Electrophorese Sur Gel D Agarose [PDF]

Zitiervorschau

Electrophorèse sur gel d’agarose Principe : L’électrophorèse est l’une des principales techniques utilisées en biochimie ou biologie moléculaire pour la séparation des protéines ou celle des acides nucléiques. Dans un milieu donné, la séparation des particules se fait en fonction de leur charge électrique (déplacement d’ions sous effet d’un champ électrique) et pour des charges identiques, en fonction de leur taille. Les molécules anioniques (-) migrent vers l'anode (+) et les molécules cationiques (+) se déplacent vers la cathode (-). La molécule d’ADN est un polynucléotide. Chaque nucléotide est composé de 3 types de résidus : le désoxyribose, la base azotée, le groupement phosphate H2PO4 qui peut s’ioniser en PO42-. En milieu basique, la molécule d’ADN se charge négativement (H2PO4 → 2 H+ + PO42-). Sur les acides nucléiques, les charges sont portées par les groupements phosphate du squelette. La molécule d’ADN placée dans le tampon (TAE 1X, pH 8) et dans le champ électrique créé dans la cuve à électrophorèse va migrer vers l’anode (+). On va donc effectuer les dépôts coté cathode (-). La migration de l’ADN sous l’effet du champ électrique va se réaliser dans l’épaisseur du gel poreux d’agarose dans lequel l’ADN a été déposé. Les pores de ce gel vont se comporter comme un tamis qui freine le déplacement des fragments d’ADN. La vitesse de migration des fragments sera déterminée par : - la résistance du gel à la migration des fragments proportionnelle à leur taille, - la charge des fragments proportionnelle à leur taille, - la concentration du gel en agarose Les fragments d’ADN vont donc se séparer en fonction de leur taille. Si le facteur le plus important est la résistance du gel à la migration de l’ADN, ce sont les plus petits fragments qui migreront le plus loin.

Préparation du gel agarose 2% L’agarose est un polymère à base d'agar purifié, il se présente sous forme de poudre. On détermine le poids d’agarose à utiliser, et le volume de tampon nécessaire pour la formation du gel, en fonction de la taille des fragments à séparer : Concentration d'agarose (% en M/V) 0,3 0,6 0,7 0,9 1,2 1,5 2

Gamme de tailles idéales (en kb) 5-60 1-20 0,8-10 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,1-2

√ Peser 1g d’agarose et ajouter 50 ml TAE 1X (Tris/Acétate 40mM - EDTA 1 mM - pH 8).

50 ml TAE 1X 1 g d’agarose

√ Dissoudre l’agarose au four à micro-ondes (le surveiller pour ne pas que ça déborde) √ Ajouter 5 µl de SYBR Safe DNA gel stain (Invitrogen) et mélanger Le SYBR Safe est un agent intercalant des acides nucléiques, moins mutagène que le bromure d’éthidium. Il émet de la fluorescence lorsqu’il est intercalé dans l’ADN double brin. Deux longueurs d’ondes d’excitation : 280 et 502 nm. Longueur d’onde d’émission : 530 nm. √ Monter les joints de coulage et les peignes et couler le gel :

3. Verser le gel d’agarose entre les 2 joints de coulage et laisser prendre le gel.

1. Placer les joints de coulage

Cuve électrophorèse 2. Placer les 2 peignes dans les supports prévus à cet effet. Le peigne permet de marquer l’empreinte des puits de dépôt de l’ADN.

4. Une fois le gel pris, retirer les éléments de montage et recouvrir le gel de TAE 1X 5. Déposer les échantillons et le marqueur de taille puis faire migrer