8.techniques Chromatographiques [PDF]

Zitiervorschau

3.Techniques analytiques 3.1. Techniques chromatographiques La chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les différences d'affinités des substances à analyser à l'égard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successive sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase 3.1.1. Nature des phases 3.1.1.1. Phase fixe La phase fixe peut être solide ou liquide. Les solides, silice ou alumines traitées, permettent la séparation des composants des mélanges grâce à leurs propriétés adsorbantes. Ils

peuvent

être

employés

comme

remplissage

d'une

colonne

(chromatographie par gravité et chromatographie à haute performance ou HPLC) ou étalés en couche mince sur une plaque de verre, d'aluminium ou sur une feuille de matière plastique (chromatographie sur couche mince ou CCM) La phase fixe peut aussi être constituée par un liquide imprégnant un support solide ou encore par une chaîne carbonée fixée sur un support (phase greffée). Ainsi en chromatographie sur papier, la phase fixe est formée par l'eau que les molécules de cellulose du papier adsorbent, alors qu'en chromatographie en phase gazeuse, elle est constituée d'un liquide peu volatil et thermiquement stable imprégnant un granulé poreux. 3.1.1.2. Phase mobile La phase mobile est:

- Soit un gaz (exemple chromatographie en phase gazeuse): la phase mobile est appelée gaz vecteur ou gaz porteur. - Soit un liquide (exemple chromatographie sur papier, couche mince ou colonne): la phase mobile est appelée éluant Manipulation Echantillons : les extraits des plantes . *Préparer la cuve à chromatographie : l’éluant le mieux adapté à la chromatographie des  colorants est un mélange ethanol ; methanol et eau.  Préparer ce mélange dans une fiole jaugée de 50 ml :  Verser environ 1 cm de hauteur d’éluant dans la cuve. Recouvrir la cuve de son couvercle. *Préparer la phase fixe :  On utilise de la plaque de silice : découper un rectangle pouvant entrer verticalement dans la cuve.  Faire un trait léger au crayon à 1 cm du bas.  Marquer très légèrement sur ce trait la place des dépôts pour que ceux-ci soient régulièrement espacés.  A l’aide d’une pipette pasteur, déposer un peu de chacun des échantillons (diamètre des tâches inférieur à 1 mm). * Elution :  Suspendre la plaque verticalement dans la cuve (il ne doit pas toucher le fond de la cuve)  Observer le phénomène qui se produit (c’est l’élution).  Lorsque le front du solvant est arrivé à environ 2 cm du bord supérieur, sortir la plaque, noter le front du solvant et entourer les taches. * Etude de la chromatographie.  Faire des schémas annotés de l'expérience réalisée.  Décrire ses observations.

 Qu’est devenue la tache? Justifier alors le titre « séparation d’espèces chimiques par chromatographie. »  Calculer le rapport frontal : La distance parcourue par l’extrait est la distance mesurée entre le dépôt et le centre de la tache obtenue après migration. 3.2. Chromatographie en phase liquide à haute performance HPLC La chromatographie en phase liquide à haute performance (l’abréviation anglaise HPLC - High Performance Liquid Chromatography est plus fréquemment utilisé) est une technique de séparation analytique basée sur l'hydrophobicité des molécules d'un composé ou d’un mélange de composés. L’échantillon à analyser est poussé par un éluant liquide (appelée aussi phase mobile) dans une colonne remplie d'une phase stationnaire composée de grains solides très fins. Le débit d'éluant est assuré par une pompe à haute pression. Dans la colonne, les divers composés de l’échantillon sont séparés l’un de l’autre en raison de leurs diverses affinités à l’égard des deux phases – stationnaire et mobile. A la sortie de la colonne les composés sont détectés à l’aide d’un détecteur (pouvant être UV, IR etc.). 3.3. Chromatographie en phase gazeuse Comme l’HPLC, la chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une technique permettant de séparer les composés d'un mélange. Elle s'applique principalement aux composés gazeux ou susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans décomposition. La différence principale par rapport à l’HPLC vient du fait que dans la CPG la phase mobile est gazeuse (Figure8).

Fig 8: Schéma simplifié de la chromatographie en phase gazeuse

Conclusion Les techniques d’extraction et séparation des biomolécules à partir des plantes, ce qui nous ouvre plusieurs perspectives. Ainsi, une perspective pourrait consister à travailler sur le choix des conditions opératoires de telle façon qu’on puisse isoler les produits cibles dans les extraits et dans les résidus des diverses étapes, ce qui donne la possibilité de « jouer » avec la place de l’étape dans le schéma technologique.