Curs 3 Antibiotice PDF [PDF]

Zitiervorschau

3. BIOTEHNOLOGIA ANTIBIOTICELOR

3.1. Consideraţii generale Antibioticele formează o grupă importantă de medicamente cu toxicitate selectivă, inhibând, în concentraţii foarte mici, unele procese metabolice din celula microbiană sau producând adevărate ruperi, ale acesteia, fără a fi nocive pentru celulele gazdă. Se cunosc antibiotice produse de microorganisme şi plante superioare, dar importanţă terapeutică au căpătat numai unele din antibioticele produse de microorganisme. După descoperirea microbilor de către Pasteur, s-a observat că organismele inferioare se apără de alte microorganisme prin utilizarea intensivă a substanţelor nutritive, prin modificarea pH-ului, a tensiunii superficiale etc., sau elaborând anumite substanţe chimice nocive. Acest fenomen este numit antibioză, iar substanţele rezultate din metabolismul organismelor antagoniste poartă numele de antibiotice. Primul care a sugerat, în 1885, ideea că prin antagonism se produc substanţe chimice cu acţiune inhibantă asupra microorganismelor, a fost savantul român Victor Babeş. El a remarcat şi faptul că aceste substanţe pot fi folosite în terapeutică pentru distrugerea agenţilor patogeni, purtători ai bolilor infecţioase. Introducerea în practica medicală a antibioticelor cu un spectru larg de acţiune şi cu potenţă neîntâlnită constituie cea de a doua etapă extrem de importantă, după introducerea sulfamidelor (1935), în dezvoltarea chimioterapiei. De la descoperirea în 1928 de către Fleming a penicilinei, primul antibiotic utilizat în terapeutică, cercetările în acest domeniu au luat o extindere considerabilă, izolându-se pînă astăzi aproape 2500 substanţe active, din care 60 au căpătat aplicare practică. Antibioticele se aplică în medicina umană şi veterinară ca mijloace antiinfecţioase, bacteriene, în combaterea bolilor virale şi canceroase, precum şi în unele afecţiuni de natură neinfecţioasă. În afară de aceasta, antibioticele şi-au găsit utilizarea în zootehnie, agricultură şi pomicultură. Producţia mondială de antibiotice a început în 1943 cu fabricarea pe cale biochimică a penicilinei şi a continuat să se extindă, ajungînd astăzi la peste 12 000 t anual. În ţara noastră fabricarea industrială a antibioticelor a început în anul 1955, iar în prezent se fabrică o gamă destul de largă de antibiotice a căror producţie se cifrează la aproximativ 100 t anual. Astăzi, în cadrul industriei chimice, industria antibioticelor de biosinteză reprezintă o ramură productivă deosebit de importantă, iar dezvoltarea, modernizarea, automatizarea şi optimizarea tehnologiilor de fabricaţie asigură integral nevoile interne de antibiotice şi oferă pentru export aproape o treime din producţia realizată. La ridicarea productivităţii tehnologiilor de biosinteză din ţara noastră un aport substanţial au adus şi specialiştii de la întreprinderea de antibiotice Iaşi, a

46

căror contribuţii originale sunt concretizate în peste 35 de invenţii, dintre care o parte au fost brevetate şi în străinătate. 3.2. Definiţia şi sursele de antibiotice Prima definiţie a antibioticelor a fost dată în 1944 de Waksam, după care, orice substanţă chimică produsă de microorganisme şi care distruge sau inhibă înmulţirea bacteriilor şi a altor organisme, este denumită antibiotic. Această definiţie a fost considerabil modificată, deoarece cloramfenicolul izolat mai întâi (1947) din Streptomyces Venezuelae se obţine acum prin sinteză, iar penicilinele noi se obţin prin semisinteză. Astăzi, prin antibiotic se înţelege un compus chimic elaborat de un microorganism sau obţinut prin sinteză care, în doze foarte mici, inhibă dezvoltarea microorganismelor patogene. Din numărul total de antibiotice naturale şi substanţe asemănătoare descrise până în prezent, 98% sunt produse de plante şi microorganisme şi numai 2% sunt produse de tulpini animale ca protozoare, moluşte, insecte sau forme superioare ale organismelor animale. Dintre antibioticele adevărate 68% sunt produse de microorganisme aparţinând actinomicetaceelor, 12% de schizomicete şi 20% de diferite specii de eumicete. În clasa schizomicetelor 85% din antibiotice sunt produse de actinomicetale şi 15% de eurobacteriale. Din clasa ascomicetelor familia aspergilaceelor este cea mai importantă, ea producând 78% din cantitatea totală de antibiotice provenite din fungi. Cercetările asupra antibioticelor din fungi, au ocupat un loc important între anii 1945 - 1950 şi aceasta ca rezultat al valorii terapeutice ridicate a penicilinei, iar după 1950 s-au intensificat cercetările asupra antibioticelor produse de actinomicete. În ultimul timp numărul antibioticelor a crescut şi este de aşteptat o creştere şi mai mare în viitorul apropiat,datorită extinderii cercetărilor asupra ascomicetelor, bazidiomicetelor şi adelomicetelor, insuficient studiate până în prezent. 3.3. Clasificarea antibioticelor Numărul foarte mare de antibiotice cunoscute până în prezent a pus problema clasificării acestor produse. S-au propus mai multe criterii de clasificare funcţie de originea microorganismului producător, structura chimică a antibioticelor şi acţiunea antibacteriană. Cu toate că fiecare metodă folosită la clasificare este susceptibilă la anumite critici, clasificarea antibioticelor se va face funcţie de originea microorganismelor producătoare, structura chimică a antibioticelor, biogeneza şi acţiunea lor farmacologică. a) După originea microorganismului producător, antibioticele se clasifică în următoarele grupe: - antibiotice produse de bacterii: gramicidina, gramidina S, bacitracina, polimixinele etc.; - antibiotice produse de actinomicete: streptomicina, cloromicetina, tetraciclina, neomicina, kanamicina, nistatina, actinomicina etc.; - antibiotice produse din fungi: penicilina, grizeofulvina.

47

Clasificarea în funcţie de originea microorganismului producător nu este concludentă, deoarece este cunoscut faptul că acelaşi microorganism poate produce mai multe antibiotice diferite ca structură şi proprietăţi fiziologice. b) După constituţia chimică, antibioticele se clasifică în următoarele grupe: - antibiotice cu structură alifatică: alicina; - antibiotice cu structură aromatică: acidul gladiolic, cloramfenicolul (cloromicetina); - antibiotice cu structură chinonică: fumigatina, ftiocolul; - antibiotice cu cicluri de furan şi piran: acidul penicilic; - antibiotice heterociclice cu azot în moleculă: acidul aspergilic, acidul hidroaspergilic; - antibiotice heterociclice cu azot şi sulf în moleculă: penicilinele; - antibiotice cu structură polipeptidică: gramicidina; - antibiotice cu structură complexă: macrolidele; - antibiotice cu structură nedeterminată: viomicina. Clasificarea după structura chimică oferă posibilitatea formării unor grupe, care elucidează legătura dintre constituţia chimică şi proprietăţile antibacteriene. c) După biogeneză, antibioticele se clasifică în următoarele grupe: - antibiotice derivate din aminoacizi sau din unităţi asemănătoare: oxamicina, azaserina, cloramfenicolul, penicilinele, bacitracinele, actinomicinele; - antibiotice derivate parţial sau total din acetat: grizeofulvina, tetraciclinele, grupul macrolidelor, antibiotice polienice; - antibiotice derivate din glucide simple: streptomicina, kanamicina, neomicina; - antibiotice diverse: novobiocina, vancomicina. Clasificarea după geneză permite explicarea mai uşoară a mecanismului biochimic de formare a antibioticelor. d) După acţiunea farmacologică, antibioticele se clasifică în următoarele grupe: - antibiotice cu acţiune antibacteriană; - antibiotice cu acţiune antituberculoasă; - antibiotice cu acţiune antivirotică; - antibiotice cu acţiune anticanceroasă; - antibiotice cu acţiune antifungică; - antibiotice cu acţiune antiprotozoariană. Prin urmare, antibioticele nu exercită aceeaşi acţiune antimicrobiană asupra tuturor germenilor patogeni; ele au spectru antibacterian caracteristic, determinat de rezistenţa specifică a microorganismelor patogene. 3.4. Metode de determinare a activităţii antibioticelor Înainte de a prezenta metodele generale de determinare a activităţii antibioticelor, trebuie subliniat faptul că exprimarea conţinutului în antibiotic se face în unităţi gravimetrice sau unităţi internaţionale de activitate. Aceste sisteme de unităţi sunt folosite atât în tehnologia de fabricaţie cât şi în terapeutică.

48

Unitatea internaţională de activitate, stabilită după descoperirea penicilinei sodice, reprezintă cantitatea minimă de antibiotic pur, necesară pentru a înhiba o cultură de 18 ore de stafilococ auriu în 50 ml bulion. Pentru câteva antibiotice, mai uzuale, corespondenţa dintre unităţile internaţionale de activitate şi concentraţia gravimetrică, precum şi activităţile standard şi cele ale produselor comerciale sunt prezentate în tabelul 3.1. Tabelul 3.1. Corespondenţa dintre unităţile gravimetrice şi cele internaţionale ale cîtorva antibiotice Nr. crt . 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Denumire a antibiotic ului Penicilină G Penicilină V Streptomic ină Dihidrostre ptomicină Tetraciclin ă Clortebraci clină Oxitetracicl ină Eritromicin ă Polimixină

Greutatea corespunzăt oare pentru IUL, mg

Activitatea standard Ui/mg

5,98 ∙ 10-4

1670

5,90 ∙ 10-4

1965

12,80 ∙ 10-4

780

13,16 ∙ 10-4

760

10,0 ∙ 10-4

980

11,0 ∙ 10-4

990

11,1 ∙ 10-4

990

10,53 ∙ 10-4

950

1,27 ∙ 10-4

7874

În practică, producţia de antibiotice se exprimă în unităţi gravimetrice (kg sau t), iar în fazele tehnologice randamentele se exprimă în unităţi internaţionale (UI). Activitatea antibioticelor poate fi determinată cantitativ prin următoarele grupe de metode: a) metode microbiologice; b) metode chimice; c) metode fizico-chimice. Metodele microbiologice au avut importanţă prioritară în prima perioadă a dezvoltării industriei de biosinteză. Cauza principală a acestei priorităţi se explică prin faptul că la început numeroase antibiotice nu au putut fi obţinute decât sub formă de produse brute, iar analiza microbiologică era singura în măsură să furnizeze date asupra eficienţei terapeutice. Odată cu dezvoltarea industriei de antibiotice şi cu creşterea purităţii preparatelor antibiotice, au început să fie aplicate, tot mai mult, metodele chi-

49

mice şi fizico-chimice de analiză. Datorită simplităţii şi rapidităţii lor, aceste metode sunt preferate metodelor microbiologice în controlul operativ al procesului de fabricaţie. Metodele microbiologice sunt laborioase, durează mult, iar precizia lor este inferioară metodelor fizico-chimice (eroarea în cazul tetraciclinelor este de peste 10%). De asemenea, metodele microbiologice nu pot identifica un anumit antibiotic dintr-un amestec. Cu toate acestea, metodele microbiologice sunt de neînlocuit în caracterizarea activităţii antimicrobiene a unor antibiotice în care se găsesc produşi secundari (inactivi biologic), foarte apropiaţi din punct de vedere structural. Metodele chimice şi fizico-chimice sunt recomandate în prezent ca metode oficiale de identificare şi dozare a antibioticelor. Pentru identificarea antibioticelor se folosesc reacţii specifice, metode cromatografice şi metode spectroscopice în U.V. şi I.R., iar pentru dozarea activităţii se folosesc metode titrimetrice în U.V. şi I.R., electrochimice, cromatografice, polarimetrice şi colorimetrice. Descrierea acestor metode depăşeşte tematica lucrării, ea fiind prezentată detaliat, pentru fiecare antibiotic, în publicaţiile de specialitate. 3.5. Biotehnologia fabricării antibioticelor În acest paragraf se vor prezenta numai problemele tehnologice comune tuturor proceselor de obţinere a antibioticelor, iar în capitolele următoare se vor prezenta aspectele specifice fiecărei tehnologii printre care: mecanismul de biosinteză, parametrii fermentaţiei, influenţa diferiţilor factori asupra procesului de biosinteză şi separarea produselor biosintetizate. Tehnologiile de obţinere a produselor de biosinteză au comun procesele de pregătire şi sterilizare a mediului, sterilizarea aerului, fermentaţia şi filtrarea biomasei. Mediile de cultură se prepară, conform reţetelor de fabricaţie, în instalaţii special destinate acestui scop sau direct în fermentator. Dacă cantitatea de mediu este mică, ca în cazul mediului nutritiv din fermentatorul de inoculare, atunci prepararea şi sterilizarea lui pot fi realizate direct în fermentator. Sterilizarea fermentatorului, a răcitorului, a liniei de inoculare şi transvazarea biomasei, precum şi sterilizarea filtrelor de aer se face cu abur la 5 ata, timp de 1 oră, la 125 - 130°C. Sterilizarea lichidului antispumant din vasul 4 (fig. 3.1) se face prin încălzire cu abur, care circulă prin serpentina interioară, timp de 3 - 4 ore. Umplutura filtrelor (vată de sticlă) trebuie schimbată lunar, pentru a avea garanţia unei sterilizări perfecte a aerului tehnologic. De asemenea, umplutura filtrelor se schimbă ori de câte ori apar infecţii repetate. După schimbarea încărcăturii, filtrele se sterilizează cu abur direct la 1,5 - 2 at, timp de 1 - 2 ore, apoi se suflă aer steril până la îndepărtarea totală a umidităţii. În instalaţia de fermentaţie astfel sterilizată, se introduce inoculul după care este pus în funcţiune sistemul de agitare şi aerare. Fermentaţia se realizează în trei stadii (inoculator, intermediar, regim), iar transvazarea biomasei dintr-un fermentator în altul se face printr-un sistem steril.

50

Fig. 3.1. Schemă de principiu a instalaţiei de fermentaţie: 1 - inoculator; 2 - filtru de aer; 3 - fermentator intermediar; 4 - vas cu lichid antispumant; 5 - fermentator de regim; 6 - pompă Pentru marea majoritate a tehnologiilor de biosinteză temperatura, aeraţia, agitarea şi pH-ul au valori foarte apropiate. Astfel, temperatura optimă a proceselor de biosinteză este de 26 - 28°C şi se menţine prin răcire în manta şi serpentină. Deoarece procesele de fermentaţie sunt exoterme, problema grea care apare în proiectarea şi construcţia fermentatoarelor este asigurarea unui regim uniform de răcire în toată biomasa. Aeraţia este un alt parametru comun tuturor tehnologiilor de biosinteză aerobă şi care influenţează hotărâtor asupra randamentelor în faza de fermentaţie. Asigurarea unui regim optim de aeraţie pe toată durata procesului se realizează prin folosirea unui debit de aer de un litru pentru un litru mediu pe minut. Acest coeficient de aerare este aproximativ acelaşi atât în fermentatoarele de mare capacitate, cât şi în cele de inoculare şi este însoţit de un intens regim de agitare la un pH cuprins între 6 şi 6,5 pentru faza de creştere a masei celulare şi între 6,8 - 7,5 pentru faza de biosinteză a principiilor active. O problemă importantă în dirijarea procesului de biosinteză este reglarea spumării. Administrarea unei cantităţi mari de aer în lichidul de cultură, prezenţa în mediu a unor substanţe tensioactive, a particulelor coloidale şi a suspensiilor, măresc rezistenţa bulelor de aer şi prin aceasta favorizează producerea spumării. Adeseori procesul de formare a spumei este atât de intens încât stânjeneşte desfăşurarea normală a fermentaţiei, favorizând apariţia infecţiilor în lichidele de cultură. Pentru distrugerea spumei se folosesc substanţe chimice şi dispozitive mecanice. Dintre substanţele chimice se remarcă efectul antispumant deosebit al uleiului vegetal, al grăsimii de caşalot, al uleiului de silicon şi al polimerului oxipropilenic. În fermentaţie se foloseşte curent uleiul vegetal care oferă rezultate acceptabile.

51

Intensificarea procesului de distrugere a spumei se poate realiza prin utilizarea unor separatoare mecanice de spumă cu talere rotative (fig. 3.2).

Figura 3.2. Separator mecanic de spumă tip CHEMAP 1 – ştuţ ieşire aer; 2 – presetupă; 3 – dispozitiv de fixare; 4 – garnitură de etanşare; 5 – presetupă; 6 – canale de separare centrifugală a aerului din spumă (canale de spargere a spumei); 7 – intrarea spumei în separator; 8 – talere rotative de spargere a spumei; 9 – orificii de ieşire a aerului; 10 – axul separatorulu; 11 – fermentator; 12 – rotor cu diferenţial; 13 – motor electric. Acest dispozitiv constă dintr-o serie de talere conice de absorbţie a spumei, montate pe un rotor tubular acţionat mecanic. Efectul de distrugere a spumei este mărit de prezenţa unor şicane radiale în talere. Gazele sunt evacuate prin axul rotorului, iar soluţia apoasă returnată în zona de fermentaţie. Numărul mare de parametri şi limitele de variaţie foarte restrânse impun automatizarea completă a controlului şi reglării lor. Pentru realizarea procesului de fermentaţie discontinuu au fost propuse diferite tipuri constructive de fermentatoare, printre care fermentatorul cilindric vertical cu agitator turbină, serpentine de răcire şi barbotor de aer (figura 3.3.), utilizat curent în tehnologiile de biosinteză.

52

Figura 3.3. Schema fermentatorului discontinuu 1 – fermentator; 2 – manta de răcire; 3 – serpentine de răcire; 4 – barbator; 5 – agitator turbină; 6, 9 – ştuţ de admisie a agentului de răcire; 7, 8 – ştuţ de ieşire a agentului de răcire; 10 – ştuţ de admisie a aerului Pentru fermentaţiile în flux continuu se experimentează în fază de laborator sistemul de fermentatoare tubulare cu agitare prezentat în figura 3.4.

Figura 3.4. Schema fermentaţiei continue pe două fermentatoare tubulare cu agitare legate în serie: 1 – sterilizator; 2 – răcitor; 3, 4 – fermentator tubular cu agitare; 5, 6 – separator parţial de masă celulară; 7 – sistem de pompe pentru recircularea sterilăa masei celulare Fermentatorul tubular cu agitator orizontal (figura 3.5.) este considerat cel mai convenabil pentru procesele aerobe, deoarece oferă o eficacitate deosebită a aeraţiei. În procesul de fermentaţie discontinuă se recomandă ca înainte de transvazare din inoculator în intermediar şi de aici în regim, biomasa să se

53

menţină cîteva ore la parametrii procesului din faza următoare, pentru a evita unele stagnări în procesul de creştere sau biosinteză.

Figura 3.5. Schema fementatorului tubular cu agitare: A – rotorul agitatorului; B – fermentatorul tubular; C – spaţiu tubular pentru răcire; D – dispozitiv de etanşare şi ghidare a axului agitatorului; E – axul agitatorului; 1 – ştuţ intrare mediu; 2 – ştuţ intrare aer; 3 - ştuţ intrare lichid antispumant; 4 – ştuţ ieşire mediu fermentat; 6 - ştuţ de recirculare a mediului fermentat; 7 - ştuţ pentru aparate de măsură (T, pH etc.). Schema simplificată a unui proces de fermentaţie este exemplificată prin fluxul tehnologic de fabricaţie a penicilinei, G reprezentată în figura 3.6.

54

Figura 3.6. Schema instalaţiei de biosinteză şi separare a penicilinei G sare de potasiu: 1 – vas depozitare extract de plumb; 2 – pompă cu roţi dinţate; 3 – vas depozit extract de porumb; 4 – cadă pentru cântărire; 5 – vas pregătire mediu pentru inoculator; 6 – vas soluţie NaOH; 7 – vas de măsură NaOH; 8 – vas de pregătire a mediului pentru intermediar; 9 – vas pentru zahăr; 10 – vas pregătire mediu pentru regim; 11 – pompă centrifugă; 12a – coloană de sterilizare a mediului pentru fermentatorul de regim; 12b – coloană de sterilizare a mediului pentru fermentator intermediar; 13, 13a - menţinător; 14, 14a – răcitor; 15 – inoculator; 16a, 16b, 16c – filtru pentru aer; 17 – fermentator intermediar; 18 – fermentator de regim; 19 – vas cu lichid antispumant; 20 – pompă centrifugă; 21 – filtru tambur cu vid; 22 – vas pentru lichid filtrant; 23 – pompă centrifugă; 24 – răcitor tubular; 25 – vas colector soluţie nativă; 26 – pompă; 27 – vas colector soluţie nativă; 28 – vas reţinător de picături; 29 – vas tampon de vid; 30 – pompă de vid; 31 – pompă; 32 – vas măsură H2SO4; 33 – vas acetat de butil; 34 – vas măsură cetazol; 35a, 35b, 35c – extractor Podbielniak; 36 – vas neutralizare ape; 37 – vas acetat de butil; 38 – vas de soluţie fosfat-carbonat; 39 – vas cu soluţie de fosfat-monopotasic; 40 – vas de măsură H2SO4; 41 – vas acetat de butil; 42 – vas acetat de butil concentrat; 43 – vas îngheţare decolorare; 44 – filtru; 45 – vas colector concentrat; 46 – druk filtru; 47 – filtu Seitz; 48 – vas de precipitare; 49 – vas soluţie alcoolică de acetat de potasiu; 50 – filtru nuce; 51 – vas culegere soluţie mumă; 52 – vas măsură butanol; 53 – vas măsură cloroform; 54 – vas de spălare penicilină; 55 – filtru nuce; 56 – vas culegere butanol; 57 – vas culegere cloroform; 58 – uscător cu pat fluidizat.

55

3.6. Biotehnologia de obţinere a penicilinelor G şi V Penicilinele constituie un grup de antibiotice, obţinute prin biosinteză sau semisinteză, caracterizate printr-un larg spectru bacteriostatic şi bactericid în faza de multiplicare logaritmică a germenilor patogeni. Acţiunea penicilinelor este complexă; ele împiedică încorporarea unor factori în membrana bacteriană, ducând la multiple tulburări de nutriţie şi metabolism bacterian. Deoarece majoritatea penicilinelor, mai ales cele naturale, sunt inactivate de penicilinază şi acilază, se impune găsirea unor peniciline cu rezistenţă şi acţiune ridicată. Penicilinele „ideale" ar trebui să posede un larg spectru antibacterian, stabilitate în mediu acid, rezistenţă la penicilinază, stabilitate în soluţie, absorbţie rapidă şi să nu producă hipersensibilitate la administrare. Cu toate că nu se cunosc, deocamdată, peniciline care să satisfacă toate exigenţele, ele deţin totuşi supremaţia în practica medicală, datorită atât proprietăţilor terapeutice însoţite de toxicitate redusă, cât şi apariţiei penicilinelor de semisinteză, despre care se poate spune că au deschis epoca de aur a penicilinelor. 3.6.1. Peniciline de biosinteză Penicilinele de biosinteză sunt substanţe chimice produse de diferite specii de microorganisme, din clasa Penicillium şi Aspergillus printre care: P. crysogenum, P. notatum, P. crustosum, A. niger, A. giganteus, A. flavus etc. Aceste substanţe sunt neomogene din punct de vedere chimic, fiind formate din câteva peniciline care au comun sistemul biciclic tiazolidin- β-lactamic şi care diferă între ele prin structura catenei laterale şi activitate anti-bacteriană. Penicilinele sunt acizi monobazici puternici (pK = 2,7—2,76) cu următoarea structură generală: S 1 CH3 2 C R CO NH CH CH 5 6 CH3 O

7

C

N

4

3

CH

COOH

Denumirea tipurilor de peniciline separate din lichidul de cultură, activitate antibacteriană şi structura catenei laterale sunt prezentate în tabelul 3.2. Tabelul 3.2. Denumirea, structura şi activitatea penicilinelor naturale Nr. crt .

Denumirea penicilinei

1.

Penicilina F

2.

Penicilina dihidro F (Acid

Structura radicalului CH3-CH2-CH = CHCH2 CH3-CH2-CH-CH2CH2 -

56

Denumirea radicalului

Activitatea UI/mg sare Na

2-pentenil

1500

n-amil

1670

3. 4. 5. 6.

gigantic) Penicilina G Penicilina X Penicilina K Penicilina V

7.

Penicilina O

C6H5 - CH2 HO-C6H4 -CH2 CH3-(CH2)5-CH2C6H5-O-CH2CH2 = CH-CH2-SCH2-

benzil p-hidroxibenzil n - heptil fenoximetil

1667 900 2 300 1630

alilmercaptometil

-

În terapeutică se folosesc numai penicilinele G şi V sub formă de săruri de sodiu, potasiu, calciu, trietilamină şi novocaină (procain-peniciline). Fenoximetilpenicilina (penicilina V) se utilizează şi sub formă de acid liber. 3.6.2. Proprietăţile fizice ale penicilinelor G şi V Benzilpenicilina (penicilina G) este o substanţă albă, cristalină care se topeşte la 80°C şi se descompune la 87oC, solubilă în apă şi solvenţi organici. Având 3 atomi de carbon asimetrici (3,5,6) benzilpenicilina este optic activă cu [α ] D 23 = + 241°. Principalele proprietăţi fizice ale sărurilor benzilpenicilinei sunt prezentate în tabelul 3.3. Tabelul 3.3. Proprietăţile fizice ale sărurilor benzilpenicilinei Metalul sau amina din sare Sodiu Potasiu

Temperatur a de topire, °C 215 (cu desc.) 214-217 (cu desc.)

[α] D

Condiţiile determinării Temperatura, Solven Concentraţii, °C t %

+301

24,8

apă

2,0

+ 285

22

apă

0,784

Trietilamină

145 – 147 (cu desc.)

+ 214

21,5

Novocaină

129 – 130 (cu desc.)

+ 173

25

N. etilpiperidin ă

167 – 168 (cu desc.)

+ 238

25

tampon fosfat 1% acetonă 50% apă

0,22 0,1 —

Dintre sărurile prezentate cele mai importante sunt sărurile de sodiu şi potasiu caracterizate printr-o bună solubilitate în apă, metanol şi etanol; mai greu solubile în izo-propanol, butanol normal şi terţiar, cetone, dioxan şi piridină. Solubilitatea sării de sodiu şi potasiu în solvenţi organici creşte foarte mult atunci când solventul conţine mici cantităţi de apă. Dependenţa dintre solubilitatea sării de sodiu sau potasiu şi cantitatea de apă din solvent este utilizată în recristalizare; sarea solvită în solvent cu 10% apă este recristalizată

57

prin adăugare de solvent anhidru. Solubilitatea sării de sodiu în solvenţi conţinând diferite cantităţi de apă este redată în tabelul 3.4. Tabelul 3.4. Solubilitatea benzilpeniciline sodice în amestec apă — solvent Solvent Acetonă Acetonă Acetonă Acetonă Metiletilcetonă Dioxan Alcool n butilic

Conţinutul de Temperatura, apă în o C solvent % 0 0 0,5 0 1,0 0 2,0 0 0 0 0 14 0

0

Solubilitatea, mg la 100 ml solvent 6,0 15,6 31,0 100,0 2,4 15.0 81,0

Este interesant de remarcat că între +25 şi -78°C solubilitatea în acetonă a sărurilor benzilpenicilinei cu sodiu, potasiu şi amoniu creşte o dată cu scăderea temperaturii. Fenoximetilpenicilina (penicilina V), spre deosebire de benzilpenicilina, fiind stabilă în mediu acid se poate obţine fie sub formă de acid, fie sub formă de sare. Sub formă acidă, fenoximetilpenicilina este o substanţă incoloră, crista20 lizată în diverse forme, având p.t. 118 - 120oC şi [α ] D = + 193°. Principalele proprietăţi fizice ale sărurilor fenoximetilpenicilinei sunt prezentate în tabelul 3.5.

Tabelul 3.5. Principalele proprietăţi fizice ale sărurilor fenoximetilpenicilinei Metalul sau amina din sare Sodiu Potasiu Amoniu Novocaină

Temperatura de topire (cu desc.), °C 220 – 228 256 – 260 115 – 125 70 - 72

[α ] D

20

+ 222 + 223 + 236 + 140

Condiţiile determinării Temperatura, Solven Concentraţii, °C t % 20 apă 1 20 apă 1 20 apă 1 20 apă 1

3.6.3. Structura penicilinelor Din studiile întreprinse cu metode chimice şi fizico-chimice, îndeosebi cu ajutorul razelor X, s-a demonstrat că penicilinele au comun un sistem biciclic tiazolidin- β-lactamic, care rezultă prin înlănţuirea biogenetică a 2 aminoacizi şi anume l-cisteină şi d – valină. Structura moleculară a penicilinelor este:

58

1 - Cisteinã d - Valinã

S 6

R

C

NH H

C

O

C

7

C

N

O

H 4

2C

3

C

CH3 CH3 COOH

H

Ciclu lactamic Grupa catenei laterale

1

5

Ciclu tiazolidinic

Nucleu de penicilinã (acid 6 - amino - penicilanic)

Structura bicliclică tiazolidin- β-lactamică este mai sensibilă decât structura β - lactamică simplă la acţiunea agenţilor nucleofili, electrofili şi oxidanţi. Toate penicilinele sunt extrem de sensibile la atacul nucleofil al ionilor de hidroxil, amine, etc. (schema 1). Produsul iniţial rezultat prin hidroliza penicilinelor este acidul penicilic (I) biologic inactiv. Acesta este stabil în soluţii neutre numai sub formă de săruri sau esteri; la acidulare pierde uşor o moleculă de CO2 trecând în acidul peniloic (II) corespunzător, iar în anumite condiţii de reacţie acidul penicicloic poate trece şi în acid penamaldic (III). Penicilina reacţionează nucleofil cu hidroxilamină, alchil amine, alcooli, hidraţi de carbon, glicooli, formând acizi hidroxamici (IV), alchilamide (V) şi esteri (VI). De asemenea, ionii metalici şi β-lactamazele catalizează reacţia de hidroliză a penicilinelor la acizi peniciloici. Produşii finali de degradare hidroxilică a penicilinelor sunt: peniloaldehidele (VII), CO2 şi penicilamina (VIII).

59

S

S R C NH O

CH CH

C(CH3)2

C

CH COOH

O

NH OH I

OH

R C NH O

CH CH

C(CH3)2

C

CH COOH

N

O

C(CH3)2

R C NH

II

R C NH

CH

C(CH3)2

C O

NH OH

NH

CH CH

C(CH3)2

C

CH COOH

CH COOH III

S CH2

CH

R CO

O

VII

O +

NH

HON

CO2

O IV

+

CH3 C CH3

C

O

CH COOH

NH

OH

- OH

S

2

SH

R C NH CH2 CH O

NH

- CO2

CH COOH

SH NH2

VIII

S R C NH CH CH C

O 2+

Cu

S R C NH CH CH C

O O

N

C(CH3)2

b et

a

I S

R C NH CH CH

R'OH

CH COOH

C

O R' -N

CH COOH

NH OH

O

H 2O az ã am t c -l a

C(CH3)2

CH COOH

O

OR''

H

NH

C(CH3)2

VI

2

S R C NH CH CH C

O

NR' H

NH O

C(CH3)2 CH COONH3+R'

V

Schema I Penicilinele sunt sensibile şi la atacul electrofil atât la azotul β-lactamic cât şi la atomul de sulf (schema 2). În mediu puternic acid penicilinele

60

izomerizează la acid penilic (IX) printr-un mecanism implicând structura de tranziţie oxazolonică (X), iar în mediu slab acid, prin aceeaşi structură de tranziţie, se transformă în acid penicilinic (XI) care izomerizează rapid în acid peniciloic sau penilic. Ionii metalici atacă atomul de sulf al ciclului tiazolidinic, transformând acidul penilic în penicilamină. S R C NH CH CH N

C

O

CH

CH N

CH3

R C H

C

N

CH3 CH COOH H+

CH

CH3 CH3

C

HgCl2

R C

S

N

S

HC CH NH

C

O

SH NH2 VIII

C CH

SH

H+ N

C

R C

C O

CH

C

H+

CH3 OH- ' R C CH3

COOH X

O

IX

CH COOH

CH3

COOH

O COOH

CH3

C

CH3

S C

NH CH CH C

O O

NH

CH

OH

CH3 CH3

COOH I

HO-

CH3 NH CH COOH O XI

Schema 2 Faptul că penicilamina se formează la hidroliza oricărui tip de penicilină demonstrează că aceasta reprezintă un element structural comun tuturor penicilinelor. Al doilea component al degradării avansate a penicilinelor este peniloaldehida care cuprinde catena laterală şi este specifică tipului de penicilină supusă hidrolizei. Multe din proprietăţile fizice, chimice şi biologice sunt influenţate de structura catenei laterale. Dacă în catena laterală a penicilinelor se introduce o grupare electronatrăgătoare se constată o creştere a stabilităţii în mediu acid. S-au obţinut corelaţii liniare între stabilitatea în mediu acid a penicilinelor şi aciditatea catenei laterale. Astfel, prin înlocuirea unui hidrogen din poziţia α a benzil-penicilinei sau a unui hidrogen din ciclul benzenic al meticilinei şi fenil-penicilinei cu o grupare aminică sau cu un halogen, creşte foarte mult stabilitatea în mediu acid. Confirmarea structurii penicilinelor s-a făcut şi prin sinteza acestora. Greutatea mare care apare în sinteza penicilinelor este închiderea ciclului β lactamic. O serie de încercări se bazează pe condensarea D-penicilaminei cu 4alcoximetilen-5-oxazolonă, dar randamentul reacţiei nu depăşeşte 0,1%. O sinteză mai practică a fost realizată de Sheenan şi colab. în cazul penicilinei V şi a altor peniciline. Sinteza se bazează pe o metodă nouă, foarte simplă, de obţinere a legăturii amidice prin tratarea celor două componente care conţin grupele funcţionale (carboxil şi amino), cu N, N'-dicilo-hexil-carbodiimidă.

61

Folosind diciclohexil-carbodiimida la ciclizarea acidului fenoximetilpeniciloic (XV) s-a obţinut, prin închiderea inelului β-lactamic fenoximetilpenicilina (XVI). Acidul fenoximetilpeniciloic a fost obţinut din esterul terţbutilic al acidului ftalimido-monoaldehidic (XII) şi clorhidratul penicilaminei: SH C6H4

CO CO

N

CH2

COOR

HCOOR

CO

C6H4

NaOR

N

CO

C6H4

S

CO

N

CH

CH

COOR NH XIII C6H5OCH2COCl HCl

C

CH3

2)

NH2

O

CH2

CO

CH

HOOC

CH

CH

C

HCl

CH3 CH COOH

HN

H2N

COOR NH

CH3

CH3 CH COOH VIII

H2N S

1) H2N

S C 6H5

CH O +

COOR

XII CO

CH

C

CH

CH3 CH3 COOH

CH3

CH

C

NH

CH3 CH COOH

C6H11N C N

C6H11

Penicilinã

XVI

XV

Prin separarea sterioizomerilor derivatului acidului peniciloic (XV) înainte de ciclizare s-a ajuns la penicilină V cu randament de 10 - 12%. La acelaşi rezultat s-a ajuns şi prin ciclizarea acidului peniciloic obţinut prin hidroliza penicilinei V naturale. În cursul studiilor privind desinteza şi sinteza penicilinelor s-a stabilit că inelul β-lactamic este foarte important pentru activitate antibacteriană, iar înlocuirea lui cu un ciclu de 5 termeni duce la scăderea pronunţată a activităţii biologice. Restul acil, din catena laterală, poate avea diverse structuri fără a influenţa sensibil activitatea produsului. Identificarea şi dozarea penicilinelor se poate face prin cromatografiere, analize spectrale în U.V., I.R. şi RMN, analize titrimetrice şi analize colorimetrice. Penicilina G, ca şi alte peniciline monoaromatice, prezintă în spectrele U.V. o absorbţie slabă în apă la 264; 257,5; 252 şi 257 nm. Aceste benzi sunt benzi tipice pentru absorbţia grupei benzilice. Prezenţa unor produşi de degradare acidă a penicilinelor este indicată de apariţia unui maxim la 320 nm, a cărui intensitate este proporţională cu gradul de descompunere. Datorită ciclului β-lactamic condensat, penicilinele prezintă în spectrul I.R. o bandă de absorbţie intensă la 5,62 µ , atribuită vibraţiei grupei C=O. Această bandă dispare dacă ciclul β-lactamic este scindat prin hidroliza enzimatică sau chimică şi apare o bandă nouă la 5,75 µ caracteristică absorbţiei peniciloil esterului sau amidei. Restul benzilor de absorbţie caracterizează celelalte grupări din peniciline: COOH (5,69 µ ), vibraţia de alungire a legăturii NH (3 - 3,5 µ ), amidă I (6 - 6,1 µ ) şi amidă II (6,5 - 6,7 µ ).

62

O altă tehnică utilă pentru caracterizarea medicamentelor β-lactamice este spectroscopia RMN. În mod normal spectrele RMN ale sărurilor solubile de penicilină pot fi determinate în D2O. Penicilinele prezintă, de obicei, un semnal pentru 2 protoni la τ - 4,42 ppm ai atomilor de hidrogen β-lactamici, un semnal net monoprotonic la τ - 5,71 ppm pentru protonul apropiat grupării carboxil şi semnale nete de 2 sau 3 protoni la τ = 8,38 ppm şi τ = 8,47 ppm pentru gruparea dimetilică. Pentru dozarea cantitativă a penicilinelor se poate utiliza cu succes metoda iodometrică sau colorimetrică descrise detaliat în literatură. 3.6.4. Cinetica inactivării penicilinelor Instabilitatea penicilinei în soluţie apoasă a fost pusă în evidenţă încă din perioada descoperirii sale. Studiile referitoare la inactivarea penicilinelor naturale în medii apoase au demonstrat că această reacţie este ireversibilă de ordinul întâi. Brodersen, studiind procesul de inactivare a penicilinei G în mediu acid, arată că viteza de inactivare depinde de temperatură şi de concentraţia ionilor de hidrogen. Formele moleculare şi ionizate ale penicilinei interacţionează cu ionii de hidrogen cu viteze diferite. La un pH cuprins între 1 şi 10 şi o tărie ionică de 0,5 la 30°C viteza de degradare a penicilinei decurge după o cinetică de ordin pseudo întâi, iar degradarea minimă se petrece la un pH de 6,5. Studiul cinetic al degradării penicilinelor naturale la pH cuprins între 1 şi 14 şi o tărie ionică de 0,5 la 35oC a scos în evidenţă faptul că timpul de înjumătăţire a penicilinei potasice la pH de 1,5 şi 35oC este de o oră, în timp ce pentru penicilina G acid liber este de 4 min, iar energia de activare este 17,6 kcal/mol. Viteza mare de degradare a penicilinei G acid liber este determinată de instabilitatea ciclului lactamic în soluţi apoase acidulate. Rezultatele cercetărilor privind timpul de înjumătăţire a penicilinei potasice în funcţie de temparatură şi pH sunt prezentate în tabelul 3.6. Tabelul 3.6. Timpul de înjumătăţire (în h) a benzilpenicilinei potasice în funcţie de temperatură şi pH pH 2,0 3,0 4,0 5,0 5,5 6,0 6,5

0 4,25 24 197 2000 -

Temperatura, oC 10 24 1,30 0,31 7,6 1,70 52 12 341 92 336 281

37 62 103 94

pH 7,0 7,5 8,0 9,0 10,0 11,0

0 -

Temperatura, oC 10 24 37 218 84 178 60 125 27,6 31,2 9,3 1,7 -

Plecând de la faptul că extracţia penicilinelor se face numai în mediu acid, Kodratieva şi Bruns au determinat viteza de inactivare a benzilpenicilinei şi fenoximetilpenicilinei în funcţie de temperatură, la un pH cuprins între 2 şi 3, rezultatele obţinute sunt redate în tabelele 3.7. şi 3.8.

63

Tabelul 3.7. Constantele de viteză la incativarea penicilinei G pH = 2,0 C k ∙ 103 15,0 11,78 20,00 20,4 30,00 52,5 o

pH = 2,5 C k ∙ 103 15,0 5,76 24,1 14,7 35,1 40,1 o

pH = 3,0 C k ∙ 103 24 6,01 35,1 20,8 o

Tabelul 3.8. Constantele de viteză la incativarea penicilinei V pH = 2,0 C k ∙ 103 35,0 3,26 45,0 8,32 55,0 18,8 o

pH = 2,5 C k ∙ 103 35,1 1,92 45,0 4,58 55,0 10,54 o

pH = 3,0 C k ∙ 103 35,6 1,05 45,2 2,70 55,5 7,01 o

Rozenberg, studiind viteza de incativare a penicilinei G şi V în mediu bazic (pH cuprins între 9 şi 10), arată că viteza de incativare a penicilinei V este în medie de 2,2 ori mai mare decât viteza de inactivare a penicilinei G. În toate cazurile viteza de degradare a penicilinei a fost determiantă prin dozarea iodometrică şi microbiologică. Pentru a evita erorile de metodă este necesar să se aleagă un tampon pe bază de acid acetic, acetat, citrat bazic, acid boric, fosfat primar sau glicocol, care nu au aproape nici un efect catalitic. 3.6.5. Mecanismul biosintezei penicilinelor Deşi mecanismul biosintezei penicilinelor nu este pe deplin elucidat, totuşi ţinând seama de faptul că în molecula lor se găsesc 3 componente de bază: d-valină, l-cisteină şi un acid substituit, precum şi identificarea în miceliul de Penicillium crysogenum a unei tripeptide ( δ -amino-adipil-cisteinil-valină), se pot concepe etapele care intervin în biosinteză. Prima etapă constă în formarea, din glucoză, a l-cisteinei şi d-valinei, iar din acestea a δ -amino-adipil-cisteinil-valinei, conform schemei I. Pentru elucidarea mecanismului celei de-a doua etape, în care se formează sistemul biciclic al penicilinelor, sunt propuse două ipoteze: 1) plecând de la o tripeptidă (schema II); 2) plecând de la l-cisteină şi l-valină (schema III). După schema II, sinteza nucleului de bază al penicilinei, acidul 6-aminopenicilanic ar rezulta din acidul α -amino-adipic, l-cisteină şi l-valină trecând prin faza tripeptidei δ -amino-adipil-cisteinil-valină. În ultima etapă se formează penicilina G (prin schimb de grupe acil) sau acid 6-aminopenicilanic prin pierderea grupei acil.

64

Această ipoteză nu este, deocamdată, confirmată deoarece toate încercările de a schimba în tripeptidă acidul amino-adipic cu acidul fenilacetic, necesar formării penicilinei G, au eşuat. Penicilinele s-ar putea forma şi direct din l-cisteină şi l-valină printr-o serie de faze intermediare, despre care nu se ştie dacă se formează în stare liberă, aşa cum sunt redate în schema III. În esenţă, se disting în această schemă următoarele faze în formarea penicilinei: condensarea aminoacizilor, dehidrogenerarea peptidei, hidrogenarea şi ciclizarea intermediarului la acid 6amino-penicilanic şi introducerea catenei laterale. Formarea acidului 6-amino-penicilanic în lipsa precursorului, precum şi obţinerea diferitelor peniciline în funcţie de precursorul folosit, demonstrează că procesul de biosinteză poate decurge şi după această schemă.

65

Glucozã: Piruvat:

C6H12O6 CH3 CO

COOR COOR

CH2 COOR

Succinat:

Acetolactat:

CH2 COOR Glioxilat:

O

Glicinã:

NH2

Serinã:

OH

CH COOR

Dihidroxi(CH3)2 C CH izovalerianat:

l-cisteinã: SH

CH2

CH(NH2) COOH

alfa-hidroxi- (CH3)2 CH CH COOR valerianat: OH CH(NH2) COOH L-valinã: (CH3)2 CH CH

(CH2)3 COOH

HOCO CH

NH2

NH2 Acid alfa-amino adipic (Ad) CH2 SH Ad

NH CH COOH

CH2 SH Ad

COOR

OH OH

CH2 COOR

HO CH2

CH3 CO C CH3

NH CH CO

CH(CH3)2 NH CH COOH

gama-amino-adipil-cisteinil-valinã

Schema I

66

COOR

CH(CH3)2

CH2 SH Ad NH CH CO

NH CH COOH CH S CH(CH3)2

Ad CO NH CH

CO N CH COOH SH

H

CH

CH(CH3)2

Ad CO NH CH

N CH COOH C O SH CH

Ad CO NH CH

C(CH3)2 N C COOH

C O

S

CH Ad CO NH CH

N C

e bd l m i ci h Sc pe a S gru

CH C6H5 CH2CO NH

CH

N

C

O

CH3 CH COOH

Pie rde re aci l

C(CH3)2 CH COOH

CH3

S CH

H2N

N

CH

C(CH3)2 CH

CO

CO

Acid 6-amino-penicilanic

Penicilina G

Schema II

67

COOH

CH(CH3)2

SH H2N

CH CH2

+

H2N

CH COOH l-valinã

COOH 1-cisteinã

SH H2N

CH CH CO

N

CH(CH3)2 CH COOH

SH H2N

CH CH CO

N

C(CH3)2 CH COOH S

H2N

CH CH CO

C(CH3)2 CH COOH

N

Acid 6-amino-penicilinic (6-AP)

CH2 COOH

C6 H 5

S C6H5

CH2

CO

NH

CH CH CO

N

C(CH3)2 CH COOH

Penicilina G

Schema III 3.6.6. Tehnologia obţinerii penicilinelor de biosinteză Penicilinele de biosinteză se obţin printr-o tehnologie comună care cuprinde următoarele faze: 1) pregătirea mediilor de cultură şi sterilizarea lor; 2) fermentaţia biochimică; 3) filtrarea soluţiilor native; 4) separarea şi purificarea penicilinelor. 3.6.6.1. Pregătirea mediilor Această fază constă în dizolvarea în apă a componenţilor mediului conform reţetei pentru fiecare fază a procesului de fermentaţie. Compoziţia calitativă a mediilor de cultură pe faze este prezentată în tabelul 6.9, iar compoziţia cantitativă se încadrează în limitele valorilor din tabel.

68

Valorile exacte pentru compoziţia mediilor de cultură depinde de natura suşei producătoare şi constituie secretul de fabricaţie al fiecărei uzine producătoare de peniciline. Tabelul 6.9. Compoziţia mediului de cultură pe faze de fermentaţie Componenţii mediului de cultură Extract de porumb Lactoză Glucoză Făină de soia

Inoculator Intermediar Regim 2

2-3

0,5-0,6 3-3,5 -

3-3,5 1,2 -

CaCO3

0,7-0,8

0,7

KH2PO4

0,1

0,2-0,3

-

0,12 0,06 0,2

2,52,8 6-7 2-3 0,3 1,21,3 0,50,6 0,3 0,06 0,002 0,002 0,4

-

0,016

0,8

NH4NO3 Na2SO4 ZnSO4 MnSO4 Fenilacetamidă Tiosulfat de sodiu Apă până la 100 %

Pregătirea şi sterilizarea mediilor de cultură pentru inoculator şi intermediar se poate realiza direct în fermentatoarele respective, sau în aparate destinate acestui scop. Pregătirea mediului de cultură pentru fermentatorul de regim are loc într-un aparat prevăzut cu agitator, conductă pentru abur viu necesar încălzirii şi serpentină de răcire. În acest aparat se introduce apa conform reţetei, se încălzeşte la 60 - 70°C, se adaugă extractul de porumb şi se fierbe timp de 0,5 – 1 h. După aceasta, soluţia se răceşte la 50-60°C şi se adaugă restul componenţilor mediului în următoarea ordine: CaCO3, NH4NO3, Na2SO4, MgSO4, MnSO4, KH2PO4, ZnSO4, lactoză, glucoză. Mediul, astfel preparat, este sterilizat în instalaţia de sterilizare cu coloană şi menţinător, prin încălzire cu abur direct la 124 - 126°C şi menţinere la această temperatură timp de 10 - 12 min. În continuare, mediul este răcit la 60 - 65°C şi trimis cu această temperatură în fermentatorul de regim, unde se răceşte în continuare până la 27°C. 3.6.6.2. Fermentaţia penicilinelor Fermentaţia este faza fundamentală a procesului de biosinteză şi se realizează în trei trepte - inoculator, intermediar, regim - care corespund anumitor stadii de dezvoltare a microorganismelor. Astfel, în inoculator se

69

petrece procesul de aclimatizare a microorganismelor producătoare de antibiotic la noile condiţii de dezvoltare, în intermediar începe creşterea exponenţială a numărului de microorganisme, iar în regim se desăvârşeşte procesul de creştere a microorganismelor şi de elaborare a penicilinelor. Această etapizare reprezintă o imagine generală şi puţin idealizată a procesului de biosinteză, deoarece chiar în intermediar începe procesul de elaborare a penicilinelor ca rezultat al distribuţiei vârstelor microorganismului. Acumularea unor cantităţi mari de masă celulară face ca volumele fermentatoarelor, în care se realizează cele trei etape, să crească în raport zecimal. Eficacitatea procesului de biosinteză este determinată de conformaţia genetică a tulpinii producătoare. Tulpina utilizată curent în fabricarea penicilinelor este P. crysogenum Q 176 a cărei potenţă a fost ridicată foarte mult prin procese de mutaţie. O tulpină bună se caracterizează prin capacitate mare de înmulţire, utilizare rapidă a azotului şi a precursorului, lipsa pigmenţilor în biomasă şi miceliu fibros. Procesul de fermentaţie a penicilinelor cuprinde trei faze metabolice distincte: faza de creştere, faza de producere şi faza autolitică. Faza de creştere se caracterizează prin acumulare de masă miceliană şi utilizarea intensivă a componentelor mediului de cultură. Glucoza este asimilată foarte rapid atât pentru formarea materialului celular, cât şi pentru furnizarea energiei necesare. Cerinţele de oxigen sunt maxime în această perioadă, iar activitatea respiratorie, caracterizată prin degajare de CO2, este ridicată. Faza de producere a penicilinelor se caracterizează prin încetinirea creşterii miceliului - fie datorită epuizării constituienţilor uşor asimilabili, fie altor condiţii existente - scăderea consumului de oxigen, menţinerea pH-ului, la 6,8 7,5 şi acumularea de penicilină. În această fază lactoza este folosită lent de către miceliu şi furnizează energia necesară proceselor de biosinteză sau pentru formarea constituienţilor celulari. Faza autolitică corespunde stadiului în care microorganismul se epuizează ca urmare a activităţii metabolice prelungite, iar sursele de carbon din mediu sunt consumate. Conţinutul în azot al miceliului descreşte considerabil şi începe procesul de autoliză al acestuia cu eliberarea de amoniac şi creşterea pH-ului peste 8. Producerea penicilinelor încetează şi apare un proces de hidroliză alcalină a penicilinelor formate. În practica industrială nu este permisă prelungirea fermentaţiei până la apariţia autolizei. Cantitatea de peniciline formate într-o fermentaţie biochimică normală este rezultatul îmbinării raţionale a următorilor factori:  conformaţia genetică a tulpinii care decide capacitatea de producere a penicilinelor;  folosirea unor constituienţi adecvaţi în mediu şi un echilibru corect în proporţiile acestora;  menţinerea pH-ului optim în mediul de fermentaţie;  dozarea corectă a raportului între hidraţii de carbon;  adăugarea de precursori care vor decide natura catenei laterale şi tipul de penicilină produsă;  asigurarea necesităţilor de substanţe minerale;  menţinerea temperaturii optime.

70

Din datele existente în literatură se poate conchide că pH-ul afectează vitezele reacţiilor enzimatice, permeabilitatea membranelor celulare şi gradul de ionizare a sărurilor. Pentru faza de creştere a masei celulare pH-ul optim este de 4,5 - 5,0, iar pentru faza de producere a penicilinelor este de 7,0 - 7,5. Prin urmare procesul va trebui condus în cele două etape în regim diferit. Nu se recomandă depăşirea pH-ului de 7,5, deoarece începe procesul de autoliză însoţit de degradarea penicilinelor formate. Dacă fermentaţia penicilinei se realizează prin proces continuu, atunci, realizarea regimului optim de pH pentru faza de creştere a microorganismelor şi pentru fazade elaborare a produsului este uşor de realizat. Pentru procese discontinui pH-ul este cuprins între 6,4 - 7,0. Brown şi Peterson, studiind faza de producere a penicilinei de către microorganism, demonstrează că menţinerea pH-ului la valoarea 7 în ultima parte a ciclului de fermentaţie asigură valori ridicate pentru vitezele de respiraţie şi elaborare de peniciline. Regimul optim de temperatură este de 25 ± 1°C, iar necesarul de aer, deoarece procesul este aerob, este de 1 - 1,5 l aer/l mediu ∙ min, la o turaţie a agitatorului elicoidal de 110 - 140 rot./min. Compoziţia mediului de cultură are un rol hotărâtor în procesul de biosinteză deoarece, în dezvoltarea sa, microorganismele au nevoie de surse de hidraţi de carbon, azot, substanţe minerale şi precursori. Sursele de hidraţi de carbon sunt necesare pentru dezvoltarea microorganismelor şi pentru producerea antibioticului. Este necesar să se menţioneze că biosinteza unei molecule aşa de complexe, ca penicilina, necesită un flux de energie din exterior, procesul fiind endoterm. Prin urmare, biosinteza penicilinelor se poate realiza numai dacă se desfăşoară simultan cu procese de oxidare ale hidraţilor de carbon care constituie sursa principală de energie. Oxidarea lentă a lactozei eliberează o energie ce depăşeşte cu 66 kJ/l mediu de cultură energia necesară sistemului; din această cauză procesul de biosinteză în ansamblu este exoterm. Viteza de utilizare a hidraţilor de carbon se înscrie în următoarea schemă: glucoză > acid lactic > lactoză, care confirmă faptul că în faza de creştere a microorganismelor se consumă glucoza, iar în faza de producere a penicilinelor se consumă lactoza. Introducerea fructozei sau lactozei în locul glucozei are ca efect imediat scăderea bruscă a vitezei de creştere a masei celulare. Sursele de azot sunt necesare pentru formarea grupelor aminice şi obţinerea acizilor aminici. Se utilizează azot mineral din săruri de amoniu şi azot organic furnizat de aminoacizii şi peptidele din extractul de porumb. Prezenţa substanţelor minerale este vitală în procesul de creştere deoarece ele afectează direct permeabilitatea membranei celulare şi echilibrul ionic, activează sistemele enzimatice sau intră în sisteme enzimatice. Astfel, KH2PO4 oferă K3- pentru activarea unor sisteme enzimatice şi PO+ pentru fosforilare. Jarvis şi Johnson au determinat experimental, pentru tulpina P. crysogenum Q 174, necesarul de substanţe minerale pentru fazele de creştere a masei celulare şi elaborarea de peniciline. Tabelul 3.10. Necesarul de substanţe la producerea penicilinelor

71

Element Potasiu Magneziu Fosfor Fier Sulf

Valori exprimate în mg/l mediu Creşterea Producerea ciupercii penicilinei 40 40 8 8 80 200 0,2 7 70 100

Dirijarea procesului de biosinteză spre o anumită penicilină se face cu ajutorul unor substanţe care sunt înglobate în catena laterală a penicilinelor şi poartă numele de precursori. Pentru penicilina G se utilizează ca prescursor fenilacetamida, iar pentru penicilina V acidul fenoxiacetic. Precursorii se adaugă în porţiuni, deoarece în concentraţii mai mari de 0,1 - 0,2% sunt toxici pentru microorganisme. Dinamica procesului de fermentaţie este redată în figura 3.7. Procesul de fermentaţie a penicilinelor fiind aseptic, sterilizarea aparaturii şi a mediului se face cu abur viu la 124 - 125°C, iar menţinerea sterilităţii în timpul procesului este asigurată de suprapresiunea creată prin barbotarea aerului steril necesar biosintezei.

Figura 3.7. Dinamica procesului de fermentaţie a penicilinelor Procesul de fermentaţie se realizează în fermentatoare cilindrice verticale construite din oţel inoxidabil, echipate cu agitator elice sau turbină, serpentină pentru răcire, conductă pentru aerare, dispozitive sparge-val, teacă termocuplu, filtru individual de aer şi rezervor cu antispumant. Fundurile fermentatoarelor sunt sudate pentru a asigura un grad sporit de securitate

72

împotriva infecţiilor, iar ştuţurile au garnitură metalică pe toată suprafaţa flanşelor de legătură. Parametrii principali ai procesului de fermentaţie sunt prezentaţi grupat în tabelul 3.11. Tabelul 3.11. Parametri procesului de fermentaţie biochimică a penicilinei Etapa de fermentaţi e Inoculator Intermediar Regim

t°c 26 ± 1 26 ± 1 26 ± 1

Agitarea, rot/min

Debit aer, l/l mediu min

Presiunea , ata

Durata procesului, h

270

1,0

1,2-1,3

30 - 40

170

1 -1,2

1,2-1,3

20 - 40

120

0,6-1

1,2-1,3

90 - 120

Controlul procesului de fermentaţie se realizează prin determinarea sterilităţii mediului, a gradului de dezvoltare morfologică a ciupercii, a pH-ului mediului, a activităţii lichidului de cultură şi a consumului de zahăr. Probele se iau la interval de 4 - 6 ore, iar procesul se consideră terminat atunci când conţinutul de zahăr al biomasei ajunge la 0,2 - 0,6%, iar concentraţia soluţiei rămâne aproape constantă între două determinări. Concentraţia penicilinelor în soluţia nativă la terminarea procesului de fermentaţie este cuprinsă între 1 şi 1,8%. Valoarea exactă depinde de potenţa suşei folosite şi condiţiile de realizare a procesului de fermentaţie.

3.6.6.3. Filtrarea soluţiilor native Lichidul de cultură obţinut la fermentaţie se separă de miceliu pe filtru tambur cu vid. Soluţia rezultată se trece printr-un răcitor tubular unde se răceşte până la 3 – 5oC şi se depozitează în rezervorul de aşteptare, unde este trimisă la extracţie. Răcirea este absolut necesară pentru a reduce viteza reacţiilor de degradare a penicilinelor. În unele tehnologii de fabricaţie soluţia răcită se tratează cu cetazol 10% pentru coagularea albuminelor, se filtrează şi se trimite la extracţie. 3.6.6.4. Separarea şi purificarea penicilinelor Datorită diluţiilor foarte mari, separarea penicilinelor se poate face, rentabil, numai prin extracţii repetate cu solvenţi, conform schemei din figura 3.8.

73

Pentru separarea penicilinei prin extracţie lichid-lichid au fost studiaţi mulţi solvenţi organici, determinându-se valorile coeficienţilor de repartiţie între apă şi solvent, funcţie de temperatură şi pH (tabelele 3.12 şi 3.13). Dintre solvenţii studiaţi pentru extracţia penicilinelor cel mai economic este acetatul de butil. Solutie apoasã de KH2PO4

Solutie H2SO4 Solvent Solutie nativã

Solutie H2SO4 Solvent

Cristalizare

Solvent cu penicilinã Solvent epuizat

Solutie apoasã epuizatã

Solutie apoasã epuizatã

Figura 3.8. Schema de principiu a procesului de extractie a penicilinelor

Tabelul 3.12. Coeficienţii de repartiţie a penicilinei la 0°C funcţie de pH Solvent Metiletilcetona Dimetilciclohexan Metilciclohexan Ciclohexan Furfuriacetat Metilizobutil cetonă Dimetilftalat Acetat de amil Dietiloxalat

Coef. repartiţie pH = pH = 0 4,0 180 19 160 15 80 7 62 4 44 4 33

3

30 20 20

2,7 1,8 1,8

Tabelul 3.13. Coeficienţii de repartiţie a penicilinei G la 0° şi pH 2,5

74

Coef. repartiţie determinat Prin microbiologie titrare 63 67 30 35 27 39 24 37 14 14 7,8 8,6 0,12 0,11 0,1 0,06

Solvent Acetat de izobutil Acetat de butil Acetat de amil Cloroform Eter etilic Dicloretan Diizopropil eter Toluen Tetraclorură de carbon

0,03

0,015

Echilibrul de fază la extracţia penicilinelor şi stabilirea condiţiilor optime de extracţie a constituit obiectul multor cercetări. Rowley şi colaboratorii, studiind procesul de extracţie a penicilinelor cu acetat de butil, au observat că: 1) în solvent organic trec numai moleculele de penicilină acid nedisociate; 2) între moleculele de penicilină nu au loc asociaţii în condiţiile de extracţie; 3) în solvent organic penicilinele nu disociază în ioni. În aceste condiţii se poate afirma că echilibrul de fază la extracţia penicilinelor cu un anume solvent depinde numai de temperatură şi pH. Repartiţia penicilinelor între faza apoasă şi solvent este descrisă prin coeficienţii de repartiţie Ko şi K:

Ko = K=

Cs Ca

(3.1)

'

Cs Ca

(3.2)

unde: Ko - coeficientul de repartiţie al penicilinei nedisociate; K - coeficientul efectiv (total) de repartiţie; Cs - concentraţia penicilinei în solvent; C'a - concentraţia penicilinei nedisociate în faza apoasă; Ca - concentraţia totală a penicilinei în faza apoasă. Din ecuaţia bilanţului de materiale şi a legii acţiunii maselor rezultă: Ca = C'a + Ca(3.3) −

Kd =

Ca ⋅ C H + Ca

'

75

(3.4)

unde: CH+ este concentraţia ionilor de hidrogen Ca- - concentraţia penicilinei disociate; Kd - constanta de disociere a penicilinei. Prin combinarea ecuaţiilor (6.1 - 6.4) se obţine: 1 K = Ko K (3.5) 1+ d CH + Ecuaţia (3.5) descrie influenţa pH-ului asupra coeficientului de repartiţie în procesul de extracţie a penicilinelor cu solvenţi organici. Valoarea coeficientului de repartiţie pentru sistemul acetat de butilbenzilpenicilină-apă, determinat experimental la temperatura de 0°C şi pH= 2,5 este K = 30, iar constanta de disociere a penicilinei acid este Ka = 10 -2,75. Introducând în ecuaţia (3.5) valoarea lui K = 30, Ka = 10 -2,75 şi CH+ = 10 -2,5 se obţine pentru coeficientul de repartiţie a penicilinei nedisociate valoarea Ko = 47. La pH < 6 coeficientul de repartiţie a penicilinei nedisociate este constant (Ko = 47), iar dependenţa dintre coeficientul total de repartiţie şi pH este descrisă prin ecuaţia: 47 K = (3.6) 1 + 10 pH −2, 75 La pH > 6, Ko nu mai este constant, iar dependenţa dintre K şi pH este dată de relaţia: 1 K = 0 ,35 pH −0, 66 (3.7) 10 Prin combinarea ecuaţiei (6.6) cu (6.7) se obţine ecuaţia de calcul a coeficientului de repartiţie a penicilinei nedisociate la pH > 6. 1 + 10 pH −2, 75 K o = 0,35 pH −0, 66 (3.8) 10 Ecuaţiile (3.5 - 3.7) permit calculul coeficientului de repartiţie a penicilinei între faza apoasă şi acetat de butil, funcţie de condiţiile în care se realizează procesul de extracţie. Pentru acelaşi scop se pot utiliza şi diagrame care dau variaţia coeficientului total de repartiţie funcţie de pH pentru pH < 4,4 (figura 3.9) şi pH > 4,4 (figura 3.10).

Figura 3.9. Influenţa pH-ului asupra coeficientului de repartiţie (K) a penicilinei între acetat de butil şi apă

76

Figura 3.10. Influenţa pH-ului asupra coeficientului de repartiţie a penicilinei între apă şi acetat de butil Lucrările experimentale, confirmând calculele teoretice, demonstrează că la un pH = 4,4 coeficientul de repartiţie K are valoarea 1 şi ca urmare separarea penicilinei este practic imposibilă. După cum s-a arătat mai sus (figura 3.8) separarea penicilinei din soluţia nativă necesită concentrarea soluţiei prin trecere repetată din faza apoasă în solvent (extracţie) şi din solvent în faza apoasă (reextracţie). Caracterizarea cantitativă a procesului de extracţie şi reextracţie se face funcţie de valorile coeficienţilor de transfer de masă:

V kL = F ⋅τ

V kL = F ⋅τ '

Ca i '

∫

Ca ' f

Ca f '

∫ 0

dCa

'

'

C a − C ae

- pentru extracţie

(3.9)

'

dCa - pentru reextracţie ' C ae − C a

(3.10)

unde: V este volumul extractorului; F - suprafaţa de contact; Cae - concentraţia de echilibru a benzilpenicilinei nedisociate; i şi f - condiţii iniţiale şi finale. În funcţie de Ca (concencentraţia soluţiei native), Ko şi K se calculează valorile concentraţiilor Ca’ şi Cs, după care prin integrarea relaţiilor (3.9) şi (3.10) se determină coeficienţii de transfer de masă pentru extracţie (kL = 25,3 cm/h la pH = 2 - 2,5) şi reextracţie (k'L = 0,022 cm/h la pH = 4,4 şi 8,8). Din comparaţia valorilor coeficienţilor de extracţie kL şi k'L rezultă că viteza procesului este de 1000 ori mai mare la extracţie faţă de reextracţie. Pentru a mări viteza procesului de reextracţie (treapta a doua din figura 3.8) se transformă penicilina acid în sare de sodiu sau potasiu, prin tratare cu fosfat sau acetat de sodiu (K), iar sub formă de sare penicilina trece total în soluţia apoasă. Alegerea regimului optim de extracţie în contracurent a penicilinei cu acetat de butil se poate face cu ajutorul nomogramei din figura 3.11 care corelează cantitatea de penicilină neextrasă ϕ, gradul de concentrare m, pH-ul fazei apoase şi numărul teoretic al treptelor de contact N.

77

Figura 3.11. Nomograma pentru calculul extracţiei penicilinei: I - E = f (pH, m) pentru extracţia penicilinei din soluţia apoasă în acetat de butil; II - ϕ= f (E, N); III - E = f (pH, m) pentru extracţia penicilinei din acetat de butil în soluţia apoasă Pentru sistemul soluţie apoasă de antibiotic – acetat de butil se poate neglija solubilitatea fazelor, iar gradul de concentrare în acest caz este determinat de raportul volumelor fazelor participante la proces: m=

V (extracţie pH < 4,4) Vs

sau m ' =

(3.11)

Vs (reextracţie pH > 4,4) V

unde: V este volumul fazei apoase; V', - volumul de solvent. În partea stângă a nomogramei din figura 3.11 este redată dependenţa dintre factorul de extracţie, gradul de concentrare şi pH-ul fazei apoase la extracţia penicilinei din faza apoasă în acetat de butil, iar în partea dreaptă a nomogramei este redată dependenţa aceloraşi factori, dar la reextracţie (trecerea penicilinei din faza organică în faza apoasă). În mijlocul diagramei este redată dependenţa fracţiei neextrase funcţie de factorul de extracţie şi numărul treptelor teoretice de contact. Factorul de extracţie a fost calculat funcţie de pH cu relaţia (3.12), iar fracţia neextrasă cu relaţia (3.13): E =K

1 (extracţie pH < 4,4) m

1 1 ⋅ (reextracţie pU >4,4) K m' E −1 ϕ = n +1 E −1

(3.12)

E=

(3.13)

Nomograma permite determinarea rapidă a parametrilor procesului de extracţie şi poate furniza datele necesare optimizării aparaturii şi procesului de extracţie a penicilinei cu solvenţi organici.

78

Mai jos sunt prezentate două exemple de utilizare a nomogramei din figura 3.11: 1. Extracţia penicilinei se realizează la pH = 2, cu un raport de volume m = 0,3 pe un extractor cu 1,5 trepte teoretice de contact. Se cere determinarea fracţiei neextrase. Pentru aceasta se determină punctul de intersecţie dintre ordonata ridicată din pH = 2 cu curba m = 0,3, iar din acest punct se duce o paralelă la abscisă până ce intersectează curba N = 1,5, funcţie de care se determină fracţia neextrasă ϕ= 2,3%. 2. Se cere determinarea raportului volumetric m la reextracţia penicilinei din acetat de butil pH = 6,5 pe acelaşi extractor (N = 1,5). Pentru aceasta se determină punctul de intersecţie dintre ordonata cu ϕ = 2% şi curba corespunzătoare lui N = 1,5. Din acest punct se duce o paralelă la abscisă, până ce întâlneşte ordonata cu pH = 6,5. Punctul de intersecţie corespunde la m' = 0,12. Deoarece proprietăţile fizice ale penicilinelor diferă, apar mici diferenţe şi în procesul de extracţie, din care cauză extracţia se va trata separat pentru benzilpenicilină şi fenoximetilpenicilină. Penicilina G se separă din soluţia nativă, prin extracţie cu acetat de butil în trei stadii, după care se purifică prin decolorare şi cristalizare. În stadiul I de extracţie are loc trecerea penicilinei din soluţia nativă în acetat de butil la un pH de 2 - 2,5. Acidularea soluţiei native la pH 2,4 - 2,5 se face cu acid sulfuric de 6 10% iar raportul între acetatul de butil şi soluţia nativă este de 1: 3. Acest raport se alege în aşa fel, încât în final soluţia de acetat de butil să aibă o activitate de 20 - 25 000 UI/ml. Extracţia se realizează în extractoare centrifugale în contracurent, tip Luwesta sau Podbielniak descrise mai sus. În stadiul II de extracţie, care se realizează în acelaşi tip de extractor, are loc trecerea penicilinei din acetat de butil în soluţie apoasă de fosfat disodic şi carbonat de sodiu (4%) la pH 7 - 7,2. Raportul dintre soluţia apoasă şi acetat este de 1: 2,5 - 1: 3. În acest stadiu penicilina, sub formă de sare de sodiu, trece cantitativ în soluţie apoasă a cărei concentraţie finală este de 40 - 45 000 UI/ml. În stadiul III de extracţie, soluţia apoasă este tratată cu acid sulfuric de 6 - 10% până la pH 2 – 2,5 după care se amestecă cu acetat de butil în raport de 1 : 1,3 - 1 : 1,5. După separarea fazelor se obţine o soluţie de penicilină în acetat de butil cu concentraţia de 60 - 80 000 UI/ml care se supune procesului de uscare în vederea cristalizării penicilinelor. Pentru îndepărtarea apei, soluţia de acetat de butil se trece într-un vas cu serpentină unde se răceşte până la -10, - 12°C, când apa îngheţaţă formând cristale fine care se filtrează pe druck-filtru (figura 3.12). Soluţia filtrată se trece peste sulfat de sodiu anhidru pentru desăvârşirea uscării după care, prin tratare cu soluţia alcoolică de acetat de potasiu 30%, cristalizează penicilina potasică. Penicilina cristalizată se filtrează şi se spală pe filtru cu butanol pentru îndepărtarea acetatului de butil şi apoi cu cloroform sau eter pentru

79

îndepărtarea butanolului. Uscarea benzilpenicilinei potasice se face sub un uşor vid la 50 - 60°C timp de 4 - 5 ore. Penicilina G se separă sub formă de sare, deoarece sub această formă este mult mai stabilă decât acidul liber. Dacă în faza de fermentaţie se adaugă ca precursor nu fenilacetamida ci acidul fenoxiacetic, atunci se obţine penicilina V. Separarea penicilinei V se realizează tot prin extracţie cu acetat de butil, dar numai în două stadii. Aceasta este posibil deoarece solubilitatea penicilinei V în apă este mică.

Figura 3.12. Schema de principiu a instalaţiei de separare a penicilinei G din soluţia de acetat: 1 - vas de îngheţare; 2 - filtru; 3 - vas uscare pe Na2SO4 anhidru; 4 - vas precipitare; 5 - filtru nuce; 6 - uscător Precipitarea penicilinei V, din soluţia apoasă rezultată de la stadiul II de extracţie, se face prin acidulare cu acid clorhidric sau sulfuric diluat. Penicilina V precipitată se filtrează pe filtru nuce şi se usucă în uscător dulap la 35 - 45°C sub vid de 100 - 225 mm Hg, timp de 16 - 20 ore. 3.6.7. Peniciline de semisinteze Apariţia penicilinelor de semisinteză a fost determinată de faptul că benzilpenicilina are o activitate scăzută faţă de germeni gram-negativi şi o foarte slabă rezistenţă în mediu acid şi la acţiunea penicilinazei. Încercările de obţinere a noi peniciline s-au axat fie pe modificarea catenei laterale, fie pe sinteza chimică directă. Modificarea cantenei laterale, bazată pe utilizarea diverşilor precursori în procesul de biosinteză, a condus la un număr restrîns de peniciline, deoarece microorganismul producător acceptă ca precursor numai derivaţii monosubstituiţi ai acidului acetic. Pe de altă parte, sinteza chimică directă a prezentat un imens interes teoretic, dar randamentele obţinute au fost prea mici pentru a transforma procedeul într-un mijloc curent de preparare a penicilinelor modificate. Prima comunicare despre nucleul de penicilină a fost făcută în anul 1950 de către Sakaguachi şi Murao, care au descoperit în miceliul de Penniccillium crysogenum Q 176 o nouă enzimă, penicilamidaza, capabilă să scindeze catena laterală din molecula penicilinei. Mai târziu, în 1953, Kato a identificat iodometric, la fermentaţia penicilinei fără precursor, un metabolit care în

80

prezenţa acidului fenil-acetic a trecut în penicilină G; acest metabolit a fost denumit de Kato „nucleul penicilinei". Etapa culminantă a cercetărilor în acest domeniu a constituit-o izolarea, de către Batchelor în 1959, a acestui nucleu de penicilină pe care l-a denumit acidul 6-aminopenicilanic. După descoperirea şi purificarea acidului 6aminopenicilanic (A 6 -AP), a devenit posibilă sinteza unui număr mare de peniciline noi, denumite peniciline de semisinteze, având catene variate. Acţiunea lor antibacteriană cât şi proprietăţile lor farmacologice depind de structura acidului care participă la formarea catenei laterale. Penicilinele de semisinteză păstrează, în general, lipsa de toxicitate caracteristică penicilinelor şi înlătură dezavantajele majore ale acestora în afară de alergie; acest fenomen este atribuit de majoritatea cercetătorilor, însuşi nucleului penicilinei.

3.6.7.1. Clasificarea penicilinelor de semisinteză Penicilinele de semisinteză se pot clasifica după structura chimică a catenei laterale şi după rezistenţa în mediul acid şi la penicilinază. După natura radicalilor legaţi de carbonul α al catenei laterale, penicilinele de semisinteză se clasifică în următoarele grupe: 1) peniciline metil monosubstituite; 2) peniciline metil disubstituite; 3) peniciline metil trisubstituite; 4) peniciline α, β nesaturate; 5) aril, heterociclil, cicloalchil-peniciline. După rezistenţa chimică şi la penicilinază penicilinele semisintetice se clasifică în patru grupe: 1) peniciline rezistente la acizi: feneticilina, propicilina, peniciline cu grupări dialchilsulfonamidice şi morfolinosulfonamidice; 2) peniciline rezistente la penicilinază: meticilina, nafticilina; 3) peniciline stabile la acizi şi la penicilinază: oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, amicilina; 4) derivaţi cu spectrul larg: ampicilina, carbencilina. Formulele de structură şi caracteristicile cele mai importante ale principalelor peniciline semisintetice sunt prezentate în tabelul 6.14. 3.6.7.2. Stabilitatea penicilinelor de semisinteză Cunoaşterea domeniului de temperatură şi pH, în care penicilinele de semisinteză prezintă o bună stabilitate, este necesară pentru alegerea condiţiilor optime de obţinere, păstrare şi utilizare. A fost studiată influenţa principalilor factori asupra vitezei de degradare a penicilinelor de semisinteză utilizate curent în terapeutică, stabilindu-se că procesul inactivării decurge, în toate cazurile, după o cinetică de ordinul I. Din studiul vitezei de degradare a meticilinei, în domeniul de pH 1 - 10, la tăria ionică constantă de 0,5 şi la 25°C, s-a stabilit că aceasta este foarte puţin

81

stabilă în mediu acid, iar viteza de descompunere este de 2 - 3 ori mai mare decât la feniticilină. Tabelul 3.14. Caracteristicile penicilinelor de semisinteză S R NH

CH3 CH3 CH COOH

N O

Denumirea Penicilina G Penicilina V Feneticiclina Propiciclina Lenebencilina

R

Stabilitat e în pH acid

Rezistenţă la penicilinază

+

-

Activitate asupra germenilor gramnegativi -

+

+

-

+

+

-

+

+

-

-

+

-

+

+

-

+

+

-

+

-

+

C6H5 CH2 CO C6H5 O CH2 CO

C6H5 O CH CO CH3

C6H5 O CH CO C 6 H5 O

C 2 H5 CH CO CH

OCH3 CO

Meticilina C6H5

Oxacilina

OCH3 C C CO N C

CH3

O ClC6H4 C C CO

Cloxacilina Ampicilina

N C

CH3

O C6H5 CH CO

NH2

Influenţa pH-ului asupra vitezei de degradare a meticilinei este redată în figura 3.13.

82

Figura 3.13. Stabilitatea meticilinei funcţie de pH Forma curbei este tipică pentru degradarea penicilinelor prin ioni de H+ şi OH-, iar curbura din partea acidă apare datorită ionizării meticilinei. Domeniul de pH în care meticilina prezintă stabilitate maximă este relativ îngust şi se găseşte în jurul pH-ului 7. Un studiu complet asupra degradării oxacilinei în soluţie apoasă în domeniul de pH 1 - 11 la o tărie ionică de 0,5 şi la 25°C a fost efectuat de Kondratieva şi Bruns. Curba care exprimă dependenţa dintre viteza de inactivare şi pH-ul soluţiei la 25°C poate fi împărţită în cinci domenii (figura 3.14).

Figura 3.14. Stabilitatea oxacilinei funcţie de pH În primul domeniu (pH = 0 - 1,3) oxacilina se găseşte sub formă nedisociată, iar viteza de inactivare sub acţiunea ionilor de hidrogen este proporţională cu concentraţia iniţială a oxacilinei: ' dC dCa ' − a = = kCa = kCa ' dτ dτ (3.14) iar k = k1 ⋅ C H +

În domeniul III (pH = 3 - 5,5) oxacilina fiind disociată, are loc procesul de inactivare electrofilă a anionilor de oxacilină, iar viteza acestui proces este proporţională cu concentraţia ionilor de hidrogen la puterea n ≠ 1:

83

'

dCa = kC − a ' dτ (3.15) −

iar

k = k2 ⋅ C n H − În domeniul V (pH peste 7,5) are loc procesul de inactivare nucleofilă, iar viteza procesului este proporţională cu concentraţia ionilor de hidroxil: ' dCa − = kC − a ' dτ (3.16) iar k = k3 ⋅ COH −

Prin urmare, viteza procesului de inactivare a oxacilinei la pH < 1,3, la pH > 7,0 şi pH cuprins între 3 şi 5,5 este descrisă prin ecuaţiile (3.14) - (3.16). Pentru determinarea constantelor k1 k2, k3 se logaritmează relaţiile de definiţie a lor, obţinându-se: log k = log k1 – pH log k = log k2 – n pH (3.17) log k = log k3 + pKw + pH unde: pKw este produsul ionic al apei. La pH = 0 ecuaţiile (3.17) iau forma: log k1 = log k log k2 = log k (6.18) log k3 = log k - pKw Prin extrapolarea curbelor din figura 3.9 se obţin valorile numerice ale constantelor catalitice (k1, k2 şi k3), iar valoarea lui n pentru domeniul III se determină din panta dreptei în acest interval de pH. În cazul oxacilinei valorile constantelor catalitice sunt: kl = 2,1 ∙ 10-1, min-1; k2= 1,7 ∙ 10-1, min-1; k3 = 23,7, min-1 iar n = 0,78. În domeniul II (pH = 1,3 - 3) oxacilina existând sub formă disociată şi nedisociată, vitezele de degradare pentru aceste forme sunt diferite şi ca urmare pe curbă apare o inflexiune. În intervalul de pH 5,5 - 7,5 (domeniul IV) curba prezintă un minim, iar procesul de inactivare se realizează nucleofil şi electrofil, cu viteze comparabile. Domeniul de pH 6 - 7 corespunde stabilităţii maxime a oxacilinei. Ecuaţia generală a vitezei procesului de degradare a oxacilinei într-un interval larg de pH se obţine prin însumarea ecuaţiilor (3.14) - (3.16): dC − a = k1Ca ' ⋅ CH + + k2 (C n H + ) ⋅ C − a + k3 (COH − ) ⋅ C − a dτ (3.19)

84

Exprimând concentraţia formelor disociate şi nedisociate ale oxacilinei în funcţie de constanta de disociere Ka şi concentraţia totală de oxacilină Ca se obţine: Ca C H + Ca k d − C 'a = şi C a = k + C kd + CH + d H+ (3.20) Prin combinarea ecuaţiilor (3.19) şi (3.20) se obţine: −

dC a 1 = Ca dτ kd + CH +

 k3 K d K w  2 n k1C H + + k 2 K d C H + +  CH +    

(

)

(3.21) unde: k = k1CH+ + k2Kd(CnH+) +

k3 K d K w CH +

(3.22) Ecuaţia (3.22) permite calculul constantei de viteză la inactivarea oxacilinei. Acelaşi rezultat a fost obţinut de Brodersen pentru inactivarea penicilinei G. Pentru fiecare domeniu din figura 3.15, constanta de viteză poate fi calculată foarte uşor cu ecuaţiile din tabelul 3.15. Tabelul 3.15. Ecuaţiile de calcul al constantei de viteză la inactivarea oxiacilinei pH < 1,3 1,3 – 3,0 3,0 – 5,5 5,5 – 7,5 > 7,5

Forma Ionul de catalizator existenţă PnH H+ PnH, P

n

H

+

Ecuaţia de calcul al lui K k = k1C H +

(k C ) + k K C k= 1

H+

2

K d + CH +

k = k 2C n H +

Pn-

H+

Pn-

H+, OH-

k = k 2C n H + +

Pn-

OH-

k = k3

85

n

d

(

)

Kw CH +

k3 K w CH +

H+

Figura 3.15. Diagrama de stabilitate a oxacilinei funcţie de temperatură şi pH Pentru determinarea rapidă a constantei de viteză şi a gradului de inactivare, funcţie de temperatură şi pH, într-o perioadă de timp determinată, se recomandă utilizarea nomogramei din figura 3.10. Dacă se urmăresc valori foarte exacte ale vitezei de inactivare atunci este necesară utilizarea relaţiilor cinetice. Recent au fost publicate rezultatele unor cercetări din care rezultă că pHul degradării minime a ampicilinei la 27°C este de 4,4. Hou şi Poole au studiat cinetica degradării ampicilinei în câteva sisteme de tampon cu pH 0,8 - 10, cu tărie ionică de 0,5 şi la diverse temperaturi. Vitezele de reacţii la degradarea ampicilinei se conformează cineticii de ordinul întâi şi sunt afectate simţitor de cataliza generală acid-bază îndeosebi de către ionii de fosfat cu polisarcină. În soluţia acidă, vitezele aparente cresc odată cu tăria ionică şi scad cu constanta dielectrică a solventului, pH-ului degradării minime este de 4,85, valoare ce coincide cu punctul izoelectric al ampicilinei în condiţiile folosite. Astfel spus, forma de ion amfoter al moleculei de ampicilina este cea mai stabilă atât la acizi cât şi la baze. Inactivarea ampicilinei într-o bază este de circa 1400 ori mai rapidă decât în acid. Energiile aparente de activare pentru degradarea ampicilinei sunt de 16,4, 18,3 şi 9,2 kcal/mol în sisteme tampon cu pH 1,35, 4,93 şi respectiv 9,78. 3.6.7.3. Metode de obţinere a penicilinelor de semisinteză Dintre metodele cunoscute privind obţinerea penicilinelor de semisinteză, utilizarea practică a căpătat metoda acilării acidului 6-AP cu cloruri acide, cu anhidride mixte şi cu acizi carboxilici în prezenţa diciclohexil-carbodiimidei. A. Acilarea acidului 6-AP cu cloruri acide Acilarea acidului 6-AP cu cloruri acide este cea mai utilă metodă de obţinere a penicilinelor de semisinteză. Reacţia se realizează în prezenţă de NaHCO3 sau trietilamină în mediu apos sau amestec de apă-acetonă: P-NH2 + Cl-COR

NaHCO3 N(C2H5)2

P-NH-CO-R + NaCl + CO2 + H2O

86

Dacă clorura acidă nu este stabilă în soluţie apoasă, condensarea se efectuează în mediu de acetonă anhidră, diclormetan, cloroform sau alt solvent anhidru. În locul clorurii acide se pot utiliza fie bromuri acide, fie anhidride ciclice sau aromatice. B. Acilarea acidului 6-AP cu anhidride mixte Metoda de acilare a acidului 6-AP cu anhidride mixte este avantajoasă pentru introducerea acizilor carboxilici ale căror cloruri acide sunt greu sau imposibil de obţinut. Anhidridele mixte se prepară din acid carboxilic tratat cu cloro-carbonatul de etil sau izobutil în prezenţa aminelor terţiare: R COOC OC2H5 + HCl

R COOH + Cl C OC2H5

O

O R COO

R CO NH

C OC2H5 + H2N P

P + CO2 + C2H5OH

O C. Acilarea acidului 6-AP cu acizi carboxilici Acest procedeu utilizează ca agent de condensare N, N' - diciclohexil carbodiimida. Reacţia decurge în două trepte: în prima treapta are loc adiţia acidului carboxilic la diciclohexil-carbodiimidă, iar în treapta a doua compusul de adiţie reacţionează cu acidul 6-AP formând penicilina respectivă şi diciclohexil-ureea: N C6H11

NH C6H11

C

C

+ HO CO R

N C6H11

NH C6H11

COR + P NH2

P NH COR + C O NH C6H11

N C6H11

Reacţia se realizează la temperatura camerei, în mediu de tetrahidrofuran, sub o bună agitare. Diciclohexil-ureea formată cristalizează la diluarea masei de reacţie şi se separă prin filtrare. D. Obţinerea principalelor peniciline de semisinteză Utilizând una din metodele prezentate se obţin principalele peniciline de semisinteză după cum urmează: - Feneticilina (Broxil, α - fenoxietilpenicilina). Se obţine prin condensarea acidului 6-AP cu clorura acidului α - fenoxipropionic în mediu de acetonă şi în prezenţa bicarbonatului de sodiu: P NH2 + Cl CO

CH CH3

O C6H5

+NaHCO3 -NaCl -CO2 -H2O

87

P NH

CO

CH CH3

O C6H5

Este activă împotriva stafilococilor penicilinorezistenţi dând rezultate bune în infecţiile căilor respiratorii şi otită. - Propicilina (Brocilin, Boycilin). Se obţine prin condensarea în mediu apos a acidului 6-AP cu anhidrida mixtă rezultată din acidul fenoxibutiric şi clorocarbonatul de izobutil: C6H5

O

CH COOH + Cl

C

CH2 CH3

O

P NH2 + C6H5

O

CH COOC

O

O

CH COOC

OC(CH3)3

-CO2 -(CH3)3-C-OH

P NH

OC(CH3)3

O

CH3 CH2

O

CH3 CH2

C6H5

C(CH3)3

CO

CH

O C6H5

CH2 CH3

- Meticilina (Celbenina, Cinopenil). Rezultă prin condensarea clorurii acidului 2,6-dimetoxibenzoic cu acidul 6-AP în mediu de CH2Cl2 în prezenţă de trietilamină: OCH3

OCH3 2N(C2H5)3

P NH2 + Cl CO

P NH CO

OCH3

OCH3

Meticilina este stabilă la acţiunea penicilinazei fiind utilizată în infecţii dermice şi ale gâtului, precum şi în tratamentul pneumoniilor bacteriene. - Oxacilina (Rezistopen, Prostaphlin). Se obţine prin condensarea clorurii acidului 5-metil-3-fenil-izoxazolil-4-carboxilic cu sarea de sodiu a acidului 6-AP în prezenţa bicarbonatului de sodiu:

P NH2 + Cl CO

C

C

CH3 C

N

C6H5

+NaHCO3 -NaCl -CO2

O

P NH

CO

C

C

CH3 C

N

C6H5

O

Oxacilina este stabilă în mediu acid şi la penicilinază, fiind foarte activă împotriva stafilococilor rezistenţi la penicilină. - Ampicilina (Penbritin, Polycillin). Pentru obţinerea ampicilinei se pleacă de la acidul fenilacetic care se bromurează, apoi se transformă în acidul aminofenil acetic. Acesta se acilează mai întâi cu esterul benzilic al acidului clorcarbonic şi apoi cu cloroformiatul de etil, iar anhidrida mixtă rezultată se condensează cu acidul 6-AP:

88

C6H5

CH2

COOH

+Br2 -HBr

C6H5

CH

COOH

+NH3

-NH4Br

C6H5

Br C6H5

CH

COOH

Cl-COOC2H5 Cl-CO-CH2-C6H5

NH2

C6H5

O

CH

COOH

NH2 CH

COO

NH

C

COOC2H5

OCH2

+P-HN2

C6H5

O +P-NH2

P

NH

C

CH

O NH

H2O

C6H5

P

NH

CO

COOCH2 C6H5

CH

C6H5

NH2

Ampicilina acţionează asupra germenilor penicilino-rezistenţi, dar este inactivată de penicilinază. 3.6.7.4. Tehnologia fabricării penicilinelor de semisinteză Penicilinele de semisinteză au o tehnologie de obţinere comună care cuprinde următoarele etape:  obţinerea acidului 6-aminopenicilanic;  obţinerea clorurii acide sau a esterului sare;  condensarea acidului 6-AP cu clorura acidă sau anhidrida mixtă şi separarea penicilinei obţinute. 1. Obţinerea acidului 6-amixopenicilanic Dintre procedeele propuse pentru obţinerea acidului 6-AP (biosinteza acidului 6-AP prin cultivarea ciupercii P. crysogenum pe un mediu fără precursor, sinteza chimică şi degradarea penicilinelor la acid 6-AP), utilizare practică a căpătat procedeul degradării enzimatice a penicilinelor la acid 6-AP. Pe lângă degradarea enzimatică, aplicată în industrie, se studiază intens hidroliza chimică a penicilinelor în vederea găsirii unui procedeu rapid şi economic. Procedeul hidrolizei chimice este aplicat la scară industrială în câteva ţări ale lumii pintre care şi în ţara noastră. a) Hidroliza chimică a penicilinei. Pentru hidroliza catenei laterale a penicilinei se folosesc reactanţi cu o înaltă selectivitate, care să atace gruparea amidică laterală şi să nu afecteze ciclul β-lactamic. Astfel prin reducerea onitrofenoximetilpenicilinei cu tetrahidrură de bor în prezenţa catalizatorilor (paladiu) se obţine acidul 6-AP şi benzoxazin. Acest procedeu are dezavantajul că foloseşte materie primă scumpă şi greu de obţinut:

89

O

CH2

S

NH

O NO2

N

O

CH3 CH3 COOH

O

BH4

CH2

NH

O

O

S

H2 N

N

N

O

N

O

OH

+

S

C NH

Pd / C

CH3 CH3

CH3 CH3 COOH

OH Un alt procedeu, brevetat în Olanda, constă în obţinerea iminoesterilor penicilinei care hidrolizează cantitativ în acid 6-AP. Conform acestui procedeu, penicilinele de biosinteză (G sau V) se transformă în esteri metil-silanici (I) pentru protejarea grupei carboxilice din nucleul penicilinei.

R CO

S

NH N

O

R CO

CH3 + CH3 COOK

S

NH N

O

CH3 CH3 COO

CH3

CH3

S

Cl Si Cl CH3 K OOC CH3

CH3 Si

CH3 CH3 OOC

NH CO R N

O

S

NH CO R N

O

CH3 I

R C

*N

N*

C

OH

R

OH II

R C

*N

N*

Cl

R C

*N

OR

IV

90

R

Cl

III

N*

C

C R OR'

2

OR' R C

+

2

S

H2 N

O*

N

O

CH3 CH3 COOH

Acidul GAP Prin tratarea esterului cu cloranhidrice (PCl5 sau POCl3) în prezenţă de catalizatori bazici se obţine iminoclorură (III). Timpul optim pentru realizarea acestei reacţii este funcţie de temperatură, natura şi cantitatea de solvent şi cloranhidridă. La tratarea iminoclorurii cu alcooli au loc două procese simultane: formarea iminoesterilor (IV) şi hidroliza grupării esterice formate cu metilsilan, fără a fi afectat ciclul β-lactamic. Temperatura şi durata reacţiei sunt determinate de natura alcoolului folosit. Pentru separarea acidului 6-AP se face hidroliza iminoesterului în mediu slab acid şi la temperatură moderată. Acest procedeu oferă randamente foarte bune, fiind aplicate pe scară industrială în unele ţări. Cheltuielile de producţie la hidroliza chimică sunt mai mici comparativ cu ale procedeului de hidroliză enzimatică şi depind în mare măsură de preţul penicilinei. De asemenea, procedeul hidrolizei chimice conduce la un acid 6-AP pur şi cu activitate mare. b) Hidroliza enzimatică a penicilinelor Acest procedeu se bazează pe capacitatea unor microorganisme – Escherichia coli, Bacterium alcologenes faecalis, Nocardia – de a produce enzima “Amidază" capabilă să scindeze catena laterală, din peniciline cu eliberarea acidullui 6-AP. Procesul tehnologic de fabricare a acidului 6-AP prin scindare enzimatică a penicilinei cuprinde următoarele etape:  obţinerea masei de Escherichia coli prin fermentaţie biochimică şi separarea ei de lichidul de cultură;  scindarea enzimatică a penicilinei cu E. coli şi separarea soluţiei de 6AP;  concentrarea, cristalizarea şi uscarea acidului 6-AP. Prima etapă, privind obţinerea masei bacteriene, se realizează printr-un proces obişnuit de fermentaţie în trei trepte (inoculator, intermediar, regim) a E. coli pe un mediu steril conţinând extract de porumb, peptonă, fenil-acetamidă, săruri minerale. Parametrii principali ai procesului de fermentaţie sunt redaţi în tabelul 3.16. Tabelul 3.16. Parametrii de fermentaţie a E. Coli Faza de fermentaţi e

Temper atura, °C

pH

Presiunea , ata

91

Aeraţia l aer/l Agitare, mediu rot/min min.

Concentr aţia masei mg/l

Timp, h

Inoculator

30 ± 1

8

1,8

1

210

3,05

Intermediar

30 ± 1

8

1,5

1

140

3,1

Regim

30 ± 1

8

1,5

1 – 1,2

110

4,1

18 – 20 18 – 20 20

După atingerea concentraţiei în masa celulară de 4,1 mg/l, conţinutul fermentatorului se trimite la o centrifugă unde se separă de lichidul de cultură şi se spală cu apă distilată. Biomasa rezultată, cu concentraţia de 0,122 gr/l, este trimisă în aparatul de scindare unde se încălzeşte la 35 - 40°C. Peste biomasa încălzită, la pH 7,5 se adaugă benzilpenicilina potasică în aşa fel încât activitatea soluţiei să fie de 50 000 UI/ml. În general, 1 kg penicilină este scindată de 1,5 kg E. coli. Procesul de scindare a penicilinei, cu amidaza secretată de E. coli durează 4 - 5 ore după care, masa se răceşte la 20°C şi se separă prin centrifugare soluţia cu acid 6-AP de masa miceliană, care se utilizează la o nouă scindare. Soluţia obţinută conţine acid 6-AP şi penicilină G nescindată (randamentul scindării 70 - 75%). Pentru separarea penicilinei nescindate, soluţia se acidulează la pH 2 - 2,5 şi se supune extracţiei cu acetat de butil. Stratul apos separat de la extracţii, conţinând acidul 6-AP, se neutralizează la pH = 1 cu soluţie de NaOH, se purifică şi se concentrează la vid. Prin acidulare la pH = 3 - 3,5 şi răcire la 5°C, acidul 6-AP cristalizează din soluţia concentrată în timp de 10 - 20 ore. În procesul de hidroliză enzimatică se impune găsirea valorilor optime pentru principalii parametri – pH şi temperatură – deoarece pe lângă reacţii de hidroliză a penicilinei G la acid 6-AP au loc şi reacţii secundare de degradare a penicilinei şi a acidului 6-AP, cu deschiderea ciclului lactamic precum şi dezactivarea amidazei. Studiind optimizarea acestui proces enzimatic Ho şi Humghrey au demonstrat că randamentul maxim în acid 6-AP se obţine la pH = 8 (corespunzător stabilităţii maxime pentru acid 6-AP şi enzimă) şi la temperatura de 35 - 40°C. Depăşirea acestei temperaturi accelerează viteza de inactivare a enzimei şi de degradare a ciclului lactamic din penicilină şi acid 6-AP. 2. Obţinerea clorurilor acide Clorurile acide se obţin prin clorurarea acizilor organici corespunzători cu clorură de tionil în exces: R—COOH + SOCl2 —> R—COCl + SO2 + HCl Clorurarea se realizează în topitură sau în solvent inert (benzen) la temperaturi nu prea ridicate. După terminarea reacţiei, se distilă solventul şi clorura de tionil nereacţionată, după care, sub vid, se distilă clorura acidă. 3. Condensarea acidului 6-AP cu cloruri acide

92

Condensarea acidului 6-AP cu cloruri acide se face în soluţie apoasă în prezenţă de NaHCO3, iar dacă clorura acidă este puţin stabilă se lucrează în mediu de solvent (diclormetan sau dicloretan) în prezenţa trietilaminei, ca agent de legare a acidului clorhidric degajat din reacţie. În reactorul de condensare se introduce acidul 6-AP în soluţie apoasă sau în solvent şi agentul de fixare a acidului clorhidric, iar după răcire la 2 - 3°C se adaugă clorura acidă.

Figura 3.16. Schema de principiu a instalaţiei de obţinere a penicilinei de semisinteză: 1 - aparat scindare; 2 - centrifugă; 3 - extractor; 4 - evaporator; 5 - cristalizator; 6 - filtru; 7 - reactor condensare; 8 - aparat concentrare; 9 - cristalizator Adăugarea clorurii acide se face în aşa fel încât temperatura să nu depăşească 5°C (timp de 1 - 1,5 ore), iar perfectarea reacţiei se face la 20°C , timp de 1 - 1,5 ore. După aceasta, masa de reacţie răcită la 2 - 5°C se aduce la pH = 2 - 2,5 şi se extrage cu acetat de butil penicilina formată. Din soluţia de acetat de butil penicilina se transformă în sarea de sodiu cristalizată cu NaHCO 3 sau acetat de sodiu, iar din soluţia apoasă sarea de sodiu cristalizează prin răcire. Prin filtrare, spălare cu butanol şi recristalizare, se obţine penicilina pură, cu randamente cuprinse între 60 şi 80%.

93