25 0 620KB
Cromatografia planară Cromatografia planară (CP) este cunoscută şi sub denumirea de cromatografie în strat subţire fiind cea mai simplă şi ieftină dintre metodele cromatografice. In literatura de specialitate se utilizeaza mai multe denumiri (cu prescurtarile asociate acestora). Pe lânga termenul consacrat — cromatografia planara (planar chromatography — PC) se mai întâlnesc denumiri precum cromatografia in strat subtire de înaltă performanta (high performance thin layer chromatography — HPTLC) sau cromatografia de lichide planara (planar liquid chromatography — PLC). In aceasta varianta a cromatografiei de lichide, separarea nu mai are loc intr-o coloana inchisa ci pe o faza stationara similara, granulara (poroasa) dispusa intr-un strat subtire, formând un plan (fig. 1).
Fig.1. Placa cromatograficä şi poziiile relative ale spoturilor pe linia de start, înainte de începerea separării. 1-3 reprezintă probe necunoscute iar Et — proba etalon, cunoscuta
Acest realizează
strat
denumit
“subţire”,
se
Fig.2 Aparatul Linomat pulverizează probele în formă de benzi pe staturile subţiri . Astfel se pot aplica probe care se concentrează pe zone înguste asigurându-se o eficienţă mărită a separării Se pot utiliza si dispozitive complexe de alimentare cu solventi ( cu minipompe) . Migrarea eluentului poate avea loc pe veriticala (ascendent sau descendent) si pe orizontala.
O placa se poate elua de mai multe ori sau se poate evapora solventul in timpul migrarii. In acest fel se mareste eficienta pe seama timpului de separare.
Pentru realizarea separarii ( elutiei) se utilizeaza camere de developare. Formele cele mai uzuale ale camerelor de developare sunt cele paralelipipedice sau cilindrice ( pahare) prevazute cu capac si cu dispozitiv de fixare a placii plane (hartie sau strat subtire). Ele pot fi saturate cu amestecul de solventi utilizat la separare pentru a mari viteza de elutie. Camerele de developare de forma paralelipipedice se numesc camere de tip N ( normale) , iar cele subtiri se numesc camere de tip S (sandwich). Camerele de developare de tip S prezinta avantajul unui volum redus al fazei gazoase ceea ce duce la o viteza de saturare mai mare si o durata mai mica a procesului de separare. Elutia are loc dupa introducerea placii in camera cromatografica, pana cand amestecul de solventi atinge o inaltime finala, fixata de obicei intre 5 si 18 cm , sau dupa un anumit timp stabilit, in prestabilit prin incercari preliminare. Solventii utilizati se aleg in functie de proprietatile de elutie ale substantelor supuse
separarii ( analize prin CSS). Natura acetora depinde nu numai de substantele implicate, dar si de mecanismul de separare propus, respectiv de faza stationara avuta la dispozitie.
Fig. 3 Camere cromatografice uzuale în cromatografia planara După eluţie placa de developare se scoate şi se usucă. Daca substanţele separate sunt incolore, ele trebuie “vizualizate” cu ajutorul unor reactivi cu care se obţin compuşi
coloraţi. Acest proces se mai numeşte şi revelare. Vizualizarea componenţilor pe placa cromatografică se poate realiza astfel:
Scufundarea plăcii cromatografice într-un reactiv ( de exemplu, acidul sulfuric concentrat care va carboniza la cald, la 120 ºC substanţele organice separate pe placă).
Pulverizarea cu soluţia reactivului cu ajutorul unui pulverizator;
Introducerea într-o atmosferă ce conţine gaze reactive (de exemplu vapori de iod care reacţionează cu legaturile duble )
Plăcile cromatografice se pot vizualiza şi prin introducerea în etuvă, la cald, când au loc reacţii chimice.
Se pot folosi plăci impregnate cu o substanţă fluorscentă, de exemplu ZnS sau fluoresceina. Prin examinarea cromatogramelor eluate şi uscate în lumină UV se vor observa spoturi închise la culoare sau colorate pe un fond fluorescent , luminos. Când substanţele separate sunt fluorescente, nu mai este nevoie de fondul fluorescent.
Utilzarea de placi cu straturi subtiri continand amestecuri de luminofori. In acest caz placile au o culoare compusa ( de regula lumina emanand din trei substante luminescente avand culori diferite). Fiecare luminofor emite la o alta lungime de unda, iar substantele separate prin cromatografia planara absorb diferit lumina, astfel incat fiecare component de pe placa va avea o alta culoare. In aceast caz detectia este mai sigura , caci difera atat pozitia relativa a spoturilor pe placa cat si culoarea acestora.
Fig. 4 Aspectul plăcilor cromatografice după vizualizare . A spoturi fluorescente in lumină UV ; B – spoturi vizualizate în lumină vizibilă Faze mobile şi faze staţionare In cromatografia planara sunt posibile mai multe mecanisme de separare: (1) Cromatografia de adsorbtie; (2) Cromatografia de repartitie ( cu faze directe si cu faze inversate); (3) Cromatografia de schilm ionic ; (4) Cromatografia de excluziune sterica.
Fazele stationare utlizate sunt: silicagel, alumina, celuloza sau derivati ai acestora cum este silicagelul silanizat avand grefate cu 8sau 18 atomi de carbon care sunt echivalente cu o pelicula de faza nepolara depusa pe granula suport.
Conditiile pe care trebuie să le îndeplinească fazele mobile. Clasificarea lor în serii eluotrope
Pentru facilitarea selecţiei fazei mobile necesare separării unui amestec, s-au ordonat solventii în ordinea puterii lor de separare in serii eluotrope (tabelul 1). Se observă că locul şi ordinea unor solvenţi diferă. Aceasta datorita faptului că pe lângă ,,taria” solventului, în sistemul cromatografic mai actionează şi alţi factori care pe ansamblu produc modificări în comportarea solvenţilor. Alegerea fazei mobile. Legătura dintre structura chimică a substanţelor şi comportarea lor cromatografică Alegerea fazei mobile reprezintă pasul cel mai dificil în CSS. Alegerea developanţilor se realizează, in primul rand, in funcţie de structura şi proprietătile substanelor de separat şi anume: - substanţe de separat care conţin grupe puternic polare ca: -OH, -COOH, - NH2,
-CONH2, -CHO, -SO3H;
- substanţe de separat care conţin grupe semipolare ca: >C=O, -NR3, -NO2, -COOR; - substanţe de separat care conţin grupe nepolare ca: -CH3, cicluri aromatice; - substanţe de separat ce conţin grupe mixte. Daca faza staționară aleasă este polară (silicagel, poliamida, oxid de magneziu hidratat), grupele polare dintr-o molecula vor micşora valorile Rf ale componentilor respectivi, iar grupele nepolare le vor mări. În CSS majoritatea legaturilor care intervin între substanţele de separat şi cele douã faze (stationarã şi mobilã) sunt legãturi polare. Se poate considera o moleculă mai polară decât alta, acea moleculă care este mai puternic reţinută pe suprafaţa adsorbantă polară, de exemplu, la separarea unui amestec de substanţe folosind ca adsorbant silicagelul şi ca developant benzenul, se consideră ca find mai polara substanta cu valoarea Rf mai mică (silicagelul find mai polar decât benzenul).
Dacă, din contră se foloseşte o fază mobilã mai polarã decât silicagelul, va fi considerată mai polară substanţa cu valoarea Rf cea mai mare.
Principalii adsorbanti folosiţi în CSS Adsorbanţii utilizaţi în CSS nu sunt în număr foarte mare, dar printr-o tratare prealabilă potrivită se pot obţine trepte de activare cu puteri de adsorbţie diferite. Pentru ca un adsorbant să poată fi utilizat în CSS trebuie să îndeplinească următoarele condiţii: Să nu reacţioneze cu substanţele de separat sau cu developanţii; Să nu reacţioneze cu reactivul de identificare; Să reziste la t> 100º C la care trebuie uneori încălzite plăcile; Să aibă suprafaţa specifică mare, respectiv granulaţia fină (sub 100 μm) şi număr mare de pori de diametru mic.