Cours Biotransformation M1 SAQ Partie I [PDF]

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Cours : Conception d’un bioréacteur Master I, SAQ Dr Meziane

Introduction générale : De nos jours, L’utilisation durable des ressources est un enjeu important. Les déchets organiques sont des matières premières sous-valorisées, notamment sur le plan économique et écologique. La microbiologie industrielle est l’un des domaines qui couvre l'ensemble des procédés de bioconversion ou biosynthèse réalisé par un microorganisme à des fins agricoles, médicales, alimentaires…. Elle concerne l'utilisation des microorganismes dans la production de substances organiques (éthanol, glycérol, acétate, propionate…), d’antibiotiques, de composés pharmaceutiques et d’additifs alimentaires…. Elle permet de transformer un produit alimentaire en un aliment plus accessible par l'amélioration des qualités nutritionnelles et l'augmentation des qualités organoleptiques. La transformation des produits alimentaires se fait souvent par voie enzymatique plutôt que par voie chimique, ce qui permet de réduire la consommation d'énergie et de générer moins de déchets. La transformation des produits alimentaires se fait souvent par voie enzymatique plutôt que par voie chimique, ce qui permet de réduire la consommation d'énergie et de générer moins de déchets. La fermentation l’un des procédés de cette transformation, peut se produire en l'absence d'oxygène (fermentation anaérobie) comme la transformation du sucre en C02 et alcool sous l'influence des levures. Elle peut également se produire à l'air libre (fermentation aérobie) comme la transformation d'alcool en acide acétique. Bien avant que Pasteur ait démontré que la fermentation était provoquée par des cellules vivantes, les microorganismes étaient déjà exploités par l’homme. Ainsi 7 000 ans avant JésusChrist, les Sumériens utilisaient la plus ancienne fermentation connue, la conversion du sucre en alcool, pour fabriquer de la bière. 4000 ans avant J C, les Egyptiens employaient la levure pour faire lever la pate à pain. Le terme de fermentation est apparu au XVIème siècle, il vient du latin fervere :bouillir (dégagement de CO2 dans un mout de vinification) Pasteur l’a défini comme « la vie en absence d’oxygène ». Les premiers procédés industriels de fermentation ont été les versions extrapolées de ces recettes domestiques.  Définition scientifique : Il faut attendre Louis Pasteur, vers le milieu du XIXe siècle, pour avoir une vision rationnelle et scientifique des phénomènes impliqués. Pasteur va donner la première définition scientifique de la fermentation : « La fermentation, c’est la vie sans air » ; cette première définition est élaborée à la suite de ces travaux sur la bière et convient très bien à toutes les fermentations liquides traditionnelles. Par la suite, cette définition a été précisée et les fermentations, au sens scientifique, sont des métabolismes énergétiques anaérobies intracellulaires à base de molécules organiques, et s’opposent aux respirations qui sont les autres grandes voies métaboliques énergétiques. Pour satisfaire les besoins de plus en plus importants, de nouvelles dimensions se sont développées à partir de la capacité des microorganismes à produire en quantité importante, des métabolites primaires ou secondaires d’intérêt industriel, intéressant la plupart des grands secteurs de l’activité économique: chimie, pharmacie, énergie, alimentation, agriculture et environnement.Les réactions de fermentations est un processus qui fait appel à des microorganismes qui se développent en consommant une partie d’un réactif appelé substrat et en transformant l’autre en divers produit.  Définition industrielle :

À la suite des travaux de Pasteur, de nombreuses applications industrielles de la fermentation en milieu liquide ont vu le jour. Les industriels se sont très vite aperçus que certains micro-organismes aérobies produisaient aussi des métabolites d’intérêt et ont donc modifié les appareils utilisés « les fermenteurs » pour y cultiver aussi les organismes aérobies. Cela a entraîné la dérive du sens « fermentation », qui aujourd’hui dans l’industrie, est relatif à tout procédé faisant intervenir une culture microbienne qu’elle soit anaérobie ou aérobie d’une part, mais aussi qu’elle se passe en phase solide ou en phase liquide. Le mot fermentation présente deux significations différentes pour les biochimistes et les microbiologistes industriels. En biochimie, les fermentations sont des voies cataboliques anaérobies au cours desquelles des composés organiques servent à la fois de donneurs et d’accepteurs d’électrons, la synthèse d’ATP étant réalisée par phosphorylation au niveau du substrat. En microbiologie industrielle, le terme de fermentation désigne l’opération unitaire qui permet de produire de la biomasse ou des produits de bioconversion par la culture de microorganismes. Ainsi, contrairement au sens biochimique, le terme de fermentation industrielle ne se réfère pas au métabolisme du micro-organisme. Ce terme s’applique en industrie pour des métabolismes aérobies et anaérobies. Selon Afnor NFX 42-2000 -1996: La fermentation se définit par:  « la dégradation des substrats glucidiques sans utilisation d’oxygène ».  « Bio-fermentation qui utilisent les microorganismes ». Plus récemment, au 21éme siècle: la fermentation est l’oxydation des composés sans utilisation d’oxygéne grâce à des systèmes enzymatiques».

Chapitre I : Conception d’un bioréacteur Les critères de conception d’un fermenteur industriel découlent de la réaction biologique de fermentation que l’on souhaite mettre en œuvre dans le but de produire soit de la biomasse soit des molécules contenues dans le microorganisme ou produites par ce dernier (acide organique, acides aminés). En fonction du métabolisme sélectionné, les critères de stérilité, de transfert de matière, de gaz et de transfert de chaleur imposent des conditions de calcul qui gouvernent la conception du fermenteur. Au centre de ce diaspositive de fermentation, se trouve le bioréacteur ou fermenteur (recipient) dans lequel, pour que se déroule le processus microbiologique, les phases biotiques et les phases abiotiques du système sont mises en présence l’une de l’autre. 1.1. Définitions : Un bioréacteur, appelé également fermenteur ou propagateur, est un appareil dans lequel on multiplie des micro-organismes (levures, bactéries, champignons microscopiques, algues, cellules animales et végétales) pour la production de biomasse (écologie), ou pour la production d'un métabolite ou encore la bioconversion d'une molécule d'intérêt. A coté de cette installation de fermenteur , divers matériel tel que les cuves et les échangeurs de chaleur pour préparer et stériliser le milieu de culture,une centrale de production, de traitement et de stérilisation des gaz (O2, CO2….). enfin, le matériel de régulation et d’automatisation, relient les éléments entre eux, permet de faciliter la conduite de l’installation et de maîtriser le processus avec une meilleure sécurité. 1 : Entrée d’air muni d’un filtre ou tuyau d’échantillonnage 2: Enveloppe de refroidissement 3 :Entréed’eau de refroidissement 4 : Moteur pour agitation 5 : Manomètre 6 :Sortie d’eau de refroidissement 7 : Pales pour agitation 8 : Tuyau de vidange

Figure 1 : Schéma d’un bioréacteur 1.2. Bases microbiologiques de la conception d’un bioréacteur: Un bioréacteur comporte : · Une cuve ou enceinte en verre (pour les modèles de laboratoire) ou en acier inoxydable · Un bouchon si nécessaire pour ne pas laisser passer l'air du milieu intérieur et celui du milieu extérieur · Une seringue avec cathéter pour injecter une solution · Un système d'agitation comportant une ou plusieurs turbines selon leur taille

· Des capteurs pour la mesure de la température (thermomètre), du pH (pH-mètre), de la concentration en oxygène dissous (sonde oxymétrique), du niveau… · Un système de contrôle-commande géré par ordinateur permettant d'enregistrer et piloter tous les paramètres de fonctionnement Les différents paramètres qui interagissent au cours de la fermentation: - l’apport des substrats et réactifs permet de favoriser le développement des microorganismes et exerce donc une influence sur le comportement cinétique de la population microbienne présent. - l’aération et l’agitation permettent aux microorganismes de se répartir de façon homogène, et que l’oxygène nécessaire soit apporté et la température optimale maintenue, - la concentration cellulaire augmente, la concentration en produit synthétisé par le microorganisme aussi, tandis que le milieu s’appauvrit en substrat, au fur et à mesure que le développement microbien se poursuit, - des modifications de fonctionnement, les transferts ne s’effectuent plus de la même aux changements des caractéristiques rhéologiques et chimiques du milieu. D’où la nécessité d’agir sur les modalités de fonctionnement (puissance d’agitation, débit d’air, ajout de substrat, de réactifs) pour faire en sorte que la population microbienne soit à tout moment dans les meilleures conditions et que son comportement cinétique soit optimal.

P : puissance consommée l’agitateur Kgm/s : Xconcentration en biomasse g/l Rp : vitesse de production de métabolites g/l.h Rx : vitesse de production de biomasse g/l.h Rs :vitesse de consommation de substrat g/l.h

P, X R0 : vitesse de consommation d’oxygène m mol/l.h

P

Cl : concentration d’oxygène dissout dans la phase liquide ppm

Rp

X

ө : tension superficielle mj/m2 η : viscosité dynamique

Cinétique Rx, Rs, R0

X

N : vitesse de rotation tours/s V : volume de la culture ou m3

Réactifs TM : temps de mélange s

Milieu pH, T, Cl, ө, η Transfert

Substrat (s)KT : cœfficient d’échange thermique Qa :débit d’aération m/s

Kla : coéfficient volumétrique de transfet . Agitation - aération Figure 2: Schéma des bases microbiologiques de la conception des bioréacteurs.

N, P/V, TM, KT, Qa KLa

: d é b i t d ’ a

1.3. Critères de conception d’un fermenteur industriel: Les bioréacteurs sont conçus tel qu’ils doivent assurer 4 grandes fonctions : - transferts de matière; - bon transfert de chaleur; - maintien de la stérilité ; - suivi des paramètres et conduite de régulations. Les critères de conception selon : - le type de processus microbiologique (ex : en aérobiose ou anaérobiose) ; - le type de microorganisme, le bioréacteur doit permettre un contact parfait entre les deux phases (biotique et abiotique). - le transfert de matière entre cellule et milieu de culture (substrat – cellule – produit). * Dans le cas des processus aérobies : un bon transfert d’oxygène facilite le transfert de chaleur du milieu vers les cellules (au début du processus) puis des cellules vers l’extérieur (réactions exothermiques). Pour éviter les risques de contamination ,la conception du bioréacteur doit être faite de manière à assurer leur étanchéité surtout au niveau du point d’intersection de l’arbre d’agitation et les parois du couvercle dans le cas des bioréacteurs parfaitement agité qui s’avèrent les plus fragiles aux contaminations. 1.4. Objectifs :  Obtention d’une biomasse servant : -Soit d’aliment (levures comme compléments nutritionnels); -Soit à la fabrication d’aliment (levures pour fabrication de pain, moisissures pour fromages ….).  Synthése de molécules d’intérêt alimentaire, médical ou industriel(acide citrique , pénicilline …). *Un bioréacteur de laboratoire est une cuve accueillant 1à5 L en général; *Un bioréacteur industriel est une une cuve accueillant de quelques centaines de L à plusieurs mᴈ.

Chapitre II: Mode de Conduite Des Bioréacteurs La performance des bioréacteurs dépend de :  Leurs conception interne, • Leurs dispersion du gaz (aération et agitation), • Leurs modes opératoires. Les fermenteurs sont constitués d'une cuve principale et d'un certains nombre de systèmes périphérique. La mise en oeuvre de la fermentation implique la préparation du milieu de cultures, obtenu par un mélange aqueux de différents ingrédients nécessaires à la croissance du microorganisme et à la production du métabolite recherché. 2.1. Description de l’installation du bioréacteur: L'installation prévoit une ou plusieurs cuves de préparations du milieu de cultures, des cuves de stockages des différents réactifs nécessaires au bon fonctionnement des fermenteurs. Durant le déroulement de la fermentation : - Le milieu de culture est ajouté dans le fermenteur au fur et à mesure de sa transformation par les microorganismes, - Les réactifs de corrections du pH (acide-base) les composés sécrétés au cours de la fermentation par les microorganismes (les processus microbiologiques sont très souvent acidogènes), - Les réactifs anti- mousses évitent le débordement du milieu, - Les composés divers sont ajoutés (parfois nécessaires à la biosynthèse des métabolites recherchés. L'installation est aussi conçue pour permettre le contrôle et l'automatisation des différents paramètres (stérilisation, maintien de l'asepsie, distribution d'air dans le cas des aérobies, réduction ou élimination de la mousse et transfert des fluides et des suspensions d'une cuve à l'autre). 2.1. Les conditions de la fermentation : 2.1.1. La stérilisation et le maintien de l'asepsie : Toutes les fermentations ne nécessitent pas des conditions d'asepsies très rigoureuses ; aussi les degrés d'exigences de stérilisations varient selon les différentes actions microbiennes. Exemples :  Cas d ' un e fermentation acétique ou alcoolique : De par sa composition ce milieu de culture est très défavorable aux développements des microorganismes de contaminations.  Cas où le milieu de culture est riche en substances nutritives (pour satisfaire les besoins des microorganismes exigeants) ou possède un pH voisin de la neutralité : Ce milieu nécessite des conditions d'asepsies très strictes ; dans ce cas on a recours à la stérilisation et à des précautions particulières de maintien de l'asepsie plus strictes.  Cas d’une fermentation destinée à la production de vaccins : Sa culture implique des microorganismes pathogènes. Elle peut poser des difficultés supplémentaires puisque dans ce cas on redoute les microorganismes de contaminations et surtout on doit éviter que la souche, agent de production se propage à l'extérieur du fermenteur étant donné le risque que peut pendre le personnel. 2.1.1.1. La stérilisation du milieu de culture Elle est basée sur l'application des lois classiques de destructions des microorganismes par la chaleur sur la base de la stérilité pratique. La stérilisation peut s'effectuer selon différents procédés qui sont :

- La stérilisation du milieu de culture en discontinue, - La stérilisation dans le bioréacteur. 2.1.1.2. La stérilisation des périphériques : Les dispositifs périphériques de l'installation tels que les circuits de distributions d'air et d'évacuations de gaz du bioréacteur doivent être stérilisés. Pour cela on utilise la vapeur produite par la stérilisation du milieu de culture lorsqu'elle a lieu dans le biréacteur. Il faut aussi isoler les circuits de telle façon à pouvoir maîtriser leur entretien. Des contaminations peuvent se produire aux différents points de communications du bioréacteur avec l'extérieur (vannes de prélèvements et de vidanges). Tous ces points devront être maîtrisés car toute réduction de diamètre des conduites est susceptible d'apporter des proliférations microbiennes. -Les vannes : Elles peuvent provoquer des risques de contaminations au niveau de la tige de la vanne, bien que protégée par une presse étoupe (appareil adapté à la vanne pour empêcher les fuites), par l'introduction des microorganismes à cause des mouvements répétés et le fait qu’elle soit difficile à nettoyer. - Les pompes : On emploi des pompes sur des circuits aseptiques qu'en cas de nécessité. -Les dispositifs anti mousses : Certains fermenteurs s’accompagnent d'une forte production de mousses, il faut les réduire pour empêcher les bioréacteurs de déborder par des moyens chimiques et mécaniques. 2.2. Types de procédés de fermentation : Disposant d’une souche bactérienne dont on connait le comportement cinétique et les valeurs des paramètres à optimiser, la productivité du procédé de mise en œuvre est étroitement liée au mode de conduite du bioréacteur utilisé. Dans un bioréacteur, le milieu de culture peut se définir : - comme le milieu permettant la production de la biomasse, - comme le milieu permettant la synthèse du produit désiré, Il contient une source de carbone, d’azote, d’O2 (pour une culture aérobie),d’H2, d’oligo-éléments, de vitamines , des facteurs de croissance et de précurseurs métaboliques. Des agents anti-mousses et des produits chimiques tampons peuvent être également dans le milieu . La conception du biréacteur contribue à: un bon transfert entre les cellules et le milieu de culture. Un bon transfert d’oxygéne (processus aérobique); On distingue trois 3 modes de conduite pour alimenter et soutirer du milieu de culture aux bioréacteurs: -- le procédé batch ou fermentation discontinue ; -- le procédé fed-batch ou fermentation discontinue alimentée ; --le procédé de fermentation de culture en continu (voir fig n° 3)

Figure 3 : Types de procédés de fermentation 2.2.1.Critéres de classement de ces bioréacteurs: 1.Le mode d’introduction des réactifs et de soustraction des produits: 2. L’évolution dans le temps des microorganismes : -vitesse d’obtention des produits ; -comportement des microorganimes avec les réactifs. 3- Degré de mélange dans le bioréacteur (homogénisation du mélange. 2.2.2.Procédé discontinu (batch) (non Alimenté) : a. Principe : Le procédé est réalisé dans un système clos dans lequel un même volume de milieu non renouvelé est utilisé pour la croissance des micro-organismes ; la quantité de nutriments est donc limitée. - Aucun apport ni prélèvement n’est réalisé ; - La réaction se déroule à volume constant. - Les seules actions possibles de l'opérateur ne concernent que les variables d'environnement (pH, température, vitesse d'agitation, aération,...). Dans le fermenteur, au cours de l'incubation :  la quantité de microorganismes,  la concentration en biomasse, en substrat et en produit varie constamment, en conséquence du métabolisme microbien. Dans la fermentation discontinue, on introduit le milieu de culture frais, on utilise des petits volumes. Une fois le bioréacteur rempli de milieu de culture et stérilisé, l’innoculum est introduit et on laisse se dérouler la fermentation. - Durant le temps de fermentation, le milieu reste homogène et pas d’introduction de milieu de culture. Un réactif de neutralisation (faible quantité) et encore un peu de produits d’anti – mousses. -Le produit fini est soustrait qu’à la fin de la fermentation. - La concentration en biomasse augmente selon la courbe de croissance microbienne en proportion avec la quantité de substrat consommé.

Productivité faible

Figure 4 : Schéma d’une fermentation discontinue, mode batch La courbe de croissance microbienne en mode discontinu fait apparaître différentes phases : Les phases de latence et d’accélération correspondent à une période d’adaptation métabolique du micro-organisme au milieu. La phase de latence sera réduite au maximum en fermentation industrielle. La phase exponentielle de croissance est la phase au cours de laquelle la vitesse spécifique de croissance est maximum. La quantité de nutriments est en excès et la biomasse augmente donc le plus rapidement. Les produits formés au cours de cette phase sont les métabolites primaires.

Figure 5 : Cinétique de croissance bactérienne en milieu non renouvelé (Batch)  Avantages :  limite la contamination par d’autres micro-organismes et permet donc de rester plus longtemps dans des conditions axéniques.  Du fait de sa simplicité, c’est le système le plus utilisé dans l’industrie pour produire un métabolite ou une biomasse.  Contraintes:  Il est mal adapté à un échantillonnage à haute fréquence qui pourrait significativement modifier son volume.  L’apport initial d’une quantité élevée de substrat inhibe généralement la croissance des microorganismes qui le consomment, ce qui se traduit par des durées de traitement allongées, et limite la charge initiale admissible (Queinnec, 2000). 2.2.3. Procédé semi-continu (ou feed-batch) (bath alimenté):

Le substrat est apporté au fur et à mesure de sa consommation par les microorganismes. Ce système est employé dans la production de la pénicilline. Celle-ci est soumise à une répression catabolique lors de la présence d'une forte concentration de substrat carboné (le glucose). L'ajout du substrat au fur et à mesure de sa consommation afin d'éviter l'accumulation de substrat dans la réaction. La croissance démarre plus vite étant donné que le volume de culture peut être réduit. La concentration obtenue peut alors être plus élevée qu’en mode batch. Dans la fermentation discontinue, le bioréacteur est alimenté par des ajouts successifs de milieux ou de substrats (éviter la toxicité ou l’épuisement du substrat) . On procède différemment :  Soit on utilise au départ un petit milieu, puis on ajoute en continu du substrat dilué, le volume augmente fortement et la concentration de la biomasse varie peu.  Soit on utilise au départ un grand volume, et on ajoute en continu du substrat concentré, Le volume augmente peu à peu et considéré comme constant alors que la concentration de la biomasse augmente.

Figure 6 : Schéma d’une fermentation discontinue, mode batch Le volume dans la cuve augmente alors au cours du temps. Le débit est réglé de façon que la concentration en substrat soit constante dans la cuve et que l’effet de dilution ne soit pas inhibiteur de la production de biomasse. Lorsque la cuve est remplie, l’alimentation est coupée : la conduite est alors en mode discontinu.  Avantages : Ce mode de fonctionnement permet un meilleur contrôle des conditions de croissance, il permet en pratique un gain de temps, une augmentation de productivité et une possibilité de modification du milieu en cours de culture Le bioréacteur étant le plus souvent alimenté par un débit contrôlé en boucle fermée (Carmaux, 2008).  Contraintes: Il suppose un arrêt de la réaction lorsque le volume atteint une certaine valeur (risque de débordement ou impossibilité d'assurer une aération correcte, ....). Le risque de contamination est élevé (Eibl et Eibl, 2009).