en petriskål

(1) Fikser i glutaraldehyd 2-4% i 0.1 M Na-cacodylatbuffer, eller i en blanding av 2% glutaraldehyd og 2% formalin i 0.1 M Na-cacodylatbuffer. Glutaraldehydet kan kjøpes i ren form på ampuller. Ellers må det rystes i aktivt kull, sentrifugeres og filtreres gjennom Milleporfilter. Formalinløsningen lages fra paraformaldehyd for å unngå metanolforurensning. En 40% løsning lages ved å varme 40 g pulver i 100 ml vann på magnetrører til 60-65 °C med tilsetning av få dråper kone. NaOH. Løsningen klarner etter ca. 2 minutter, pH justeres til 7.1-7.3 med HC1. Vevsbitene må ikke være større enn 1 mm3, helst vesentlig mindre. Fikse­ ringen skjer ved 20 °C (se også side 104). (2) Flytt vevet til 0.1 M cacodylatbuffer 24 t ved 20 °C. Om nødvendig kan vevet opp­ bevares i kjøleskap i lengre tid på dette trin­ net. (3) Postfikser i 2% OsO4 i 0.1 M cacody­ latbuffer. Tiden må prøves ut på det aktuel­ le materiale, ofte er 24 t passende. Skyll kort i buffer. (4) Dehydrer i etanol (eventuelt aceton) med trinn 30, 50, 70, 96% 2 ganger, 100% 3 ganger. Tid for lavere trinn er ca. 15 minut­ ter, for høyere trinn 30 minutter. Deretter ren propylenoksid (meget giftig, ildsfarlig)

139 2 ganger å 30 minutter, så propylenoksid: Epon i forholdet 3:1 i 24 timer. Denne løs­ ningen lar man dampe av ved værelsestemperatur. Flytt vevet etter 24 timer over i ren Epon der plasten herder (polymeriserer) ved 60 °C i 3 døgn. Som regel ligger vevet med plasten i små gelatin- eller plastkapsler. Disse brukes i en størrelse som passer til holderen på ultramikrotomen (dvs. diame­ ter ca. 9 mm).

Eponløsningen lages på magnetrører slik: 60 g Epon 812 30 g Epon 826 10 g Epon x-71 95.7 g DDSA 24 g MNA 3.84 g DMP-30 (DDSA = dodecenylsuccinicanhydrid, MNA = methylnadicanhydrid, DMP-30 = 2.4.6 tri(dimethylaminomethyl)fenol.) Skal man undersøke bare noen få prøver, kan man klare seg med 1/10 av oppgitte mengder. Engangssprøyter i plast er fine til å dosere de små mengdene av komponente­ ne i Eponblandingen. Ta ut stempelet og fyll plast i. Komponentene må blandes grundig i den foreskrevne rekkefølge. En annen oppskrift er:

(a) Epon 812 DDSA (b) Epon 812 MNA

62 100 100 89

ml ml ml ml

(a) og (b) kan blandes i ethvert forhold. Det­ te varierer hårdheten av plasten. Jo mer av blandingen som inneholder (b), desto harde­ re blir den ferdige plastblokken. Tilsett 1.5% DMP-30 før polymeriseringen. Araldit kan brukes istedetfor Epon. De­ hydrer som før i etanol.

Araldit DDSA Dibuthylftalat Trimetaminmethylfenol

10 10 1.0 0.5

ml ml ml ml

En tredje oppskrift er:

Araldit 502 DDSA DMP-30

27 ml 23 ml 1.5%

Vestopal er likeledes brukbar. Da må man dehydrere i en gradert acetonserie. Man bru­ ker samme trinn som for etanol. Vestopal W er utmerket for mange typer materiale. (Aceton er blandbart med vann). Tilsett 1 % initiator (tertiær buthylperbenzoat) og 0.5% aktivator (koboltnaftenat) rett før bruk. Alle plastblandingene skal oppvarmes til 60 °C for 3 døgn.

Ultramikrotomen Mens vanlige mikrotomer i beste fall kan snitte ned til ca. 1/2 pim, noe som er til­ strekkelig for alle typer lysmikroskopi, kan ultramikrotomen levere snitt med tykkelse helt ned i ca. 100 Å. For elektronmikroskopiske undersøkelser av biologisk mate­ riale brukes vanligvis snittykkelser på 400-600 Å. I prinsippet er ultramikrotomen ikke særlig forskjellig fra parafinmikrotomen. Det stilles imidlertid usedvanlige store krav til mekanisk stabilitet og presisjon dersom man skal kunne få reproduserbare snitt. Snittflaten er som oftest ytterst liten, bare 1/10 mm x 1/10 mm. Med parafinmikroto­ men er det derimot mulig å snitte objekter så store som en hjernehemisfære fra et menneske. Det er vanskelig å oppnå like tynne snitt med en ultramikrotom. Det kreves nemlig

140

jevn og stabil føring av objektet på høyt presisjonsnivå for hvert enkeltsnitt. Dette byr på mekaniske problemer og mange mikrotomer er derfor basert på prinsippet med termisk utvidelse. Objektet er festet til en metallstav som føres mot kniven når sta­ ven oppvarmes av en innebygd varmespiral. I stedet for vanlig stålkniv benyttes spesial­ laget glasskniv eller diamantkniv. Snittene er ytterst små og vanskelige å håndtere. De flyter ut på et vannbad som festes på kni­ ven. Snittene observeres i binokularmikroskop. Belyses de i passende vinkel (det er innebygd lys i mikrotomen), viser de tydeli­ ge interferensfarger, dette brukes til bedøm­ melse av snittykkelsen. Tabell 5 Interferensfarger og snittykkelse (i nm): Grå 75 %), så innvirker dette ofte på fargereaksjonene. (1) Lag et utstryk på ikke-fluorescerende objektglass.

191 (2) Tørr i varm luftstrøm (10-15 min) (hår­ tørrer kan brukes, må ikke være for varm).

(3) Dehydrer i 4 bad med nedkjølt etanol, 1-2 dager i hvert bad.

(3) Fikser i 95 °7o etanol ved 37 °C (30 mi­ nutter) (gjelder påvisning av protein antige­ ner). For virus antigener fikseres i kald aceton (30 minutter). For bakteriepolysakkarider fikseres i 1 % pikrinsyre ethylalkohol (30 minutter).

(4) Oppklaring i 3 bad nedkjølt xylen, 1-2 timer i hvert bad. Det siste xylenbadet taes ut av kjøleskapet og får langsomt oppnå romtemperatur.

(4) Tørr ved 37 °C, 30 minutter. (5) Vask i kald PBS (pH 7.2). (6) Tørr av overskytende fuktighet med et filtrerpapir. (7) Hold selve utstryket fuktig. (8) Fukt materialet med en dråpe FITCkonjugat. (9) Oppbevar i fuktekammer (enten varmt i inkubator ca. 37 °C eller flere timer ved romtemperatur).

(10) Vask forsiktig med kald PBS. (11) Dekk med dekkglass og forsegl med neglelakk eller vaselin.

(12) Observer i fluorescensmikroskop.

(5) Vevet overflyttes gjennom 4-5 parafinbad, 1-2 timer i hvert. Støp inn i parafin og oppbevar blokken ved 4°C. Det lønner seg å snitte raskt ettersom forstyrrende egenfluorescens øker med tiden. Blokker 4-5 må­ neder gamle kan fremdeles være brukbare.

(6) Snitt som vanlig. Strekk snittene (bruk bare 40°C i kort tid). Oppvarmingen kan ødelegge fluorescensreaksjonen. Tørr snit­ tene for en halv time ved 37 °C. (7) Snittene deparafineres raskt og føres ned til vann på vanlig måte.

Farging med FITC merkete antistoffer:

(1) Plasser 1 dråpe FITC konjugat på snittet (i fuktekammer 30 min ved 37 °C eller noen timer ved romtemperatur). (2) Skyll i kald PBS (pH 7.2). Monter i 10 % glyserol i PBS. Legg på dekkglass, forsegl preparatet.

Parafin teknikker:

(1) Vevsbiten bør være tynn, ca. 2 mm (en kvadratcentimeter stor). Riv ikke i vevet, press det ikke. Varme eller uttørring ødeleg­ ger reaksjonen. Vevet fikseres i kald etanol (4°C), over­ flytt til kjøleskap. (Dette er ingen god fikse­ ring cytologisk sett). Etter en time, skift til ny etanolløsning. (2) Fikseringen fortsetter for 24 timer.

Hvordan merke antistoffet med fluoresce­ rende fargestoff:

(1) Proteinkonsentrasjonen i gram skal være en prosent per ml. (2) Mengden 0.5 M karbonatbuffer er 10% pr. ml. (3) Beregn mengden ubufret saltløsning som skal være i blandingen.

192

(4) På magnetrører (ved 4°C) blandes rea­ gensene i denne rekkefølge: Saltløsning karbonatbuffer proteinløsning (punkt 1)

(5) Fortsett å blande med magnetrørenen (kaldt). Blant i fluorescein isothiocyanat (1/60 vektmengde i forhold til mengde av protein). (6) Fortsett blandingen i 18 timer kaldt. Det beste er å stille apparaturen i et kjøleskap.

(7) Dialyser mot PBS inntil dialysatet er fri for grønnfarge. For 500 mg protein trengs flere skift av PBS morgen og kveld i løpet av 2-3 dager. Mengden PBS som går med er hele 5-10 liter! (8) Tilsett merthiolat i forholdet 1:10 000. (9) Fordel på 0.5 ml porsjoner i små rør, frys ned og oppbevar i dypfryser. Karbonatbufferen lages slik:

Flaske A: 0.5 M Na2CO3 (13.25 g i 250 ml dest. vann) Flaske B: 0.5 M NaHCO3 (10.5 g i 250 ml dest. vann)

Buffer pH 9.2 til 9.5: Bland 9 deler A til 1 del B. Sjekk pH og juster med (A) (ba­ sisk) eller (B) (sur) etter behov.

Konjugering av immunglobuliner med tetramethyirhodamiu isoihiocyaiiai (TRITC,.

(1) Fortynn antiserumet med en like stor volummengde saltløsning. (2) Tilsett ammoniumsulfatkrystaller (NH4)2 SO4 mens man blander i magnetrøreren inntil endelig konsentrasjon er 1.8 M.

(3) Sentrifuger bunnfallet ved 60 000 g (det fins rimelige, små mikrosentrifuger som kan stå på laboratoriebenken). Sentrifugeringstiden er 20 minutter, vask to ganger med 2 M ammoniumsulfat, resuspender i saltløsning. (4) Dialyser proteinløsningen mot saltløsningen til den er fri for sulfatjoner, deretter mot 0.01 M natriumfosfatbuffer pH 7.2.

(5) Tilsett immunglobulinfraksjonen til en DEAE-cellulose separasjonskolonne. Den­ ne skal være pH korrigert med 0.01 M pH 7.2 fosfatbuffer. (6) Eluer (første synlige topp i spektrofotometer) med den samme bufferen. (7) Eluer den andre fraksjonstoppen (målt med spektrofotometri) med 0.05 M NaCl i den samme bufferen (sur fraksjon). (8) Bland sammen eluatene fra begge frak­ sjoner. Konsentrer dem mot dextran 110 eller polyenthylenglycol 60.000. (9) Dialyser mot fosfatbufret saltløsning.

(10) Beregn proteinkonsentrasjonen på ba­ sis av N (nitrogeninnhold).

Konjugasjonsprosedyren:

(1) Lag stamløsning av krystallint tetramethylrhodamin isothiocyanat (TRITC). Detic UiiwicS ved a iøSc 5 iiig i 5 iiii aCciuii. Røt på magnetrører (bruk den aller minste mag­ neten). Det skal være 5 ml aceton og 5 mg TRITC. Hold det hele kaldt, på isbad, ca. + 4°C. (Laboratorievekter som veier nøyaktig i milligramsområdet er dyre. Det er lett å lage en slik selv, basert på fjærvektsprinsip-

193 pet for minimale omkostninger. En slik vekt er meget nøyaktig).

konsentrasjoner (0.05, 0.1, 0.2 og 0.3 M) i den samme bufferen.

(2) Nedkjøl 2 ml av immunglobulinløsningen med en proteinkonsentrasjon på 4 mg/ml til 4°C ved røring på isbad. Bring pH til 9.0-9.5 ved tilsetning av 0.1 N NaOH.

(5) Proteinkonsentrasjonen i konjugatene bestemmes etter følgende formler:

(3) Tilsett maksimalt 240 gg amorft TRITC (30 jzg/mg protein) eller O.lml av stamoppløsningen (A) (12.5 /zg/mg protein) dråpevis til proteinløsningen under kraftig om­ røring. (4) Bland løsningen på isbad i 1 time (!) mens man holder pH kontinuerlig på 9.0-9.5 ved å tilsette 0.05 M Na-karbonat eller bikarbonat. (5) Flytt apparaturen til kjøleskapet og fortsett røringen i 18 timer uten pHkontroll.

Gelfiltrering av konjugatet i Sephadex G-50 kolonner: (1) Sentrifuger løsningen før tilsetning til kolonnen. (2) Tilsett supernatant til en 3 x 30 cm Sep­ hadex kolonne (G-50). Denne er justert med 0.05 M NaCl i 0.01 M fosfatbuffer. (3) Elueringen skal utføres med den samme bufferen. Fraksjonene som inneholder første topp (spektrofotometer) slåes sam­ men (inneholder det konjugerte proteinet). (4) Konjugatene skal kromatograferes på DEAE-cellulose. Overfør eluatet fra G-50 kolonnen til en 2 x 21 cm DEAE-cellulose kolonne justert med 0.05 M NaCl i 0.01 M Na-fosfatbuffer (pH 7.2). Utfør trinnvis eluering med økende NaCl7 - Mikroskopi

FITCkonjugat mg/ml 0^280 nm

~ 0-35 X (OD490 nm) 1.4

TRITCkonjugat mg/ml = OD280 — 0.56 x OD515 nm) 1.4

Cellekulturer av perifert blod Cellekulturer fra perifert blod var tidligere regnet for relativt ufarlig laboratoriearbeid både for medisinere og biologer. På grunn av økt smittefare (spesielt HIV virus, borriellabakterien, trypanosomer, malariaparasitter - de to sistnevnte kommer inn i lan­ det med økt reisevirksomhet) bør blodprø­ ver nå bare taes under strikte laboratorieforhold. Dette gjelder ikke bare blod fra mennesker, men også en rekke pattedyr, spesielt dyr fra tropiske og subtropiske strøk. Det er lett å stikke seg på nåler, skjære seg på skalpeller og liknende i laboratoriet. Faren for infeksjoner av ulike slag synes å ha økt i de senere årene. Moderne cellekulturmetoder gjør det mulig å foreta nøyaktige kromosomanalyser både fra dyr og mennesker. Som oftest kan det anlegges kulturer fra de fleste vevs­ typer, men kromosompreparater fra blod­ celler blir som regel de beste. Det er mulig helt å unngå å kultivere cel­ lene. Ved såkalt sternalpunktur (benmarg-

194 prøve fra brystbenet = sternum) kan man samle celler som allerede er i mitose og som bare trenger enkel behandling før fargingen.

Følgende metode gir gode kromosom­ preparater fra venøst blod: (Dette er den originale metode, i forenklet utgave kan den utføres med ferdigkjøpte reagenser, kulturflasker etc., alt sterilisert og klart til bruk.)

(1) Glassutstyret må være fullstendig rent. De minste spor av joner fra glasset vil kun­ ne forstyrre kulturen og gi fatalt resultat. Glassutstyret renses på følgende måte: Legg kulturglassene natten over i kromsvovelsyre (12-24 timer). For lang behand­ ling vil ødelegge dem til vevs- og cellekulturbruk. Vask grundig i rent, rennende vann, - minst 12 timer. Deretter legges glas­ sene i destillert vann som skiftes 5 ganger. De to siste badene skal være destillert, jonebyttet vann. Autoklaver kulturglassene i et stort begerglass med destillert, jonebyttet vann i autoklaven. Hell forsiktig vannet av, tørr dem i varmeskapet ved 40-60 °C. Pakk glassene i papir, forsyn dem med dato (bly­ ant) og tørrsteriliser dem ved 140-160°C i ca. 4 timer. Man kan kjøpe ferdige sterile kulturkar i ulike slags materialer, men den opprinnelige metoden er å foretrekke for kvalitetspreparater. (2) Ta blodprøven med engangssprøyte (røntgensterilisert plastsprøyte). Heparin vitrum (5000 int. enheter/ml) er nødvendig for å forhindre at blodet levrer seg. En drå­ pe trekkes opp i sprøyten fra den sterile heparinflasken. Ved hjelp av stempelet fuktes innersiden av sprøyten. Ca. 1 ml blod i sprøyten fra venen nær fossa cubiti er til­ strekkelig. Man kan også ta blod direkte fra øreflip­ pen. Vask med 70% etanol, klem så den blir blodfylt, stikk med en steril lansett. Blodet kan man la dryppe rett ned i kultur-

karet. Det trengs bare noen få dråper blod (5-10). Klem kraftig på såret på øreflippen med litt rent gazbind. Blødningen kan være vanskelig å stoppe. Sett på plaster. (3) Blodcellene skal dyrkes i det såkalte «medium 199». Dette må først tilsettes hu­ mant blodserum (av type AB) til 15 %. Det er enklest å kjøpe humanserumet ferdig. Det kan også lages selv. Man rekvi­ rerer da 1/2 liter blod fra sykehusets blod­ bank. Det skal være tappet på tørr flaske fra fastende pasient. Denne flasken må ikke inneholde heparin. Blodet skal stå en times tid og koagulere på laboratoriebenken. Så settes flasken i kjøleskapet i tre døgn. Seru­ met kan deretter pipetteres av. Man bør ikke ta mer serum enn det som er uten­ for koagelet («cruor»). Dette tilsvarer 1560-2000 ml. Dermed unngår man å trek­ ke med seg større mengder blodceller. Alle disse prosessene må foregå sterilt. I medium 199 skal det være antibiotika for å hindre bakterievekst. Noen ganger må man tilsette antibiotika selv. Dette er i tilfel­ le angitt på den medfølgende bruksanvis­ ning. Det går også an å lage medium 199 selv etter oppskrift. Dette er ytterst arbeidskre­ vende og krever et spesiallaboratorium. På grunn av det store antallet innholdsstoffer, ofte i meget små mengder, vanskelige sterilfiltreringsprosesser, oppveininger på mg vekt, og store muligheter for å gjøre feil, har dette liten hensikt selv på større labora­ torier. Hver sterile kulturflaske skal inneholde 5 ml medium og 0.75 ml serum. Tilsett 18 dråper blod fra sprøyten (blod med både røde og hvite blodlegemer). Tilsett 0.5 ml phytohaemagglutinin M. Phytohaemagglutininet kjøpes som pul­ ver på sterile flasker og er et slags «bønneekstrakt». Opprinnelig ble det brukt for å lette adskillelsen av røde og hvite blodceller.

195 Senere har det vist seg at stoffet induserer de hvite blodlegemene til å dele seg, noe som ikke skjer under normale forhold. Phytohaemagglutininet tilsettes sterilt, jonebyttet, autoklavert vann før bruk. Mengde er angitt på flasken. Stoffet kan oppbevares på små pyrexrør som tar hver ca. 5 ml (sterilt). Disse rørene må være ren­ set slik som det vanlige glassutstyret. Kor­ kene kokes i svakt såpevann (NB! skum­ mer), legg derpå i litt vann som inneholder noen dråper H2SO4. Korkene pakkes for­ siktig inn i aluminiumfolie, derpå i papir, autoklaveres 30 min ved 120 °C. For oppbe­ varing bør phytoagglutininet fryses ned ved ca. -20°C. Humanserum kan også fryses, men ikke medium 199. (4) Inkuber i termostat i tre døgn ved 37 °C. Halvparten av kulturen kan helles i et sentrifugeglass. Hvis resultatet blir mislykket, kan man prøve den andre halvparten.

(5) En liten dråpe colchemid tilsettes. (Van­ lig konsentrasjon benyttet er 0.4 mg/ml). Colchicin kan benyttes i samme konsentra­ sjon, men er mye giftigere. (Merk at dyreceller/humanceller er mye mer følsomme for denne giften enn planteceller). Colchemidet er nødvendig for at vi skal få rette, pene kromosomarmer. Selve spredningen av kromosomene skjer vesentlig i en senere prosess (hypotonbehandlingen). Colchemidets hovedeffekt er å samle opp mange mitoser i metafase. De homologe kromosomarmene blir også bedre separert. For mye, eller for lang colchicinbehandling fører til små, sammentrukne kromosomer med lite detaljer.

(6) Sentrifugeglasset settes i varmeskapet ved 37 °C. I glasset er det nå 2,5 ml kulturvæske med celler. Inkuber 2,5 timer. Centrifuger cellene ned med ca. 1000 r.p.m. Dette tar 7-8 minutter. Man kan bruke en helt vanlig laborato-

riesentrifuge. Rørene bør helst kunne svin­ ge helt ut så de står horisontalt under rota­ sjonen. Vær nøye med balanseringen av ro­ tor, diametralt motsatte sentrifugerør skal veie nøyaktig det samme. Har man få prø­ ver, kan det ene røret i hvert par inneholde vann som «ballast». Tilsynelatende like sentrifugerør kan ha høyst forskjellig vekt. Begge rør må ha nøyaktig samme vekt. Det er viktig at man ikke sentrifugerer så kraftig at cellene setter seg fast i bunnen av glasset. Hell nå mesteparten av mediet av. La ca. 1.2 ml være igjen. Resuspender celleklum­ pen forsiktig med en finspisset pasteurpipette. (7) Tilsett Na-citrat av 37 °C (0.8% i destil­ lert vann) til volumet er 3 ml. Plasser i ter­ mostaten i 15 minutter.

(8) Sentrifuger pånytt (1000 r.p.m.) i ca. 4 minutter. Pipetter av overskuddet av citrat med pasteurpipette til det er ca. Vi ml væs­ ke igjen Cellene resuspenderes med pipet­ ten. Er man uforsiktig med resuspenderingen, går cellene i stykker. (9) Sett et fikserglass med 3 deler metanol: 1 del iseddikk i et glass vann med isbiter. Det er viktig at fikseringsvæsken blir kjølt ned. Den er lite holdbar, bare ca. 2 timer, og må alltid nylages.

(10) Sett kulturglasset ned i isvannet. Tilsett fikservæsken med en fin pipette slik at det dannes et tofasesystem med kulturmediet nederst og fikseringsvæsken over. Fikser ved å blåse forsiktig luft ned med en tilspis­ set pasteurpipette mot overflaten av cellesuspensjonen i 2-3 minutter, slik at cellene blander seg langsomt med fikseringsvæs­ ken. Det hele bør ta ca. 6 minutter. (11) Centrifuger cellen ned etter fikserin­ gen. Pipetter forsiktig av. Tilsett en ny por-

196

sjon kald fikseringsvæske. Fikser pånytt. Bland cellene ved å ryste glasset forsktig og centrifuger cellene ned en gang til. (12) Suspender cellene i lite fikservæske, bare 2-3 dråper. (13) Det er viktig at objektglassene man bruker er helt rene. Vask dem i kromsvovelsyre, spyl dem i rent vann. Deretter i destil­ lert vann. Ved preparatfremstillingen legges objektglassene i isvann. Når de etter avkjø­ lingen taes opp, flyter vannet jevnt utover overflaten. En dråpe av cellesuspensjonen tilsettes. Den må flyte jevnt utover. Tørr glasset over varm, tørr luft. Dermed squasher cellene seg selv. Man kan vifte glasset raskt frem og tilbake over en spritflamme (høyt over), men det bør ikke bli varmt. (14) Det tørre preparatet kan farves i vandig løsning av methylenblått for foreløpige stu­ dier og senere avfarves med vann hvis man vil prøve å farve det med permanente farver etterpå. Vanligvis farves med 2% orcein i 45% eddiksyre. Preparatet føres gjennom alkoholrekken 70, 80, 96 og 100%. Deretter abs. etanol: xylen i forholdet 1:1, så ren xylen og innleiring i Eukitt, kanadabalsam. Euparal kan brukes fra 100% etanol.

(15) For kromosomanalyser velges de 30 beste cellene ut. Fotografier gir de nøyaktigste data. Det fins spesialmikroskoper som foretar automatisk karyotypeanalyse av humane celler. Merk: Ikke alle glasstyper kan brukes til cellekulturer. Man kan finne variasjoner innen samme fabrikat. Glass av typen «Pyrex» er ofte brukbare. Alle proses­ ser for «høsting» av cellene må foregå sterilt. For enk­ lere undersøkelser der det gjelder kromosomanalyser av et begrenset materiale, kan man få ferdige kjemikaliesett med sterile kulturglass og alle nødvendige re­ kvisita i handelen («TC-mikrotest kit» etc.). Bare ca. tre dråper blod er nødvendig for cellekulturer med dette utstyret som er enkelt å håndtere. «Medium 199» bør man kjøpe ferdig til bruk.

Blodutstryk (1) Litt blod (én dråpe) dryppes sentralt på objektglasset (blod fra finger, øreflipp etc.), Glasset skal ligge mot flatt underlag. Glas­ set skal være rent og fettfritt. Sett dem først i en alkoholløsning, gjerne iblandet litt eter, tørr støvfritt i luft. (2) Bruk slepne objektglass. Vanlige glass er for ru i kantene til at utstryket blir bra. Hold glasset fast med underlaget i den ene ende med venstre hånd. Hold et annet objektglass ned mot bloddråpen på skrå. Dråpen flyter nå inn i vin­ kelen mellom glassene. Skyv raskt glasset fra dråpen, ut mot kanten. Blodcellene blir liggende i et tynt lag som tørker raskt. (3) Farging i Leishmanns farge (inneholder methylenblått og eosin i methylalkohol): Drypp på ferdig farge slik at det dekker la­ get med blodceller. Methylalkoholen fikse­ rer nå blodcellene. Vent 1 minutt. Drypp på mer farge hvis det har tendens til å tørke.

(4) Tilsett dobbelt så mye vann som det var fargevæske. Nå inntrer fargingen av cellene. Vent 5 minutter. Hell av, drypp på rent de­ stillert vann, skyll forsiktig. La preparatet lufttørke. Hvis det oppvarmes, kan det bli ødelagt.

(5) Preparatet er nå ferdig. Ofte mikrosko­ peres det uten dekkglass med immersjonslinsen.

NB! Det lufttørkete preparatet (pkt.2) kan også fikseres ved tørr varme. Trekk glasset 3-4 ganger langsomt gjennom spritflammen (celler skal vende opp, de må ikke brennes). Etter avkjøling helles Giemsas farge over. Vent 5 minutter. Skyll i vann, lufttørr.

197

Bruk av tellekammer Det fins en rekke ulike typer, vanlige er Thomas tellekammer og Biirkers tellekam­ mer. Til kamrene hører pipetter hvor væs­ ken med partiklene kan måles og blandes med fortynningsvæskene. Blod fortynnes 1-100 eller 1-200 ved telling av røde blodle­ gemer, 1-10 eller 1-20 ved telling av hvite blodlegemer. Kammeret er i prinsippet et objektglass som har innrisset kvadrater på bunnen av en liten beholder med definert volum og et planslepet tykt dekkglass som lokk. Telling av røde blodlegemer:

Blodet må fortynnes minst 1:100, helst 1:200. Til fortynningen bruker man en væs­ ke som bevarer blodlegemene, best er den såkalte Hayems væske. Til nød kan man bruke fysiologisk saltvann.

Hayems væske Hg2 Cl2 Na2SO4 NaCl Dest. vann

0.25 g 2.50 g 0.50 g 100 ml

I pipetten er det en liten kule. Kapillærrøret opptar 1 volumenhet, kulen 100. Like over kulen står merket 101. Skal blodet fortyn­ nes 1:200, suges det opp til merket 0.5.

(1) Ta blod fra fingerpulpa eller øreflipp. Press det ikke ut, sammensetningen kan da endres. (2) Fjern overskytende blod ved å holde pi­ petten mot et filtrerpapir. Det må ikke hen­ ge væske ved spissen av pipetten. Arbeid raskt for å unngå koagulering. Fortynningsvæsken skal være klargjort. Stikk ikke pipetten ned i flasken.

(3) Når pipetten er fylt til merket 101, lukk den oventil med fingeren og ved spissen. Bland innholdet godt. Pust ut den lille drå­ pen, denne har stått i kapillærrøret og skal ikke brukes! (4) Anvend neste dråpe. Plasser den på midtflaten i tellekammeret. Legg det planslepne dekkglasset på. Dråpestørrelsen må være avpasset slik at dekkglasset ikke svømmer i væsken. Avstanden mellom kammerbunnen og dekkglassets underside er nøyaktig 1/10 mm.

Det gjør ikke noe om det flyter litt væske ut i rillene. Unngå luftblærer, dette gjør tellin­ gen unøyaktig. Blodlegemene skal nå synke ned og være jevnt fordelt på det innrissete rutenettet. Hvert kvadrats side er 1/20 mm. Bunn­ flaten er derfor 1/400 mm2. Cellens høyde er 1/10 mm og kubikkinnholdet er derfor 1/4000 mm3. Antallet røde blodlegemer er derfor gjennomsnittsantallet i et kvadrat multiplisert med 4000 og med blodfortynningen (1:100 eller 1:200). Dette gir antallet blodlegemer i 1 mm3 blod. Man bør telle minst 200 kvadrater.

NB! Strengt tatt får man også de hvite blod­ legemene med, men normalt er tallet så lite at det ikke innvirker særlig på nøyaktig­ heten. Telling av hvite blodlegemer: Fortynn blodet 1:10 evt. 1:20. Som fortynningsvæske bruker man tynn eddiksyreoppløsning (1/3 %) som er tilsatt litt gentianafiolett (1-5000). Nøyaktigheten ved tel­ ling av hvite blodlegemer er mindre og man bør være meget omhyggelig. Hvis blodet skulle koagulere i kapillær-

198

røret, kan det settes i en oppløsning av pep­ sin og saltsyre. Etter et døgn er blodet oppløst.

Følgende oversikt viser mulige diag­ noser: Tabell 6.

Påvisning av blodflekker, haeminkrystaller:

Hvis blodfargestoff utsettes for konsentrert eddiksyre og natriumklorid, dannes haematinklorid som krystalliserer i pene, bru­ ne rhombiske krystaller (Teichmanske kry­ staller). De er noen ganger nåleformete, andre ganger flate «tavler». Reaksjonen er meget følsom, det kreves ubetydelige blodspor. Reaksjonen kan ut­ føres på objektglasset. Materialet kan være blodkoageler fra urin, faeces eller ventrikkelinnhold. (1) Fordel litt av materialet på objektglas­ set, bland med noen korn koksalt og tilsett et par dråper iseddik. (2) Varm over flamme. Isedikken oppløser blodfargestoffet og fordamper. Ikke varm opp for raskt. (3) Tilsett litt ny eddiksyre når det hele er fordampet. Jo langsommere man oppvar­ mer, jo finere blir krystallene. Blant Teichmannske krystaller fins også fargeløse kry­ staller av koksalt.

Kjønnskromatin Ved meget enkle fargereaksjoner i epitelceller er det mulig å påvise avvikelser i antall kjønnskromosomer hos mennesker. Prin­ sippet beror på at det ene X-kromosomet er heteropyknotisk og lar seg påvise som et ovalt, farget område i cellens interfase. For sikre undersøkelser bør et stort antall celler analyseres.

Antall kjønnskromatinflekker

Kjønnskromosomer i cellen

0 1 2 3 0 og 2 i ulike celler

XY XO XX XXY XYY XXX XXY XXXX XO XXX (mosaikkind.)

Fargemetode Fargen lages som stamløsning:

Basisk fuksin 70% etanol

3 g 100 ml

Arbeidsløsningen lages rett før bruk Stamløsning 5 % fenol i dest.vann. Iseddik 40% formaldehyd

10 90 5 10

ml ml ml ml

Farg 5-10 min i arbeidsløsningen, fulgt av differensiering 1 min i 96% etanol og 1 min i absolutt etanol (2 bad). Monter i Euparal. Cellene høstes fra overflaten av innsiden av høyre eller venstre kinn ved å skrape av precornifiserte celler med en spatel. Cellene skal fikseres i en blanding av like deler eter og 95 % etanol. Merk: Kjønnskromatinet kan undertrykkes hos pasienter under hormonbehandling.

Kontrolltest: Y-kromosomet fremtrer som sterkt fluorescerende flekk i interfasekjerner dersom man istedet farger med Quinacrine2HCl og eksiterer med blått lys i fluorescensmikroskopet. Sperrefilter 530 nm.

199 PERMANENTGJØRING AV SQUASHPREPARATER:

Gammel metode:

(1) Legg to glasslister, ca. 4 mm bredde dia­ metralt motsatt i en 9 cm petriskål. Fyll i 25 ml blanding av iseddikk og absolutt etanol. (2) Legg preparatet på listene med dekk­ glasset vendt nedover. Vent 2-3 minutter eller inntil dekkglasset faller av.

(3) Før objektglass og dekkglass hver for seg gjennom et bad med absolutt etanol.

(4) Monter dem sammen med en dråpe Eu­ paral. (Dette er ganske vanskelig og det blir lett mye søl. Slipp dekkglasset forsiktig ned på Euparaldråpen som bør være lettflytende. Ikke rør preparatet som bør hvile på en tynn trelist i hver ende. Vent ca. 30 mi­ nutter. Gjøres dette riktig fordamper etanol og flykti­ ge stoffer uten at det trekkes Euparal opp på oversiden og rundt kanten av dekkglasset. Når preparatet er halvtørt, settes et lite blylodd på.)

Metoden har følgende mangel: Mye av ma­ terialet faller av i eddiksyre-alkoholbadet. I dette badet blekes fargen sterkt. Det blir spor av syre i det ferdige preparat. Over tid vil mesteparten av fargingen forsvinne. Det er celler både på dekk- og objektglass. Når vi monterer dem sammen igjen, får vi et «rotete» preparat med doble cellelag og partier uten celler.

Bedre metode:

Vi fryser av dekkglasset etter nedkjøling til -15 til -20 °C i et kjøleapparat. Kjøleapparatet kan man lett bygge selv (se Figur 75). Det består av et batteri av Peltierelementer som har den egenskap at sender vi en likestrøm igjennom, blir den ene siden varm, den andre sterkt avkjølt. Leder vi varmen vekk med kjølevann, synker tempe­ raturen på den kalde siden ytterligere. Peltierelementet leveres for montering i en alu-

miniumholder med tilkobling for kjølevann (tynne plastslanger) til vasken. Kjøleelementet legges i en liten isoporboks der man benytter en glassplate som lokk. Slike isoporbokser brukes mye på laboratorier til frakt av biologiske eller medisinske prøver eller ømtålelige kjemikalier. Strømforsyningen består av en transfor­ mator (prim. 220V AC, sek. 9V AC, brolikerettere og kondensatorer for utjevning av likestrømmen etc., se Fig. 75). Transfor­ matoren blir billigst om man får den viklet på et elektroverksted. Det hele monteres i en standard elektronikkboks (flere tusen kr spart på å bygge dette selv).

(1) Sett på kjølevannet, slå på strømmen til kjøleelementet. (2) Legg preparatet med dekkglassiden ned mot kjøleelementet. Legg glasslokket på isoporboksen. Det tar ofte tid (10-15 min), første gangen etter man slår på før alt har stabilisert seg og det er blitt riktig kaldt inni boksen. (3) Ta opp det frosne preparatet. Med en skalpell vippes raskt og presist dekkglasset av. Hvis man somler, blir preparatet ødelagt. (4) Dekkglass og objektglass lar man falle øyeblikkelig ned i et bad absolutt etanol. Vent et minutt. (5) Ta opp objektglasset. Legg det med preparatsiden opp på to parallelle, tynne trelister som ligger på bordet. Drypp på 1-2 dråper Euparal. Slipp forsiktig et nytt dekkglass oppå. Det er viktig at Euparalen er tyntflytende. Da unngår man oftest luftblærer. Vent til etanolen er fordampet. Sett på lodd. Dekkglasset skal monteres med cellesiden ned mot et nytt objektglass.

200 470R

470R

Figur 75 Konstruksjonstegning for selvbygging av rimelig fryseapparat til squashpreparater. (Fra Laane 1976, in Hayat: Principles and Techniques of Scanning Electron Microscopy).

201

Av det opprinnelige preparatet får vi to nye, hver riktignok med ca. 50% færre cel­ ler. I etanolbadet forsvinner som regel siste rest av syre i preparatet. Det blir ingen bleking av fargene. Ingen celler faller vanligvis av. Preparatene bevarer høy kvalitet og det blir ingen doble lag med celler, eller forflyt­ ninger av vev under permanentgjøringen.

Overlege Tore Hagen ved Lillehammer Fyl­ kessykehus har løst disse problemene og ut­ viklet en metode som gir muligheter for fremstilling av 2-3 p.m tynne snitt på en vanlig mikrotom med C-kniv og med snittflater på flere cm2. Man kan selv regulere plastens hardhet og fjerne den polymeriserte plasten fra snittene før farging. Denne metoden synes overgå alle kommersielle metoder i kvalitet og muligheter. Den gjengies her med hans tillatelse:

Plastsnitt for lysmikroskopi av medisinske vevsprøver

Overlege Hagens metode for eponsnitt til lysmikroskopi:

Innleiring i plast og snitting til lysmikro­ skopi gir preparater av fremragende kvalitet. I motsetning til parafinsnitt bevares selv de aller fineste cellestrukturer, snittpreparatene blir av elektronmikroskopisk kvalitet. Polymerisert plast er imidlertid hard og det er vanskelig å oppnå snitt over noen kvadratmillimeters flate. Vanlige mikrotomer og stålkniver har generelt fungert dår­ lig, mikrotomene fordi de ikke er presise og solide nok, knivseggen fordi den er for bløt i forhold til plasten. Forsøker man å snitte, får man enten ri­ per på langs av snittet, eller ikke snitt i det hele tatt. Det kan også oppstå bølgeliknende striper på tvers av snittretningen, noe som skyldes mekaniske svingninger i mikrotomkniven. I de senere år har man utviklet spesielle kommersielle plastblandinger, f.eks. «LKB 2218-500 Historesin» som fungerer med vanlige mikrotomer og lysmikroskopi. Pla­ sten er glycolmetakrylat tilsatt polyethylenglycol 400 og hydrokinon. Benzoylperoksid brukes som aktivator og D.D.S.A. for regulering av hardheten. Slike og en rekke andre tilsvarende plast­ blandinger kan i mange tilfeller fungere bra, men krever oftest spesielle stålkniver med herdet egg (kastes etter bruk). Snitt fla­ tene man oppnår er ofte ikke særlig store. 8 - Mikroskopi

Egner seg for de fleste vevstyper, svulster, biopsier (også deklacinerte). Utmerket til undervisnings- og demonstrasjonspreparater. Egner seg også for zoologisk og botanisk materiale.

Nødvendige bestanddeler:

Eponblanding (etter Hagen): Epikote 812 («Shell») eller Lx-resin (Ladd) M.N.A. ( = N.M.A.) (= nadic methyl anhydrid) D.D.S.A. ( = Dodecenyl succinic anhydrid) DMP-30 = Tri (dimethyl - amino - methyl) fenol Ricinusolje («lakserolje») fra apotek

Løsemidler/dehydrering: Etanol eller isopropylalkohol Aceton

For snitting: Tween 80 (eller «Zalo» oppvaskmiddel)

For å feste snittene på glasset: Gelatin Kalsiumkromalun

For å løse opp plasten: KOH Natriumtetraborat (borax)

Andre stoffer/hjelpemidler: Araldit lim, eller annet polymeriserende plastlim Treklosser for fastliming av blokker (4 x 2.5 x 1.5 cm)

202 Tollekniv, skarp, til trimming av blokkene. Et tre­ stykke ca. 10 cm som underlag for trimming.

Div. engangssprøyter for blanding av plast, vanlig mikroskopisk lab. utstyr.

Epon 812 M.N.A. D.D.S.A. Ricinusolje

(«hardere») («bløt») 4 deler 10 deler 4 deler 2 deler 6 deler 2 deler 2.5 deler 1 del

Mikrotom: Vanlig rotasjonsmikrotom, motor! C-kniver, skarpe.

f.eks.

Jung,

uten

Fiksering:

(1) Vevet fikseres i 4% formalin, 24-28 ti­ mer. Formalinen kan nøytraliseres ved å ris­ te med CaCO3. Best fiksering med biter under 5 mm. (Best snittkvalitet får man med standard glutaraldehyd fiksering + buffer som for elektronmikroskopi. Sløyf osmiumfikseringen. Etterfikser 2-3 timer i formalin 40%: abs. 20:80. Man har da allerede kom­ met til 80% under dehydreringen). Dehydrering:

(2) Standard dehydrering benyttes, evt. med ekstra skift på 80% trinnet.

(3) Overfør til absolutt etanol eller absolutt isopropylalkohol.

Intermedium: (4) Overfør til vannfri aceton, 10-15 min. Infiltrering og innstøpning:

(5) Tilsett like deler aceton til plastblandingen (istedetfor propylenoksid). Blandingen blir nå lettflytende og kan trenge inn i det fikserte vevsstykket. Lag plastblandingen slik: (Fyll de ulike komponentene i hver sin plastsprøyte først så er de lette å dosere.)

Tilsettes 1 % DMP-30. Blandes på magnetrører. (Plasten blir lettere å snitte hvis man tilsetter 1 del hexenyl succini anhydrid til hver av blandingene.) Blandingen kan holde 2-3 dager i kjøleskap. (6) Legg preparatene over i aceton-plastblandingen i 24 timer.

(7) Legg preparatene i ren plastblanding ved 40°C (varmeskapet) 12 timer. Snu bitene fra tid til annen. Når de er sunket, er de in­ filtrert. (8) Herdingen skjer i små kar (plastkar) ved 60 °C 24 timer. Hvis det er rester av aceton i vevet når plasten er herdet, blir materialet for mykt. Bruk store volum med plastmasse, 5-10 ml. Hvis blokkene er bløte eller kle­ brige, fortsettes herdingen 24 timer til, evt. ved 80°C. (9) Ta blokkene ut av plastkaret (riv det evt. i stykker). Blokkene skal være varme under trimmingen, 50-60C. Legg dem på trestyk­ ket, skjær blokkene til rombeform. Lim blokken på trekloss med Araldit, rombespissen skal peke ned mot kniven når klos­ sen festes i mikrotomen. Trim eventuelt med kniven eller en liten fil slik at objektet ligger helt ut mot snittflaten.

(10) Monter i mikrotomen. Med en bløt ma­ lerpensel pensles kniv og blokk med vann tilsatt fuktemiddel («Zalo» eller «Tween80»). Snitt 4 >i. Enkeltsnitt overføres til en liten skål med abs. etanol eller isopropanol. Derved folder de seg ut.

203

satt noen dråper eddiksyre. Før ned på van­ lig måte til vann.

Festing av snittene til objektglass: (11) Lag en kromalun-gelatin blanding slik: (A) Løs 1 % kaliumkromsulfat («kroma­ lun») K (Cr (SO4)2) • 12 FLO i vann.

(B) Løs 1% gelatin i vann (bruk helst pulver). (C) Bland like deler av (A) og (B).

(12) Flytt snittene fra alkoholbadet til kromgelatinløsningen. Dette gjøres ved å holde et objektglass på skrå under snittene og løfte dem opp. Før dem på skrå ned i kromalun-gelatinbadet. Det er best at de flyter på overflatehinnen. Ta dem opp med et nytt glass. Nå er det litt kromalun mel­ lom snittet og objektglasset. (13) La snittene tørke (evt. ved 40 °C). Kromalungelatinen stivner og fungerer som lim.

(17) Alternativ farging uten å fjerne plasten:

Farges med:

Borax (Na2B4O7) Dest. vann Toluidinblått

1 g 100 ml 0,5 g

La snittet ligge fritt i litt av fargeløsningen. Varm til koking. Skyll snittet i vann. Flytt til aceton, der fargen løses gradvis ut (diffe­ rensiering). Flytt til abs. etanol. Sperrefilter 530 nm øker kontrasten i mikroskopet. DEKALSINERING AV MATERIALE:

Fjerning av plast for farging:

I tradisjonell teknikk farger man uten å fjerne plasten som er uoppløselig i alle løs­ ningsmidler fra snittene. Det ytterste vevet ut mot overflaten tar farge. Med Hagens metode lar det seg gjøre å fjerne plasten helt uten å skade vevet strukturelt: (14) Lag følgende blanding: KOH Abs. etanol

Farging: (16) Snittene kan farges i haematoxylin og eosin (som kontrastfarge) på vanlig måte. Sølvfarging virker også.

1 g 100 ml

Varm på varmeplate til koking

(NB! FARLIG, alkoholen kan begynne å brenne!)

Saltsyre løser ut kalk, men kan ødelegge fikseringskvaliteten. Tilsettes formalin og sulfosalicylsyre, forhindres dette. Lag føl­ gende oppløsning: Formalin 8 % Sulfosalicylsyre HCL kone.

1000 ml 50 g 50 ml

Blandes i avtrekket. Krukker med vevsbiter holdes lukket.

(1) Vevet fikseres i formalin evt. glutaraldehyd. (2) Legg i ovenstående oppløsning 24-48 ti­ mer. Benbitene er blitt bløte og kan trim­ mes med kniv.

Væsken er ikke holdbar. (15) Legg snittene oppi, vent 60 s. Plasten løser seg nå opp. Flytt over i abs. etanol til­

(3) Legg materialet i 70-80% etanol 1-2 ti­ mer. Dehydrer og støp inn i plast på vanlig måte.

204

Mikroskopering av ventrikkelinnhold Mikroskopering av ventrikkelinnhold (opp­ kast, sondeprøve) gir et ytterst variert bilde. Noen ganger kan man påvise friskt blod, men oftest er blodet dekomponert. Antatte blodrester kan legge på objektglasset, tør­ kes over flamme og man kan prøve å kry­ stallisere ut haemin. Små prøver kan tynnes med en dråpe vann. Av mikroskopisk/diagnostisk betyd­ ning ved denne enkle undersøkelsen er gjærceller, pussceller og enkelte karakteris­ tiske bakterier.

Generelt om sterilteknikker Noe kjennskap til sterilteknikker er nød­ vendig for dyrking av celler, sopp og bak­ terier. Varmesterilisering utføres for tørre glassvarer ved oppvarming i termostatskap til 145 PC i 5-6 timer. Petriskåler kan holde seg i månedsvis hvis de plasseres i støvfritt skap etter avkjøling. Pipetter kan pakkes i aluminiumfolie, eller de kan legges i metallbeholdere som er beregnet for tørrsterilisering. Pass på at de vender samme vei og at retningen dit spissene vender er avmerket. Erlenmeyerkolber kan dekkes med lokk av aluminiumfolie. Pinsetter, sakser, nåler og kniver kan pakkes i papir og tørrsteriliseres på samme måte. Den enkleste formen for sterilisering av platina podenåler er å trekke dem gjennom gassflammen slik at de gløder. Medier steriliseres lettest i autoklav eller trykkoker. Mediet blandes sammen i erlen­ meyerkolber, tettsluttende aluminiumfolie benyttes om lokk og kolbene settes i autok­ lav eller trykkoker. Mediet er fullstendig sterilt etter oppvarming i vanndamp til 120 °C, 1 atmosfæres overtrykk i 20 minut­

ter. Har man ikke autoklav, kan man sterili­ sere ved gjentatt oppvarming. Varm først til 99 °C i en time, avkjøl langsomt til romtem­ peratur. Aluminiumfolie må sitte tett på som «lokk». Gjenlevende sporer vil nå spi­ re. Disse knekkes ved å gjenta prosessen et­ ter 24 timer. En tredje oppvarming kan være nødvendig. Noen medier tåler ikke langvarig oppvarming, men kan steriliseres ved filtrering gjennom et bakteriefilter. Gummikorker steriliseres best ved autoklavering. Pakk dem i aluminiumfolie. Tørrsterilisering av gummigjenstander er umulig. Alle steriliserte gjenstander skal behand­ les slik at kulturene man arbeider med ikke blir infisert. Lokk på petriskåler osv. må ikke løftes av så støv og bakterier eller soppsporer faller nedi. Ved opphelling av medium løftes lokket forsiktig på skrå, slik at man kan helle i fra den ene siden. Under opphelling holder man erlenmeyerkolben hele tiden på skrå. Det må arbeides raskt, li­ keledes må det ikke være trekk i rommet. Bordet man bruker, bør av og til strykes over med en svamp fuktet med fortynnet fe­ nol (karbolsyre). Husk fenol er giftig! Hovedprinsippet ved all sterilisering er at man verken direkte eller indirekte må bruke usterile gjenstander når man er i kontakt med næringsmediet. Da vil det bli infisert og må kasseres. Hosting og nysing under arbeidet er ikke å anbefale. Arbeidsrommet kan holdes noenlunde fritt for sporer ved å bruke en ultrafiolett steriliseringslampe. Enkelte organismer er patogene. Andre er ufarlige i små mengder, men lager syk­ dom ved massiv infeksjon. Store mengder muggsoppsporer kan gi dødelig lungeinfeksjoner.

Autoklaver alltid gamle kulturer med celler og mikroorganismer før de kastes, selv om de ikke er regnet for patogene!

205

SO2-vann

Tilleggsprosedyrer og oppskrifter Feulgens fargereaksjon Feulgens fargereaksjon er en presis kjemisk reaksjon for påvisning (og måling) av DNA i cellen. Vi bruker basisk fuxin, eller til nøy­ aktigere formål pararosanilin. Noen andre fargestoffer virker også. Standard Feulgen (= Schiffs reagens)

Basisk fuxin IN HC1 K2S2O5 Destillert vann

0,5 g 10 ml 0,5 g 100 ml

Kvaliteten på basisk fuxin varierer. Løs fuxinet i vann ved forsiktig koking. Avkjøl til 50°. Tilsett 10 ml HC1. Fargen endres. Vent til temperaturen er sunket til 25 °. Tilsett K2S2O5. Lukk flasken tett, sett i kjøleska­ pet ved 4 °C. Ta løsningen ut etter 24 timer. Er den ufarget, kan den brukes direkte. Ved gulaktig farge, ryst med aktivt kull (magnetrører). Filtrer. Søl ikke med fargen, den setter stygge flekker på huden.

(1) Løs 5 g Na2S2O5 i 950 ml dest. vann. (2) Tilsett 50 ml IN HC1 rett før bruk. Mange har problemer ved tillaging av Feul­ gens reagens. Selve reagenset skal være helt uten farge, likner rent vann. Det lønner seg å prøve ulike fabrikat basisk fuxin. Det blir lett mye søl med Feulgevæsken. Kjøper man en billig «kaffemaskin» kan man koke vann og «trakte» det over fargepulveret som ligger på filtret. Ha lokk på så det ikke spruter. Man lager da en liter rea­ gens av gangen. Ha aldri fargepulver direkte i kokende vann. Vannet støtkoker og fargen spruter utover.

Haupts medium for feste av snittpreparater

(1) Løs 1 g gelatin i 100 ml varmt vann (30-35 °C). (2) Tilsett 3 g fenol som antiseptikum (3) Ved bruk, smør tynt på objektglass (4) Snittene skal strekkes på vann med 4 To formalin, tørk i varmeskapet ved 35 °C i 3 døgn.

For fluorescensformål (s. 133)

Permanentgjøring snittpreparater

(1) Løs 0,1 g pararosanilin i 15 ml IN HC1 ved romtemperatur. (2) Løs 0,5 g Na2S2O3 i 85 ml dest. vann ved romtemperatur. (3) Bland (2) i (1). (4) Oppbevar mørkt i kjøleskap 24 timer. (5) Hvis fortsatt farge, ryst med aktivt kull. Filtrer.

(1) Bruk Eukitt, Canadabalsam eller Cederolje, fortynn noe med xylen. (2) Ferdigfargete snitt føres gjennom 30, 50, 70, 80, 96, 100 To etanol. (3) Flytt til to bad xylen, et minutt i hvert. (4) Legg preparat med snittsiden opp på to parallelle trelister. (5) Drypp rikelig på med innleiringsmiddel. Legg dekkglass på skrå ned på preparatet så det ikke blir luftblærer. (6) Vent 2-3 timer, sett på messinglodd. La tørke et par uker. Merk pent med etiketter.

Denne fargen gir ingen synlig Feulgenreaksjon ved vanlige lysforhold, men meget god fluorescens selv ved små DNA-mengder.

206

Mcllvaines buffer (bruk istedet for BBS)

Safranin/fastgreen farge (til botaniske snittpreparater) 60% etanol Safranin Fast green

200 ml 1,5 g 0,5 g

Røde kjerner, grønt cytoplasma. Differen­ sieres under dehydreringen. Til enkle kro­ mosompreparater, planteanatomi.

100 ml 100 ml 100 ml

ml (B)

ml (A)

5,5 6,8 7,0

57,0 77,2 82,4

43,0 22,8 17,6

Løs Na-cacodylat i dest. vann til 0,2 eller O,1M • pH = ca. 7,4. Kan justeres med IN HCx. Andre bufferløsninger (Sørensen etc.) kjø­ pes best ferdig.

Sur haemalum, Meyers farge

Haematoxylin Natriumjodat Kaliumaluminiumalun Kloralhydrat Citronsyre Destillert vann

pH

Cacodylatbuffer 0,2M, O,1M

Pfeiffers løsning Metanol (99%) Formalin (37 %) Iseddik

Løsning (A) 21,01 g sitronsyre • H2O Løsning (B) 28,4 g Na2HPO4 (vannfri)

1 g 0,2 g 50 g 50 g 1 g 1000 ml

Eggehviteglycerol Bland like deler hønseeggehvite og glycerol. Tilsett 1 krystall thymol. Filtrer (tar en måned).

Gilsons fluid (fikservæske) La først haematoxylin i vannet, tilsett natriumjodat og kalalun. La stå 2 timer. Ryst. Tilsett kloralhydrat og citronsyre. Farge skifter fra blåfiolett til rødfiolett. Ubegren­ set holdbar.

SSC-løsning (= standard saltløsning) NaCl Natriumcitrat

105,3 g 52,9 g

Dette gir 12X SSC-stamløsning, tynnes ved bruk.

Etanol (70%) HNO3 (80%) Iseddik HgCl2 Destillert vann

25 ml 4 ml 1 ml 5g 220 ml

207

Litteraturliste

Abramowitz, M. 1985. Microscope, Basics and Beyond, vol. 1. Olympus Cooperation. 26 pp. Baker, J. R. 1963. Cytological Technique. The Principles underlying Routine Methods. London. Methuen & Co. Ltd. 150 pp. Baumeister, W. 1967. Planktonkunde fur Jedermann. Franckhsche Verlagshandlung. Stuttgart. 121 pp. Becker, E. (u.å.). Fluorescense Microscopy. Principles, Instruments, Applications. Wild Leitz GmbH. Wetzlar. no. 512-193. 71 PPBergner, J. & al. 1961. Einfiihrung in die praktische Mikrofotografie. VEB Fotokinoverlag Halle. 284 pp. Berlyn, G.P. and Miksche, J.P. 1976. Botanical Microtechnique and Cytochemistry. Iowa State University Press. Iowa (U.S.A.). 326 pp. Bloss, F. D. 1961. An Introduction to the Methods of Optical Crystallography. Holt, Rinehart and Winston. New York. 294 pp. Bradbury, S. 1968. The Microscope Past and Present. Pergamon Press. Oxford. 272 pp. Bradbury, S., Evenett, P.J., Haselmann, H. and Piller, H. 1989. Dictionary of Light Microscopy. Compiled by the Nomenclature Comitteé of the RMS. Oxford Uni­ versity Press. Royal Microscopical Socie­ ty. 139 pp. Brinkmann, A. 1950. Mikroskopet og det Mikroskopiske Preparat. Joh. Grundt Tanum Forl. Oslo. 148 pp.

Burgess, J., Marten, M. & Taylor, R. 1987. «Microcosmos». Cambridge University Press. Cambridge. 208 pp. Carolina Biological Supply Company. Catalogue 1992. Burlington, Ohio, N.C., U.S.A. (Omlag 20 000 objekter og prepa­ rater innen biologi og medisin, også le­ vende materiale, læremidler ). 1304 pp. Casselmann, W.G.B. 1959. Histochemical Technique. London. Methuen & Co. Ltd. 205 pp. Claussen, C. H. 1962. Das Mikroskop und seine Anwendung. Ernst Leitz GmbH., Wetzlar. 35 pp. Darlington, C. D. and LaCour, L.F. 1969. The Handling of Chromosomes. Georg Allen & Unwin, Ltd. London. 272 pp. Determan, H. und Lepush, F. (u.å.). Das Mikroskop und seine Anwendung. E. Leitz, Wetzlar. (no.512-69b). 108 pp. The Microscope and Its Application (eng. utg.). E. Leitz, Wetzlar. (no. 512-069). 115 pp. Dollin, S. 1988. Das neue Handbuch ftir Video-Filmer. Interbook, Hamburg. 159 pp. Dyer, A. F. 1979. Investigating Chromoso­ mes. Edward Arnold Publ. London. 138 pp. Ealing Electro-Optics. Product Guide. 1991 (inneh. beskrivelse og katalog over op­ tiske komponenter for egne konstruksjo­ ner). Ealing-Optics, Watford, England. Eames, A. J. and McDanieis, L. H. 1947. An introduction to Plant Anatomy. McGraw-Hill Book Co. Inc. New York. 427 pp.

208 Esser, K. 1976. Kryptogamen. Blaualgen, Algen, Pilze, Flechten. Praktikum und Lehrbuch. Springer-Verlag, Berlin. 572 pp. European Microscopy and Analysis. (Tidsskr. gratis distr. til forskere ). Rolston Gordon Comm. Bookham, Leatherhead, Surrey, England. Farb- und Filterglas fur Wissenschaft und Technik. 1962. Jenaer Glaswerk. Shott & Gen., Jena. 27 pp. Fuller, M. S. 1978. Lower Fungi in the Laboratory (inneh. kulturanvisninger og oppskrifter etc.). Palfrey Contr. in Botany. Publ. by The Dept.Bot. University of Georgia, Athens, Georgia, U.S.A. 213 pp. Galigher, A. E. and Kozloff, E. N. 1964. Essentials of Practical Microtechnique. Lea & Fibiger. Philadelphia. 484 pp. Geitler, L. 1949. Schnellmethoden der Kern- und Chromosomenuntersuchung. 3 Aufl. Springer-Verl., Berlin. 35 pp. Gerlach, D. 1976. Das Lichtmikroskop. Georg Thieme Verlag. Stuttgart. 311 pp. Gerlach, D. 1977. Botanische Mikrotechnik. 2 Aufl. G. Thieme Verl. Stuttgart. 311 pp. Gray, P. 1973. The Encyclopaedia of Mic­ roscopy and Michrotechnique. Van Nostrand Reinhold Co. New York. 638 pp. Greulich, K. O. 1992. Moving Particles by Light : No longer Science Fiction. Proc. R.M.S. 27 : 3-8. Helle, I. 1983. Råd for helse og sykdom un­ der langtidsopphold i utviklingsland, (beskriver eksotiske sykdommer, tildels av interesse for mikroskopiske studier ). Universitetsforlaget, Oslo. 144 pp. Heunert, H.-H. 1954. Die Nåhaufnahme. Leitfaden fiir die Makrophotographie in Wissenschaft und Technik. SpringerVerlag. Berlin. 125 pp. Hintzsche, E. 1951. Mikroskopet. CibaTidskriftet. 3 (27) : 882 - 911. Hirsch, G. C., Ruska, H. und Sitte, P.

(Red.) 1973. Grundlagen der Cytologie. Gustav Fisher Verl. Stuttgart. 790 pp. Holck, P. 1988. Fra mikroskopets historie. Tidsskr. Nor. Lægefor. 108 : 654-659. Holz, H.M. (u.å.). Worthwhile facts about fluorescence microscopy. Opton Feintechnik GmbH. Oberkochen. 47 pp. Hoyer, H. 1882. Beitråge zur Histologischen Technik 3 Einschlussfliissigkeiten. Biol. Zentrlbl. 2 :23-24. Hdglund, S. och Nilsson, O. 1972. Elek­ tronmikroskopisk teknik. Almqvist & Wiksell. Stockholm. 84 pp. Iversen, T.-H. 1973. Elektronmikroskopi. Tapir Forlag. Trondheim. 108 pp. James, D. E. 1978. Culturing Algae. Carolina Biological Suppl. Co. Burlington, N.C., U.S.A. 23 pp. Johansen, D.A. 1940. Plant Microtechni­ que. McGraw-Hill Book Co. Inc. New York. 523 pp. Juniper, B.E., Cox, G.C., Gilchrist, A. J. and Williams, A. J. 1970. Techniques for Plant Electron Microscopy. Blackwell Scientific Publ. Oxford. 108 pp. Kerr, P.F. 1959. Optical Mineralogy. McGraw-Hill Book Company, Inc. New York. 442 pp. Krogness, M.L. (u.å.) Mikroskop og Stereolupe. Bygning, Stell og Bruk. Skolelaboratoriene for Naturfagene, avd. Biologi, Univ, i Oslo. 52 pp. Kruif, P. de. 1947. Microbe Hunters. The Albatross Ltd. London. 287 pp. Laane, M. M. 1970. Kromosomteknikk for Biologer og Medisinere. Universitetsfor­ laget, Oslo. 150 pp. - 1972. Einfache Methoden zur Chromoso­ menuntersuchung. Die Reifeteilungen bei Pflanzen und Tieren. Mikrokosmos (Stuttgart) 61 : 185-188. - 1974. Fluoreszensmikroskopie - auch fiir Amateure. Mikrokosmos (Stuttgart) 63 : 30-32. - 1980. Die Chromosomen von Rhoeo discolor Mikrokosmos (Stuttgart) 69: 311-314.

209 - 1990. Der Schleimpilz Physarumpolycephalum. Ein fascinierender Organismus flir Biologische Experimente. Mikrokos­ mos (Stuttgart) 79 : 197-203. Laane, M.M. and Haugli, F.B. 1974. Divisions centres in mitotic nuclei of Physa­ rum polycephalum plasmodia. Norw. J. Bot. 21 : 309-318. Laane, M.M. and Lie, T. 1975. Examination of Fungal Nuclei with the FeulgenFluorescense Method. Mikroskopie 31: 85-90. - und Mellem, T. R. 1978. Mitose der Endospermzellen von Haemanthus. Herstellung von mikroskopischen Pråparaten. Mikrokosmos (Stuttgart) 67 : 364 370. - und Thogersen, P.-J. 1974. Ein selbstgebauter Mikroskoptisch fiir anspruchsvolle Lichtmikroskopie. Mikrokosmos (Stuttgart) 63 : 344-348. -und Wahlstrøm, R. 1981a. Haplopappus gracilis, eine Pflanze mit nur zwei verschiedenen Chromosomen. Mikrokosmos (Stuttgart) 70 : 71-75. - 1981 b. Einfache Bånderungsverfahren fiir Menschliche Chromosomen. Mikro­ kosmos (Stuttgart ) 70 : 23-29. Latt, S.A. 1973. Microfluorometric detection of deoxyribonucleic acid replication in human metaphase chromosomes. Proc. nat. Acad. Sci 70 : 3395-3399. Lawson, D. 1972. Photomicrography. Academic Press, London. 494 pp. Løve, A. and Løve, D. 1975. Plant Chromo­ somes. J. Cramer, Vaduz. Lichtenstein. 184 pp. Løvlie, A. og Sirevåg, R. 1990. Biologi 2 Bi. Cappelen, Oslo. Manwell, R.D. 1968. Introduction to Protozoology. Dover Publ. Inc. New York. 642 PPMargulis, L. and Sagan, D. 1988. The Microcosmos Coloring Book. Harcourt Brace Jovanovich. Publ. Boston. 232 pp. -and Schwartz, K. V. 1982. Five Kingdoms.

An Illustrated Guide to the Phyla of Life on Earth. W.H. Freeman and Co. San Fransisco. 338 pp. McLeish, J. and Snoad, B. 1972. Looking at Chromosomes. MacMillan, St.Martins Press. London and Basingstoke. 97 pp. Mellem, T. R. und Laane, M. M. 1979. Mi­ tose bei der Blutblume Haemanthus. Rasterelektronenmikroskopische Bilder. Mikrokosmos (Stuttgart) 68 : 111 - 113. Mercer, E. H. and Birbeck, M.S. C. 1966. Electron Microscopy. A handbook for Biologists. Blackwell Scientific Publications. Oxford. 102 pp. Metzner, P. und Zimmermann. A. 1928. Das Mikroskop. Ein Leitfaden der Wissenschaftlichen Mikroskopie. Zweite Aufl. Franz Deutiche, Leipzig und Wien. 509 pp. Mikrokosmos. (Kjent tidsskrift for forskere og amatører ). Deutschen Mikrobiologischen Vereiningung Hamburg etc. Franckh. Stuttgart. Moewis, G. 1978. Histo-patologisk Teknik. Almqvist & Wiksell Forlag, Stockholm. 216 pp. Mollerberg, H. 1985. Kliniske Laboratorie­ undersøkelser. Tano Forlag. Oslo. 293 pp. Mdldner, K. 1974. Pråparationsverfahren fiir die Transmissions-Elektronenmikroskopie. (u.å.) Carl Zeiss, Oberkochen. 53 pp. Mollring, F. K. 1980. Mikroskopieren von Anfang an. Carl Zeiss, Oberkochen. 59 pp. Nachtigall, W. 1985. Mein Hobby : Mikro­ skopieren. Technik und Objekte. BLV Naturfiihrer. BLV Verlagsgesellschaft. Mtinchen. 191 pp. Neubert, W. 1991 Langzeitbeobachtung von Mikroorganismen. Ein praktisches Mikroaquarium. Mikrokosmos 80 : 228-231. Nultsch, W. und Grahle, A. 1974. Mikroskopisch-Botanisches Praktikum. G.

210 Thieme Verlag. Stuttgart. 190 pp. Oehlinger, S. 1937. Rationelle Mikrofotografie mit der Exakta-Kamera. Gerhard Isert Verlag zu Magdeburg-Sudenberg. 82 pp. Ohnsorge, J. und Holm, R. 1978. Rasterelektronenmikroskopie. Eine Einfuhrung fur Medisiner und Biologen. (Scanning Electron Microscopy. An introduction for Physicians and Biologists). G. Thie­ me Verlag. Stuttgart. 155 pp. Optical Systems for the Microscope (u.å.). Carl Zeiss GmbH. Oberkochen. (no. 41 -101-e). 95 pp. Ott, J. 1958. My Ivory Cellar. The Story of Time-Lapse Photography. Twentieth Century Press. Inc. Chicago Ill. 157 pp. Pantin, C.F.A. 1962. Notes on Microscopical Technique for Zoologists. Cambridge University Press. 77 pp. Patzelt, W. J. 1974. Polarisationsmikroskopie. Grundlagen, Instrumente, Anwendungen. E. Leitz, GmbH, Wetzlar. (no. 550-51). 115 pp. Perry, P. and Wolff, S. 1974. New Giemsa method for the differential staining of sister chromatids. Nature 251 : 156-157. Photomacrography and Photomicrography. 1979. Wild Herbrugg Ltd. 61 pp. Pråzisionsoptik 1988. Spindler & Hoyer GmbH & Co. (Katalog over optiske kom­ ponenter, mikroskop, optiske benker, måleapparatur. Firmaet kan slipe linser etter brukerens spesifikasjoner ). Gottingen. Reinert, G.G. Practische Mikrofotografie. Wilhelm Knapp Verlag. Halle (Saale). 160 pp. Rosenbauer, K.A. und Kegel, B.H. 1978. Rasterelektronenmikroskopische Technik. G. Thieme Verlag. Stuttgart. 241 pp. Sagan, D. and Margulis, L. 1988. Garden of Microbial Delights. A practical Guide to the Subvisible World. Harcourt Brace Jovanovich Publ. Boston. 231 pp.

Scheel, V., Ellerman, V. og Chrom, J. P. 1905. Klinisk Mikroskopi, Bakteriologi og Kemi. Aug. Bang Forlag. Kdbenhavn. 116 pp. Shillaber, C. P. 1945. Photomicrography. In Theory and Practice. New York. John Wiley & Sons. Inc. 2 Ed. 773 pp. Stehli, G. 1960. The Microscope - and how to use it. Cornerstone Library. New York. 160 pp. Streble, H. und Krauter, D. 1974. Das Leben im Wassertropfen. Mikroflora und Mikrofauna des Siisswassers. Ein Bestimmungsbuch mit 1700 Abbildungen. Kosmos Naturfiihrer. Franckh’sche Verlagshandlung, Stuttgart. 336 pp. The Microscope and its Application. 1938. E. Leitz, Wetzlar. 31 pp. The use of the Olympus Fluorescence Mic­ roscope (u.å.). Olympus Optical Co. Ltd. Tokyo, Japan. 54 pp. Video-Fascination. Vejledning til bedre Vi­ deofilm. Tips, Muligheder og Udstyr. HAMA Mohnheim, Bayern. 248 pp. Walther, F. 1980. Das Mikrotom. Leitfaden der Pråparationstechnik und des Mikrotomenschneidens. E. Leitz, Wetzlar, GmbH. 97 pp. White, M. J. D. 1961. The Chromosomes. London. Methuen & Co. Ltd. 188 pp. Whitten, R.H. and Pendergass, W.R. 1980. Carolina Protozoa and Invertebrates Manual. Carolina Biological Suppl. Co. Burlington, N.C. U.S.A. 35 pp. Willmer, E. N. 1958. Tissue Culture. The Growth and Differentiation of Normal Tissues in Artificial Media. London. Methuen & Co. Ltd. 191 pp. Wurst, W. 1963. Exakta KleinbildFotografie. VEB Fotokinoverlag. Halle (Saale). 294 pp. Øye, A. 1968. Håndbog i Mikroskopi. P. Haase & Sons Forlag. København. 335 PP-

211

Stikkord

Abbé, E. 10 Abbés teori 51 Acarus scabei 183 Achhylostoma duodenale 182 akromater 40 alger 154 alger på dekkglass 156 algesopper 149 alizarinviridin 162 Amici, G. 10 Amici-Bertrand linse 78 ammoniakalsk sølv 187 Amphioxus 179 amplitudeobjekter 51 amøber 170 analysator 77 anodesystem 135 aperturblende 19 aralditblandinger 139 Archana naturae 9 Ascaris 17 7 Ascaris lumbricoides 182 astigmatisme 38 auraminfarging 188 avstøpning med silikon 133 azanfargeløsning 119 azokarmin B 162

bakterier, svingtråd 160 bakterier 180 barneorm 182 bendelormer 182 bikonveks linse 18, 19 bildefeltkrumning 38 bilharzia 183 blodflekker, påvisning 198 blodparasitter 183, 184 blodutstryk 196 blycitratløsning 144

boraxkarmin 169 botaniske teknikker 146 Bothriocephalus latus 182 Bouin 103 brennpunkt 18, 19 brennvidde 18 Brown, R. 10 brytningsindeks 24 båndfarging, kromosomer 162 C-bånd, Allium 164 cacodylatbuffer 102 Carnoy-Lebrun fiksering 178 CCD-brikke 44 cederolje 34 cellekultur, perifert blod 193 celloidinmeoden 113 cellulose, påvisning 159 cellulære slimsopp 154 Chevalier, J. L. V. 10 ciliater, teknikker 166, 169 colchicin 99 coli-bakterier 181

dekalsinering 203 dekkglasstykkelse 36 deklinasjon, kniv 111 Demodex folliculorum 183 diatoméer 155 diaoméer, celleinnhold 156 diffraksjon 25 diffraksjonsbilde 25 difteri 181 DIK (Nomarski) 47 dikroitisk delespeil 78 dispersjon 24, 37 dissosiasjonsmetoder 186 Distomum lanceolatum 183 Divini, E. 8

212 dobbeltbrytning 74 dobbeltflaske 23, 34 Dracunculus medinensis dråpeakvarium 171 dunkelfelt 53 dybdeskarphet 36

182

Eckerts gullmetode 168 egenforstørrelse 32 eksitasjonsstråling 78 eksiteringsfilter 79 ekstrautstyr 89 elektronisk bilde 57 elektronmikroskop 135 elektronmikroskopsøyle 135 elementærbølger 25 enkelt lysmikroskop 20 eponblandinger 139 erter, løkfrø, Scilla 163 etanol 100 Exakta systemkamera 60 FA A 104 faeces 186 farge plasttynnsnitt 120 fargeløsninger 118 fargemetoder, fluorescens 121 fargemetoder 117 farging, plastsnitt 203 farging av snitt 120 farging elektronmikroskopi 144 Fasciola hepatica 183 fasekontrastkondensor 46 fasekontrastmikroskop 51 fasekontrastobjektiv 41 faseobjekter 51 feltblende 16, 19 Fermats lov 24 festeklemmer 14 Feulgen fluorescens 133 Feulgen-squash teknikker 132 Feulgenbånd, kromosomer 170 Feulgens fargereaksjon 205 Feulgens reagens 120, 205 Feulgenvæske, fluorescens 205 Feulgenvæske 205

fikserbad 66 fikseringer uttørkete 161 fikseringsprosedyrer 97 Filaria bancrofti 182 filmfremkaller 65 filmkamera 66 finskrue 14 fiskebendelorm 182 FITCmerket antistoff 189 flatlus 183 flatormer 177 Flemming-Benda 102 fluorescens 78 fluorescensfarge 120 fluorescensobjektiv 40 fluorescerende skjerm 135 fluoritobjektiver 40 fluorochrom 78, 122 flått 183 fokalplan 98 formvarhinne 138 forstørrelse (lupe) 20 forstørrelse (mikroskop) 20 forundersøkelser 99 fosforescens 78 fotografiske feil 64 fotookular 44 fryseapparat 107 frysemikrotomen 107

G-båndfarging 163, 165 Galilei 8 gangforskjell 74 gassutladningslampe 49 gelfiltrering, konjugat 193 gentianafiolett 118 Giemsa-Romanovsky 184 Giemsas farge 184 Gilsons væske, bendelorm 177 gitter 28 gitterkonstant 28 glasskniver, å lage 111 glutaraldehyd 101 glutaraldehydfiksering 104 glycerolgelatin 157 glødelampe 48

213 Golgis metoder 187 gonokokker 181 Grams jodløsning 185 Grams metode 185 gridboks 143 grids 138 grovskrue 14 Guineaorm 182 gullkloridfarging 168

haemalaun, Meyer 162 haeminkrystaller 198 Hagens metode 201 Hall, C. 10 halogenlampe 49 harlequinkromosomer 170 Haupts medium 205 havregrynagar 152 Hayems væske 197 Heidenhainfarger 118, 119, 120 herapatittkrystaller 77 hodelus 183 Hooke, R. 8 hoppekreps 168 hovedmaksimum 30 Hoyers medium 1 173 Hoyers medium 2 174 humankromosomer 193 hundebendelorm 182 Huygensokular 44 Hydra 176 hydroider 176 hydroxyquinoline 99 høybakterier 159 hårsekkmidd 183

immersjonsolje 23, 34 immunfluorescens 189 immunglobulin 189 immunserum 189 indikatrixdiagram 74 infrarød mikroskopi 70 inklinasjon, kniv 111 innstøping 114 invollsparasitter 181 interferens 25

interferensfargetabell 140 interferenskontrast 47 isopor 83 Ixodes ricinus 183 Janssen, H. 8 Janssen, Z. 8

karbonatbuffer 192 karmineddiksyrepreparat 128 katodesystem 135 kernechtrot 161 kjemikalier/varer 90 kjøleapparat 199 kjønnskromatin 198 Kleins sølvmetoder 168 klokkedyr 167 kloroform 101 kobbergrids 138 Koch, R. 8 Kohlerinnstilling 22 Kohlersk prinsipp 19, 22 kolera 181 kollektor 19, 47 kollektorlinser 19 kombinasjonsdiagram 26 kompensasjonsokular 43, 44 kondensor 19 kondensorsystemet 45 konfokalt mikroskop 72 konjugasjonsprosedyre 192 krepsdyr 179 kritisk punktbehandling 135, 136 kromatisk avvik 36 kromosomanalyser 127 kromosomer, Tulipa 164 kromtrioksid 100 kroppslus 183 kryssbord 14 kryssfører 17 krystallfiolett 118 krystallografiske akser 55 krystallsystemer 75 kullysbuelampe 48 kvartskile 76 kvikksølvdamplampe 49

214

laboratoriejournal 87 lansettfisk 179 lawoltlampe 48 Leeuwenhoek, A. van 8 Leitz, E. 12 Levan, A. 127 levende blodparasitter 184 levende vev i pålys 174 levendeundersøkelser, sopp 151 leverikte 183 Levitsky 103 ligning, påvisning 159 limsjiktpreparater 151 linse-peptonmedium 147 linsefeil 36 litteraturliste 206 luft i vevet 98 luminarobjektiv 41 luminiscens 78 lupeforstørrelse 21 lysets bølgenatur 25 lyshastigheten 24 lysmikroskop uten linse 71 lysmåling 61 Løfflers methylenblått 185

maismedium 146 makromorfologi 172 malariaparasitten 183 Mallory trippelfarge 119 maltmedium 147 markgresshopper, meiose 175 McArdles medium 152 medisinsk fluorescens 188 medisinske teknikker 180 meduser 177 meiose, mitose i dyr 175 meioseanalyser 130 mekonsyre 166 mellombilde 14 meningokokker 181 menneskelopper 183 metemark 178 methylalkohol 101 methylenblått 120 Meyers reagens 166

Michel-Levys tabell 78 Micrographia 9 mikroakvariet 169 mikroblits 67 mikrofotografering 58, 62, 63 mikrokjemi, valmue 166 mikroskop, konstruksjon 13 mikroskopbelysning 48 mikroskoplaboratoriet 86 mikroskopstativet 15 mikroskoptegning 67 mikroskoputstyr 89 mikrotomen 105 mikrotomkniven 110 miltbrand 181 mineralstamløsning 147 Minots mikrotom 106 mitose i plasmodier 153 Monocystis 179 mørkefelt 53 mørkefeltkondensor 45 måleokular 44 Navashin-Karpechenko 103 nematoder 177 Nomarski 12 nonieskala 14 numerisk apertur 24 nye plantesorter 165 objektbord 13, 17 objektglass 14 Objektivet 31 Objektivkonstruksjoner 32 objektivrevolver 14 objektivtyper 38 observasjon el-mikroskop 137 oksetintens bendelorm 182 okular 14 okularer 43 opiumvalmue 166 oppløsningsevne 28 optisk konjugert 22 optisk korreksjon 36 optiske pinsetter 70 optovar 16 orden på laboratoriet 86

215

ordentlig stråle 74 ormer 177 ortoskopi 77 osmiumtetroksyd 101 Ostergren-Henéen 103 overflatestudier 173 overordentlig stråle 73 Oxyuris vermicularis 182

Palades fikservæske 104 pancreatinløsning 186 Papaver somniferum 166 paraffinoljepreparater 174 paraffinsnitt 108 Paramecium 167, 169 parasitter, midd, insekter 183 Parfokale objektiver 33 Pasteur 8 pattedyrhår 176 pattedyrkromosomer 170 Pediculus capitis 183 Pediculus corporis humanis 183 Peltierelementer 107, 199 pepsinløsning 186 permanente preparater 131 permanente preparater 199 pest 181 Phthirius pubis 183 Physarum polycephalum 152 pikrinsyre 101 piskeorm 182 plankonveks linse 19 planobjektiver 40 planokular 43 planteanatomiske snitt 183 plastfjerning i snitt 202 Pleurosigma angulatum 30 polarisasjonsmikroskop 73 polarisator 77 polarisert lys 47 pollen i honning 158 pollen i torv, jord, sand 158 polsko 136 polyppdyr 176 preparater for TEM 137 preparatsamlingen 92

preparering SEM 145 preparerutstyr 89 primærfiksering 100 projeksjonsokular 44 projektiv 58 propionsyre 101 propylenoksid 138 protozooer, fiksering 171 Provasolis medium 155 Pulex irritans 183 pumpesystemer 135 pussmateriale 184 pådampning av preparater pålysobjektiv 41

Q-båndfarging

145

163

Rayleighs kriterium 25 Raymon y Cajals metode 187 reduksjonsløsning 187 reflekser 41 replikateknikk 143 Reynolds blycitrat 144 Rheinberg filtre 54 ringblende 46 Ringerløsning, human 186 rotasjonsmikrotomen 106 rundormer 177 rystekulturer, Physarum 153

salicylsyrealkohol 169 scanning lysmikroskop 71 scanning probe mikroskop 68 scanning tunneling mikros. 70 scanningelektronmikros. 135 Schaudinns væske 104 Schiffs reagens 205 Schistosoma haematobium 183 SEM 135 seriesnitt, TEM 144 sfærisk avvik 36 sidemaksimum 30 sjøanemoner 177 skabbmidd 183 skjerping av kniv 112

216 skråstilling, kniv 111 skyggelegging 143 sledemikrotomen 106 smearmetoder 126 smørsyrebakterier 159 snitting, plastblokker 140 snitting av vev 112 snittplan 115 sopp, fluorescensmikros. 150 sopphyfer 149 soppmycel, objektglass 150 soppreparater, gode 149 soppteknikker 146 sovesyken 184 speilreflekskamera 60 sperrefilter 79 squashmetoder 126 squashpreparater. sopp 148 SSC - Giemsabånd 164 stativ 13 sterilteknikker 204 stivkrampe 181 store plastsnitt 201 streptokokker 181 stroboskop 67 strålegang, lysmikroskop 20 superhøytrykkslampe 49 svamper 176 svinebendelorm 182 sykdommer 180 sølvnitratfarging 168

Taenia echinococcus 182 Taenia saginata 182 Taenia solium 182 tellekammer 197 telleokular 44 telling, hvite blodlegemer 197 telling, røde blodlegemer 197 TEM 135 testskjema 81 time-lapse film 66 Tjio, J. H. 127 tom forstørrelse 35 Tour, de la 10 Tradescantia støvbærere 159

tredimensjonale bilder 72 Trichinella spiralis 182 Trichocephalus dispar 182 trikin 182 trypanosomer 184 trådorm 182 tuberkulose 181 tuberkulosebakterier 185 tubus 13 tubuslengde 32 tyfus 181 tøffeldyr 167 uendelig tubuslengde 32 ultrafiolett mikroskop 67 ultrafluarobjektiver 40 ultramikrotom 139 Ultraphot 16 uranylacetat 144 utstryk, bakterier 181 utstryksmetoder 126 utstyr og hjelpemidler 87 UV-objektiv 40 vakuum 135 vakuumkammer 135 vannagar med haemin 152 ventrikkelinnhold 204 vestopalblanding 139 Vicia faba 164 videokamera 66 Vorticella 167

Wollastonprisme xenonlampe

47, 55

50

y-kromosom, påvisning YAS-medium 146 Zahn, J. 10 Zeiss, C. 10 Zenker 103 Zernike, F. 12 Ziehl-Nielsens farge 185 zoologiske teknikker

198

Trichinella spiralis, innkapslete muskeltrikiner (se s. 182). Foto: Dr. M.L.

Castor fiber, milt. Plastsnitt gjennom milt fra bever. Hagens metode. Foto: Dr. M.L.

Sordaria macrospora. Ascussporer, tofaktorkrysning. Ufarget glycerolpreparat. Foto: Dr. M.L.

Penicillium sp. Limskiktpreparat, muggsopp. akridin-orange fluorescens, mørkefelt. Foto: Dr. M.L.

Physarum, slimsoppsporangier. Pålysfotografi. Foto: Dr. M.L.

Physarum. Kjerne fra plasmodium. Akridin-orange fluorescens (DNA er grønn, RNA er rød). Digitalisert bilde. MTOC («centriole») gitt gul farge. Foto: Dr. M.L.

Moderne fluorescensmikroskop (Leitz Dialux). E. Leitz GmbH, Wetzlar.

Mikrotubuli i He-la celler. Fluorescens, antibulin-antimus biotin, streptavidin, Texasrødt. Leica Mikro­ skopie und Systeme GmbH, Wetzlar.

Boriella sp. fra Ixodes. Smittebærende bakterier i flått. Digitalbehandlet bilde. Foto: Dr. M.L. fra E. Leitz, GmbH, Wetzlar.

Ixodes ricinus. Flått. Canadabalsampreparat. Foto: Dr. M.L.

Epitelcelle, kengururotte. Nyreepitel. Digital-behandiete, konfokale bilder. Propiumjodid, FITCfluorescens. Mitose med kromosomer og spindel: Leica Mikroskopie und Systeme GmbH, Wetzlar.

Ctenocephalus canis. Hundeloppe. Foto: Dr. M.L.

1

Acorus calamus. Kalmusrot, stengel. Tverrsnitt. Polarisert lys. Foto: Dr. M.L.

Allium cepa. Husholdningsløk. Meiose i pollenmorceller. Aceto-orcein squash. (DIK). Foto: Dr. M.L.

Haemanthus katherinae (= Scadoxus k.). Afrikansk blodlilje. Levende mitose i endospermcelle Foto- Dr M.L.

(A, B, C): Fotografier i scanning elekt­ ronmikroskop. A: mitoseprofase i Haemanthus, B: del av mitoseanafase, D: overflate på levende blad av Pinguicula (tettegras). C: Humane kromosomer i quinacrine-fluorescens, merk Y-kromosom (pil). Foto: Dr. M.L.