Curs - Variabilitatea Somaclonala [PDF]

Zitiervorschau

Curs: VARIABILITATEA SOMACLONALǍ Regenerarea plantelor din celule cultivate in vitro este un proces asexuat. Proces care implică, desigur, numai diviziuni celulare mitotice. Dat fiind faptul că toate celulele somatice ale unei plante donor de explante provin dintr-o celulă-ou (celulă-mamă) şi ar trebui să fie identice din punct de vedere genetic, procesul de regenerare ar trebui să fie sinonim cu o clonare. Altfel spus, plantele obţinute ar trebui să fie copii fidele ale originalului. Însă, pe măsură ce au fost elaborate sisteme de cultură in vitro şi regenerare, la tot mai multe specii economic importante, iar plantele astfel obţinute au fost studiate din punct de vedere morfologic, fiziologic, biochimic, citogenetic, molecular, s-a constatat existenţa unei ample variabilităţi. O variabilitate ce pare să nu fie specifică speciei sau unui anumit organ. Cultura de celule şi ţesuturi in vitro este deci un protocol mutagen, iar variabilitatea pe care o generează poate constitui o nouă sursă de caractere valoroase pentru ameliorare atât timp cât este stabilă şi se transmite la descendenţi. DEFINIŢIE. NOMENCLATURǍ. TIPURI. Variabilitatea manifestată de plantele regenerate din culturi in vitro a fost numită “variabilitate somaclonală” (Larkin şi Scowcroft, 1981). Variabilitatea generată in vitro este de două tipuri: genetică (mutaţională) şi epigenetică (de expresie). Atunci când nu se cunoaşte natura variabilităţii (variaţiei) – cu alte cuvinte, dacă este genetică sau epigenetică – se foloseşte termenul “variantă”. Termenii de “variaţie genetică” şi “mutantă” se utilizează pentru a desemna variaţia care se transmite sexuat conform legilor eredităţii sau se menţine la mai multe generaţii obţinute prin multiplicare vegetativă. Variaţia epigenetică – rezultat al modificării expresiei genelor – este de obicei, instabilă. METODE DE OBŢINERE ŞI EVALUARE A VARIABILITǍŢII SOMACLONALE Pentru a obţine plante mutante sau variante somaclonale, se recomandă parcurgerea următoarelor etape: -

inducerea şi apoi, menţinerea calusului sau a suspensiei celulare, prin subcultivări repetate; 1

-

regenerarea unui mare număr de plante din celulele cultivate, timp îndelungat, sub formă de calusuri sau suspensii;

-

studierea plantelor regenerate şi a descendenţei lor pentru identificarea caracterelor calitative şi cantitative variabile;

-

evaluarea stabilităţii caracterului selecţionat, în decursul mai multor generaţii;

-

multiplicarea şi/sau utilizarea în programele de ameliorare a mutantelor/variantelor stabile.

În funcţie de scopul urmărit, există două opţiuni: stabilitate sau variabilitate. Stabilitatea este dorită în micropropagare şi inginerie genetică, în timp ce variabilitatea este utilă în selecţie şi ameliorare. În ambele cazuri, trebuie evaluată populaţia plantelor regenerate la nivel fenotipic, biochimic, citogenetic şi molecular. De asemenea, ori de câte ori este posibilă, este oportună o analiză genetică a descendenţei pentru a se stabilii natura şi modul de transmitere ereditară a modificărilor apărute. De exemplu, la speciile ornamentale, plantele regenerate in vitro prezintă numeroase variaţii somaclonale ale unor caractere calitative, identificabile prin studiul morfologiei frunzelor, florilor etc. La crizanteme, Begonia şi Saintpaulia a fost raportată şi variabilitatea unor caractere cantitative: înălţimea plantei, numărul de flori etc. Evaluarea calitativă şi cantitativă a unor enzime, proteine sau metaboliţi secundari permite identificarea variantelor somaclonale apărute ca urmare a unor mutaţii genetice sau a modificărilor induse de cultura in vitro în modul de reglare a expresiei familiilor de multigene. De exemplu, rezultatele studiului comparativ al cantităţilor de alcaloizi tropanici şi al spectrelor alcaloidice la 19 gametoclone şi la planta de origine, aparţinănd speciei Datura innoxia, au evidenţiat o amplă variabilitate, mai ales din punct de vedere calitativ. Studiul numărului şi structurii cromozomilor permite corelarea modificărilor fenotipice cu schimbările induse in vitro la nivelul genomului. La lucernă, analiza cariotipului unei protoclone ce prezenta modificări fenotipice a evidenţiat existenţa unui număr aneuploid de cromozomi şi a două translocaţii. De exemplu, prin utilizarea sondelor specifice, a fost evidenţiat la somaclonele de cartof un polimorfism la nivelul ADN corespunzător genelor care codifică ARN ribozomal. Pe de altă parte, prin utilizarea markerilor moleculari a fost evidenţiat la somaclone de grâu, orez, tutun şi usturoi polimorfismul ADN nuclear şi citoplasmatic.

2

Atunci când variaţiile fenotipice ale somaclonelor nu pot fi asociate unor modificări ale structurii şi/sau numărului cromozomilor evidenţiate prin analize citogenetice, trebuie studiată descendenţa obţinută prin autofecundare. Într-un asemenea caz, pot fi întâlnite mai multe situaţii: - identitatea descendenţei cu planta de origine; - uniformitatea descendenţei în privinţa unui caracter fenotipic nou; - segregarea descendenţei conform rapoartelor mendeliene.

În primul caz, este vorba de variante. În al doilea – de o mutaţie homozigotă, de o expresie genică nouă sau de amplificarea ori deleţia regiunii de pe cromozom implicate în determinarea caracterului respectiv. În al treilea caz, este vorba de o mutaţie la nivelul unui locus implicat în determinarea unui caracter calitativ. Mutaţie care poate fi dominantă, codominantă sau recesivă. FACTORII CARE INFLUENŢEAZǍ SPECTRUL ŞI AMPLITUDINEA VARIABILITǍŢII SOMACLONALE Apariţia variabilităţii în populaţiile regeneranţilor este o regulă. Frecvenţa şi natura variaţiilor depind de o serie de factori, a căror implicare va fi ilustrată, în majoritatea cazurilor, prin rezultatele unor cercetări proprii. Modul de regenerare. La Datura innoxia, toate plantele regenerate prin embriogeneză somatică directă au fost diploide, în timp ce 70% dintre regeneranţii obţinuţi prin organogeneză indirectă au fost poliploizi. Stabilitatea regeneranţilor obţinuţi prin embriogeneză somatică a mai fost raportată şi la speciile Panicum, Pennisetum, Hordeum etc. 3

Natura explantului. În general, regeneranţii din explante organizate, cu meristeme preformate pe plantă, sunt stabili din punct de vedere genetic. Explantele lipsite de meristeme preformate, care dediferenţiază, generează însă o mare variabilitate, pentru că sunt formate din tipuri celulare diferenţiate structural şi funcţional. În consecinţă, atunci când sunt folosite ca explante pentru obţinerea calusului segmente de frunză sau rădăcină, celulele diferenţiate dediferenţiază, adică încep să se dividă. Condiţia nucleară in vivo se va reflecta astfel in vitro prin formarea unei populaţii de celule cu modificări la nivelul genomului. Modificări ce se vor regăsi şi la regeneranţi. Genotipul. Influenţează atât capacitatea de regenerare in vitro, cât şi amplitudinea variaţiei somaclonale. De exemplu, la somaclone de grâu provenite din două soiuri şi două linii dublu haploide au fost evidenţiate, prin studiul meiozei, diferenţe genotipice majore. Frecvenţa aberaţiilor meiotice a fost de 27,77% la plantele provenite din cele două soiuri şi de 72,72% la regeneranţii derivaţi din haploizii dublaţi. Aceste rezultate sugerează faptul că plantele care au mai parcurs un ciclu de cultură in vitro – ciclu destinat obţinerii haploizilor – sunt mai puţin stabile decât soiurile, prezentând cu o frecvenţă mare (42,65%) restructurări cromozomale, sugerate de anomaliile din meioză. Nivelul de ploidie. În general, frecvenţa variaţiei somaclonală este mai mare la speciile poliploide şi la cele propagate vegetativ (trestia de zahăr, cartoful, unele specii de plante ornamentale etc). Amplitudini remarcabile ale variaţiei somaclonale au fost înregistrate însă şi la unele specii care se reproduc sexuat, fie ele poliploide (lucerna) sau diploide (orezul). Durata culturii. Calusurile şi suspensiile celulare menţinute in vitro timp îndelungat sunt o excelentă sursă de variabilitate. Există însă riscul ca ele să-şi piardă complet potenţialul regenerativ. Dacă se urmăreşte stabilitatea clonală, se reduce deci la minim timpul menţinerii culturilor in vitro (în cazul micropropagării) sau se recurge la crioconservare (în cazul băncilor de germoplasmă). Întreprinderile care practică micropropagarea în scop comercial, culturile unor specii ornamentale (Begonia, Pelargonium) sunt reiniţiate periodic, deoarece creşterea numărului de cicluri de propagare este asociată cu frecvenţa mare a apariţiei variantelor fenotipice. Substanţele reglatoare ale creşterii. Efectele unui anumit tip de hormoni asupra frecvenţei variaţiei somaclonale nu sunt deplin elucidate. Creşterea amplitudinii variaţiei manifestate de regeneranţi odată cu sporirea concentraţiei hormonilor în mediile de cultură in vitro a fost demonstrată însă la căpşun, Begonia, Saintpaulia. Se presupune că hormonii nu au un efect mutagen direct, ci

4

acţionează indirect, stimulând creşterea neorganizată sau selecţionănd celulele cu un anumit nivel de ploidie. TIPURI DE MODIFICǍRI GENETICE ASOCIATE VARIABILITǍŢII SOMACLONALE În celula vegetală cultivată in vitro apar frecvent o serie de modificări la nivelul materialului genetic: poliploidii, aneuploidii, restructurări cromozomale, schimbări ale structurii şi expresiei genelor etc. La Nicotiana tabacum, din calus indus din măduvă de tulpină prelevată de la plante haploide şi diploide au fost obţinuţi dihaploizi şi, respectiv, tetraploizi cu o frecevenţă variabilă în funcţie de soi (tabelul următor ).

Soiul

Nr. de cromozomi ai plantei donor

Nr. plantelor analizate

Virginia Havana Havana

n n 2n

42 33 26

Rata plantelor (%) n 41 42 -

2n 52 50 60

4n 7 8 40

Cercetările noastre citogenetice efectuate în cursul procesului de calusare a explantelor constând din embrioni imaturi au evidenţiat apariţia celulelor poliploide in vitro la grâu. În momentul inoculării, toate mitozele din celulele explantelor au fost normale şi diploide. Variabilitatea cromozomală a apărut foarte repede în cultură (într-un interval de 1-2 zile), cu o rată diferită în funcţie de genotip, dar a scăzut treptat în perioada de calusare, fapt ce sugerează existenţa unui proces de eliminare a tipurilor celulare care suferă pierderi mari de informaţie. Analiza cariotipului în celulele mitotice ale plantelor regenerate şi studiul meiozei sunt modalităţi de evaluare a variaţiilor numerice şi structurale ale cromozomilor induse prin cultivarea in vitro. De exemplu, cu ocazia studiului meiozei la somaclone de Avena, s-a constatat că anomaliile cele mai frecvente au constat în rupturi şi pierderi de fragmente cromozomiale (McCoy et al., 1982). Peste 20% dintre plantele regenerate prezentau una sau mai multe translocaţii şi/sau deleţii. La grâu, analiza meiozei la somaclone a evidenţiat o frecvenţă neobişnuit de mare a translocaţiilor (Karp şi Maddock, 1984). 5

La plantele regenerate din culturi in vitro au fost observate şi rearanjamente de ADN cloroplastic (cp) şi ADN mitocondrial (mt). De asemenea, a fost semnalată apariţia unor plantule albinotice în cursul regenerării. Mutaţii specifice culturilor in vitro Din această categorie fac parte: mutantele homozigote recesive; modificarea expresiei genice în familiile de multigene; amplificarea sau reducerea numărului de copii ale unor secvenţe repetate ş.a. Regenerarea unor mutante homozigote recesive din explante heterozigote pentru un anumit caracter are la bază crossing-over-ul mitotic. La grâu a fost studiată variabilitatea indusă de cultivarea in vitro la nivelul locilor implicaţi în sinteza unor enzime şi proteine de rezervă. Au fost detectate subunităţi proteice noi, au apărut noi fracţii enzimatice sau a fost modificată mobilitatea electroforetică a acestora. A fost emisă ipoteza conform căreia rearanjamentele induse in vitro ar putea modifica expresia unei familii de multigene, determinând fie represia unor gene anterior exprimate, fie derepresia unor gene anterior represate. MECANISMELE VARIABILITǍŢII SOMACLONALE UTILIZAREA VARIAŢIEI SOMACLONALE ÎN AMELIORARE Unul dintre cele mai importante avantaje constă în faptul că variabilitatea somaclonală este o potenţială sursă suplimentară de caractere utile, preţioasă mai ales în cazul speciilor care, înmulţindu-se asexuat sau fiind apomictice, au o bază genetică limitată. La unele specii, frecvenţa mare a modificării unor caractere face din variabilitatea somaclonală o sursă de mutante utile. De exemplu, la grâu au fost regenerate somaclone cu proteine de rezervă modificate. Rata mare a dublării numărului de cromozomi permite, la unele specii, diploidizarea haploizilor sau obţinerea poliploizilor prin regenerarea plantelor in vitro (tabelul de mai jos).

Variaţia cromozomială Dublarea numărului de cromozomi pentru

Exemple de utilizare Tutun 6

producerea dihaploizilor Multiplicarea numărului de cromozomi pentru producerea poliploizilor Modificarea structurii cromozomilor pentru realizarea unor introgresii la hibrizi interspecifici

Variaţia numărului şi structurii cromozomilor pentru producerea amfiploizilor şi realizarea unor introgresii la hibrizii intergenerici

Cartof Tutun Brassica spp. Datura innoxia Lolium multiflorum x Lolium perenne Hordeum vulgare x Hordeum jubatum Hordeum vulgare x Hordeum bulbosum Oryza sativa x Oryza latifolia Triticum crassum x Hordeum vulgare Triticum aestivum x Secale cereale Elymus canadensis x Secale cereale Triticum tauschii x Secale cereale Hordeum vulgare x Triticum aestivum Lolium multiflorum x Festuca pratensis Triticum aestivum x Agropyron sp. Saccharum officinarum x Sclerotachya fuchsa

Multe schimbări se reflectă favorabil asupra unor caractere importante din punct de vedere agronomic, cum sunt: rezistenţa la boli sau la dăunători, productivitatea, conţinutul de proteine, toleranţa la stres. În sfârşit, pot să apară caractere noi sau combinaţii de caractere interesante la un singur regenerant, sau la scara întregii populaţii de plante regenerate in vitro.

7