Extraction Et Dosage Des Composés Phénoliques [PDF]

Zitiervorschau

Extraction et dosage des composés phénoliques La détermination des composés phénoliques : polyphénols totaux (PPT), flavonoïdes totaux (FVT) et tannins condensés (TC) présents au niveau des différentes parties des plantes étudiées a été réalisée à l’aide d’un spectrophotomètre UV-visible de type Cary 50. 1.

 Réactifs chimiques Une série de produits chimiques ont été utilisés pour doser les composés phénoliques des différents extraits des plantes. Le réactif de Folin-Ciocalteu est fourni par VWR international (France), l’acide gallique, la catéchine, le nitrite de sodium (NaNO 2) et la vanilline sont fournis par Sigma-Aldrich Chimie (France), le carbonate de sodium (Na 2CO3), le trichlorure d’aluminium (AlCl3) et l’hydroxyde de sodium (NaOH).  Préparation des extraits Pour la préparation des extraits végétaux, la méthode qui a été utilisée est celle proposée par Kim etal. (2002) puis par N’Guessanetal. (2011) avec quelques modifications. Ainsi, 10g de poudre fine ont été macérés dans 2 x 100 ml d’une solution de méthanol-eau (80:20 v/v). Le mélange est mis sous agitation permanente pendant 24h. Après filtration, le filtrat obtenu a été concentré sous pression réduite à 38 °C à l’aide d’un évaporateur rotatif.Après évaporation, le résidu est dissous dans 50 ml de méthanol et le mélange est ajusté à 100 ml avec l’eau distillée. Enfin, le mélange obtenu est centrifugé (1536 x g) pendant 20 minutes puis compléter à 100 ml avec une solution de méthanol-eau (50:50 v/v). Le mélange est conservé au frais (+4 °C) en attente d’utilisation pour les analyses. 1.

Dosage des polyphénols totaux (PPT)  Méthode utilisée pour doser les PPT

Le dosage des polyphénols est réalisé à l’aide du réactif de « Follin-Ciocalteu » (Waterhouse,

1999)

en

présence

de Na2CO3.

Il

s’agit

d’une solution

d’acide

phosphotungstique (H3PW12O40) et d’acide phosphomolybdique (H3PMo12O40) dont la réduction par l’action des polyphénols donne un mélange de complexes de sels de tungestène (W8O23) et de molybdène (Mo8O23) de couleur bleue. Cette solution absorbe à une longueur d’onde de 725 nm. Ainsi, le dosage des PPT se fait par comparaison de l’absorbance de la solution étudiée par rapport à celle obtenue par un étalon qui est l’acide gallique. D’abord une courbe d’étalonnage a été réalisée. Pour cela 500 mg d’acide gallique est dilué dans 10 ml d’éthanol puis le volume est ajusté à 100 ml avec de l’eau distillée (Solution stock). Des solutions diluées de concentrations connues en acide gallique ont été préparées (0, 50, 100, 150, 250 et 500 mg/L).Le dosage des PPT de chacun des échantillons se fait par comparaison de leur absorbance à celle de la courbe d’étalonnage. Les résultats obtenus sont exprimés en mg équivalent d’acide gallique par gramme de matière sèche (EAG/g MS) La courbe d’étalonnage de l’acide gallique représente l’absorbance en fonction de la concentration en acide gallique. Elle est obtenue avec un coefficient de corrélation de 99,97% (Figure 4).

1.4 1.2

f(x) = 0 x − 0.01 R² = 1

Absorbance

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

100

200

300

400

500

600

Concentration des composés phénoliques (mg/L)

Figure 1 : Courbe d’étalonnage pour le dosage des polyphénols totaux  Mesures Pour le dosage des PPT la méthode utilisée est celle décrite par Waterhouse (1999) avec quelques modifications. Ainsi, dans des tubes à essais on a placé 40 µl de chaque solution à étudier puis 3,16 ml d’eau distillée sont ajoutées, ensuite 200 µl de réactif de « Follin-Ciocalteu ». Le mélange est agité pendant 8 minutes puis on ajoute 600 µl de Na 2CO3 (20%). La solution finale est agitée une deuxième fois puis incubées pendant 40 minutes à température ambiante et à l’abri de la lumière. L’absorbance de chaque solution est directement mesurée au spectrophotomètre UV-visible à 725 nm. En ce qui concerne la courbe d’étalonnage, on va utiliser l’acide gallique et les résultats obtenus sont exprimés en mg équivalent d’acide gallique par gramme de matière sèche (EAG/g MS).

1.

Détermination des flavonoïdes totaux (FVT)  Méthode utilisée pour doser les FVT

Pour le dosage des flavonoïdes totaux, la méthode utilisée est celle développée par Zhishenetal. (1999) puis par Chen et Chen, (2011) avec quelques modifications. D’abord une courbe d’étalonnage a été réalisée en utilisant la catéchine. Des solutions de l’ordre 0, 20, 40, 60, 80, 100 mg/L ont été préparées. Les réactifs utilisés sont : le nitrite de sodium (NaNO2, 5%), le trichlorure d’aluminium (AlCl3, 10%) et l’hydroxyde de sodium (NaOH, 1N). La courbe d’étalonnage de l’absorbance en fonction de la concentration en catéchine a été réalisée. Elle présente un coefficient de corrélation de l’ordre de 95,05%. Les résultats obtenus sont exprimés en mg équivalent de la catéchine par gramme de matière sèche (EC/g MS) (Figure 5).

0.14 0.12

f(x) = 0 x + 0.01 R² = 0.95

Absorbance

0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0

20

40

60

80

100

120

Concentration des flavonoïdes (mg/L)

Figure 2 : Courbe d’étalonnage pour le dosage des flavonoïdes totaux

 Mesures

La méthode consiste à placer dans des tubes à essais et d’une manière successive, 250 µl de l’extrait étudié et 1 ml d’eau distillée. A un temps initial (0 minute) on ajoute 75 µl d’une solution de NaNO2 (5%), après 5 minutes 75 µl de AlCl3 (10%) sont ajoutés. 6 minutes après 500 µl de NaOH (1N) sont ajoutés ainsi que 2,5 ml d’eau distillée. L’absorbance de chaque mélange obtenu est directement mesurée au spectrophotomètre UVvisible à 510 nm. Les résultats obtenus sont exprimés en mg équivalent de la catéchine par gramme de matière sèche (EC/g MS).