Celula Şi Mediul Intern [PDF]

Zitiervorschau

FIZIOLOGIE UMANA CELULA SI MEDIUL INTERN

Dragomir Nicolae Serban Ionela Lăcrămioara Serban Walther Bild

EDITURA PIM Iaşi – 2008

Prefaţă Această carte prezintă noţiuni de bază din fiziologia umană. Prima parte se referă la funcţiile generale ale celulelor, la care am adăugat transmiterea sinaptică şi contracţia musculară. Partea a doua prezintă sângele, ca factor pasiv în asigurarea condiţiilor de viaţă pentru celule şi ca factor activ în apărare şi hemostază. Cartea este destinată studenţilor de la Programul de Licenţă în Medicină şi de la Colegiul Medical Universitar, dar poate fi utilizată şi de către studenţii Facultăţilor de Biologie, ai secţiilor de Biofizică, şi de alţi cititori care au cunoştinţe de biologie, chimie şi fizică la nivel de liceu şi sunt interesaţi de rolurile şi mecanismele proceselor biologice din corpul uman. Ea poate fi un instrument util şi pentru persoane implicate în sistemul de asigurare a sănătăţii sau în cercetarea biomedicală. Considerăm că noţiunile de fiziologie celulară şi a mediului intern sunt cea mai potrivită introducere în studiul fiziologiei umane. Cuprinderea şi profunzimea informaţiilor s-a dorit a fi în conformitate cu cerinţele pregătirii studenţilor la medicină, pentru examenele de fiziologie şi nu numai, pentru a le oferi un instrument de lucru cu informaţie suficientă, dar accesibil comparativ cu tratatele consacrate care le sunt destinate. In acest demers am pornit tocmai de la necesitatea unui astfel de material, util pentru trecerea studenţilor de la prelegerile şi lucrările practice pe care le oferim la studiul aprofundat, la nivel de tratate, monografii, reviste de specialitate. Textul nostru se bazează pe o experienţă didactică proprie de durată şi este natural influenţat de tradiţia şcolii medicale de la Iaşi, de tratatele de fiziologie1 pe care ne-am sprijinit activitatea şi de interesele noastre de cercetare. Dedicăm modesta noastră lucrare marilor dascăli care ne-au îndrumat pe drumul cunoaşterii şi al vieţii, din şcoala primară şi până azi. Dragomir Nicolae Serban Ionela Lăcrămioarara Serban Walther Bild 1

Cu puţine excepţii, cartea de faţă conţine numai informaţii de specialitate de uz comun (publice şi bine-cunoscute, inclusiv conţinutul ilustraţiilor), care se regăsesc în diverse forme în multe lucrări didactice (unde nu sunt citate studiile originale în cauză), un grad de asemănare cu aceste lucrări fiind inevitabil. In limitele impuse de acurateţea informaţiei, textul, tabelele şi figurile din volumul de faţă sunt originale sub aspectul formei, asigurându-se astfel respectarea proprietăţii intelectuale (indicaţii bibliografice succinte au fost introduse numai unde a fost cazul).

CUPRINS FIZIOLOGIE CELULARA - D. N. Serban, W. Bild 1. Organizarea şi proprietăţile fundamentale ale materiei vii 2. Organitele celulare 2.1. Specializările funcţionale ale organitelor celulare 2.2. Stocarea energiei metabolice 2.3. Nucleul, ribozomii, sinteza proteică, diviziunea celulară 3. Ciclul celular 3.1. Fazele ciclului celular 3.2. Faza G1 3.3. Faza S 3.4. Replicarea ADN 3.5. Faza G2 şi punctul de control G2/M 3.6. Mitoza şi citokineza 3.7. Meioza 4. Apoptoza 4.1. Evoluţia apoptozei 4.2. Cauzele apoptozei 4.3. Semnalele şi căile care induc apoptoza 5. Membrana celulară şi comunicarea celulei cu mediul 5.1. Structura membranei celulare 5.2. Permeabilitatea ionică şi potenţialul transmembranar 5.3. Clasificarea formelor de transport transmembranar 5.4. Difuziunea prin membrane 5.5. Osmoza 5.6. Canale ionice membranare 5.7. Transportori moleculari membranari 5.8. Potenţialul transmembranar şi modificările sale 5.9. Receptori membranari şi sisteme de semnalizare intracelulară 5.10. Joncţiuni celulare 5.11. Traficul celular al membranelor fosfolipidice 5.12. Exocitoza ca mecanism secretor 6. Transmiterea sinaptică 6.1. Organizarea funcţională a sinapsei

1 4 5 7 10 12 13 15 17 18 22 22 28 33 35 35 37 39 40 46 47 48 51 53 60 65 72 116 118 122 123 123

6.2. Placa motorie 6.2. Mecanismul eliberării mediatorilor sinaptici 6.3. Efectele postsinaptice şi presinaptice ale mediatorilor 7. Motoarele moleculare şi contracţia musculară 7.1. Motoare moleculare 7.1. Fiziologia miocitului striat scheletic 7.2. Fiziologia miocitului neted

125 127 129 130 130 130 141

FIZIOLOGIA SANGELUI – I. L. Serban, D. N. Serban 8. Introducere în fiziologia sângelui 8.1. Compartimentele hidrice ale organismului 8.2. Rolul sângelui în susţinerea funcţiilor de nutriţie 8.3. Proprietăţi fizico-chimice ale sângelui 8.4. Alcătuirea generală a sângelui 8.5. Compoziţia chimică a plasmei sanguine 8.6. Proteinele plasmatice 9. Hematopoeza 9.1. Celula stem şi celulele progenitoare 9.2. Factorii de creştere implicaţi în hematopoeză 9.3. Eritropoeza 9.4. Leucopoeza 9.5. Trombopoeza 10. Hematiile 10.1. Membrana eritrocitară 10.2. Hemoglobina 10.3. Distrugerea eritrocitelor 10.4. Constante eritrocitare 10.5. Grupele sanguine 11. Leucocitele 11.1. Neutrofilele 11.2. Eozinofilele 11.3. Bazofilele 11.4. Monocitele 11.5. Limfocitele 12. Ansamblul reacţiilor de apărare

152 152 153 154 155 156 158 162 164 165 165 169 171 172 172 174 177 178 179 183 183 183 184 184 185 185

12.1. Inflamaţia 12.2. Fagocitoza 12.3. Activarea sistemului complement 12.4. Imunitatea specifică sau dobândită 12.5. Complexul major de histocompatibilitate şi imunitatea 12.6. Limfocitele T 12.7. Limfocitele B 12.8. Mecanismele răspunsurilor imune 13. Hemostaza fiziologică 13.1. Aderarea, agregarea şi secreţia plachetară 13.2. Coagularea sângelui

186 188 189 189 190 192 194 199 202 203 207

FIZIOLOGIE CELULARA

1. Organizarea şi proprietăţile fundamentale ale materiei vii Obiectul de studiu al fiziologiei Stiinţele fiziologice reprezintă pentru domeniul biomedical ceea ce înseamnă fizica pentru ştiinţele naturii. In ansamblu fiziologia1 descrie mecanismele şi rolurile fenomenelor din materia vie. Ca rezultat direct al progresului cunoaşterii, numeroase aspecte esenţialmente fiziologice sunt descrise cu precădere în cadrul unor discipline de studiu (domenii ştiinţifice) înrudite: biofizică, biochimie, biologie celulară şi moleculară, genetică, imunologie, etc. Pornind de la aspectele generale şi particulare ale funcţiilor celulare, fiziologia pe de o parte le analizează până la nivel molecular şi pe de altă parte descrie integrarea treptată a acestora la nivel de organ, sistem funcţional şi organism în cadrul “marilor funcţii”: de nutritiţie (digestia, respiraţia, excreţia, circulaţia), de apărare împotriva microorganismelor, de reproducere, de comandă şi control (reglarea integrativă neuro-endocrină a funcţiilor menţionate), de integrare somato-vegetativă şi relaţie cu mediul (funcţii senzitivo-senzoriale, somato-motorii, psiho-comportamentale). Energia metabolică şi organizarea celulară a materiei vii Esenţa vieţii (a tuturor fenomenelor biologice) constă în capacitatea sistemelor vii de a oxida gradat diferite substanţe, utilizând mare parte din energia chimică astfel eliberată pentru desfăşurarea anumitor reacţii chimice care consumă energie (reacţii endergonice). Ansamblul acestor transformări de nivel molecular se numeşte metabolism şi stă la baza vieţii, asigurând condiţiile energetice pentru fenomenele anti-entropice prin care sistemele vii asamblează, păstrează şi dezvoltă structuri proprii, care participă la diverse fenomene cu finalitate bine determinată (procese fiziologice). Celula este unitatea fundamentală a materii vii. La nivel celular se manifestă toate proprietăţile generale, fundamentale, ale materiei vii, adică metabolismul, excitabilitatea, mişcarea şi reproducerea. Aceste proprietăţi sunt asigurate morfo-funcţional la nivel subcelular în mod diferenţiat, prin specializările organitelor celulare. Unele aspecte ale vieţii sunt prezente (izolat şi incomplet), chiar şi la nivel de organite izolate şi de ansambluri supra-moleculare reconstituite artificial. Pe de altă parte, în organismul 1

Etimologia termenului fiziologie, introdus de Fernel în 1542, conduce spre înţelesul de “ştiinţa principiilor vieţii”.

1

FIZIOLOGIE CELULARA

uman celulele sunt diferenţiate morfo-funcţional pentru roluri specifice, iar procesele fiziologice celulare sunt integrate treptat, la nivel de ţesut, organ, aparat şi organism, rezultând manifestări cu o complexitate crescândă. Tesutul este o grupare de celule învecinate ce aparţin aceluiaşi tip tisular, adică au aceeaşi specializare morfo-funcţională (rezultată printr-un proces complex de diferenţiere celulară). Există patru tipuri tisulare majore; ţesut epitelial, muscular, nervos şi conjunctiv. Organele sunt grupări tisulare structurate în scopul integrării funcţiilor, care pot astfel să devină mai complexe, cu elemente calitativ superioare, ce nu se manifestă ca atare la simplul nivel celular sau tisular. La rândul lor organele formează sisteme funcţionale de organe, numite uneori aparate. Această complexă arhitectură funcţională bazată pe celule presupune existenţa unei varietăţi de conexiuni celulare şi de spaţii intercelulare. Cu rare excepţii spaţiile respective conţin un lichid extracelular, o soluţie apoasă ce reprezintă mediul de viaţă al celulelor, denumit generic mediu intern (vezi capitolul “Compartimentele hidrice ale organismului”). Relaţia dintre celule şi organism poate fi rezumată tocmai prin faptul că, pe lângă integrarea în scopul realizării de procese funcţionale complexe, organismul utilizează sistemele sale funcţionale pentru asigurarea condiţiilor adecvate pentru funcţionarea fiecărei celule (fig. 1). Este esenţial faptul că majoritatea celulelor nu sunt în contact cu mediul extern şi deci nu pot realiza direct cu acesta schimbul de substanţe necesar pentru metabolism. Sistemele care asigură funcţiile de nutriţie sunt organizate tocmai în acest scop, de intermediere a schimburilor dintre celule şi mediul extern (fig. 2). funcţii celulare

integrare

compoziţia mediului intern

sisteme funcţionale

Fig. 1. Schema generală de organizare funcţională a celulelor în organism

Organismele sunt şi ele organizate în nivele superioare, pe plan ecologic (populaţie, biocenoză şi ecosistem, biosferă) şi teoretic (sistematic şi filogenetic: populaţie, specie, gen, familie, clasă, încrengătură, regn). 2

FIZIOLOGIE CELULARA

mediu extern material ingerat Ö Ö Ö tub digestiv Ö Ö Ö material neabsorbit

inima stângă aport O2 aparat respirator eliminare CO2 inima dreaptă celule mediu intern

aparat excretor

Øurină Fig. 2. Sistemele funcţionale şi schimburile de substanţe în cadrul organismului

Proprietăţile fundamentale ale materiei vii Metabolismul cuprinde fenomene catabolice (litice) şi anabolice (sintetice). Catabolism înseamnă scindarea substanţelor complexe, cu eliberare de energie chimică de legătură, care este în parte stocată sub formă de energie metabolică, de fapt energia legăturilor fosfat macroergice din diferiţi compuşi, în special adenozin-trifosfat (ATP). Lanţurile de reacţii catabolice realizează de fapt un transfer treptat de electroni către atomii de oxigen, rezultând în final CO2 şi H2O, precum şi alţi produşi finali de catabolism, ce nu mai pot fi oxidaţi la nivel celular. Anabolism înseamnă sinteză de substanţe proprii, realizată cu consum de energie, adică pe baza energiei furnizate de catabolism prin intermediul ATP. Alte categorii de procese biochimice, ce se desfăşoară tot cu consum de energie metabolică, nu sunt reacţii anabolice propriu-zise, ci permit realizarea la nivel molecular a fenomenelor de mişcare direcţionată şi activă a substanţelor (transport activ transmembranar, circuite intracelulare ale proteinelor şi lipidelor, fenomene secretorii), precum şi a manifestărilor celulare electrice şi mecanice.

3

FIZIOLOGIE CELULARA

Excitabilitatea este proprietatea materiei vii de a răspunde, mai mult sau mai puţin specific, la acţiunea unui stimul adecvat. Stimulul (excitaţia) este o variaţie energetică din mediu şi poate induce răspunsul dacă este adecvat ca: formă energetică, amplitudine, durată de acţiune, bruscheţe (rată de transfer energetic). O formă particulară este “excitabilitatea electrică”, ce reprezintă prin definiţie capacitatea unei membrane celulare de a genera şi conduce semnale electrice speciale numite potenţiale de acţiune. Cuplarea dintre “starea de excitaţie” şi răspunsul celular propriu-zis este un fenomen deosebit de complex, care de obicei cuprinde o etapă de transducţie membranară şi mecanisme de semnalizare intracelulară. Există numeroase şi variate forme de mişcare celulară, bazate pe interacţiuni între proteine specializate. Cele două motoare moleculare principale sunt reprezentate de cuplul actină-miozină, baza contracţiei musculare, şi de cuplul tubulină-dineină, baza mişcării de tip ciliar-flagelar. Reproducerea celulară se realizează prin diviziune. Forma somatică de diviziune este mitoza, în care fiecare din cele două celule fiice primeşte o copie a întregii informaţii genetice prezente sub formă de acid dezoxiribonucleic (ADN) la nivel nuclear, în urma duplicării acesteia în cadrul fenomenului de replicare a ADN. Reproducerea sexuată a organismelor presupune formarea zigotului (celulă-ou) prin fuziunea gameţilor, celulele reproducătoare specializate, ce rezultă prin meioză şi au jumătate din numărul de cromozomi (haploide). 2. Organitele celulare Celula este alcătuită din membrană, citoplasmă şi nucleu (fig. 3). Componenta principală a membranei celulare este plasmalema, un bistrat fosfolipidic în care se găsesc proteine periferice şi integrale, la care se adaugă la exterior glicokalixul (cu compoziţie predominant glicoproteică), iar la interior specializări citoplasmatice submembranre (citoscheletul submembranar, reticulul endoplasmic superficial, etc.). Citoplasma e compartimentată prin sistemul de membrane fosfolipidice intracelulare. Organitele delimitate de membrane sunt de tip vezicular-canalicular: mitocondriile, veziculele de endocitoză, lizozomii, reticulul endoplasmic, aparatul Golgi, veziculele de exocitoză. Alte organite (nedelimitate de membrane) pot fi granulare, cum sunt ribozomii şi diverse incluziuni citoplasmatice, sau fibrilare, grupate într-un ansamblu morfo-funcţional numit citoschelet. 4

FIZIOLOGIE CELULARA

2.1. Specializările funcţionale ale organitelor celulare Ribozomii sunt granule libere în citosol sau ataşate reticulului endoplasmic şi reprezintă sediul sintezei proteice (translaţie). Secvenţa de aminoacizi din lanţul polipeptidic sintetizat la acest nivel este dictată de succesiunea codonilor (triplete de nucleotide) din acidul ribonucleic mesager (ARNm). Alte forme de ARN intră alături de proteine în structura ribozomilor (ARN ribozomal; ARNr) sau transferă aminoacizii din citosol la ribozomi (ARN de transfer; ARNt).

Fig. 3. Reprezentare schematică a structurii generale a celulelor

Mitocondriile sunt organite delimitate de membrană dublă, specializate pentru producţia de ATP. In matricea mitocondrială se desfăşoară ciclul acizilor tricarboxilici (Krebs), iar în cadrul membranei mitocondriale interne funcţionează lanţul enzimatic transportor de electroni (lanţul respirator), ce realizează gradientul protonic dintre spaţiul inter-membranar şi matricea mitocondrială, pe baza căruia funcţionează o ATP-sintază (fosforilarea ADP în acest caz unic se numeşte “oxidativă”). Reticulul endoplasmic este un ansamblu tubulo-vezicular cu rol în: transportul intracelular de substanţe2, stocarea şi eliberarea calciului, sinteza fosfolipidelor, acizilor graşi şi steroizilor. Porţiunile de reticul care prezintă

2

Rolurile reticulului endoplasmic, lizozomilor şi aparatului Golgi în dinamica celulară a membranelor fosfolipidice sunt descrise într-un capitol separat.

5

FIZIOLOGIE CELULARA

ribozomi ataşaţi (reticulul rugos) participă la sinteza proteinelor ce sunt eliberate direct în lumenul reticular. Aparatul Golgi este o formaţiune specializată din reticulul endoplasmic, constituită ca un ansamblu de cisterne turtite şi mici vezicule (vezicule de transfer dinspre reticul şi vezicule de exocitoză), cu rol în procesarea post-translaţională a proteinelor secretorii (glicozilare şi împachetare în vezicule de exocitoză) şi în direcţionarea proteinelor proprii. Lizozomii, formaţi la nivelul aparatului Golgi, sunt vezicule cu conţinut bogat de hidrolaze, ce realizează procese de digestie intracelulară a materialului de endocitoză (heterofagie, după fuziunea cu vezicule de endocitoză) sau a structurilor proprii (auto-fagie), cea din urmă mai ales în cadrul procesului de înlocuire permanentă a proteinelor pentru menţinerea funcţionalităţii lor. Peroxizomii sunt o categorie aparte de vezicule, cu conţinut bogat de enzime ce realizează procese chimice de oxidare puternică a conţinutului rezultat prin fuziunea cu alte vezicule. Citoscheletul este un ansamblu de filamente de natură proteică, cu diferenţieri regionale de compoziţie şi arhitectură, ce servesc diverse roluri funcţionale. După criterii structurale (fig.4) se descriu patru clase de filamente: microfilamente (implicate în menţinerea arhitecturii celulare), filamente intermediare (cu rol de ancorare a unor proteine membranare) filamentele groase de miozină şi microtubulii (formaţi din tubulină şi implicaţi în menţinerea formei celulare, motilitatea cililor şi flagelilor, în transportul vezicular şi în formarea şi funcţionarea fusului de diviziune). Microfilamentele sunt cele mai mari formaţiuni ale citoscheletului sunt alcătuite din actină, iar în celulele musculare şi din miozină. Microfilamentele reprezintă sistemul contractil al celulei, care asigură contracţia celulelor musculare, mişcările amiloide ale leucocitelor, mişcările filamentelor celulare. Filamentele intermediare au dimensiuni cuprinse între cele ale microtubulilor şi microfilamentelor şi se găsesc mai ales în celulele care suportă compresiuni mecanice. Reţeaua microtrabeculară este alcătuită din filamente foarte subţiri interconectate care traversează întreaga citoplasmă ancorându-se de faţa internă a plasmalemei. Organitele, microtubulii şi microfilamentele par a fi suspendate de reţeaua microtrabeculară. Reţeaua microtrabeculară constituie scheletul celulei conferind în acest mod unitate funcţională tuturor constituienţilor citoplasmatici. 6

FIZIOLOGIE CELULARA

Fig. 4. Clasele principale de filamente citoscheletice

In afară de organitele menţionate, comune tuturor celulelor, există varietăţi ale acestora, ce sunt caracteristice anumitor tipuri celulare. Un foarte bun exemplu este structurarea ultraspecializată a filamentelor de miozină şi actină în miofibrile cu organizare sarcomerică în fibrele musculare striate. In axonii neuronilor se constituie neurofilamente, în care tubulina participă la transportul axonal de substanţe. Unele celule epiteliale prezintă evaginări membranare filiforme ale plasmalemei numite cili, ce pot fi mobili prin prezenţa unei diferenţieri citoscheletice specifice. In timpul mitozei microtubulii formează fusul de diviziune, ce asigură migrarea către polii celulei a materialului genetic (cromatide în cazul mitozei sau cromozomi în cazul meiozei). 2.2. Stocarea energiei metabolice Desfăşurarea reacţiilor anabolice şi a celorlalte procese celulare consumatoare de energie necesită disponibilitatea acesteia într-o formă direct utilizabilă, uşor controlabilă şi în cantitate suficientă. Aceste criterii sunt îndeplinite de energia chimică din aşa-numitele legături fosfat macroergice (esterice fosfat-fosfat sau fosfat-substrat), din diverşi compuşi cum sunt creatin-fosfatul şi nucleotidele. Cel mai important compus din această clasă este de departe adenozin-trifosfatul (ATP). Reacţiile chimice care se desfăşoară cu consum de energie metabolică (sub forma principală de ATP) sunt catalizate direct de enzime cu activitate ATP-azică sau cuplate indirect cu hidroliza ATP, care furnizează astfel energia necesară.

7

FIZIOLOGIE CELULARA

Sinteza de ATP se realizează prin fosforilarea ADP, cuplată cu anumite reacţii din catabolismul nutrimentelor şi poate necesita sau nu prezenţa oxigenului. De aici provine de fapt distincţia conceptuală dintre metabolismul aerob şi cel anaerob, bazată pe diferenţa dintre mecanismele ce permit fosforilarea ADP: fosforilarea “de substrat” şi cea “oxidativă”. Cea mai mare parte a producţiei de ATP se realizează la nivel mitocondrial, dar contribuţia acesteia diferă în funcţie de tipul celular (de fapt în funcţie de numărul mitocondriilor şi încărcarea lor enzimatică), precum şi în funcţie de statusul metabolic şi de oxigenare al celulei. In matricea mitocondrială se desfăşoară secvenţa catabolică finală pentru toate nutrimentele, ciclul acizilor tricarboxilici (Krebs). Intr-un ciclu de reacţii3 este preluat un rest acetil de către o moleculă de coenzimă A, în final se eliberează două molecule de CO2, iar pe parcurs se fosforilează o moleculă de ADP şi se reduc trei molecule de nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD+) şi o moleculă de flavin-adenin-dinucleotid (FAD). Aceste coenzime sunt re-oxidate de către citocrom-oxidaze, la nivelul membranei mitocondriale interne, în cadrul lanţului enzimatic transportor de electroni (lanţul respirator). Enzimele respective preiau practic câte un atom de hidrogen de la coenzimele menţionate şi îl separă în proton şi electron. Protonii şi electronii respectivi sunt direcţionaţi după cum urmează (fig. 5). Protonii sunt eliberaţi în spaţiul intermembranar, menţinând gradientul electrochimic ce asigură funcţionarea unei ATP-sintaze din membrana mitocondrială internă. ATP-sintaza asigură un ciclu de reacţie în cadrul căruia un proton este transferat în sensul gradientului spre matrice, simultan cu fosforilarea unei molecule de ADP. Tot în membrana internă electronii sunt transferaţi în gradient redox către oxigenul molecular, reacţia finală având forma O2 + 4e- + 4H+ = 2H2O. Resturile acetil sunt introduse în ciclul Krebs de către acetil-coenzima A, care le preia din catabolismul nutrimentelor după cum urmează2. Glucoza este catabolizată până la piruvat cu producerea netă a 2 molecule de ATP şi 2 molecule de NADH, care pot fi reoxidate prin transformarea anaerobă a piruvatului în lactat. Conversia piruvatului în acetil-coenzimă A mai produce o moleculă de NADH. Aminoacizii sunt deaminaţi, iar acizii

3

Detaliile chimice referitoare la metabolismul energetic şi intermediar sunt subiect clasic de biochimie; aici sunt prezentate unele aspecte relevante din punct de vedere funcţional

8

FIZIOLOGIE CELULARA

carboxilici rezultaţi sunt convertiţi în piruvat sau un intermediar din ciclul Krebs. Glicerolul de provenienţă lipidică intră în calea glicolitică. Acizii graşi sunt catabolizaţi în matricea mitocondrială prin β-oxidare, un ciclu de reacţii în care intrarea se face prin conversie în acil-coenzimă A, cu dubla defosforilare a unei molecule de ATP. Apoi al treilea atom de carbon din lanţ este hidroxilat şi oxidat, cu producerea câte unei molecule de FADH2 şi NADH. In final se eliberează acetil-CoA, iar o altă moleculă de CoA reintroduce în ciclu acidul gras rezultat, mai scurt cu 2 atomi de carbon decât cel iniţial. MATRICEA MITOCONDRIAL

MEMBRANA INTERNA

SIM

CO2

NAD+ FAD

CICLUL KREBS

NADH

NADH

OXIDAZE Ö Ö H+ Ø e-e Ø lanţ Ø respirator Ø Ø O2 +4H++4e= H2 O

FADH2

ATP-sintaza

FADH2

glicoliza citosolică Ö piruvat Ö Acetil-CoA

NAD+ FAD

BETA OXIDAREA

H+

Acil-CoA ADP + P

ATP Fig. 5. Coenzimele respiratorii în stare redusă furnizează energia pentru menţinerea pH-ului scăzut din spaţiul intermembranar (SIM). Gradientul protonic asigură funcţionarea ATP-sintazei din membrana internă.

Calculele stoechiometrice arată următoarea producţie de molecule de ATP prin catabolizarea completă a unei molecule de nutriment: 30 pentru

9

FIZIOLOGIE CELULARA

glucoză, 124 pentru un acid gras cu 18 atomi de carbon, maximum 12,5 pentru aminoacizi (ciclu Krebs complet). Reglarea intrinsecă permanentă a metabolismului energetic se face prin concentraţia de ATP şi ADP, alosteric la nivelul etapelor enzimatice limitante de viteză. Exemplul tipic este controlul fosfofructokinazei, care este inhibată de NADH, citrat şi ATP şi este stimulată de ADP. La nivelul fosforilării oxidative ADP realizează “controlul respirator”; scăderea ADP inhibă lanţul respirator datorită gradientului protonic excesiv creat prin scăderea activităţii ATP-sintazei; în mod normal aceasta permite limitarea permanentă a creşterii gradientului protonic prin calea oferită pentru difuzia retrogradă (utilizată ca sursă de energie pentru sinteza ATP). 2.3. Nucleul, ribozomii, sinteza proteică, diviziunea celulară4 Toate organismele folosesc acizii nucleici ca suport al informaţiei genetice5. Cu excepţia hematiilor şi plachetelor sanguine, anucleate, toate celulele corpului uman prezintă unul sau mai mulţi nuclei. Nucleul este delimitat de o dublă membrană de tip bistrat fosfolipidic, cu pori de ~100 nm, ce asigură selecţia dimensională a moleculelor permeante. Conţinutul nuclear (nucleoplasma) cuprinde cromatina, formată din ADN şi proteine asociate. In cursul mitozei cromatina se organizează în cromozomi. Celulele somatice umane (diploide) conţin două seturi de cromozomi, fiecare cuprinzând 22 de cromozomi somatici şi cromozomul X sau Y, ce determină sexul: XX=feminin, XY=masculin. In multe cazuri este prezent în nucleoplasmă şi un nucleol, format din ARNr şi proteine de tip ribozomal, reprezentând tocmai locul de asamblare a ribozomilor. Acizii nucleici sunt lanţuri polinucleotidice monocatenare (ARN) sau bicatenare (ADN). Nucleotidele din acizii nucleici sunt derivaţi glicozilaţi (riboză, respectiv dezoxi-riboză) şi mono-fosforilaţi ai unor baze purinice (adenină, guanină) şi pirimidinice (timină, citozină, uracil). Codul genetic este un limbaj bazat pe trimeri nucleotidici numiţi codoni, care funcţionează prin complementaritatea (fig. 6) catenelor ADN surori, atât în cadrul replicării ADN (A-T, G-C), cât şi al transcripţiei sale în ARN (A-U, G-C). 4

Detalii privind ciclul celular sunt prezentate separat (cap. 6). Organismele unicelulare sunt eucariote sau procariote, după cum materialul genetic, reprezentat de acidul dezoxiribonucleic (ADN), este sau nu delimitat de o membrană, adică celula prezintă un nucleu tipic sau doar un nucleoid.

5

10

FIZIOLOGIE CELULARA

Fig. 6. Complementaritatea bazelor azotate în cadrul moleculei de ADN

Procesele de creştere şi reparaţie tisulară se bazează pe diviziunea celulară somatică (mitoză), în care fiecare din cele două celule fiice (diploide) primeşte cele două seturi complete de cromozomi. Formarea celulelor reproducătoare (gameţi; spermatozoid şi ovul) presupune un şir de mitoze şi o diviziune specială, în care fiecare din celulele fiice (haploide) primeşte numai un set de cromozomi; refacerea diploidiei se realizează în cursul procesului de fecundare. Mitoza este posibilă prin replicarea întregii cantităţi de ADN, pe baza complementarităţii nucleotidelor şi cu ajutorul ADN-polimerazei. Replicarea (dublarea cantităţii; duplicarea mesajului genetic) se realizează în cursul perioadei S din interfază4, ce este încadrată de perioadele numite de creştere, G1 şi G2, în care ADN este utilizat strict pentru transcripţie în ARN, în vederea sintezei proteice. Diviziunea propriuzisă cuprinde patru faze: profaza (individualizarea cromozomilor şi disoluţia membranei nucleare), metafaza (ataşarea cromozomilor la filamentele fusului de diviziune), anafaza (migrarea cromozomilor spre polii celulei), telofaza (formarea noilor nuclei şi separarea celulelor fiice; citokineză). ARNm este produs prin transcripţia ADN sub acţiunea unei ARN polimeraze ADN-dependente. Aceasta determină separarea locală a catenelor ADN după legare la nivelul unei regiuni promotoare şi catalizează legarea nucleotidelor, rezultând transcrierea primară. Acest ARN este procesat post-transcripţional, fiind înlăturate secvenţele nesemnificative

11

FIZIOLOGIE CELULARA

(introni) iar cele ce codifică secvenţa polipeptidică (exoni) sunt realipite, rezultând produsul final, ce pătrunde în citoplasmă prin porii nucleari. Sinteza proteică are loc la nivel ribozomal, printr-o “translaţie” a secvenţei de codoni din ARNm în secvenţa polipeptidică. Fiecare aminoacid este specificat de unul sau mai mulţi codoni, la care se adaugă un codon special de iniţiere a sintezei şi trei codoni de stopare. Oricare din aceşti codoni are semnificaţie translaţională unică. La nivel ribozomal mesajul este decodificat cu ajutorul ARNt, fiecare aminoacid fiind adus de o asemenea moleculă specializată, ce recunoaşte codonul corespunzător în ARNm (cu ajutorul anticodonului din propria structură amplasat în cadrul unui situs de recunoaştere). Legarea ARNt pe ARNm se face la situsul A (aminoacil) din structura ribozomului. O aminoacil-transferază realizează alipirea noului aminoacid la secvenţa peptidică preexistentă, ataşată de ARNm prin ARNt anterior la situsul P (peptidil) al ribozomului (fig. 7). Apoi o translocază determină mişcarea reciprocă a ribozomului şi ARNm, cu eliberarea ARNt anterior şi citirea unui nou codon. ARNt situs A Procesarea post-translaţională ARNt situs P a polipeptidelor cuprinde reacţii de adenină adenină fosforilare, glicozilare, proteoliză. Diferenţierea celulară, deseori şi reglarea funcţională, se realizează prin controlul ratei de transcripţie. Acest control implică mecanisme Fig. 7. Formarea unei bazate pe principiile stimulării prin legături peptidice în substrat şi inhibiţiei prin produs, cadrul translaţiei folosind gene reglatoare. 3. Ciclul celular Ciclul celular reprezintă ciclul de viaţă al unei celule, din momentul în care ea se formează prin diviziunea celulei progenitoare până când se divide la rândul ei. Durata acestui ciclu variază de la 2-3 ore la organismele unicelulare, precum bacterii sau fungi, până la aproximativ 24 ore la celulele mamifere în cultură6. Cu cât gradul de diferenţiere al celulei devine mai 6

Există diferenţe semnificative între ciclul celular al celulelor procariote (fără nucleu organizat) şi cel al eucariote (cu nucleu individualizat). Omul aparţinând celei din urmă categorii, referinţele din acest text vor fi făcute exclusiv la ciclul celular al eucariotelor.

12

FIZIOLOGIE CELULARA

semnificativ, cu atât ciclul său vital este mai diferit. Organismele unicelulare se divid fără oprire până când saturează spaţiul sau consumă toate resursele din mediu, în vreme ce celulele diferenţiate ale organismelor superioare au cicluri celulare ce variază de la câteva zile până la aproape un secol (la om). De exemplu, celulele măduvei hematogene, celulele spermatice sau ale epiteliului digestiv se divid necontenit, în vreme ce neuronii, celulele miocardice sau celulele fotosenzitive retiniene pot supravieţui de la începutul până la sfârşitul vieţii individului. Toate fenomenele care contribuie la creşterea şi dezvoltarea unei celule, dublarea masei celulare, dublarea numărului de organite şi a materialului genetic în vederea diviziunii, toate acestea sunt guvernate de către genele ce controlează ciclul celular, controlând în final dezvoltarea cantitativă şi calitativă a unui ţesut. Orice modificare în secvenţele ciclului celular, orice dereglare a controlului temporal pe care îl exercită genele ciclului celular duce la pierderea caracteristicilor celulare (neoplazie) şi la proliferare necontrolată, cunoscută sub denumirea generică de cancer. 3.1. Fazele ciclului celular Mitoza reprezintă diviziunea unei celule somatice în 2 celule fiice. Pentru ca fiecare celulă-fiică să fie identică din punct de vedere genetic, celula parentală trebuie să fi realizat o copie a fiecărui cromosom înainte de mitoză. Aceasta are loc în faza S din interfază. Fiecare nou cromosom conţine două copii identice ale sale, numite cromatide-surori, ataşate împreună într-o regiune specializată numită centromer. Cromatidele surori nu sunt considerate a fi cromosomi de sine stătători, şi un cromosom nu conţine întotdeauna două cromatide-surori. Producerea de celule-fiice care sunt copii exacte ale progenitorului implică asocierea unui ciclu de creştere a masei celulare cu un ciclu discontinuu de diviziune a materialului genetic, replicarea şi împărţirea genomului între celulele-fiice. Ciclul celular este pus în mişcare de către diverse modificări citoplasmatice, modificări care se datorează fosforilării sau defosforilării unor enzime, sintezei sau degradării unor proteine. Enzimele care realizează fosforilarea proteinelor sunt denumite generic protein-kinaze, sau simplu kinaze. Uneori se foloseşte termenul de fosfotransferază, adică enzimă ce transferă grupările fosfat din moleculele macroergice de tip ATP sau GTP către substrate specific. Fenomenul este numit fosforilare, şi produce de 13

FIZIOLOGIE CELULARA

obicei intrarea moleculei proteice în starea sa activă (activare). Indepărtarea grupărilor fosfat se numeşte defosforilare şi este realizată de către fosfataze. Kinazele esenţiale pentru ciclul celular se numesc CDK (kinaze ciclindependente), deoarece necesită pentru a se activa o subunitate proteică suplimentară, numită ciclină. Nivelele citoplasmice de CDK-uri sunt relativ stabile, dar ele nu se vor activa din lipsa ciclinelor, a căror proteoliză ţintită de către sistemul digestiv celular reprezintă una din modalităţile de control ale proliferării celulare. Componentele temporale care alcătuiesc ciclul celular sunt reprezentate de faza de sinteză proteică şi creştere celulară, care durează aproximativ 90% din ciclul celular şi se numeşte interfază şi faza de duplicare a materialului genetic şi în final a întregii celule, care se numeşte mitoză. Aceste componente şi fazele lor intermediare sunt realizate prin intermediul unei serii de evenimente moleculare conservate în întreaga lume animală şi foarte strict controlate. Interfaza cuprinde trei faze denumite gap (pauză, interval), perioade în care celula nu se divide. Faza G0 sau de repaus, reprezintă perioada în care celula are activitate proprie şi-şi îndeplineşte funcţiile, dar nu se pregăteşte în nici un fel pentru diviziune. Cea mai mare parte a celulelor organismului uman (adult) sunt în G0 şi nu se vor divide niciodată. Unele dintre ele pot să revină în starea de celule proliferante dacă şi numai dacă sunt supuse unor factori numiţi „mitogeni”, care să le stimuleze proliferarea. In interfază nucleul celulelor animale are o membrană dublă, cea exterioară fiind practic o extensie a reticulului endoplasmic şi făcând corp comun cu acesta. Cromatina nu este individualizată, ci este un filament continuu de eucromatină şi heterocromatină. Factorii mitogeni sunt substanţe circulante eliberate de sistemele de reglare, sau substanţe eliberate de celulele din vecinătate, care stimulează intrarea celulelor în diviziune. Pentru ca un mitogen să poată acţiona, el trebuie să aibă receptori capabili să declanşeze cascade de semnalizare intracelulară care să activeze punctele de control. Ciclul celular de la mamifere este alcătuit din interfază (cu 4 subfaze, G0, G1, G2, S) şi mitoză (fig. 8). Mitoza propriu-zisă reprezintă separarea cromosomilor celulelor fiice, aceasta fiind însoţită de împărţirea citoplasmei şi organitelor şi fisiunea celulară, grupate sub denumirea de citokineză.

14

FIZIOLOGIE CELULARA

Fiecare dintre aceste subfaze este precedată de un punct de control (checkpoint). Punctele de control G0 G1 înseamnă de fapt reacţii enzimatice obligatorii pentru trecerea ciclului celular spre faza următoare. Aceste R reacţii nu pot însă continua dacă nu M sunt întrunite multiple condiţii care S G2 certifică utilitatea şi necesitatea proliferării celulare. Cel mai important PC PC din punctele de control este punctul R (restricţie), situat la sfârşitul fazei Fig. 8. Fazele ciclul celular la eucariote şi G1, care odată depăşit obligă celula să intre în diviziune. punctele de control (R, S/G2 şi G2/M) 3.2. Faza G1 În celulele proliferante G1 este perioada dintre apariţia celulei şi iniţierea sintezei de ADN. La vertebrate celulele în G1 au un număr diploid de cromozomi (2n), câte unul moştenit de la fiecare părinte. După citokineză, celulele sunt de obicei la jumătatea dimensiunilor celulei-mamă, şi în timpul fazei G1, vor creşte până la dimensiunile normale. In această perioadă cea mai mare parte a genelor implicate în progresia ciclului celular sunt inactive. Dacă se primesc stimuli antiproliferativi, sau aportul de nutrimente este deficitar, celulele vor evolua către diferenţiere terminală, sau vor ieşi din ciclu pentru a intra în G0. Tranziţia G0/G1 este dependentă de existenţa de semnale mitogene exterioare şi de responsivitatea celulei la acestea. Cea mai comună cale de transducţie a semnalului mitogen este calea protein-kinazei activate de mitogeni (MAP-kinaza). MAPK va activa o cascadă enzimatică ce va duce la activarea căii CDK (kinaze ciclin-dependente). Ciclinele sunt o serie de subunităţi reglatoare ale protein-kinazelor heterotrimerice ce controlează secvenţa evenimentelor ciclului celular. Ele se cuplează pe nişte subunităţi catalitice numite kinaze ciclin-dependente (CDK-uri), care altfel nu au activitate kinazică. Fiecare CDK se poate asocia cu mai multe cicline, iar această asociere determină care din proteinele ciclului celular vor fi fosforilate de acel complex anume. 15

FIZIOLOGIE CELULARA

Calea Ras/MAPK controlează intrarea celulei în G1, progresia G1/S şi recent s-a dovedit implicarea ei şi în tranziţia G2/M. Ca urmare, dacă activitatea căii MAPK ar fi să fie menţinută la nivele înalte printr-un nivel foarte ridicat al mitogenilor extracelulari, aceasta ar putea duce la transformare celulară şi tumorigeneză. Către sfârşitul fazei G1 apare primul punct de control şi cel mai important. Se numeşte punctul de restricţie (R) şi decide începerea sintezei de ADN. Este cel mai important punct de control deoarece dacă celulele îşi replică ADN-ul dar nu pot intra în diviziune vor fi distruse prin apoptoză, întrucât starea de poliploidie nu este în general acceptabilă pentru celulele de la mamifere. Replicarea ADN necesită un set de gene aparte, care sunt inactive în celulele G0. Această stare de inhibiţie este păstrată de lipsa unui factor de activare numit E2F-1 (fig. 9). Acesta există în citoplasmă dar este cuplat cu o proteină numită RB (se numeşte astfel pentru că a fost descoperită iniţial, ca formă mutantă, într-un tip de cancer numit retinoblastom). RB este fosforilată de către o enzimă numită CDK-4, ceea ce o decuplează de pe E2F-1. E2F-1 se activează, stimulând replicarea ADN. CDK-4, împreună cu CDK-2 şi CDK-6 sunt activate de către factorii de creştere. RB va fi defosforilată după ce a început faza S, pentru a nu mai permite activarea din nou a căii E2F-1. O proteină RB anormală nu se va defosforila complet şi nu va fi capabilă sa blocheze E2F-1, ceea ce va produce o diviziune continuă şi necontrolată a celulelor cu proteina defectă, celule tumorale. Pe lângă mecanismul RB de control al ciclului celular, la nivelul kinazelor ciclin-dependente din grupul CDK 2, 4, 6 mai intervin şi alte mecanisme de evitare a proliferării necontrolate sau de propagare a celulelor cu ADN defect sau mutant. CDK-urile vor fi inhibate şi de către un alt grup de substanţe, care au denumirea generică de CKI (inhibitori ai ciclinkinazelor). Există o multitudine de proteine de tip CKI, şi toate cu acelaşi scop: oprirea diviziunii celulare. Unul dintre cele mai răspândite semnale de oprire a diviziunii este inhibiţia de contact. Atunci când celulele unui ţesut proliferează, pe marginea unei plăgi sau pe o placă de cultură, în momentul când se ating (fenomenul de confluenţă) se opresc din creştere. Aceasta se datorează secreţiei unor proteine, p16INK4a şi p27kip1, care inhibă CDK-1; fac parte din CKI-uri. Pierderea inhibiţiei de contact este una din primele transformări petrecute cu celulele normale ce devin celule canceroase. 16

FIZIOLOGIE CELULARA

Toxici Celulari

FACTOR DE CREŞTERE (GF)

p53 INHIBIŢIE de CONTACT

Receptor pt. GF

CKI

CDK4

MAPK

Ras

inhibiţie fosforilare

RB+P

RB+ E2F-1 E2F-1 ADN Fig. 9. Mecanismele de oprire a proliferării celulare în punctului de control R; CKI - inhibitori de ciclin-kinaze; GF - factor de creştere; RB - proteina retinoblastom

Un alt mod de inhibiţie a proliferării celulare este oprirea diviziunii celulelor cu ADN lezat sau mutant. La nivelul punctului de control R, dar şi al celorlalte puncte de control, integritatea ADN-ului este verificată de o serie de enzime, din care cele mai importante sunt ATM, CHK-1 şi CHK-2. Acestea fosforilează o proteină numită p53, supranumită şi „gardianul genomului”, deoarece acesta va activa mai multe proteine, printre care şi p21, care se cuplează cu CDK-urile promotoare ale tranziţiei de fază G1/S, inhibându-le. Deci, orice fel de leziune a materialului genetic va inhiba diviziunea şi va activa, pe calea p53, apoptoza. Calea p53 reprezintă una din cele mai eficiente modalităţi de protecţie împotriva cancerului. Odată depăşit punctul de restricţie, celula intră în faza S, faza de sinteză a ADNului, o maşinărie moleculară de o complexitate atât de mare, încât nici până la ora actuală nu a fost elucidată complet. 3.3. Faza S Faza S se numeşte astfel datorită fenomenelor de sinteză de ADN care au loc în această perioadă. Este cea mai importantă fază a ciclului celular; mitoza nu se poate realiza fără un număr corect şi complet de cromosomi. 17

FIZIOLOGIE CELULARA

Faza S trebuie să fie urmată de faza M, în ordinea corectă şi o singură dată pe ciclu. Pentru a se verifica această corectitudine, faza S nu este urmată imediat de mitoză, ci sunt separate de faze gap (pauze) în care celula verifică corectitudinea replicării şi a cantităţii de material genetic. Intre faza M şi faza S există faza G1, iar între S şi M există faza G2. In afară de duplicarea cromosomală în faza S mai apare duplicarea centrozomului. Centrosomul reprezintă centrul primar de organizare al microtubulilor, iar erorile de coordonare ale duplicării centrosomale cu duplicarea ADN vor duce la separarea anormală a cromosomilor, cu instabilităţi genomice, care pot evolua către proliferarea anarhică (cancer). Sinteza de ADN este iniţiată de activarea CDK2, care se asociază cu ciclina E imediat înainte de instalarea fazei S. Substratul pentru ciclina E/ CDK2 este o proteină nucleară numită NPAT, care este implicată în reglarea expresiei genice a histonelor, proteine esenţiale pentru sinteza de ADN. Cromozomii mamiferelor sunt atât de mari, încât replicarea lor ar dura extrem de mult dacă ar porni dintr-un singur loc. Există circa 150 x 106 perechi de baze pe un singur cromosom, ce trebuie replicate, şi fiecare regiune a unui cromosom ce se dublează provenind de la un singur punct de origine se numeşte replicon. Celulele diploide proliferante trebuie să-şi replice ADN-ul o dată şi numai o dată într-un ciclu. Pentru aceasta, în timpul fazei G1 se formează ceea ce se numeşte un complex de prereplicare (fenomen numit licenţiere). Acest complex se dezactivează prin proteoliză imediat după iniţierea replicării, şi astfel replicarea nu se mai poate repeta. 3.4. Replicarea ADN Replicarea ADN reprezintă procesul prin care un dublu helix de ADN este copiat şi se formează 2 helixuri duble. Fiecare helix este complementar cu cel alăturat, şi astfel poate fi copiat de pe unul pe celălalt. Fiecare lanţ ce compune dublul helix este alcătuit din 4 tipuri de nucleotide. Un nucleotid (fig. 10) este alcătuit dintr-un complex fosfo-glucidic format dintr-o pentoză (deoxiriboză esterificată cu un fosfat) care formează coloana lanţului şi o bază azotată orientată spre interiorul helixului. Bazele azotate sunt de 2 tipuri, purinice şi pirimidinice (tab. 1). Cuplarea fiecăreia din componentele nucleotidului Fig. 10. Nucleotid se face la atomii de carbon 3` şi 5` ai (dezoxi)ribozei. 18

FIZIOLOGIE CELULARA Tab. 1. Sructura bazelor azotate din compoziţia acizilor nucleici

Baza azotată

Structura

ADENINA (purinică)

Acid nucleic ADN, ARN

GUANINA (purinică)

ADN, ARN

CITOZINA (pirimidinică)

ADN, ARN

TIMINA (pirimidinică)

ADN

URACIL (pirimidinică)

ARN

Fiecare bază azotată purinică se cuplează prin legături fizice (legături de hidrogen) cu una pirimidinică (fig. 11), adenina cu timina (2 legături) şi guanina cu citozina (3 legături), cuplând şi solidarizând lanţurile în helixul ADN. Fiecare lanţ de ADN are o direcţie, fiind Fig. 11. Legături între bazele azotate 19

FIZIOLOGIE CELULARA

numit lanţul 5` sau lanţul 3`, în funcţie de cuplarea fosfatului. Lanţurile sunt antiparalele şi redundante. Sursa de nucleotide pentru sinteză este reprezentată de nucleotide libere din citosol, trifosforilate. Legăturile fosfat macroergice din poziţiiile 5` şi 3` îşi transferă energia cu ajutorul polimerazei dedicate, pentru cuplarea bazei azotate la locul ei. Replicarea lanţului se face pornind din puncte bine stabilite, numite origini. Există multe puncte de origine pe ADN-ul uman. Din aceste puncte, lanţul se desface sub acţiunea helicazei, ducând la „bifurcaţia de replicare” (fig. 12), care se mişcă pe măsură ce lanţul este sintetizat şi apoi reasamblat. Enzimele care sintetizează ADN se numesc ADN-polimeraze. Acestea sunt capabile de a adăuga noi baze azotate numai pe braţul 5` → 3`, în aşa fel încât un braţ creşte continuu iar celălalt rămâne în urmă, numit „lanţ rămas în urmă” (lagging strand), pentru că polimerazele nu pot sintetiza ADN în direcţie 3` → 5`. Ca urmare, se sintetizează bucăţi de ADN, numite fragmente Okazaki, ce sunt completate cu ARN, sunt întoarse şi cuplate la lanţul rămas în urmă cu ajutorul unor enzime numite „ligaze”. Această etapă este cea mai supusă riscului de defecte. Fenomenul este mult mai complicat decât descrierea de mai sus, întrucât intervin şi complicaţii sterice, tendinţe de spiralizare prematură, apariţia de structuri Fig. 12. Bifurcaţie secundare etc. care se rezolvă cu ajutorul topoizode replicare merazelor, proteinelor-pensă şi altele. Deoarece un singur cromosom uman poate ajunge la 150 x 106 perechi de baze, iar viteza medie de replicare este de 20 - 100 baze/secundă, pentru a se replica un cromosom ar trebui o durată de minim 2000 de ore, în vreme ce faza S la celulele umane durează în jur de 8 ore, ca urmare există mai multe puncte de origine. Secvenţa dintre două puncte de origine vecine se replicon. Există aproximativ 60.000 de origini în întregul genom uman. Replicarea ADN nu este neapărat sincronă în totalitatea sa. Numai 10-15% din replicani sunt activi la un moment dat din faza S şi există în genomul uman ~1000 zone cu caractere temporale distincte în timpul fazei S. La eucariote replicarea porneşte de la origini şi se opreşte când ajunge la alt punct de origine. Dar, deoarece la mamifere cromosomii sunt liniari, 20

FIZIOLOGIE CELULARA

replicarea nu mai ajunge până la sfârşitul cromosomilor (telomere) deoarece mai au punct de origine. Aceasta duce la scurtarea telomerelor. La celulele somatice acesta este un proces normal, care face ca celulele să fie capabile să se dividă numai de un număr limitat de ori până ce pierderea de ADN opreşte diviziunea (limita Hayflick). Acest fenomen a fost descoperit în 1965 de către Leonard Hayflick, care a observat că celulele normale se divid doar de 52 de ori în aer cu 20% oxigen (aer obişnuit) sau de 70 de ori într-o atmosferă cu 3% oxigen (condiţii normale ale mediului intern la om), după care intră într-o fază de senescenţă. Enzima telomerază funcţionează în celulele stem sau în celulele germinale, care nu au limită Hayflick, pentru a lungi telomerele şi a limita pierderea de ADN. Lungimea telomerelor poate fi o metodă de a afla vârsta genetică a unei celule. Dacă telomeraza funcţionează defectuos, poate activa proliferarea în celulele somatice, ducând la apariţia cancerelor. Pe lângă sinteza de ADN, pentru o funcţionalitate normală a cromatinei nou sintetizate trebuie produse şi histonele aferente. Histonele sunt nişte proteine ce au rol de „mosor” pe care se înfăşoară ADN-ul din raţiuni de spaţiu şi funcţionalitate. Fiecare celulă umană are aproximativ 1,8 metri de ADN, dar înfăşurat pe histone se reduce la 90 mm, apoi condensat în cromosomi coboară la 120 μm de cromatină. Mai multe subunităţi histonice se agregă formând o bobină împreună cu ADN-ul înfăşurat pe ele, ce se numeşte nucleosom. Celulele umane au nevoie de aprox. 60 x 106 unităţi histonice, astfel că că într-un timp scurt (faza S normală = 8 ore) trebuie sintetizate cantităţi enorme de astfel de proteine. Acest lucru este posibil deoarece există 40 de gene pentru histone, ce se activează simultan. Punctele de control intra-S Datorită complexităţii procesului de replicare, numărului mare de enzime şi proteine implicate în acest proces şi faptului că se cuplează peste 150 miliarde de perechi de baze la fiecare cromozom uman, rata de erori este semnificativă. Pentru acestea există mecanisme de reparaţie, dar pentru eventualitatea că acestea nu reuşesc să readucă ADN la normal, la sfârşitul fazei S mai există o serie de puncte de control, numite generic intra-S. Există două enzime, ATM- şi ATR- kinazele care detectează rupturi ale ADN-ului şi care inhibă apoi CDK, blocând iniţierea de noi bifurcaţii de replicare. Aceasta nu permite trecerea de rupturi ADN de bifurcaţiile de 21

FIZIOLOGIE CELULARA

replicare, ceea ce ar produce cromosomi rupţi şi riscurile aferente. „Intârzierile” bifurcaţiilor de replicare pot apărea atunci când complexul de replicare întâlneşte o bază avariată sau pe care nu o poate citi. Până când nu se repară defectul, nici celălalt braţ al bifurcaţiei nu se va mai elonga. Printr-un mecanism necunoscut bifurcările existente nu se dezasamblează prematur, pentru a nu elibera ADN incomplet. 3.5. Faza G2 şi punctul de control G2/M La sfârşitul fazei S, celula şi-a replicat întregul genom şi ar trebui să intre în mitoză. Faza G a fost definită iniţial ca un interstiţiu între completarea sintezei de ADN şi începerea mitozei, dar pentru ca evenimentele de control ce au loc la nivelul acestei faze sunt graduale, biologia celulară modernă consideră faza G2 ca fiind perioada de la sfârşitul fazei S până la mijlocul profazei, când se petrece evenimentul esenţial al intrării în mitoză, şi anume activarea complexului CDK1-ciclina B1. Asamblarea acestui complex duce la transportul său în afara nucleului, unde va activa sinteza microtubulilor fusului de diviziune. Pe măsură ce se avansează către profază, complexul CDK1/cB1 se acumulează pe faţa externă a nucleului şi declanşează liza anvelopei nucleare (a membranei nucleare externe) şi intrarea în mitoză. Procesul este mult mai complicat, implicând un sistem foarte elaborat de proteine activatoare şi inhibitoare. Raţiunile unui astfel de complex ce reglează tranziţia G2/M par a fi două: pe de o parte, nu se va activa decât atunci când toate componentele sistemului sunt complexe şi în relaţie funcţională şi pe de altă parte, acumularea în timp de factori ai sintezei duce la tranziţie rapidă, practic explozivă către mitoză. In sfârşit, orice leziune a ADN-ului poate bloca una sau mai multe căi, astfel oprind mitoza unor celule defecte. Scopul punctului de control este de a bloca intrarea în mitoză dacă una din cromatidele surori este lezată. 3.6. Mitoza şi citokineza Cea mai scurtă fază a ciclului celular, 1-2 h la om, mitoza are 5 faze: 1. Profaza, de la condensarea cromosomilor la liza anvelopei nucleare; 2. Prometafaza, formarea fusului mitotic; 3. Metafaza, cromosomi biorientaţi, poziţionaţi către ecuatorul celulei 4. Anafaza, împărţită în două faze: anafaza A şi B 5. Telofaza, faza finală 22

FIZIOLOGIE CELULARA

microtubuli

centrozom Membrană nucleară

Fig. 13. Schema aparatului mitotic înainte de începerea mitozei

La acestea se adaugă o a şasea etapă, numită citokineză, ce reprezintă separarea elementelor citoplasmatice, fisiunea celulară. Profaza Incepe cu condensarea cromosomilor şi dispariţia nucleolului. Reţeaua citoplasmică de microtubuli se transformă în două agregări radiale de microtubuli de formă stelată, numite asteri (fig. 14). Deşi condensarea cromosomială a fost observată cu mai mult de un secol în urmă, mecanismul cromatide biochimic nu este încă elucidat. Se produce şi migrarea centrosomilor, ce kinetocor se mişcă în direcţia polilor opuşi ai celulei. Există sute de proteine ce se fosforilează în cascadă: histone, complexe pentamerice numite condensine, Fig. 14. Condensarea cromosomilor kinaza Aurora-B. La exteriorul nucleşi apariţia asterilor ului asterii se transformă în polii fusului mitotic. Microtubulii fusului mitotic cresc prin adiţia de unităţi de tubulină. Aparatul Golgi şi reticulul endoplasmic se fragmentează şi se veziculează în timpul profazei. Toate celelalte fenomene membranare, precum endocitoza şi exocitoza, sortarea intracelulară de componente sunt foarte mult reduse. Prometafaza Incepe cu dezasamblarea membranei nucleare. Microtubulii care cresc de la nivelul polilor fusului penetrează găuri în anvelopa nucleară, iau contact cu cromosomii şi se ataşează de aceştia prin intermediul structurilor 23

FIZIOLOGIE CELULARA

numite kinetocori (fig. 15). Kinetocorii sunt complexe proteice bazate pe centromeri ce capturează şi ajută la transportul cromosomial. Fiecare cromosom are o porţiune de ADN special care se numeşte ADN centromeric, pe care se ataşează proteinele de legare pe microtubuli (CLIP170, CENP-E). La acestea se leagă proteinele motoare ale fusului mitotic (ce mişcă cromosomii în direcţii opuse) şi anume kinezina microtubulară (MCAK) şi dineina citosolică. Aceste formaţiuni separă cromatidele-surori şi încep să migreze către polii fusului mitotic, produFig. 15. Dezasamblarea când o aliniere a cromosomilor în drumul către poli. membranei nucleare, La acest nivel mai există un punct de control, care se ataşarea filamentelor numeşte punctul fusal, care întârzie instalarea tubulare de kinetochori segregării cromosomiale dacă există erori de ataşare. Organizarea fusului mitotic Acesta este o formaţiune de aspectul unei mingi de rugby, alcătuit din trei seturi distincte de microtubuli. - microtubuli asteriali → radiază extern dinspre centrosom către exteriorul celulei, unde poziţionează aparatul mitotic şi ajută la citokineză. - microtubulii kinetochoriali se ataşează de cromosomii prin intermediul kinetochorilor. - microtubulii polari nu interacţionează cu cromosomii, ci vor solidariza fusul mitotic; aderenţa între cromosomi şi microtubuli se realizează prin intermediul unor formaţiuni proteice numite coezine. Structura tubulară este determinată de dinamica agregării subunităţilor de tubulină şi de cel puţin şapte proteine motorii tubulare, denumite generic kinezine, la care se adaugă o proteină motorie citoplasmică, numită dineină. Fiecare aster acţionează ca un centru de organizare microtubulară. Kinezina -5 va tracta asterii către polii opuşi ai celulei, îndepărtând polii fusului şi alungindu-l. Segregarea cromosomilor trebuie să fie perfectă, altfel pot apărea celule cu trisomii sau cu cromosomi lipsă. Pentru a nu apărea această eventualitate, există punctul de control fusal, dar cunoaşterea exactă a modului în care sistemul de control percepe numărul de cromosomi nu este 24

FIZIOLOGIE CELULARA

încă completă. Depăşirea punctului de control fusal produce o anafază catastrofică, ceea ce duce la o distribuţie inegală a cromatidelor surori la celulele fiică, numită aneuploidie → ex. trisomia 21 (sindromul Down), sau monosomia 45X0 (sdr. Turner). Metafaza Este faza cea mai stabilă şi mai organizată a mitozei. Cromosomii sunt orientaţi către polii celulari, iar kinetochorii îi ţin ancoraţi de fus, adunaţi la ecuatorul celulei. Fusul metafazic este alcătuit din 2 grupuri majore: filamentele ce conectează cromatidele cu polii fusului şi cele care se extind de la un pol la altul (fig. 16). Dacă o singură cromatidă se detaşează de fus, acesta nu porneşte migraţia anafazică fără aceasta. Toţi cromosomii Fig. 16. Placa metafazică aşteaptă să fie aliniaţi pentru a începe anafaza . Anafaza Cea mai dramatică serie de evenimente este separarea cromatidelor surori. Ele migrează către polii fusali opuşi (Anafaza A) şi apoi polii se îndepărtează (Anafaza B). In acelaşi timp, fusul mitotic activează complexele proteice citosolice pentru începerea citokinezei. Separarea cromosomilor în câte 2 cromatide surori (fig. 17) este controlată de către cromosomii înşişi, nu de fusul mitotic. Fenomenul este dependent de 3 factori: Fig. 17. Segregare cromatide complex de patru proteine numit coezină (fig. 18); acţionează ca un lanţ ce înconjoară cele 2 cromatide surori, menţinându-le apropiate; o enzimă numită separază, ce rupe lanţul proteic al coezinei; o proteină numită securină, care este un inhibitor de separază. Când s-a depăşit punctul de control fusal, o serie de proteine de control marchează securina cu o proteină numită ubiquitină, a cărei funcţie este de a atrage proteosomii (vezicule cu enzime proteolitice). Aceste proteaze distrug securina, ceea ce va elibera separaza, care rupe legăturile dintre subunităţile coezinei, eliberând astfel cele 2 cromatide-surori. 25

FIZIOLOGIE CELULARA

coezină cromatină

Fig. 18. Aspect schematic al mecanismului ce ţine legate filamentele de ADN ale cromatidelor-surori de-a lungul întregii mitoze, până când coezina este lizată de către separază şi cromatidele sunt tracţionate de către microtubulii fusali.

Supraexpresia securinei poate duce la tulburări în segregarea cromosomială, ceea ce poate duce la mutaţii cromosomiale sau chiar cancer. Anafaza A reprezintă mişcarea cromatinelor de la ecuatorul celulei către poli. Aceasta se realizează prin dezintegrarea controlată a microtubulilor fusali la nivelul citokinelor. Astfel, cromatinele urcă spre poli. Dezasamblarea micro-tubulilor se face cu intervenţia kinezinelor şi dineinei. Anafaza B se realizează prin apropierea polilor fusului către membrană, fenomen realizat cu ajutorul kinezinelor, ce interacţionează cu dineina ancorată în citoplasmă. La sfârşitul acestei faze, cromatidele surori devin cromosomi-fraţi, în aşa fel încât sunt adunaţi în jurul centrosomului. Telofaza Este revenirea la normal a mai multor evenimente: cromosomii se decondensează, fusul se dezasamblează (fig. 19), membrana nucleară reapare, se reasamblează şi aparatul Golgi şi reticulul endoplasmic iar nucleolul reapare. Fiecare nucleu conţine o copie completă a genomului patern şi una a genomului matern (diploidie). Citokineza Este procesul ce divide celula în 2 celule-fiică. Acest fenomen necesită apariţia Fig. 19. Reorganizarea nucleilor şi retracţia fusului unui „şanţ de clivare”, o bandă îngustă de 26

FIZIOLOGIE CELULARA

proteine contractile (actină/miozină), care înconjoară mijlocul celulei şi începe să se contracte, strangulând celula la mijloc. Mecanismul exact nu este încă perfect cunoscut, dar se ştie că este vorba de o cascadă kinazică dependentă de fusul mitotic ce activează actina şi miozina II. In fine, când celula e complet strangulată, se produce fenomenul de abscizie (fisiune) care separă definitiv celulele-fiică (fig. 20). Membrana suplimentară necesară pentru a acoperi zona de abscizie este inserată adiacent şanţului de clivare, sursa fiind cel mai probabil veziculele derivate din aparatul Golgi. Inainte de abscizie, între cele 2 celule-fiică rămâne o punte intercelulară subţire, ce conţine microtubuli şi o formaţiune proteică complexă, numită corp medial. Uneori în anumite ţesuturi, punţile intercelulare rămân deschise sub formă de canale inelare. La mamifere acest fenomen este întâlnit la testicul, unde canalele inelare conectează mai multe sute de celule spermatice înrudite. Endomitoza este o variantă de mitoză fără cito- Fig. 20. Şanţul de clivare şi abscizia kineză şi fără separare nucleară, ceea ce duce la apariţia de celule cu nucleu unic, foarte mare, ce conţine mai multe garnituri complete de cromosomi. Fenomenul este întâlnit la organismele umane în măduva osoasă hematogenă, la celulele numite megakariocite, precursoare ale plachetelor sanguine. Consecinţe ale erorilor mitozei: non-disjuncţia este situaţia când cromosomii nu se separă în timpul anafazei. Rezultatul este fenomenul de aneuploidie, cu trisomii sau monosomii. Mitoza este un fenomen foarte dinamic, în care membranele organitelor se distrug şi se refac în câteva ore, cromosomii sunt „agăţaţi” şi tracţionaţi de către microtubuli, fusul mitotic se mişcă rapid, ceea ce poate produce rupturi ale unor braţe ale cromatidelor, cu pierderea fragmentelor, fenomen numit deleţie. Sau fragmentul se poate reataşa la un alt cromosom decât cel originar, producând translocaţii. Se poate reataşa la cromosomul originar, dar invers, producând inversiuni, sau poate fi tratat ca un cromosom de sine stătător, producând duplicare cromosomială. Gravitatea consecinţelor este variabilă, producând efecte de la foarte reduse până la moartea celulei şi până la cancer. 27

FIZIOLOGIE CELULARA

3.7. Meioza Denumită şi „diviziune reducţională”, meioza este un program special de menţinere a numărului normal de cromosomi în timpul reproducţiei sexuate la eucariote. Reproducerea sexuată implică cuplarea unor celule germinale (gameţi) pentru a se produce o celulă ou (zigot) din care să se dezvolte un nou organism. Reproducerea sexuată a apărut din necesitatea de evoluţie a speciilor animale şi vegetale de pe planetă. Procariotele şi unele eucariote primitive nu au decât diviziune simplă, mitotică, ceea ce înseamnă că celulele fiică sunt copii identice ale celulelor progenitori, lucru ce face evoluţia (apariţia unor caractere noi) foarte dificilă sau chiar imposibilă. Pentru a se depăşi aceste dificultăţi, a apărut reproducerea sexuată, prin care materialul genetic de la 2 organisme se combină pentru a apărea un organism nou, diferit de progenitori. Prin dispersia materialului genetic (spori, polen, spermatozoizi, etc) se realizează fertilizarea şi schimbul de material genetic la distanţe mari, precum şi selectarea exemplarelor cele mai bine dotate pentru supravieţuire (selecţie naturală). Dacă pentru reproducerea sexuată s-ar folosi celule de tip somatic, cu garnituri duble de cromosomi (diploide), atunci progenitura ar deveni tetraploidă, celulele germinale ar fi tetraploide ce s-ar cupla rezultând descendenţi cu număr crescând de garnituri cromozomale. Ca urmare, numărul de cromosomi trebuie redus la jumătate, pentru ca din 2 gameţi haploizi să se obţină un zigot diploid, care la rândul lui să producă gameţi haploizi care să reia ciclul, s.a.m.d. acest deziderat se realizează cu ajutorul meiozei sau diviziunii reducţionale. Meioza este un proces alcătuit dintr-o serie de etape similare sau diferite de mitoză: G1, celula sintetizează proteinele şi enzimele pentru replicarea ADN S, se produce sinteza şi replicarea materialului genetic G2, ste absentă în meioză. Meioza are 2 componente: - meioza I, care constă în separarea arbitrară a perechilor de cromosomi omologi în 2 celule: adică împărţirea numărului de cromosomi la 2, cu apariţia a 2 celule haploide. Pentru că se reduce numărul de cromosomi, meioza I se numeşte diviziune reducţională.

28

FIZIOLOGIE CELULARA

- meioza II este similară cu mitoza prin aceea că cromatidele-surori se separă între ele, iar numărul de cromosomi rămâne acelaşi (haploid). Se mai numeşte şi diviziune equaţională. Impărţirea cromosomilor materni şi paterni între cele 2 celule fiică în meioza I este total aleatorie. Astfel pentru fiecare gamet uman, există 223 combinaţii cromosomiale (>8 milioane). Combinaţi cu cromosomii celuilalt sex obţinuţi în acelaşi mod, numărul combinaţiilor posibile devine astronomic, garantând apariţia de progenituri complet diferite de părinţi. Pe lângă această distribuţie aleatorie, în timpul meiozei se mai produc şi fenomene de recombinare genetică (crossover) în timpul anafazei meiozei I, ceea ce transferă aleator bucăţi de dimensiuni variabile între cromatidele cromosomilor omologi. Efectul recombinării şi a asortărilor aleatorii produc cantităţi uriaşe de gameţi diferiţi şi produce un bazin inepuizabil de diversitate genetică ce permite evoluţia organismelor şi a speciilor. Procesele biologice esenţiale ce au loc în timpul meiozei sunt: 1. Imperecherea cromosomilor este un fenomen cu 2 faze. Prima fază este alinierea, în care secvenţele ADN de pe un cromosom îşi găsesc secvenţele omoloage de pe celălalt cromosom. După aliniere braţele cromosomilor se lipesc strâns între ele, fază numită de sinapsă (alipire), fenomen mediat de complexul proteic sinaptonemal. 2. Recombinarea este schimbul fizic de segmente de ADN între cromosomii omologi lipiţi. In urma acestui fenomen apar structuri cromatinice specializate, numite chiasme, ce păstrează împerecheaţi cromosomii care s-au recombinat până în anafaza meiozei I. 3. segregarea reprezintă împărţirea cromosomilor între celulele fiică. Împerecherea şi recombinarea cromosomilor omologi are loc în timpul profazei meiozei I. Cromosomii replicaţi şi împerecheaţi sunt numiţi cromosomi bivalenţi sau „tetrade”, pentru că au 4 cromatide. Deoarece profaza meiozei I e un proces complicat, se descriu subfaze: Leptoten → de la cuvântul grecesc leptonema, ce înseamnă „fire subţiri”. Cromosomii se individualizează, dar sunt încă subţiri. Recombinarea începe prin apariţia de rupturi ale dublului helix. La sfârşitul leptotenului, cromosomii omologi sunt aliniaţi la cca. 400 nm distanţă. Zigoten → de la cuvântul grecesc zygonema, care înseamnă „fire împerecheate” şi se datorează apariţiei de cromosomi împerecheaţi, prin intermediul complexului sinaptonemal. 29

FIZIOLOGIE CELULARA

Pachyten → de la cuvântul grecesc pachytema, ce înseamnă „panglică groasă”, sinapsele sunt complete, cromosomi sunt cuplaţi, se produc recombinările, cu ajutorul structurilor de tip chiasmă. Recombinările apar mai ales la autosomi, deoarece gonosomii nu sunt identici şi pot schimba ADN doar pe porţiunile analoage. Diploten → de la diplonema → ”2 fire” → complexul sinaptonemal se degradează iar cromosomii omologi se separă. Chiasmele rămân pe cromosomii ce s-au recombinat. In cazul reproducerii umane, toate oocitele din ovarul fetal se opresc înainte de naştere în acest stadiu. Această stare suspendată se numeşte dictyoten şi rămâne astfel până la pubertate, când oocitele se maturează, doar unul pentru fiecare ciclu estral. Fenomenul se numeşte oprire în diviziune şi se datorează intervenţiei unei proteine numită CSF (factorul citostatic), care acţionează prin intermediul MAP-kinazei. Diakineza → din cuvintele greceşti pentru „traversare”, reprezintă prometafaza meiozei I. După îndepărtarea membranei nucleare, începe fenomenul de disjuncţie, adică de separare a cromatidelor din cromosomi. Restul stadiului este foarte similar cu prometafaza de la mitoză: nucleolii dispar, membrana nucleară se dezintegrează şi începe formarea fusului mitotic. In cursul fazei S au fost sintetizaţi centrosomii, ce migrează către polii celulelor şi acţionează ca centrii de organizare ai microtubulilor. METAFAZA I. Diviziunea continuă cu aceleaşi faze ca la mitoză. Cromosomii se ordonează în placa metafazică ecuatorială. ANAFAZA I. Scurtarea microtubuluilor kinetocoriali va produce îndepărtarea cromosomilor omologi. Deoarece fiecare cromosom are o singură unitate de cuplare kinetocorială în loc de 2, cromosomii se vor separa complet şi nu cromatidele surori, formând 2 seturi haploide. Centriolii continuă mişcarea către polii opuşi trăgând cromosomii după ei. TELOFAZA I. Fiecare celulă-fiică are un set înjumătăţit de cromosomi, dar fiecare dintre cromosomi este alcătuit din 2 cromatide. Fusul meiotic dispare, nucleul se reorganizează sau nu, apare şanţul de clivaj şi celulele se separă. Celulele pot intra într-o fază de repaus numită de interkineză sau interfaza II. Aici nu se produce sinteză de ADN.

30

FIZIOLOGIE CELULARA

Fig. 21. Meioza I: duplicarea cromosomilor, selectarea cromosomilor maternipaterni şi recombinarea cromatidelor şi reducerea numărului de cromosomi. Meioza II readuce cromosomii la stadiul de cromatide, pentru în vederea fertilizării.

Meioza II este similară cu mitoza, dar cu un număr de cromosomi redus la jumătate (fig. 21). PROFAZA II. Cromatina condensează din nou, nucleii îşi pierd din nou anvelopa şi apar din nou cromosomii în set haploid. Centriolii se îndreaptă către regiunile polare şi aranjează fibrele fusale pentru cea de a doua diviziune. METAFAZA II. Apare noua placă ecuatorială, aranjată perpendicular faţă de prima placă. ANAFAZA II. Centromerii sunt detaşaţi, microtubulii fusului tracţionează şi despart cromatidele surori. TELOFAZA II este similară cu telofaza I, cromosomii se despiralează, se lungesc, fusul mitotic dispare, se reformează anvelopa nucleară şi se produce citokineza, formându-se 4 celule-fiică haploide. Meioza este completă. Caracteristicile meiozei la om Soarta celulelor ce trec prin meioză diferă în mod semnificativ de la un sex la altul. De-a lungul întregii vieţi, la bărbat se produc aproximativ 100 de milioane de spermatozoizi pe zi, printr-un proces numit spermatogeneză. Celulele stem de la care porneşte spermatogeneza sunt 31

FIZIOLOGIE CELULARA

numite spermatogonii şi înainte de a intra în meioză vor trece prin opt diviziuni mitotice, care prezintă o caracteristică neobişnuită: citokineza este incompletă şi celulele rămân unite printr-un canal inelar. Teoretic, aceste opt mitoze ar , pornind de la o singură celulă, ar trebui să producă 256 de celule, dar multe dintre acestea nu supravieţuiesc, în aşa fel încât un „bloc” de spermatogonii identice din punct de vedere genetic are cam 200 de celule. Aceste spermatogonii intră simultan în meioză, în aşa fel încât se vor obţine în jur de 800 de celule post-meiotice numite spermatide. Spermatidele nu se mai divid apoi, ci se vor diferenţia şi matura, producând o celulă haploidă ultraspecializată, numită spermatozoid. Întregul proces durează aproximativ 64 de zile. La femeie, fiecare ovar conţine aproximativ o sută de mii de foliculi primordiali, fiecare conţinând un ovocit oprit în diplotenul meiozei, care are loc între săptămânile 12 şi 16 de viaţă intrauterină. De la stadiul de embrion şi până la pubertate, gameţii femeli se află în această stare de animaţie suspendată. O dată cu declanşarea semnalelor endocrine ce însoţesc apariţia ciclului menstrual, în fiecare lună se activează un singur ovocit (rarisim doi sau mai mulţi), ceilalţi intră în apoptoză şi degenerează printr-un proces numit atrezie. După ce este eliminat din foliculul ovarian la sfârşitul fazei de ovulaţie, se completează meioza I şi se opreşte în metafaza meiozei II de către CSF (factorul citostatic), şi rămâne în acest stadiu până la fertilizare. Ca urmare a completării meiozei, se produce un singur ovul, celelalte trei celule fiind foarte mici şi cu viaţă scurtă, rămânând încastrate în citoplasma ovulară sub forma corpilor polari. Aneuploidii Deşi la om sunt destul de comune, ele nu sunt foarte frecvente în populaţie, deoarece consecinţele lor sunt atât de grave pentru embrion încât de obicei nu supravieţuieşte peste primul trimestru de sarcină. Cea mai frecventă aberaţie o reprezintă triploidia (1-3% din sarcinile umane). Aceasta se datorează fertilizării unui gamet normal cu unul nesegregat (diploid). Embrionii triploizi se opresc în evoluţie în jurul săptămânii 3. Majoritatea aberaţiilor cromosomiale sunt aneuploidii (trisomii, monosomii, etc). Aneuploidiile bicromosomiale sunt avortate imediat, şi la ora actuală ca 60% din sarcinile avortate sunt datorate aneuploidiei fetale. Aneuploidii comune sunt sindroamele Down (trisomia 21), Patau (trisomia 13), Edward (trisomia 18), Klinefelter (XXY, XXXY, XXXXY). 32

FIZIOLOGIE CELULARA

4. Apoptoza Un om la maturitate este alcătuit din aproximativ 3x1013 celule, toate provenind dintr-un singur zigot. Dacă se respectă progresia geometrică ar fi suficiente aproximativ 45 de diviziuni pentru a se atinge acest număr. In realitate, cea mai mare parte a celulelor din corpul omenesc se divid în permanenţă, în aşa fel încât aproximativ la fiecare 2 săptămâni se va genera un număr complet de 30 de trilioane de celule. Dacă celulele nu ar muri întrun fel sau altul, atunci fiecare organism ar creşte la infinit, până ar satura mediul înconjurător. Astfel, proliferarea necontenită a celulelor din corpul omenesc trebuie balansată de moartea unui număr echivalent de celule. Pe de altă parte, de la embrion până la adult, organismul trece printr-o multitudine de faze intermediare, ale căror caracteristici trebuie eliminate. Astfel, am rămâne cu membrane interdigitale, coadă, sistemul imun ar ataca propriile celule, iar creierul ar fi inundat de sinapse inutile. Moartea celulară se produce în 2 modalităţi: moartea accidentală datorită intervenţiei factorilor exteriori, şi moartea programată, atunci când necesităţile organismului o cer. Moartea accidentală, numită şi necroză, se datorează traumelor mecanice şi chimice, expunerii la agenţi chimici şi fizici toxici, inaniţie şi aşa mai departe. Este singura modalitate prin care organismele unicelulare îşi sfârşesc ciclul vital. Ca urmare, ele sunt practic „nemuritoare”, deoarece în condiţii optime nu au motive să moară. Pe de altă parte, nici nu-şi menţin „individualitatea”, deoarece se divid în permanenţă, deci, în cazul organismelor unicelulare, imortalitatea este doar o caracteristică a speciei. Pe de altă parte, odată cu diferenţierea celulară şi specializarea diverselor tipuri de celule, intervine şi necesitatea îndepărtării unor celule sau ţesuturi care au fost necesare până la un moment dat, după care îşi pierd utilitatea sau devin chiar dăunătoare. Ca urmare, se implementează un mecanism de îndepărtare a acestor celule care se numeşte „moarte celulară programată” sau apoptoză. Termenul provine din limba greacă, în care înseamnă cădere, eliminare, dar treptată şi netraumatică precum căderea frunzelor dintr-un copac, toamna. Indiferent de evenimentul declanşator, apoptoza se realizează prin intermediul unei secvenţe moleculare comune. Acest fenomen se poate realiza pe mai multe căi, sau se poate datora mai multor factori declanşatori. 1. Cea mai mare parte a celulelor umane au nevoie de semnale 33

FIZIOLOGIE CELULARA

extracelulare pentru a rămâne în viaţă. Aceste semnale de supravieţuire, sau „semnale trofice” sunt produse de către sistemul vegetativ al organismului şi transmise pe cale nervoasă sau endocrină. Absenţa unor astfel de factori trofici declanşează la nivelul celulelor-ţintă un program de sinucidere. 2. Anumite tipuri celulare, ca de exemplu cele ale sistemului imun, sunt necesare numai în anumite perioade. Atunci când nu mai sunt necesare, ele sunt îndepărtate prin eliberarea în circulaţie a unor semnale specifice ce induc programe „ucigaşe” în interiorul celulelor, prin intermediul receptorilor „domeniilor morţii”. Diferenţe între necroză şi apoptoză Necroza este un tablou dramatic, care oferă o imagine foarte potrivită de „traumatism”. Când o celulă îşi pierde, din diferite cauze, capacitatea de a-şi menţine homeostazia, apa intră în celulă, echilibrul osmotic se pierde, organitele şi întreaga celulă explodează, eliberând enzime litice care produc un proces generalizat de distrugere şi disoluţie. Acest proces va culmina cu ruperea membranei şi revărsarea conţinutului celular în mediul interstiţial. Fragmentele celulare sunt factori proinflamatori, care atrag celulele fagocitare din împrejurimi, se produc manifestările caracteristice ale inflamaţiei, creşte permeabilitatea capilară, se produce edem, creşte metabolismul local ş.a.m.d. Datorită faptului că de obicei, agentul vulnerant acţionează pe o zonă mai importantă a organismului, mai multe celule sunt afectate simultan. Spre deosebire de necroză, apoptoza nu acţionează în masă, ci câte o celulă odată, şi de cele mai multe ori celula ce intră în apoptoză părea perfect sănătoasă. De altfel, este forma sub care apoptoza a fost descrisă acum aproape un secol, sub denumirea de „necroză unicelulară”. În diagnosticul histopatologic al febrei galbene, Councilman a descris corpi hialini în ficatul pacienţilor decedaţi, descrişi ca „corpi hialini” sau „corpi acidofili”. Aceşti corpi dispăreau pe testele de urmărire la pacienţii ce supravieţuiau, fiind fagocitaţi de macrofage. Când termenul de „apoptoză” a fost introdus de Kerr şi colaboratorii săi în 1972, s-a descoperit că această formă de moarte se potrivea perfect cu definiţia.

34

FIZIOLOGIE CELULARA

4.1. Evoluţia apoptozei Apoptoza are loc în 2 etape: la 4 3 primirea unui semnal „ucigaş” sau când concentraţia de factori trofici scade sub un nivel, se activează „faza latentă” a apoptozei. In această fază, celula 2 pare normală, dar cascadele enzimatice apoptotice încep Fig. 22. Fazele apoptozei: deja să intre în acţiune. Durata 1. Izolarea celulei; fazei latente este extrem de 2. Ratatinare şi blebbing 3. Kariorexis şi picnoză, variabilă, variind de la câteva fragmentare în corpi apoptotici; ore la mai multe zile, din 1 4. Fagocitare de către macrofag motive încă necunoscute. Faza de execuţie durează ~1h, timp în care celula suferă modificări dramatice, similare în toate cazurile de moarte celulară, indiferent de tipul de ţesut, după cum urmează (fig. 22): • pierderea microvilozităţilor şi ruperea joncţiunilor celulare • ratatinarea citoplasmei • apariţia de macrovezicule ce vor îngloba întreaga citoplasmă (blebbing) • pierderea asimetriei de compoziţie a membranei cu distrugere în „petece” • hipercondensarea cromatinei (kariorexis) şi lipirea de membrana nucleară (picnoză) • fragmentarea explozivă a celulei cu formarea de corpi apoptotici, ce vor fi apoi fagocitaţi de macrofagele tisulare. Exprimarea fosfatidil-serinei pe stratul extern al membranei celulare apoptotice atrage macrofagele, dar le împiedică de a secreta mediatori inflamatori; moartea apoptotică a celulelor nu produce reacţii inflamatorii. 4.2. Cauzele apoptozei Moartea celulară programată intervine în şase instanţe, situaţii în care celulele respective şi-au depăşit utilitatea, sunt anormale sau periculoase. Celulele care îşi pierd utilitatea în cursul dezvoltării ontogenetice. Embrionii trec prin variate stadii de evoluţie până la formarea unui făt uman perfect format. De exemplu, celulele ductului Muller trebuie să moară la

35

FIZIOLOGIE CELULARA

masculi, membranele interdigitale dispar, mugurii maxilari se dezepitelizează pentru a putea fuziona, timusul involuează şi dispare etc. Celule în exces. Există o serie de situaţii în care în cursul organogenezei se produc o multitudine de celule redundante, pentru a se asigura o funcţionalitate corectă şi completă. De ex., în cursul dezvoltării sistemului nervos există mult mai mulţi neuroni motori care inervează muşchii decât sunt necesari, tocmai pentru ca cei ce vor rămâne neuroni motori pentru tot restul vieţii să aibă caracteristici optime. Toţi ceilalţi neuroni suplimentari mor prin apoptoză. Altă situaţie când apar celule în exces este în cazul răspunsului imun, când plasmocitele activate secretă anticorpi în cantităţi foarte mari, chiar şi după ce agentul infecţios a fost îndepărtat. Pentru a opri producţia de anticorpi, singura modalitate este ca celulele T-supresor să elibereze o serie de citokine pro-apoptotice care distrug limfocitele B activate, cu excepţia câtorva numite limfocite B cu memorie. Celule care nu mai au funcţie. Celulele lactogene ale glandelor mamare necesită o constantă stimulare hormonală pentru a-şi menţine funcţia şi viaţa. Celulele prostatice la rândul lor vor involua şi dispărea dacă nu sunt stimulate de testosteron. Epiteliul uterin, vasele de neoformaţie endometriale sunt alte exemple de celule ce vor intra în apoptoză fără o permanentă susţinere hormonală. Celule al căror ciclu celular este perturbat. Dacă un punct de control al ciclului celular este activat, se vor elibera 2 mecanisme de control: mecanismele de reparare ale ADN-ului şi mecanisme pro-apoptotice. Dacă ADN-ul este lezat ireparabil, celula este orientată către apoptoză. Celule infectate viral. Când virusurile infectează o celulă, mecanismul genetic al acesteia este „confiscat” în favoarea genomului viral. De cele mai multe ori, aceste celule nu-şi mai produc markerii de suprafaţă care le identifică faţă de sistemul imun sau ei sunt defecţi; celulele T citotoxice vor elibera citokine pro-apoptotice care vor distruge celulele infectate. Expunerea celulelor la agenţi chimioterapici pro-apoptotici. Un număr important de plante, ciuperci şi alge produc o serie de toxine ce induc apoptoza, pentru a se proteja de paraziţi şi alte infecţii. Cele mai cunoscute sunt ochratoxinele secretate de fungi din genul Penicillium, ce produc hepatoliză prin apoptoză, precum şi citrinina, trichotecen, fumarizină şi alte substanţe care produc degenerescenţă limfoidă şi renală la animalele de curte hrănite cu cereale mucegăite. 36

FIZIOLOGIE CELULARA

4.3. Semnalele şi căile care induc apoptoza Există 2 căi, intrinsecă şi extrinsecă (fig. 23). După cum îi spune şi numele, calea intrinsecă se declanşează intracelular de către mecanismele de supraveghere internă sau de către lipsa unor factori trofici. Lipsa de nutrienţi din mediul extern poate de asemenea să fie un stimul. Calea extrinsecă reprezintă activarea căilor pro-apoptotice de către semnalele ce provin de la alte celule. Proteinele efector ale căii apoptotice sunt o serie de enzime proteolitice numite caspaze7. Denumirea provine de la faptul că ele au activitate proteazică selectivă la capătul C-terminal al reziduului Aspartat (C-Asp-aze). La om există 15 caspaze, dormante în citiosol sub formă de pro-caspaze, ce trebuie clivate pentru a deveni active. Secvenţa de evenimente este următoarea. 1. Există o serie de enzime ce se numesc iniţiatori şi care se activează prin autoproteoliză indusă de către alte tipuri de proteină, care ajută la agregarea iniţiatorilor. Caspazele-iniţiator produc activarea prin clivare a caspazelor-efector (ex. Caspaza 3), ceea ce la rândul său amplifică activitatea caspazică totală intracelulară în interiorul celulei muribunde. Fiecare caspază aparte are alte ţinte, dintre care cele mai importante sunt lamina nucleară şi citoscheletul, ceea ce duce la distrugerea celulei. O ţintă importantă este ADN-ul, care este distrus de către nucleazele autonome, dintre care cea mai cunoscută este CAD (ADN-aza activată de caspaze), precum şi o enzimă mitocondrială numită endonucleaza G. Aceste nucleaze au evoluat ca mecanism de apărare, pentru eliminarea ADN-ului contaminat viral prin răspuns defensiv suicidar. Alţi efectori importanţi ale căii intrinseci sunt proteinele Bcl, ce pot fi grupate în trei subfamilii: Bcl-2 protectori, Bcl-2 ucigaşi (Bax şi Bak) şi Bcl-2 reglatori. S-a demonstrat recent că proteinele Bcl-2 protectori sunt responsabile, ca oncogene, de o serie de tumori maligne de tipul limfoamelor, tocmai printr-o activitate exagerată, ce protejează celulele limfatice defecte de apoptoză şi le permite continuarea proliferării. Declanşatorii apoptozei intrinsece sunt acumularea de semnale proapoptotice celulare sau lipsa de factori trofici, ce acţionează prin intermediul apoptosomului. Acesta este o structură ternară mare, alcătuită din citocromul C eliberat de mitocondrie, proteina citosolică Apaf-1 şi d-ATP. 7

Caspaze iniţiator (2 , 8, 9, 10), efector (3, 6, 7), non-apoptotice pro-inflamatorii (1, 4, 5, 11, 12, 14, 15)

37

FIZIOLOGIE CELULARA

Apare o structură cu aspect de roată cu 7 spiţe. Stimulii pot varia de la leziuni ale ADN, la acumularea de factori proliferativi datorită opririi ciclului celular la un punct de control sau anormalităţii ADN din cauza contaminării virale.

Fig. 23. Cascada apoptotică. TNFr (receptorul TNF); SRO (radicali liberi); IAP (Proteina inhibitorie a apoptozei); PARP (Poli-ADP-Riboz-Polimeraza); DFF (Factor fragmentare ADN)

Deşi apoptoza apare de obicei ca răspuns la stimuli negativi, ea poate fi indusă şi de către semnale „pozitive” (semnale „ucigaşe”). Printre cele mai cunoscute sunt TNF (Factorul de Necroză Tumorală) şi ligandul Fas. TNF este o citokină eliberată de către macrofage şi declanşează moarte celulară şi distrugere tisulară ce poate fi observată uneori în unele boli 38

FIZIOLOGIE CELULARA

inflamatorii. Ligandul Fas este o proteină membranară externă exprimată de celulele NK şi de limfocitele T citotoxice. Acest semnal necesită contiguitatea celulară şi va declanşa apoptoza în celulele infectate viral, în unele tipuri de celule tumorale şi în celulele de alogrefă. Atât TNF cât şi ligandul Fas acţionează printr-un receptor membranar trimeric cu un singur domeniu transmembranar. Activarea receptorului cuplează o proteină numită FADD (domeniu letal asociat cu Fas), care va recruta şi activa caspaza 8, una din caspazele iniţiator, care la rândul ei activează alte caspaze şi porneşte cascada de amplificare. Granzyma B este o serin-protează eliberată de către granulele citoplasmice produse de celulele T citotoxice sau celulele NK. Efectul sau este de a activa apoptoza prin clivarea pro-caspazei 3 la caspaza 3 activă. Inhibitori naturali ai caspazelor Deoarece cea mai mare parte a celulelor sănătoase exprimă o cantitate semnificativă de pro-caspaze de tip iniţiator şi există un risc de oligomerizare eronată, care ar putea să omoare celula, există o serie de mecanisme care reduc sensibilitatea căii pro-apoptotice. Aceasta este reprezentată de familia de Proteine Inhibitoare ale Apoptozei (IAP), care inhibă caspazele pe două căi. Pe de o parte se cuplează cu caspazele şi le acoperă siturile active, astfel blocându-le accesul la substrate şi pe altă parte, mai multe dintre IAP-uri sunt ubiquitin-ligaze. Ubiquitina este o proteină marker ce atrage complexul proteasomic citoplasmatic, ce distruge proteinele inutile, deci o caspază ubiquitinată va fi distrusă în scurt timp. 5. Membrana celulară şi comunicarea celulei cu mediul Lichidul intracelular al celulelor vii (citosol) are o compoziţie foarte diferită de a lichidului extracelular. K+ şi PO43- sunt prezenţi în cantităţi mai mari înăuntru decât în afară, în vreme ce Na+, Ca++, Cl- sunt mult mai abundenţi în afara celulei. Aceasta se datorează funcţionării diverselor mecanisme intracelulare, dintre care de departe cele mai importante sunt cele membranare. Plasmalema păstrează aceste diferenţe prin crearea unei bariere de permeabilitate în jurul citosolului. In mod necesar, aceasta prezintă permeabilitate selectivă, pentru a-şi realiza funcţiile multiple: primirea nutrienţilor şi eliminarea cataboliţilor, primirea şi trimiterea informaţiei sub formă de hormoni, factori de creştere şi neurotransmiţători 39

FIZIOLOGIE CELULARA

Membrana celulară cuprinde plasmalema propriu-zisă şi glicoproteinele de pe faţa sa externă (glicokalix, zonă de microvecinătate) şi este strâns legată morfo-funcţional cu structuri asociate submembranare (specializări ale citoscheletului şi reticulului endoplasmic). Plasmalema este un bistrat fosfolipidic ce conţine şi alte lipide, precum şi proteine intrinseci (integrale, ce străbat ambele straturi) sau extrinseci (periferice, aparţinând unui singur strat). Plasmalema delimitează celula, asigurând schimburi controlate de substanţă şi informaţie cu mediul extracelular. Ea prezintă structuri specializate pentru diverse aspecte funcţionale: transferul substanţelor hidrofile (pori, canale, transportori), recunoaşterea semnalelor biochimice (receptori), legătura cu celulele învecinate (joncţiuni strânse şi comunicante), mişcarea celulei sau a lichidului extracelular (cili şi flageli). Joncţiunile celulare sunt alcătuite din alipiri ale plasmalemei celulelor învecinate, simple în cazul joncţiunilor strânse (aderente), străbătute de filamente ancorate submembranar în cazul desmozomilor şi de canale în cazul joncţiunilor comunicante. Aceste canale sunt permeabile pentru ioni şi molecule mici (de exemplu ATP), sunt formate din două seturi pereche de câte şase proteine numite conexoni şi sunt reglate de concentraţia locală de calciu şi protoni. 5.1. Structura membranei celulare Structura generală a membranei a fost bănuită încă din anii 1930, datorită naturii sale lipidice. Pornind de la conceptul de bistrat fosfolipidic (fig. 24), care însă nu explica traficul transmembranar, în 1973 Lenard, Singer şi Nicholson au folosit microscopia electronică pe replici obţinute prin criodecapaj (freeze-itching) pentru a pune în evidenţă dispunerea proteinelor în bistratul lipidic. Astfel a fost introdus pentru plasmalemă modelul mozaicului fluid, păstrat cu modificări până astăzi. Lipidele membranare sunt majoritar fosfolipide (fig. 25). Mai precis esteri fosaforici ai trigliceridelor, adică fosfogliceride (glicerofosfolipide). Ele sunt alcătuite din 3 părţi: o coloană (backbone) alcătuită din glicerol, 2 acizi graşi alifatici esterificate la C1 şi C2 ai glicerolului, un radical fosfat esterificat cu un alcool. Fiecare dintre aceste molecule complexe are o formă caracteristică şi caracteristici fizico-chimice deosebite, pe care le datorează acestei structuri.

40

FIZIOLOGIE CELULARA

Cele 2 resturi de acizi esterificate la C1 sau C2 pot avea de la 13 la 19 atomi de carbon. Unul sau mai multe dintre resturile alifatice poate prezenta legături duble, ceea ce oferă un anume grad de „curbare” a moleculei ceea ce va conferi la rândul său fluiditate membranei cu cât gradul de nesaturare al lipidelor membranare este mai mare. Gruparea fosfoalcoolică de la C3 are o încărcare electrică negativă ce poate fi neutralizată sau nu de încărcarea restului moleculei, rezultând glicerofosfolipide negative sau neutre. Acest cap polar se poate cupla cu sarcinile parţiale ale moleculei de apă; caracter hidrofil. Pe de altă parte, polul lipidic este hidrofob, astefel că molecula în ansamblu are caracter amfifil (hidrofil la un pol şi Fig. 24. Evoluţia modelelor de mebrane hidrofob la celălalt). Această caracteristică duce la organizarea caracteristică a lipidelor membranare în contact cu apa. Când există o interfaţă aer-apă, lipidele se organizează într-un monostrat cu polii hidrofobi către aer şi cei hidrofili către apă (fig. 26). Dacă însă nu există o interfaţă aer-apă, şi lipidele sunt sub formă de picături în apă, vor lua o formă sferică, cu polii hidrofobi spre interior şi cei hidrofili spre exterior. Un astfel de amestec neomogen se numeşte emulsie. O a treia posibilitate de organizare spaţială a glice-rofosfolipidelor în apă este de picătură complexă, cu centru apos şi pereţi lipidici. Această formă se numeşte liposom şi este forma esenţială care va evolua către celulă. Un liposom este o Fig. 25. Glicerofosfolipid picătură de apă, înconjurată de o membrană lipidică, 41

FIZIOLOGIE CELULARA

la rândul său imersată în apă. Singura configuraţie non-entropică posibilă este cea de bistrat lipidic, monostrat adică organizarea lipidelor în două straturi, cu polii monostrat hidrofili orientaţi către apa exterioară şi interioară şi cei hidrofobi orientaţi unul către celălalt, în Lip A interiorul membranei. Acest aspect generic de miceliu membrană este prezent la toate celulele animale sau vegetale, cu variaţii de compoziţie. liposom Printre glicerofosfolipide se mai pot regăsi şi lipide ce conţin glucide, numite generic sfingolipide. Acestea îşi iau numele de la baza azotată Inter sfingozină, care înlocuieşte unul dintre acizii graşi din fosfogliceride. Capetele hidrofile sunt alcătuite din unul sau mai multe glucide, unele neutre, altele încărcate negativ. Cele esterificate cu alcooli se Exte numesc sfingomieline. Fig. 26. Fosfolipide dispersate în apă Cea de-a treia clasă de lipide membranare sunt sterolii. Cea mai mare parte din membranele lipide animale prezintă în componenţa lor colesterol, în vreme ce membranele vegetale prezintă diverse alte Fig. 27. Colesterolul variante, numite fitosteroli. Colesterolul (fig. 27) este un polialcool, cu o structură rigidă şi plată, cu 4 inele, ce se intercalează între lanţurile acizilor graşi ai fosfolipidelor şi a cărui funcţie este de a stabiliza membrana, reducându-i fluiditatea. Este un component important plasmalemal, 10-15% din totalul lipidelor membranare. Deoarece lungimile şi caracteristicile lanţurilor fosfolipidice sunt variabile, legăturile sunt laxe, ceea ce duce la o fluiditate foarte mare. Intercalarea de colesterol creşte rigiditatea. Există şi trigliceride în celule, dar nu pot fi încorporate în bistraturile lipidice deoarece le lipseşte capul hidrofil. Apar ca picături în citoplasmă, rezerve de energie pentru celulele animale. Celulele adipoase au interiorul aproape complet astfel ocupat. A A

5.1.1. Caracteristici fizice ale bistratului lipidic Compoziţia membranelor biologice variază foarte mult. Membranele situate la exteriorul celulei au cea mai mare proporţie de colesterol, în vreme 42

FIZIOLOGIE CELULARA

ce membranele ce fac parte din organitele celulare au o cantitate redusă de colesterol. Ca urmare, plasmalema are o rigiditate mai mare decât membranele intracelulare. De asemenea, structura membranelor trebuie să conţină lipide nesaturate, întrucât acizii graşi cu catenă alifatică peste 16 atomi de carbon sunt solizi la temperaturile corpului,. Aceste caractere duc la fenomenul de fluiditate membranară, care semnifică gradul de mobilitate al moleculelor din membrană. Cu cât există mai puţin colesterol, cu atât mobilitatea moleculară este mai redusă. O moleculă liposolubilă se distribuie în membrana unei bacterii în secunde datorită mobilităţii laterale a moleculelor, dar va trece mai dificil către interiorul celulei, Fig. 28. Mişcările realizate de moleculele bistratului lipidic datorită mişcărilor rare de basculare. Membranele lipidice ar trebui să fie teoretic impermeabile pentru apă şi solviţi. Totuşi, există un trafic transmembranar de apă şi ioni, deoarece moleculele şi ionii mici se pot „strecura” printre moleculele mai mari ale lipidelor membranare. La scara de timp ale fenomenelor biologice, acest tranzit este nesemnificativ. Substanţele liposolubile tranzitează liber membrana celulară, dizolvându-se cu rapiditate. Fluiditatea membranară crescută determină şi tranzitul intens al substanţelor liposolubile. Identificarea cu înaltă rezoluţie a lipidelor în compartimente distincte ale membranei a dus la observarea mişcărilor de rotaţie, difuzie transversală şi laterală (fig. 28); moleculele se mişcă diferit unele de altele şi nu la întâmplare. 5.1.2. Plutele lipidice Deoarece colesterolul interacţionează mai rapid şi mai puternic cu sfingolipidele, există o tendinţă de agregare a acestora, formând grupări mai rigide în foiţa externă a membranei celulare, care au fost numite „plute” lipidice (lipid rafts). La nivelul acestora se pare că se agregă şi glicolipide membranare şi unele proteine, oferind şi specializare funcţională acestor agregate lipidice (fig. 29). Acestea ar putea avea mai multe roluri. Ar putea fi parţial complexe de semnalizare, parţial motive structurale membranare repetitive. Plutele lipidice ar putea aduna moleculele semnal pentru o semnalizare mai eficientă. 43

FIZIOLOGIE CELULARA

Plutele lipidice sunt subdomenii plasmalemale distincte (submicronice), alcătuite în principal din glicosfingolipide şi colesterol şi prezintă proteine cu ancora GPI, mai groase şi agregate mai compact decât restul membranei. Cercetătorii au testat prezenţa şi importanţa plutelor în semnalizarea celulară, întâi identificând procesele de semnalizare şi apoi producând distrugerea localizată a plutelor cu detergenţi, notând în final modificările în funcţia celulară. Plutele sunt implicate într-o multitudine de procese şi sisteme fiziologice, cât şi patologice. Acestea includ semnalizarea Fig. 29. Aspectul unei plute lipidice celulară, traficul molecular, funcţia sistemelor imun, vascular şi reproductiv. Unii patogeni precum HIV (virusul SIDA), salmonella (bacil al febrei tifoide) sau protozoarul malariei (ce parazitează interiorul hematiilor) au capacitatea de a „deturna” funcţiile plutelor pentru scopurile proprii, de exemplu pentru a putea avea acces la interiorul unei celule. 5.1.3. Proteinele Membranare Există 2 categorii: proteine integrale (intrinseci) care sunt monotopice, multisubunitare, uni- sau multi pasaj, şi proteine periferice (extrinseci), ancorate în lipide. Proteinele integrale au unul sau mai multe segmente incorporate în bistratul lipidic, pe care-l traversează o dată sau de mai multe ori. Majoritatea proteinelor conţin reziduuri aromatice (hidrofobe), care interacţionează cu lanţurile fosfolipidice, ancorându-le în bistratul lipidic. Există trei tipuri de traversare transmembranară, adică de tip: glicoforină, bacteriorodopsină, porină. Toate acestea formează canale ce permit pasajul apei sau substanţelor ionizate si hidro solubile dintr-o parte într-alta a membranei. Interiorul canalului este hidrofil, ceea ce face ca aceste proteine să fie optime pentru transportul apei sau ionilor. La toate proteinele transmembranare cunoscute, domeniile ce traversează membrana sunt αhelixuri sau benzi β multiple. Proteinele intrinseci prezintă unul sau mai 44

FIZIOLOGIE CELULARA

multe domenii transmembranare. Acestea sunt domenii extracelulare, care pot fi de la câteva reziduuri până la mai multe sute de aminoacizi, ce se extind în mediul extracelular. Proteinele extrinseci nu interacţionează cu nucleul hidrofob al bistratului lipidic, ci sunt de obicei cuplate indirect, prin intermediul unor proteine integrale sau prin interacţiuni cu capetele polare. Proteinele periferice sunt proteine ancorate (fig. 30) în bistratul lipidic, fie pe faţa externă, fie pe faţa internă. Se cunosc 6 modalităţi de ancorare a proteinelor: coada izoprenoidă (coadă de farnezil cu 15 C, ancorează GTP-aza pe faţa citoplasmică), coada miristoil (14 C, ancorează tirozin-kinaza STC pe faţa citoplasmică a membranei), coada inozitolfosfat (ancorează glicolipidele pe suprafaţa externă a membranei, cel mai frecvent enzime de tip colinesterază sau MAO, proteine de adeziune de tip caderine sau antigene de suprafaţă), interacţiuni electrostatice cu fosfolipidele (printre proteinele cuplate se numără anexinele (proteine de adeziune), precum şi proteine motorii de tip miozină, penetrarea parţială a stratului lipidic (unele proteine se ancorează superficial în membrană, fără a o traversa; cel mai cunoscut membru al acestei familii este prostaglandin–sintaza), asociere de proteine periferice cu proteine integrale. Proteinele se pot lega de alte proteine, încât un receptor se poate lega de un canal, sau o proteină funcţională de una structurală.

Fig. 30. Moduri de pasaj şi ancorare a proteinelor

Funcţiile proteinelor membranare sunt atât de numeroase şi variate încât este aproape imposibil să fie sistematizate. O enumerare succintă va cuprinde următoarele funcţii majore, în mare parte legate de medierea semnalizării celulare: pori pentru apă, canale ionice (receptor-dependente, 45

FIZIOLOGIE CELULARA

voltaj-dependente, sau operate în alte moduri), transportori (translocatori moleculari), receptori membranari (cuplaţi cu proteine G tirozin-kinazici, pentru patogeni, etc.), molecule de adeziune celulară şi antigene de suprafaţă, diverse enzime ancorate pe membrană (sintaze de lipide, etc.), puncte de ataşare pentru citoschelet, repere veziculare, receptori pentru exo/endocitoză şi proteine de fuziune membranară. 5.1.4. Canalele pentru apă Reglarea răspunsurilor osmotice se face de către proteine transmembranare numite aquaporine (fig. 31). Cunoscute şi sub numele de canale pentru apă, sunt proteine membranare integrale, ce mai pot transporta şi alţi solviţi fără sarcină electrică, cum ar fi glicerolul, amoniacul sau ureea. Oricum, porii pentru apă sunt complet impermeabili pentru orice specie moleculară încărcată electric. Aquaporinele sunt alcătuite din şase α-helixuri transmebranare, cu ambele capete, atât C-terminale cât şi Nterminale pe faţa citoplasmică a membranei. Aspectul general al unui astfel de canal este de „clepsidră”. Aquaporinele formează tetra-meri, fiecare monomer acţionând ca un canal de apă. Mecanismul prin care sunt excluse alte molecule de la pasaj este filtrul de selectivitate ar/R (aromatic/arginină). Fig. 31. Por pentru apă Acesta este o tetradă formată din reziduuri de arginină de pe helixurile şi ansele moleculei. Această îngustare slăbeşte legăturile de hidrogen dintre moleculele de apă, permiţându-le să interacţioneze cu resturi de arginină încărcate pozitiv şi astfel resping protonii ce ar putea trece prin porul de apă. 5.2. Permeabilitatea ionică şi potenţialul transmembranar Permeabilitatea redusă şi controlabilă a plasmalemei pentru diverşi ioni stă la baza diferenţelor de compoziţie ionică între mediul intracelular şi cel extracelular, care explică existenţa în repaus a unui potenţial electric trsansmembranar. Variaţiile de potenţial electric membranar au o importanţă specială în semnalizarea la nivel celular. 46

FIZIOLOGIE CELULARA

Plasmalema este esenţial implicată în răspunsurile celulare la diverşi stimuli din mediu. Stimulii fizici determină la nivel plasmalemal modificări de conductanţă ionică, cu variaţii consecutive ale potenţialului electric transmembranar. In repaus membrana este “polarizată”; interiorul este negativ faţă de exterior. Dacă o depolarizare atinge nivelul prag pentru deschiderea unor anume populaţii de canale ionice voltaj-dependente se declanşează potenţialul de acţiune, ce se propagă în toată membrana. Potenţialul de acţiune, precum şi alte modificări de potenţial, sunt implicate în conducerea excitaţiei electrice şi în cuplarea acesteia cu alte modalităţi de răspuns celular. Modificările locale de potenţial sunt deosebit de importante prin efectul de modulare a excitabilităţii electrice; potenţialul se apropie sau se depărteză de valoarea prag pentru declanşarea potenţialului de acţiune. Stimulii chimici sunt reprezentaţi de diverse substanţe din spaţiul extracelular, cu acţiune mai mult sau mai puţin specifică. Există substanţe bioactive care trec prin membrană şi se leagă de proteine receptor din citosol, complexul rezultat acţionând ulterior la nivel nuclear asupra ratei de transcripţie a anumitor gene. Majoritatea substanţelor bioactive acţionează însă la nivel plasmalemal: asupra fluidităţii membranare, direct asupra unor canale ionice, dar mai ales prin legarea de proteine receptor mebranare. Rezultă un complex molecular format din substanţa respectivă şi receptorul său (complexul ligand-receptor), ce realizează mai departe transmiterea semnalului pe diverse căi (semnalizare intracelulară). Unii receptori au în structura lor sau sub control direct canale ionice numite receptor-operate. Această categorie de canale include şi pe cele controlate indirect, prin intermediul proteinelor G sau prin mesageri secunzi. 5.3. Clasificarea formelor de transport transmembranar Transportul transmembranar se realizează ca macrotransfer (vezi cap. “Dinamica celulară a membranelor”) şi microtransfer. După sens, macrotransferul poate fi endocitoză şi exocitoză. După cum vezicula de endocitoză conţine sau nu material solid, aceasta se numeşte fagocitoză sau pinocitoză (macro- sau micropinocitoză, după dimensiunile veziculei). Transcitoza este cuplarea endocitozei la un pol al celulei cu exocitoza la celălalt pol. Microtransferul poate fi pasiv sau activ, după cum se realizează în sensul sau împotriva gradientului electrochimic transmembranar. Transportul pasiv este de fapt un proces de difuziune prin membrană. In general 47

FIZIOLOGIE CELULARA

rata de difuzie printr-o membrană este proporţională cu temperatura absolută, gradientul de concentraţie şi coeficientul de permeabilitate, determinat la rândul său de coeficientul de partiţie între membrană şi mediu. Substanţele lipofile difuzează uşor prin bistratul fosfolipidic, iar cele hidrofile utilizează diverse căi hidrofile. In sensul scăderii ratei de transfer şi al creşterii selectivităţii, precum şi pe baza diferenţelor structurale, căile hidrofile pot fi clasificate în pori, canale şi transportori. Porii şi canalele sunt structuri proteice care delimitează căi apoase transmembranare. Canalele prezintă bariere de permeabilitate şi de selectivitate, unele din ele operate chimic sau electric. Difuziunea transmembranară pe căi preferenţiale specifice se numeşte facilitată, în opoziţie cu difuziunea simplă. Difuziunea apei prin membrană se numeşte osmoză. Presiunea osmotică este egală cu presiunea care aplicată în compartimentul cu osmolaritate mai mare poate împiedica osmoza. Osmolaritatea este numărul total de particule ale substanţelor solvite (se aplică coeficienţi de disociere şi de activitate DebyeHuckel) raportat la numărul lui Avogadro şi la volumul soluţiei (sau la masa de solvent în cazul exprimării ca osmolalitate). In cazul transportorilor transferul de substanţă presupune legarea acesteia de proteina transportoare pe o faţă a membranei, o anume modificare conformaţională a acesteia (flip-flop, ping-pong, situsuri succesive de legare), şi eliberarea substanţei transportate pe cealaltă faţă a membranei. După numărul de specii moleculare transferate pentru un ciclu transportor, există uniport şi cotransport. Acesta din urmă se numeşte sinport dacă transferul este în acelaşi sens pentru două sau mai multe substanţe diferite şi antiport dacă sensul transferului pentru una din substanţe este opus faţă de o alta. Transportul activ se realizează evident numai de către transportori proteici şi poate fi primar sau secundar, după cum proteina transportoare prezintă sau nu activitate ATP-azică proprie. Transportul activ secundar este întotdeauna cotransport, una din substanţe fiind transportată activ pe baza gradientului pentru o alta. Consumul de energie este indirect, realizându-se la nivelul unui transportor activ primar ce menţine gradientul menţionat, necesar pentru funcţionarea celui secundar. 5.4. Difuziunea prin membrane Toate moleculele dintr-un mediu fluid (lichid sau gazos) sunt într-o continuă mişcare aleatorie (agitaţie termodinamică), cu atât mai intensă cu 48

FIZIOLOGIE CELULARA

cât temperatura este mai mare. Prin definiţie difuzia sau difuziunea este un proces fizic prin care moleculele unei substanţe se împrăştie într-un “mediu de difuzie”. Mai precis, difuzia este o dispersie moleculară termodependentă. Astfel, dacă soluţiile apoase a două substanţe vin în contact direct, atât moleculele de apă cât şi cele ale substanţelor dizolvate se vor răspândi unele printre altele rezultând o soluţie apoasă care conţine ambele substanţe dizolvate distribuite în mod uniform în volumul soluţiei. Mai simplu, amestecurile de gaze se formează de fapt printr-un proces de difuzie. Dacă două compartimente lichidiene sunt separate printr-o membrană care permite trecerea moleculelor respective avem de-a face cu fenomenul de difuzie prin membrană. In oricare situaţie difuziunea este esenţialmente un proces pasiv, dictat de gradiente chimice (sau electrochimice în cazul ionilor). Viteza cu care se desfăşoară fenomenul fizic de difuzie prin membrană se numeşte rată de difuzie şi este proporţională cu energia potenţială de difuziune RTln(a/b), unde R este constanta generală a gazelor, T este temperatura absolută, iar a şi b sunt valorile de concentraţie ale substanţei respective în compartimentele între care are loc difuzia. Trebuie subliniat aspectul fizic (termodinamic), al fenomenului de difuziune, după cum urmează. Mişcarea fiecărei molecule este dezordonată, lipsită de o anumită orientare spaţială, pe o traiectorie punctată de ciocniri moleculare aleatorii, dar este mai mare probabilitatea ca în timp oricare dintre molecule să se deplaseze spre zona în care concentraţia substanţei respective este mai mică (pentru că ciocnirile sunt mai frecvente unde concentraţia este mai mare). In cazul compartimentelor separate prin membrană permeabilă pentru substanţa dizolvată se poate spune că “şansa” fiecărei molecule de a străbate membrana este egală pentru cele două sensuri opuse, dar “agitaţia moleculară” şi frecvenţa ciocnirii cu peretele vor fi mai mari pe partea cu concentraţie mai mare, astefel că efectul net va fi de difuzie către compartimentul mai diluat, până la egalarea concentraţiilor. In acest caz transferul de molecule prin membrană nu încetează, deci fenomenul de difuzie continuă să se producă, dar rata de trecere în cele două sensuri este aceeaşi, astfel că nu se mai produce un transfer net de substanţă în favoarea unuia din compartimente, adică se instalează o stare tipică de echilibru dinamic. Pe lângă diferenţa de concentraţie (gradient chimic), difuzia ionilor este influenţată şi de câmpul electric (gradient electric), asfel că ea se 49

FIZIOLOGIE CELULARA

produce ca efect al unui gradient electro-chimic. Pe lângă gradientele electro-chimice, (care determină sensul şi rata difuziei prin membrană), rata de difuzie este limitată de grosimea membranei şi depinde pentru fiecare substanţă de permeabilitatea membranei pentru acea substanţă, exprimată sub forma coeficientului de difuzie. Asfel legea lui Fick arată că rata de difuzie D poate fi exprimată sub forma D = p(a-b) = k(a-b)/d, unde a şi b sunt concentraţiile substanţei în cele două compartimente, iar p este un factor de permeabilitate egal cu raportul dintre coeficientul de difuzie k şi grosimea membranei d. Membrana poate avea o permeabilitate diferită (selectivă) pentru diferitele specii moleculare ce se găsesc în cele două compartimente. Difuziunea prin membrană a unei substanţe fără participarea specială a unei structuri moleculare din compziţia membranei se numeşte difuziune simplă, în opoziţie cu difuziunea facilitată de un sistem special de transport transmembranar. Având în vedere compoziţia predominant lipidică a plasmalemei, substanţele liposolubile o străbat prin difuziune simplă. Sunt liposolubile (lipofile, hidrofobe) în general substanţele ale căror molecule sunt electroneutre şi non-polare. Pe măsură ce o moleculă prezintă o polarizare electrică mai accentuată substanţa respectivă devine mai solubilă în solvenţi polari, inclusiv apa, deci mai hidrofilă şi mai lipofobă, astfel că trecerea sa direct prin bistratul fosfolipidic plasmalemal se face mai dificil. Difuziunea facilitată Difuziunea facilitată nu este decât în mică măsură similară cu difuzia simplă prin membrană. O anumită substanţă poate trece prin membrană prin ambele mecanisme. Transportul este în ambele cazuri pasiv, adică în sensul gradientului electro-chimic şi fără consum energetic. Esenţa fenoemnului de facilitare constă în existenţa unei structuri în cadrul membranei care pentru un gradient permite o rată de difuziune mai mare decât cea prin difuziune simplă. Subliniem faptul că orice 50

rata de difuzie totală facilitată

simplă gradient Fig. 32. Saturarea difuziei facilitate

cale transmembranară hidrofilă

FIZIOLOGIE CELULARA

reprezintă de fapt o facilitare a transportului prin membrana celulară pentru o substanţă hidrofilă, dar termenul de difuziune facilitată se foloseşte restrictiv, numai pentru acele mecanisme de facilitare care au o capacitate limitată de transport. Ca urmare curba ratei de difuzie facilitată suferă un fenomen de saturare (fig. 32), similar cu procesele catalizate enzimatic. Se descriu procese de difuziune facilitată pentru diverse substanţe (glucoză, glicerol, aminoacizi, uree, diverşi anioni, etc.), toate utilizând proteine transportoare, astfel că mecanismul şi caracterele difuziei facilitate sunt descrise separat (vezi cap. 5.7.). 5.5. Osmoza Aşa cum am precizat mai sus (vezi cap. 5.2.), difuziunea apei prin membrane se numeşte osmoză. Tot acolo am definit toţi termenii importanţi care se referă la fenomenul de osmoză. Osmoza este unul din procesele fundamentale prin care se produce transferul apei între compartimentele hidrice ale organismului, inclusiv între interiorul fiecărei celule şi mediul în care aceasta se găseşte. Practic osmoza desemnează cazul particular al fenomenului de difuziune derivat din agitaţia termică a moleculelor de apă. Dacă membrana care separă două compartimente ce conţin soluţii apoase este permeabilă pentru apă are loc fenomenul de osmoză, la fel cum se produce difuziunea prin membrană pentru substanţele solvite pentru care aceeaşi membrană este permeabilă. Ca şi pentru difuziune, termenul de osmoză nu se referă pur şi simplu la trecerea moleculelor de apă prin membrana respectivă în cele două sensuri, ci la transportul net de apă care se realizează prin acest fenomen într-unul din sensuri, ca însumare a ratei de difuzie a apei prin membrană în cele două sensuri. Subliniem faptul că osmoza se produce efectiv, ca transfer hidric net, numai dacă unul din compartimente conţine un compus dizolvat care nu difuzează prin membrană. Dacă unul din compartimente conţine o soluţie mai concentrată, dar membrana este permeabilă pentru toate substanţele dizovate, atunci difuziunea prin membrană a substanţelor dizolvate şi a apei au loc în paralel până la egalizarea concentraţiilor. Cu alte cuvinte această egalizare se produce în ultimă instanţă pe baza transferului net de substanţe dizolvate, nu de apă. Dacă însă există solviţi nedifuzibili, aceştia practic vor atrage apa (efect osmotic) în compartimentul în care se găsesc în 51

FIZIOLOGIE CELULARA

concentraţie mai mare, ducând la transferul net al unui volum de apă spre compartimentul respectiv, adică la fenomenul de osmoză. Atunci când membrana este permeabilă numai pentru apă ea se numeşte membrană ideală8 şi permite desfăşurarea unui fenomen de osmoză pură (adică neînsoţit de difuziunea prin membrană a vreunei substanţe dizolvate). Efectul osmotic este cu atât mai mare cu cât numărul particulelor nedifuzibile este mai mare, indiferent de dimensiunile particulelor9. Revenind asupra noţiunii de presiune osmotică, putem spune că ea exprimă tendinţa de realizare a osmozei, ca o presiune suplimentară existentă în compartimentul diluat, în timp ce efectul osmotic exprimă aceeaşi tendinţă privită ca o sucţiune exercitată dinspre compartimentul cu soluţie concentrată. Oricum, aplicarea în acest compartiment a unei presiuni mecanice egală cu presiunea osmotică va produce practic stoparea fenomenului de osmoză. De fapt osmoza se produce spre compartimentul cu soluţie concentrată până când se acumulează o presiune statică capabilă să o contracareze. Presiunea osmotică poate fi exprimată în unităţi de presiune (de ex. mmHg), dar putem face referire directă la osmolaritatea care o determină; pentru 1 Osmol efectul osmotic ideal are valoarea de 22,4 atm), cu menţiunea că efectul osmotic este suma efectelor osmotice pentru fiecare substanţă luată separat. Osmolaritatea se poate măsura cu osmometre, bazate pe evaluarea punctului de îngheţ sau de fierbere (sau a presiunii de vapori). Soluţiile care au aceeaşi presiune osmotică sunt denumite izotone (se referă strict la efecte osmotice reale, ale solviţilor non-permeanţi prin membrana respectivă), iar cele care au aceaşi osmolaritate sunt denumite izoosmotice (se referă la osmolaritate, incluzând solviţii permeanţi prin membrana în cauză, altfel spus se referă la efectul osmotic total şi la o membrana ideală). Celulele sunt viabile şi funcţionează normal numai dacă mediul în care se găsesc are aceeaşi presiune osmotică cu cel intracelular, adică este izoton10. Dacă mediul este hipoton celula absoarbe apă prin osmoză şi astfel volumul celular creşte şi presiunea osmotică intracelulară scade, iar dacă mediul este hipoton osmoza se realizează în sens opus, spre 8

Epiteliul ramului ascendent al ansei Henle constituie o membrană aproape ideală ce separă lichidul din lumenul tubular de lichidul interstiţial. 9 Atâta timp cât acestea sunt suficient de mici încât să respecte legile de mişcare la nivel submicroscopic, ale agitaţiei termice a particulelor în sisteme disperse stabile. 10 In practica medicală se folosesc în anumite cazuri soluţii hipotone sau hipertone.

52

FIZIOLOGIE CELULARA

exteriorul celulei, având efecte inverse. Dacă mediul este izoton dar hiperosmotic, solviţii permeanţi difuzează în gradient chimic spre interiorul celulei, determinând hipertonie intracelulară, care duce la pătrunderea apei prin osmoză, până când ea devine din nou izotonă cu mediul, dar şi izoosmotică. Aceste exemple sunt teoretice (pentru explicarea fenomenelor) şi pornesc de la modelul celulei plasate într-un mediu cu volum quasiinfinit, situaţie foarte diferită de cea reală, în care interstiţiul are un volum redus faţă de celule. Osmolaritatea este un parametru de bază în homeostazia mediului 11 intern , adică este permanent controlată, astfel încât variază în limite foarte strânse (0,280 - 0,303 Osmolar) în jurul valorii de referinţă (0,297 Osmolar). Ca parte componentă a mecanismelor osmoreglatoare, în hipotalamus sunt prezenţi neuroni ce funcţionează ca osmoreceptori specializaţi. 5.6. Canale ionice membranare Aşa cum am arătat mai sus (cap. 5.3.), canalele ionice sunt căi transmembranare preferenţiale pentru substanţe hidrofile, de nivel intermediar între pori şi transportori în ce priveşte rata de transfer şi selectivitatea. Funcţia de canal ionic este asigurată de ansambluri oligomerice de proteine transmembranare (intrinseci). Insistăm din nou asupra faptului că transportul prin canale este strict pasiv, conform gradientelor electro-chimice; doar unii transportori, care sunt sisteme complet diferite ca mecanism de funcţionare faţă de canale, pot realiza fenomene de transport activ. Aşadar, fluxul de particule prin canale este foarte rapid, comparativ cu cel asigurat de transportori, tocmai pentru că nu necesită un ciclu de modificări conformaţionale pentru transferul unui ion sau al unei molecule. Canalele ionice pot fi foarte selective, specializate pentru o singură specie ionică, sau mai puţin selective (fiind oricum diferite după semnul sarcinii electrice a ionilor permeanţi; caz în care sunt numite generic canale cationice sau anionice neselective). Canale ionice asemănătoare cu cele din plasmalemă se găsesc şi în membranele intracelulare (reticulul endoplasmic, etc.). Faptul că numai anumiţi 11

Osmolaritatea plasmei sanguine este deseori aproximată prin două formule de calcul, după cum urmează. 2[Na+] + glicemia/18 + azot ureic/2.8, cu ultimele două concentraţii exprimate în mg/dl. Sau 2[Na+] + 2[K+] + [uree] + [glucoză], cu toate concentraţiile exprimate în mmol/l.

53

FIZIOLOGIE CELULARA

ioni pot trece prin porul acestor ansambluri proteice se datorează prezenţei filtrului de selectivitate. Pe de altă parte, canalele ionice prezintă mecanisme de control al fluxului de particule; se spune că sunt „dependente” sau „operate” de anumiţi factori: potenţialul electric transmembranar (voltajdependente), complexe ligand - receptor (receptor-operate, activate de liganzi), etc. De fapt orice canal ionic prezintă fluctuaţii conformaţionale spontane sau induse, extrem de rapide, între starea “închis” (inactiv) şi starea “deschis” (activ), uneori fiind descrise şi alte stări particulare. Diverşii factori “operatori” influenţează anumiţi parametri legaţi de aceste transformări de stare, cum ar fi probabilitatea de producere a transformării sau durata de menţinere a stării activate. Clasificarea canalelor ionice este un subiect important, însă extrem de dificil. Datorită faptului că în acest domeniu volumul de informaţii este foarte mare şi în continuă creştere rapidă, există variate clasificări. In acest sens, cu sprijinul celor mai importanţi cercetători, forul modial în domeniul farmacologiei desfăşoară o acţiune permanentă pentru uniformitate în nomenclatură şi clasificare, ca şi pentru sistematizarea informaţiei disponibile privind receptorii şi canalele ionice (http://www.iuphar-db.org). Patch-clamp Existenţa canalelor ionice membranare, ca bază moleculară a permeabilităţii selective şi variabile a plasmalemei pentru ioni, a fost dovedită prin utilizarea unor tehnici avansate de electrofiziologie; metoda patch-clamp, varianta de evaluare a curentului ionic printr-un singur canal (singlechannel). Deşi în prezent există numeroase alte mijloace de studiu experimental al canalelor ionice, acestea sunt mai curând combinate cu metodele electrofiziologice de mai sus, decât folosite în locul acestora. La baza procedurilor patch-clamp stă tehnica potenţialului impus (voltage-clamp)12. Dispozitivul se bazează pe un amplificator de mare impedanţă pentru culegerea variaţiilor de potenţial şi pe un amplificator operaţional. Acesta compară (cu frecvenţă foarte mare) valoarea de potenţial electric înregistrată cu o valoare prestabilită de către utilizator şi compensează diferenţa măsurată, prin injecţia de electroni în sistem. Practic se 12

Tehnica clasică de voltage clamp foloseşte doi electrozi, unul pentru măsurare şi unul pentru compensare, dar în prezent majoritate studiilor folosesesc varianta modernă cu un electrod care este folosit alternativ cu frecvenţă mare pentru cele două scopuri.

54

FIZIOLOGIE CELULARA

împiedică variaţia potenţialului, comandând intensitatea acestui curent de electroni care compensează curentul ionic prin membrană, asfel că acesta din urmă nu determină modificarea de potenţial pe care ar determina-o în absenţa “clampării”. Această tehnică, simplă şi inventivă ca principiu, rezolvă problema măsurării curenţilor ionici, deoarece o simplă măsurare şi înregistrare a curentului electric compensator (folosit pentru impunerea potenţialului) indică valoarea curentului ionic care a fost compensat. Elementul procedural esenţial constă în plasarea vârfului electrodului de sticlă (~1μm diametru) pe suprafaţa membranei, urmată de sucţiune uşoară până la “sigilare”, adică până ce rezistenţa electrică între interiorul micropipetei şi exterior, la zona de contact cu membrana, depăşeşte 1 GΩ (gigaseal), izolându-se practic circuitul de măsurare şi clampare. Porţiunea de membrană studiată poate fi lăsată ca atare (cell-attached patch-clamp), variantă care permite măsurarea de curenţi prin canalele prezente doar în acea porţiune (posibil printr-un singur canal ionic). Sau se poate continua sucţiunea până la ruperea porţiunii respective de membrană (whole-cell voltage-clamp; ruptured patch), fapt ce permite înregistrarea cu uşurinţă a diferiţilor curenţi globali, cu amplitudine relativ mare, la nivelul membranei întregii celule13. Fără sucţiune suplimentară se poate trece la situaţia de whole-cell prin adăugarea în pipetă a unui agent special de perforare (perforated patch). In altă variantă porţiunea “sigilată” poate fi detaşată de celulă prin retragerea microelectrodului (cell-dettached patch-clamp; insideout patch14), care de asemeni permite studierea separată a canalelor din patch, dar de data aceasta în absenţa vreunei legături cu celula şi în condiţiile în care faţa internă a membranei vine în contact cu soluţia externă, a cărei compoziţie poate fi uşor şi riguros manipulată. Ionoforii Ionoforii sunt transportori de provenienţă exogenă (artificiali)15 care măresc permeabilitatea membranară pentru anumiţi ioni, prin mecanisme 13

Soluţia din pipetă are compoziţie ionică similară cu mediul intracelular, dar pipeta este mare faţă de celulă; după 10’ celula este “dializată” cu soluţia din pipetă; se produce treptat scăderea concentraţiei pentru diverse substanţe, cu atât mai mult cu cât difuzează mai uşor. 14 O tehnică diferită constă în retragerea foarte lentă a electrodului după perforare, asfel încât se formează la vârful pipetei o veziculă membranară inversată ce comunică cu interiorul pipetei (outside-out patch). 15 Nu au fost identificaţi ionofori membranari naturali la om

55

FIZIOLOGIE CELULARA

diverse. Valinomicina este ionofor de potasiu, gramicidina de sodiu, iar compusul A23187 un cunoscut ionofor de calciu. Aceste substanţe cu afinitate mare pentru anumiţi ioni, prin transconformare după ce au fixat ionul funcţionează ca o navetă transmembranară sau se pot asocia în vederea realizării unor adevărate punţi hidrofile transmembranare facilitând difuzia substanţei. Rata de transport la nivelul unei celule a acestor sisteme de transportori depinde de constanta de afinitate a lor pentru substanţa transportată şi de densitatea acestora în membrana celulară. 5.6.1. Canale voltaj-dependente Ansamblul funcţional al canalelor ionice din membrana unei celule este responsabil de variaţiile de potenţial transmembranar şi de apariţia potenţialului de acţiune. In mod aparent canalele voltaj-dependente au două funcţii principale: producerea potenţialelor de acţiune în celulele excitabile (canalele voltaj-dependente de Na+ şi K+) şi transformarea semnalului electric în semnal chimic (canalele de calciu), când calciul va fi folosit ca mesager secund (secreţie, contracţie musculară, etc.). Relaţia mult mai complexă şi bi-direcţională dintre permeabilitatea membranei pentru ioni şi potenţialul membranar va fi discutată la capitolul respectiv (vezi cap. 5.8). Din punct de vedere funcţional un canal voltaj-dependent este alcătuit din: porul de conducţie (ce prezintă un filtru de selectivitate) şi domeniile care sesisează modificarea potenţialului membranar (senzor de voltaj). Pentru canalele de K+ voltaj-dependente porul de conducţie este alcătuit din patru subunităţi identice aranjate inelar (homo-tetramer). Fiecare unitate este alcătuită din şase α-helixuri hidrofobe transmembranare, din care doar segmentele transmembranare S5 şi S6 participă efectiv la delimitarea porului. In cazul canalelor de Na+ sau Ca2+ voltaj-dependente, porul de conducţie este alcătuit similar, dar cele patru proteine nu sunt identice între ele (hetero-tetramer). Această structură funcţională se referă la componenta majoră a ansamblului proteic ce alcătuieşte canalul, numită subunitate α (fig. 33). Probabilitatea ca un canal ionic voltaj-dependent să fie deschis sau închis depinde de valoarea efectivă a potenţialului membranar în micro-aria membanară respectivă. De fapt canalele care sunt deschise prin depolarizare funcţionează pe baza unui senzor care asigură fenomenul de operare a „porţii” (gating). 56

FIZIOLOGIE CELULARA

β2

α

β1

Fig. 33. Arhitectura etalată a canalului de sodiu voltaj-dependent. Cilindrii numerotaţi indică domeniile transmembranare. Liniile punctate marchează lungi sau scurte anse de legătură între componentele subunităţii α. P indică fosforilarea mediată de proteinkinazele A (modulare) şi C (inactivare). Cu gri sunt marcate porţiunile care delimitează efectiv porul. Cercurile albe indică inelele de aminoacizi ce formează filtrul de selectivitate (extern) şi situsul de legare pentru tetrodotoxină (intern). Litera h indică poarta internă, de inactivare, iar cercurile gri situsuri implicate în “receptorul” acesteia. ScTx indică situl de legare al scorpion-toxinelor.

Acest senzor de voltaj este constituit din domenii (secvenţe, anse) transmembranare care prezintă reziduuri de arginină sau lizină încărcate pozitiv în fiecare a treia poziţie şi sunt sensibile la scăderea potenţialului negativ pe faţa internă a membranei. Ca urmare potenţialul intern negativ stabilizează starea închisă, iar depolarizarea (creşterea voltajului pe faţa internă a membranei către zero faţă de exterior) determină deschiderea canalului. Deschiderea este tranzitorie, iar durata după care canalul suferă o nouă modificare conformaţională se numeşte constantă de inactivare şi este o caracteristică funcţională importantă a canalului. Când se ia în discuţie importanţa funcţională a unei populaţii de canale ionice din membrana unei celule, mai întâi această populaţie este delimitată prin caracteristici de selectivitate (ex. canal de sodiu) şi apoi se face referire la dependenţa de voltaj caracteristică, adică relaţia dintre probabilitatea de deschidere şi valoarea potenţialului membranar. Amplitudinea curentului ionic printr-un singur canal (curent unitar) poate fi determinată prin tehnici electrofiziologice avansate (patch-clamp) şi depinde de gradientul electrochimic (concentraţiile locale de o parte şi de alta a membranei) şi de conductanţa canalului (conductanţă unitară). Curentul unitar şi constanta de inactivare determină sarcina electrică totală a ionilor care trec printr-un canal pe parcursul unei astfel de deschideri tranzitoriii. La 57

FIZIOLOGIE CELULARA

aceasta adăugăm probabilitatea de deschidere, precum şi densitatea populaţiei respective de canale în aria membranară, pentru a evalua efectul fluxului de ioni studiat asupra potenţialului membranar. Familiile de canale voltaj-dependente Canalele de sodiu voltaj-dependente: cel puţin 9 membri, implicate în mod fundamental în declanşarea potenţialului de acţiune (în celulele „electric excitabile”), por homo-tetrameric, 4 subunităţi cu 6 domenii transmembranare co-asamblate cu subunităţi β auxiliare, glicozilate. Canale de calciu voltaj-dependente: 10 membri, subunităţi variabile Canale de potasiu voltaj-dependente: 40 de membri, 12 subfamilii Canale TRP (Transient Receptor Potential): 28 de membri, cu activare dependentă de voltaj, tensionare mecanică, stare redox, osmolaritate, pH. Unele canale voltaj-dependente sunt descrise în detaliu în capitolele următoare (pentru Na+ şi K+ vezi cap. 5.8., pentru Ca2+ vezi cap. 5.9.18). Canale protonice voltaj-dependente: se deschid la depolarizare, numai în condiţiile în care gradientul electrochimic este îndreptat către exterior, în aşa fel încât să permită eliminarea protonilor din citoplasmă. Aceste canale se găsesc mai ales la nivelul fagocitelor, fiind utile în eliberarea acidităţii intracelulare din timpul „explozie de protoni” (proton-burst), în timpul distrugerii bacteriilor fagocitate cu ajutorul apei oxigenate şi a altor specii reactive ale oxigenului, produse de către NADPH-oxidază. Această enzimă este electrogenă şi formează ca produşi secundari protoni, ce trebuie eliminaţi în afara citoplasmei. 5.6.2. Canalele dependente de liganzi intracelulari Este vorba de o serie de canale de potasiu, care sunt dependente de concentraţiile unor substanţe intracelulare. Canalele de K+ dependente de Ca++ (KCa) sunt foarte apropiate din punct de vedere structural de canalele de potasiu voltaj-dependente: au şase segmente transmembranare şi o ansă P (de permeabilitate). La capătul intracelular leagă calmodulina (o proteină care funcţionează ca semnal intracelular prin legarea calciului). Variaţiile calciului intracelular datorită permeabilizării mebranei sau eliberării de calciu din depozitele intracelulare vor modifica conductibilitatea acestor canale prin asociere cu calmodulina,

58

FIZIOLOGIE CELULARA

făcându-le mai sensibile la depolarizarea mebranară. In esenţă creşterea calciului submembranar activează KCa. Canalele ionice dependente de nucleotidele ciclice prezintă şase domenii transmebranare, dintre care patru formează un canal funcţional, şi celelalte sunt domenii receptor. Cuplarea AMPc sau GMPc pe receptorul citoplasmic deschide porul, care este permeabil pentru Na+ şi Ca++. Aceste canale sunt importante pentru neuronii senzoriali olfactivi (AMPcdependent) şi pentru celulele receptoare retiniene (GTPc-dependent). 5.6.3. Canale ionice dependente de liganzi extracelulari Canalele dependente de substanţe chimice prezintă pe partea extracelulară a domeniilor transmembranare formaţiuni receptoare la care cuplează liganzi. Cuplarea modifică permeabilitatea canalului şi produce un influx ionic în celulă, ce declanşează depolarizarea. Se mai numesc şi receptori ionotropici. Pentru că de cele mai multe ori folosesc la transmiterea excitaţiei de la o celulă nervoasă la alta sau de la celulele nervoase la efectorii musculari sau glandulari, liganzii canalelor receptordependente sunt numiţi şi neuromediatori. Eliberarea acestora are loc la nivelul formaţiunilor de comunicare numite sinapse, în partea finală a acestora, numită membrană post-sinaptică.Cele mai multe din aceste canale sunt permeabile pentru cationi, activarea lor ducând la depolarizarea membranei (post-sinaptice), altele (mai puţine), sunt permeabile pentru anioni (Cl-), activarea lor determinând hiper-polarizarea membranei şi reducerea excitabilităţii. Există o multitudine de astfel de canale, dintre cale cele mai importante sunt: receptorul „nicotinic” pentru acetilcolină, cuplat cu un canal de sodiu (fig. 34); receptorii ionotropi pentru glutamat, cuplat cu canal de sodiu şi calciu; receptorii P2X pentru ATP (ca semnal extracelular), cuplaţi cu canal de calciu, Fig. 34. Receptorul nicotinic 59

FIZIOLOGIE CELULARA

receptorii GABAA pentru acidul γ-amino-butiric, cuplat cu un canal de clor (hiperpolarizant). Stimularea şi menţinerea deschisă a canalelor ionice receptor-operate durează cât timp ligandul ocupă situsul de legare, dar în fapt este tranzitorie, deoarece ligandul este îndepărtat rapid de la nivelul fantei sinaptice, fie de către enzime inactivante, fie prin mecanisme de recaptare la nivelul membranei presinaptice. 5.6.4. Canale cu alte tipuri de dependenţă Canalele de potasiu cu rectificare sunt canale ce permit influxul de potasiu, dar nu permit efluxul. Scopul este de a rectifica conţinutul de potasiu după un eflux rapid, de tip potenţial de acţiune. Sunt implicate în procese fiziologice majore, precum activitatea de pacemaker a inimii, eliberarea de insulină din celulele β-insulare pancreatice etc. Canalele de potasiu cu doi pori se mai numesc şi canale cu curgere lentă (leaky) şi asigură fenomene de rectificare. Canalele de potasiu deschise de cuante de lumină (canalorodopsina) sunt prezente la diverse organisme unicelulare fotosensibile. Canalele cationice mecanosensibile se deschid sub influenţa tensionării, presiunii, stresului de forfecare, deplasare, vibraţii. 5.7. Transportori moleculari transmembranari Moleculele hidrofile mai mari (glucoză, aminoacizi) nu pot trece prin canale, deoarece agregarea unor subunităţi suficient de multe pentru a crea un canal pentru astfel de molecule ar produce pori foarte mari, cărora nu lear putea fi asigurată selectivitatea şi astfel s-ar pierde compoziţia diferită între citosol şi mediul extracelular. Pentru o varietate de astfel de solviţi membrana trebuie să asigure mecanisme speciale de transport înt-un sens sau altul, din următoarele motive legate de substanţele hidrofile respective: dimensiunea şi/sau polarizarea nu permit transportul (e nevoie de facilitare), concentraţia este mai mare în compartimentul de destinaţie (e nevoie de transport activ, primar sau secundar). Pentru asemenea situaţii există proteine membranare integrale numite transportori (facilitatori, carriers, porters) care folosesc gradienţi de concentraţie sau electrochimici pentru a transfera substratele respective prin bistratul lipidic, nu în masă, ci moleculă cu moleculă sau ion cu ion. Transportorii sunt similari cu enzimele ca mecanism biochimic de 60

FIZIOLOGIE CELULARA

funcţionare, deoarece se leagă de substrat şi sunt specifici pentru substanţele pe care le transportă. Ca urmare, activitatea lor poate fi modelată folosind kinetica enzimatică. Eficienţa transportului este mai mare pentru difuziunea facilitată de transportori decât în cazul difuziunii simple, dar suferă un efect de saturare, adică tinde către un maxim de transport, care este determinat de numărul limitat de molecule de proteină transportor prezente şi de durata ciclului de transport (fig. 32). Aşadar un transportor poate fi definit operaţional ca o proteină membranară care leagă molecula/ionul de o parte a membranei, apoi îşi schimbă conformaţia spaţială şi expune molecula/ionul de cealaltă parte a membranei, legătura respectivă se desface şi proteina revine la conformaţia iniţială. Uneori acest lucru este posibil pentru că se realizează practic o cavitate hidrofilă mărginită de proteină membranară în timp ce exteriorul este lipofil. Transportorii sunt prezenţi în toate celulele (ubiquitari), oriunde este nevoie de introducerea de nutrimente, de eliminarea cataboliţilor, de controlul concentraţiilor ionice intracelulare. Dacă transportorul transferă o singură specie moleculară, transferul poate fi conform gradientului electrochimic (uniport) sau împotriva acestuia (pompă). Dacă se transportă două (sau mai multe) specii moleculare (molecule neutre sau ioni), atunci este vorba de cotransport (simport sau antiport), care poate fi transport pasiv, transport activ (pompă), sau transport activ secundar (pentru o altă exprimare a acestei clasificări, vezi cap. 5.3). Procesele de transport activ sunt capabile să concentreze o substanţă într-unul din compartimentele organismului sau să realizeze o mişcare în direcţie inversă proceselor de difuziune. Toate tipurile de transport activ prezintă o caracteristică comună: generarea fluxului net al particulelor se realizează cu “consum obligatoriu a unei părţi din energia totală a sistemului”. Dacă energia consumată nu este regenerată, transportul se opreşte în momentul în care energia sistemului este diminuată până la punctul de echilibru termodinamic. Aşa cum am văzut (5.3), dacă ATP este consumat direct de proteina transportoare, adică ea însăşi este o ATP-ază, transportul activ se numeşte primar, iar transportorul sa numeşte pompă. Dacă însă transportul activ la care ne referim se bazează pe un gradient (menţinut de o asemenea pompă), vorbim de transport activ secundar (care este întotdeauna un cotransport, în regim de sinport sau antiport cu specia moleculară care asigură desfăşurarea ciclului funcţional, fiind transportată în sensul gradientului). Intensificarea procesului de transport activ trebuie 61

FIZIOLOGIE CELULARA

susţinută de o creştere corelată a ratei metabolice, pentru a asigura cantitatea necesară de ATP16. 5.7. 1. Pompe ionice Aceste proteine transmembranare pot transporta ioni şi alţi solviţi împotriva gradienţilor de concentraţie. Energia pentru această activitate este de cele mai multe ori chimică, sub formă de ATP, dar poate fi şi obţinută din cuantele de lumină, reacţii oxido-reducătoare, energie termică din mediu şi alte surse. Pompele activate de ATP sunt proteine transmembranare cu unul sau mai multe situri de cuplare pentru ATP, pe faţa citosolică a membranei. Hidroliza ATP-ului are loc numai în momentul când se cuplează ionii necesari pentru transport, deci activitatea enzimatică este condiţionată. Există trei clase de pompe ionice (care transportă exclusiv ioni; clasele P, F şi V), şi o superfamilie numită ABC (ATP-Binding Cassette) care transportă molecule mici, dar conform aceleiaşi dinamici. Pompe din clasa P se găsesc în: membranele bacteriilor şi fungilor (pompa H+), membranele celulare ale eucariotelor superioare (pompa Na+/K+), membrana apicală a celulelor mucoasei gastrice (pompa K+/H+), plasmalema şi membrana reticulară a celulelor eucariote (pompele de Ca2+ ). Toate aceste pompe ionice prezintă două unităţi catalitice identice, ce conţin câte un situs de legare pentru ATP, dintre care cel puţin una este fosforilată de către o moleculă de ATP (de unde numele de clasa P). Pompa de calciu este prezentă sub două forme majore, una în plasmalemă (Plasma Membrane Calcium ATP-ase; PMCA) şi cealaltă membrana reticulului endoplasmic (Sarcoplasmic / Endoplasmic Reticulum Calcium ATP-ase; SERCA), dar şi în alte membrane. Pompa H/K din celulele mucoasei gastrice pompează H+ în afara celulei şi introduce K+ în celula oxintică gastrică. Pompa de H+ (pompa protonică) este mai bogat reprezentată în membrana celulelor tubului urinifer, în membrana lizozomilor (menţine pHul acid lizozomal), precum şi în membrana mitocondrială (unde ciclul se desfăşoară invers, permiţând sinteza ATP din ADP şi acid fosforic, deci este o ATP-sintază). Unele pompe sunt prezentate în detaliu mai jos (vezi cap. 5.8.1, 5.9.18) 16

La bacterii există o formă aparte de transport activ, folosită la preluarea monozaridelor din mediu, care nu se sprijină pe ATP ci pe fosfo-enol-piruvat (PEP) şi se numeşte translocaţie de grup (PEP group translocation; phoshotransferase system; PTS),

62

FIZIOLOGIE CELULARA

Pompele din clasa F se găsesc în: membrana bacteriană, membrana mitocondrială internă, membrana thylakoidă a cloroplastului la plante Pompele de protoni din clasa V se găsesc în: membranele vacuolare la fungi şi plante, membranele endosomale şi lizozomale la celule eucariote, membrana osteoclastelor şi a unor celule tubulare renale la om. 5.7.2. Transportul activ secundar Fenomenele de transport activ primar realizează şi menţin diferenţe de potenţial electrochimic. Transportul activ secundar reprezintă baza transportului activ pentru numeroşi ioni, glucoză, aminoacizi, etc. (fig. 35). Acest proces este posibil întrucât odată cu ionul transportat pasiv (Na+), un alt solvit se poate cupla la transportor. Astfel, pe baza gradientului de Na+ (“secundar” transportului activ de Na+) se transportă spre interior glucoză, aminoacizi (sinport), iar ionii de calciu şi protonii sunt îndepărtaţi din citosol (antiport). Transportorul de glucoză SGluT1 funcţionează în această manieră. Schimbul electrogen 3Na+/Ca2+, ce se găseşte la nivelul celulelor cardiac şi care foloseşte la relaxarea inimii, reducând calciul citosolic. De obicei antiporterii schimbă molecule similare, de exemplu antiportul Na+/H+ din rinichi, intestin şi alte celule sau antiporterul Cl-/HCO3-. Na+

K+

Na+

glucoză Na+ aminoac.

SINPORT

3Na+

Ca++

Na+

H+

ANTIPORT +

Fig. 35. Pe baza gradientului de Na funcţionează sisteme majore de cotransport

Mecanismele proceselor de transport activ secundar sunt diferite faţă de transportul activ primar. Diferenţa majoră constă în faptul că în cazul transportului activ secundar energia este furnizată de gradientul de concentraţie. Gradientul electrochimic al ionului de sodiu între exteriorul celulei şi interiorul acesteia, realizat prin procesul de transport activ primar al acestui ion (pompa Na/K) reprezintă un mijloc de înmagazinare de energie care poate fi utilizată pentru funcţionarea sistemelor de transport activ secundar. In acest sens este de subliniat faptul că inhibarea producerii de ATP (ouabaina) într-o celulă determină într-o primă fază oprirea 63

FIZIOLOGIE CELULARA

transportului activ al sodiului, cu scăderea consecutivă a gradientului transmembranar a ionului de sodiu, urmată de oprirea transportului activ secundar care depinde de gradientul de sodiu drept sursă de energie. Trecerea ionilor şi, în special, a ionului de Na+ din compartimentul în care acesta se găseşte în concentraţie crescută (cu nivel energetic crescut) în compartimentul cu concentraţie scăzută (nivel de energie coborât) furnizează energie pentru realizarea transportului activ al altui solvit împotriva gradientului său (transport activ secundar). Este de reţinut faptul că energia înmagazinată într-un gradient transmembranar de concentraţie ionică poate de asemenea să servească la sinteza de ATP din ADP şi radical fosfat. Spre exemplu, transportul de electroni în lanţul fosforilărilor oxidative mitocondriale produce un gradient de concentraţie a protonilor (H+) de o parte şi de alta a membranei mitocondriale. In aceste circumstanţe deplasarea ionilor de hidrogen in sensul gradientului, strict la nivelul proteinei numite ATP-sintază, furnizează energie pentru sinteza de ATP (proces de fosforilare oxidativă). Similar proceselor de difuziune facilată şi a proceselor de transport activ primar şi în cazul transportului activ secundar, legarea solvitului de transportat de proteina transportoare reprezintă o etapă obligatorie. Acest transportor proteic prezintă o serie de proprietăţi particulare cum ar fi specificitatea chimică şi saturaţia situsurilor de legare pentru substanţa de transportat. Specificitatea chimică îi permite proteinei transportoare să realizeze transportul numai pentru o anumită substanţă, iar saturaţia situsurilor de legare, precum şi durata ciclului de reacţie, îi plafonează viteza maximă de transport. Proteina din cadrul sistemului de transport activ secundar mai are şi un situs de legare a unui ion alături de situsul de legare a substanţei de transportat. Cel mai frecvent proteina transportoare leagă ionul de sodiu, dar şi anionii bicarbonic sau clor şi ionii de potasiu pot fi legaţi în cursul procesului de transport activ secundar. Legarea ionului de proteina transportoare în cadrul sistemului de transport activ secundar produce modificări comparabile cu cele ce apar în cadrul sistemului de transport activ primar: fie modificarea afinităţii situsului ce leagă substanţa de transportat prin proces activ secundar, fie o modificare a vitezei prin care transportorul proteic deplasează situsul de legare de pe o faţă pe alta a membranei. 64

FIZIOLOGIE CELULARA

In derularea procesului de transport activ primar, proteina transportoare suferă o modulare covalentă ca rezultat al fixării unui radical fosforilat ce provine din degradarea ATP. In cazul transportului activ secundar proteina transportoare suferă o modificare alosterică ca urmare a fixării ionului. Recapitulând, în cadrul proceselor de transport activ secundar ionul de sodiu se deplasează întotdeauna din mediul extracelular, unde se găseşte în concentraţie foarte ridicată, în interiorul celulei, unde concentraţia sa este scăzută, deci în sensul gradientului său de concentraţie, în timp ce substanţa de transportat este deplasată împotriva gradientului său de concentraţie, adică din compartimentul cu concentraţie scăzută în cel în care concentraţia este ridicată. 5.8. Potenţialul transmembranar şi modificările sale Diferenţele de concentraţie ionică dintre mediul intra-celular şi cel extra-celular sunt determinate de existenţa unor anioni nedifuzibili în citosol şi determină la rândul lor o diferenţă de potenţial electric între interiorul şi exteriorul celulei. 5.8.1. Echilibrul Donnan In funcţie de posibilităţile de traversare a membranelor de către anumiţi solviţi sau solvenţi se diferenţiază gradul de permeanţă al acestora. Astfel, aşa numitele membrane ideale sunt permeabile pentru apă şi impermeabile pentru substanţele solvite. Membrana celulară izolată este permeabilă pentru apă, electroliţi, cristaloizi şi este impermeabilă pentru macromolecule, ea comportându-se ca o “sită moleculară”. Ca urmare se stabileşte aşa-numitul “echilibru Donnan” (elaborat teoretic de către Gibbs şi confirmat experimental de către Donnan). Asfel, în cazul în care în unul din compartimentele separate de o membrană cu permeabilitate selectivă se găseşte un macroanion nedifuzibil, echilibrul dinamic rezultat se caracterizează prin distribuţia asimetrică a ionilor liberi difuzibili. Deci, dacă membrana “M” cu permeabilitate selectivă separă compartimentul “a” în care se găseşte o soluţie de KCl (Cl- + K+) de compartimentul “b” cu soluţie de KCl (Cl- + K+) şi o sare de potasiu a unui macroanion (K+ + X-) nedifuzibil, ionii difuzibili vor traversa membrana până se ajunge la starea de echilibru. Se ştie că la echilibru fiecare soluţie 65

FIZIOLOGIE CELULARA

trebuie să fie electric neutră, adică suma anionilor dintr-un compartiment să fie egală cu suma cationilor din acelaşi compartiment; produsul ionilor (anioni şi cationi) difuzibili dintr-un compartiment este egal cu produsul ionilor difuzibili din cel de-al doilea compartiment separat de membrană. Deci în condiţiile în care în unul din compartimente există un anion nedifuzibil, după realizarea stării de echilibru în acest compartiment concentraţia cationului difuzibil va fi mai mare decât concentraţia cationului din celălalt compartiment, iar concentraţia anionului difuzibil va fi mai mare în compartimentul în care nu există anion nedifuzibil. Astfel la echilibru starea de neutralitate este reprezentată prin ecuaţiile K+a = Cl-a şi K+b = Cl-b + M-b, iar produsul ionilor difuzibili dintr-un compartiment este egal cu produsul ionilor difuzibili din cel de-al doilea compartiment: K+a x Cl-a = K+b x Cl-b, deci K+b > Cl-b şi ca urmare K+b > K+a şi Cl -b < Cl-a. Efectul Gibbs-Donnan este rezultatul permeabilităţii particulare a membranei, dar la acesta se adaugă în cazul membranei celulare variaţiile de permeabilitate datorate activităţii canalelor ionice, precum şi mecanismele de transport activ. Acest efect poate fi amplificat (crescut) sau diminuat (scăzut) prin influenţarea directă a concentraţiei ionilor difuzibili de către procesele de transport activ care pot să menţină concentraţia constantă intracelulară a unui ion chiar dacă acesta nu este total nedifuzibil. Celulele vii conţin o mare cantitate de anioni, în mod deosebit fosfaţi organici şi proteine. Concentraţia anionilor difuzibili este mai mică în celulă decât în mediul extracelular; raportul clor intracelular/clor extracelular fiind subunitar. Concentraţia cationilor este mai mare în interiorul decât în afara celulei. Procesele de transport activ introduc K+ în celulă şi expulzează Na+, în schimb concentraţia H+ este ceva mai mare în celulă decât în mediul extracelular, pH-ul intrahematic spre exemplu este ceva mai mic (7,2) decât al plasmei (7,4). Celulele animale au în mod permanent tendinţa de a-şi mări volumul datorită consecinţelor osmotice generate de concentraţia intracelulară mai ridicată decât a mediului extracelular. Acestei tendinţe i se opun procesele de transport activ a cationilor, de aceea atunci când metabolismul celulei este deprimat în mod natural sau artificial (răcire, intoxicaţie, etc.) datorită perturbării proceselor de transport activ, efectele echilibrului Donnan şi deci, efectele osmotice consecutive determină

66

FIZIOLOGIE CELULARA

turgescenţa celulei însoţită de perturbări funcţionale şi, în ultimă instanţă, moartea celulei prin degradarea membranei celulare. 5.8.2. Potenţialul membranar de repaus Permeabilitatea selectivă a plasmalemei determină distribuţia asimetrică a ionilor de o parte şi de alta a acesteia. In condiţiile existenţei unnor ioni nedifuzibili într-unul din cele două compartimente separate de membrana permeabilă selectiv, pentru orice ion difuzibil se defineşte potenţialul de echilibru conform legii Nernst: E=±61log(c1/c2), c1 şi c2 fiind concentraţiile ionului respectiv în cele două compartimente; relaţia se deduce pe baza principiului echilibrului dinamic aplicat energiilor potenţiale electrică şi de difuziune. Aplicată la nivel celular această relaţie ia forma ecuaţiei Goldman-Hodgkin-Katz; potenţialul membranar de repaus este determinat de distribuţia şi coeficienţii de permeabilitate membranară pentru trei ioni majori: Na+, K+, Cl-, la care putem adăuga calciul şi contribuţia unor canale cationice neselective (fig. 36). mM

142

mV

Na+ 70

mM

10

2,5 Ca2+ 150

X+

10-4

0

4

101

K+ -98

Cl-

155

3-5

-30..-65

Fig. 36. Principalele fluxuri ionice ce determină valoarea potenţialului de repaus (sunt notate valorile potenţialului de echilibru Nernst în fiecare caz)

Permeabilitatea pentru potasiu fiind mai importantă, potenţialul de repaus este apropiat de valoarea potenţialului de echilibru pentru acest ion. Potenţialul membranar de repaus variază de la o celulă la alta, în funcţie de permeabilitatea membranei. Dat fiind mecanismul fizic al potenţialului de repaus, acesta se modifică după variaţiile concentraţiilor ionice în cele două compartimente. Ca urmare a diferenţei de potenţial, plasmalema este încărcată electric în repaus, negativ pe faţa internă şi pozitiv pe cea externă. Pentru menţinerea potenţialului de repaus este necesară pomparea permanentă a ionilor, pentru a asigura menţinerea gradientelor de concentraţie, deoarece permeabilitatea ionică a membranei pentru ionii respectivi în repaus, deşi extrem de mică, nu este nulă. In absenţa transportului activ s-ar 67

FIZIOLOGIE CELULARA

produce în timp pierderea de K şi acumularea de Na. Transportul activ al celor doi ioni este cuplat (fig. 37), fiind realizat de o ATP-ază membranară, numită şi pompă de sodiu. Pentru fiecare ciclu conformaţional 2K+ ea expulzează trei ioni de sodiu şi extracelular introduce doar doi ioni de potasiu, fiind deci electrogenă; adică are un efect hiperpolarizant faţă de valoarea calculată ADP+PO4teoretic pentru potenţialul de repaus (~4 ATP mV). Activitatea pompei fiind dependentă 3Na+ de concentraţia Na intracelular, pompa va participa la fenomenul de repo-larizare din Fig. 37. Pompa de sodiu (Na/K) cadrul potenţialului de acţiune. ATP-aza Na+/K+ este prezentă în plasmalema celor mai multe celule animale, dar şi în membrana unor celule vegetale. Ea se comportă ca o adevărată “pompă de Na+/K+” ce transportă Na+ în afara celulei şi K+ în celulă realizând în repausul celular o concentraţie foarte mare a Na+ în afara celulei şi a ionului de K+ în interiorul acesteia. Deşi ascunde încă necunoscute, ATP-aza Na+/K+ este cea mai bine caracterizată dintre pompele ionice. ATP-aza Na+/K+ este alcătuită din două subunităţi mari (alfa) care străbat membrana şi două subunităţi (beta) care sunt expuse la exteriorul celulei; este deci un tetramer. Fiecare unitate funcţională prezintă un situs de fosforilare cu activitate ATP-azică, trei situsuri de legare a ionilor de Na+, două situsuri pentru legarea ionului de K+ şi un situs de fixare a ouabainei (glicozid cardiac). Prezenţa aproape ubicvitară şi funcţionarea continuă în organismele animale face ca peste 1/3 din ATP-ul consumat de un organism animal în repaus să fie folosit în acest proces. Ciclul funcţional (fig. 38) începe cu activarea situsului enzimatic urmată de hidroliza ATP-ului cu fixarea a trei ioni de sodiu ce ocupă siturile specifice. Pompa fixează radicalul fosfat şi îşi schimbă conformaţia. In etapa următoare ionii de sodiu sunt eliberaţi. Ultima etapă cuprinde fixarea a doi ioni de potasiu din exteriorul celulei urmată de transportul lor în citosol ca urmare a unui alt proces de transconformare. In această etapă se eliberează şi radicalul fosfat de către pompă, aceasta fiind capabilă să-şi reia ciclul.

68

FIZIOLOGIE CELULARA

Fig. 38. Ciclul funcţional al pompei de sodiu

Potenţialul de repaus se măsoară cu ajutorul unui electrod introdus în celulă prin intermediul unor micromanipulatoare. Microelectrodul este conectat la un aparat de măsură care nu indică nici o diferenţă de potenţial atât timp cât acesta se găseşte în mediul extracelular la fel ca şi electrodul de referinţă (indiferent). In momentul în care micromanipulatorul realizează pătrunderea vârfului microelectrodului în interiorul celulei voltmetrul indică existenţa unei diferenţe de potenţial care reliefează faptul ca mediul intracelular este negativ faţă de mediul extracelular. Se folosesc electrozi de sticlă foarte ascuţiti, plini cu soluţie salină concentrată în contact cu un fir de platină. Electrozii sunt conectaţi la sisteme de înregistrare prin amplificatoare de mare impedanţă şi astfel pot fi urmărite variaţiile de potenţial membranar în orice tip de celulă. Potenţialul de repaus are valori diferite de la un tip la altul de celule şi mai puţin de la o celulă la alta în cadrul aceluiaşi ţesut (ca o excepţie, variază considerabil chiar în membrana aceleiaşi celule). Explicaţia este dată tocmai de diferenţele existente privind permeabilitatea ionică a mem-branelor celulare în repaus şi de diferenţele privind concentraţiile ionilor în interstiţiile şi celulele respective. In fibre nervoase şi fibre musculare striate potenţialul de repaus este apropiat de potenţialul de echilibru pentru K, având valori cuprinse între -100 şi -90 mV. Alte celule au permeabilitate mare pentru Na şi potenţiale de repaus mai puţin negative (până la -40 mV). 69

FIZIOLOGIE CELULARA

Creşterea diferenţei de potenţial electric transmembranar se numeşte hiperpolarizare, iar reducerea acesteia este o depolarizare. Depolarizarea locală presupune de obicei un influx net de sarcini pozitive. Datorită difuziunii în spaţiul intracelular şi submembranar, aceasta se propagă pe o mică arie, scăzând în amplitudine cu distanţa. 5.8.3. Potenţialul de acţiune Depolarizarea tranzitorie care se propagă nedecremenţial la distanţă se numeşte potenţial de acţiune. Canalele ionice implicate în declanşarea potenţialului de acţiune au o dependenţă de voltaj a probabilităţii de deschidere relativ abruptă, ceea ce imprimă caracteristica de fenomen cu prag a acestui fenomen şi a celor subsecvente (legea “tot sau nimic”). Propagarea potenţialului de acţiune în membrana celulară se realizează prin autoregenerare, pe baza difuziunii sarcinilor pe cele două feţe ale membranei. Cu alte cuvinte dacă propagarea locală, decremenţială, prin curenţi ionici, determină o depolarizare suficientă pentru deschiderea canalelor voltaj-dependente din apropiere. Ca urmare viteza de propagare depinde de forţa motrice a difuziei, adică de amplitudinea potenţialului de acţiune şi de panta depolarizării, ambele reflectând densitatea canalelor voltaj-dependente implicate în declanşarea potenţialului de acţiune. Fiziologic potenţialul de acţiune apare prin sumaţie temporală a efectelor depolarizante şi hiperpolarizante ale diferiţilor curenţi ionici. Curenţii ionici depolarizanţi pot fi determinaţi de mediatori chimici, ca în cazul transmiterii sinaptice sau al unor efecte hormonale sau paracrine, sau de agenţi fizici ca în cazul celulelor receptoare specializate (potenţiale de receptor) sau al canalelor ionice activate de deformare mecanică, prezente în numeroase tipuri celulare. Potenţialul de acţiune de tip neuronal In fibra musculară scheletică şi în fibrele nervoase cu diametru mare ms potenţialul de acţiune are caractere şi m mecanisme prototip. Depolarizarea este abruptă, cu durată de ~0,2 ms (fig. 39), cu depăşirea izopotenţialului Fig. 39. Curenţii ionici în cursul potenţialului de acţiune (overshoot) şi urmată imediat de re70

FIZIOLOGIE CELULARA

polarizare (spike-potential). Depolarizarea se produce ca urmare a unui influx masiv de Na prin canale voltaj-dependente rapide (cu kinetică conformaţională accelerată; deschidere cu prag de voltaj şi inactivare rapidă). Repolarizarea se produce ca urmare a efluxului de K prin canale voltaj-dependente ceva mai lente, în condiţiile inactivării canalelor de Na. Durata este de 2-3 ms. Canalele de sodiu voltaj-dependente Canalele de sodiu joacă un rol major în generarea potenţialului de acţiune în numeroase celule excitabile, neuronul, fibra musculară striată scheletică şi cardiacă etc. Aceste canale voltaj-dependente, au cel puţin două “filtre” sau “bariere de permeabilitate”: m şi h. In repaus bariera m este închisă, iar bariera h este deschisă. Dacă un stimul determină o depolarizare limitată a membranei se produce deschiderea barierei m şi Na+ intră în celulă datorită gradientului transmembranar accentuând fenomenul de depolarizare. Această depolarizare deschide la rândul ei alte canale de Na+ voltaj-dependente şi aşa mai departe, trecând potenţialul de membrană din domeniul valorilor negative înspre sau chiar în domeniul pozitiv. Intrarea Na+ se opreşte prin închiderea automată a barierei h (inactivare, vezi fig. 33). Analizându-se cinetica fluxurilor ionice prin canalele membranare s-a ajuns la concluzia că fiecare canal odată activat rămâne deschis un anumit interval de timp după care se închide automat (constantă de inactivare, vezi cap. 5.6.1). După inactivarea canalelor de Na+ potenţialul de membrană revine progresiv la valoarea sa de repaus ca urmare a efluxului de K+ prin canale voltaj-dependente, a difuziunii spre citoplasmă a inilor de Na+ pătrunşi şi a activităţii pompei de Na+ şi K+, care restabileşte diferenţa de concentraţie a acestor ioni de o parte şi de alta a membranei. Canalele de potasiu voltaj-dependente Sunt prezente mai ales în membrana celulelor “aşa zis excitabile”, prezintă particularităţi de la o specie la alta. Se descriu canale de K+ care participă la depolarizare (prin scăderea probabilităţii de deschidere) şi canale care intervin în procesul de repolarizare. Unele canale de K+ au deschiderea maximală în momentul în care canalele de Na+ se inactivează.

71

FIZIOLOGIE CELULARA

5.9. Receptori membranari şi sisteme de semnalizare intracelulară Pentru a se adapta la modificările mediului în care trăiesc, celulele trebuie să-şi modifice parametrii interni. Organismele unicelulare trebuie să răspundă la modificări de temperatură, stres osmotic, concentraţie a nutrimentelor prin mişcare sau sinteză de proteine. La animalele pluricelulare, celulele trebuie să se dezvolte şi să-şi realizeze activitatea în interiorul unui sistem armonios, de funcţionare coordonată a tuturor celulelor (vezi cap. 1). Pentru aceasta ele trebuie să fie capabile să răspundă la o varietate de stimuli din mediul intern. Mai mult, coordonarea activităţii celulelor în organism este posibilă numai în condiţiile în care acestea pot primi şi transmite mesaje; comunicarea intercelulară este esenţială. Există o multitudine de programe genetice în interiorul fiecărui genom celular, ce codifică sisteme de semnalizare extraordinar de eficiente, care pot reacţiona la foarte multe tipuri de stimuli. Comunicarea intercelulară se poate realiza între celule învecinate prin contact direct între membranele acestora şi chiar între citoplasmele lor, prin intermediul joncţiunilor comunicante (gap junctions; vezi cap. 5.10). Schimbul de informaţie între celule mai apropiate sau mai îndepărtate se face însă prin intermediul unor molecule semnal. Răspunsul celular poate să fie reprezentat de modificarea caracterelor (amplitudine, frecvenţă, etc.) unui fenomen celular care se desfăşoară şi în absenţa semnalului extracelular sau de iniţierea unor procese funcţionale programate, care sunt în stare de latenţă în absenţa stimulului. In general răspunsul celular este prezent cât timp cât acţionează stimulul. Sunt însă numeroase situaţii în care răspunsul se menţine în diverse forme după încetarea acţiunii (post-efect), reapare (rebound) sau devine mai amplu pentru acelaşi nivel de stimulare susţinută sau repetată (sensibilizare). In alte cazuri răspunsul diminuă până la dispariţie chiar sub acţiunea stimulului (adaptare, lentă sau rapidă, redusă sau pronunţată). Mai mult, continuarea pe perioade prelungite a stimulării va duce la reducerea treptată a efectului până la dispariţie. Acest fenomen a fost denumit în mai multe feluri: adaptare, atenuare, desensibilizare, tahifilaxie, toleranţă, etc. Toţi aceşti termeni doresc desemnarea unui fenomen prin care celula şi sistemele receptoare sunt capabile de a-şi reduce răspunsul la stimulii repetitivi şi/sau prelungiţi, pentru a fi capabile de a răspunde şi la alţi stimuli, poate mai reduşi cantitativ, care se găsesc în mediu şi care pot semnaliza necesitatea unui răspuns, adică pentru menţinerea capacităţii de discriminare. 72

FIZIOLOGIE CELULARA

Membranele celulare, deşi foarte subţiri (3-6 nm), sunt practic impermeabile pentru ioni şi molecule polare. Deşi ionii de K+ ating echilibrul difuzional pe aceeaşi distanţă de apă în cca. 5 ms, ar avea nevoie de ~12 zile (128 h) pentru a face acelaşi lucru prin intermediul unei membrane lipidice. Acest lucru este valabil şi pentru moleculele hidrosolubile, chiar de mici dimensiuni, cum ar fi ureea, pentru care permeabilitatea unei membrane lipidice similare cu plasmalema este de 100 ori mai mică decât pentru apă. Ca urmare adrenalina, acetilcolina, hormonii hidrosolubili cunoscuţi, nu au nici o şansă de a trece prin membrană pentru a influenţa în vreun fel celula. Ca urmare, este nevoie de un mecanism de transducţie a semnalului. Termenul de transducţie a început să fie folosit în lumea biomedicală în jurul anilor 1970, provenind din transducere (lat.), ce înseamnă „a ajuta să traversezi un râu”, a „duce pe partea cealaltă”, concept de unde a provenit şi celălalt cuvânt modern, „traducere”, în sensul de a purta un text dintr-o limbă în altă limbă. Ca atare, sistemele de transducţie celulară preiau semnalele de pe partea externă a membranei şi le transformă în informaţii interpretabile pentru sistemele de răspuns ale celulei. Pentru a percepe semnalele extracelulare celulele folosesc receptori, adică molecule membranare care vin în contact cu exteriorul celulei şi care interacţionează cu moleculele-semnal ale substanţelor hidrosolubile bioactive, furnizând energia necesară pentru iniţierea unei căi de semnalizare intracelulară. Câteva tipuri de stimuli, precum lumina, gazele, hormonii liposolubili sunt capabile de a traversa membrana liber şi de a interacţiona cu structurile responsive, producând răspunsuri. Dar cea mai mare parte a substanţelor bioactive nu poate trece prin membrane şi deci trebuie să interacţioneze cu un receptor membranar. Se cunosc mai mult de 20 de familii de receptori, fiecare cuplat cu un sistem de transducţie aparte (http://www.iuphar-db.org). Adăugându-se la acest număr şi nenumăratele variante şi izoforme de receptori şi proteine implicate în lanţurile de transducţie, numărul de sisteme receptoare poate urca la câteva mii. Comunicarea în sistemele celulare are câţiva paşi comuni: • sinteza de molecule-semnal, • eliberarea de molecule-semnal, • transportul semnalului către celula receptoare, • cuplarea moleculei-semnal pe sistemul de recunoaştere celulară, • iniţierea uneia sau mai multor căi de semnalizare intracelulară, 73

FIZIOLOGIE CELULARA

• modificările specifice ale funcţiei celulare, • îndepărtarea semnalului, ce de obicei întrerupe şi răspunsul celular. Substanţele bioactive endogene cu rol de semnalizare intercelulară sunt denumite generic mesageri primari. Fiecare dintre sistemele de receptori prezentate mai jos acţionează prin intermediul unuia sau mai multor sisteme de efectori intracelulari. Mecanismele sunt diverse, dar strategia este comună, cuprinzând: • recepţia stimulului; • transferul semnalului către celulă; • amplificarea citoplasmică a semnalului; • modularea în timp a sistemelor de efectori; • adaptare prin intermediul circuitelor de feed-back negativ. Tipuri de semnalizare prin molecule solubile Oarecum în funcţie de „distanţa” la care acţionează molecula semnal extracelulară eliberată de o celulă de control, există mai multe tipuri de semnalizare (fig. 40). In cazul moleculelor-semnal numite hormoni, produşi de către glandele endocrine, aceştia sunt eliberaţi în circulaţia generală şi acţionează asupra unor celule-ţintă situate la distanţă de glanda endocrină. Acţiunile sunt „sistemice”, asupra tuturor celulelor care prezintă receptori pentru hormonul respectiv (hormonii tiroidieni, hormonul de creştere, insulina, etc.). Acest tip de semnalizare se numeşte endocrină. Uneori substanţele bioactive endogene sunt eliberate de celule pentru a modifica activitatea celulelor din imediata vecinătate. Ele nu au efect asupra celulelor mai îndepărtate, iar cantităţile de moleculăsemnal sunt reduse. Un caz particular este sinapsa, o structură specializară pentru semnalizarea între neuroni sau între neuroni şi celule efectoare (vezi cap. 6). De multe ori producţia unui anume substanţe în interiorul unei celule duce la modificări ale funcţiilor celulare ale aceleiaşi celule. Unii factori de creştere pot acţiona astfel (unele celule în Fig. 40. Semnalizarea intercelulară 74

FIZIOLOGIE CELULARA

cultură pot secreta factori care să le regleze propria creştere). Acest fenomen se numeşte semnalizare autocrină. Unele celulele pot produce moleculesemnal care acţionează aberant sau anormal, sau care nu fac parte din secreţia normală a acestor celule. Fenomenul are loc cel mai frecvent în cazul celulelor tumorale şi se numeşte paracrinie. Mecanisme de semnalizare Transducţia semnalului înseamnă conversia unui anume semnal (stimul, mesager primar) în alt semnal (mesager secund), care acţionează asupra uneia sau mai multor mecanisme de răspuns intracelular. Unul din avantajele acestui sistem este fenomenul de amplificare. Doar câteva molecule, sau chiar una, care acţionează asupra unui receptor, pot induce un răspuns celular complet. Numărul mesagerilor extracelulari (de ordinul I) este foarte mare, în schimb posibilităţile de traducere a impactului dintre aceştia şi celule sunt relativ reduse numeric şi de aceea diverşi mesageri extracelulari folosesc acelaşi sistem de transducţie pentru generarea răspunsului celular. Multe modalităţi de semnalizare implică producerea sau modificarea concentraţiei unor molecule mai mici, difuzibile, în citoplasma celulei-ţintă. In cadrul semnalizării intracelulare, numai astfel de substanţe sunt corect numite mesageri secunzi sau de ordinul II. Frecvent utilizate în acest scop sunt nucelotidele ciclice de tip adenozin-monofosfat ciclic (AMPc) şi guanozin-monofosfat ciclic (GMPc), lipide mici derivate din membranele celulare, de tip inozitol-trifosfat (IP3) sau diacil-glicerol (DAG), precum şi ionii de calciu. Este foarte dificilă investigarea căilor de semnalizare, din mai multe motive. In primul rând, de multe ori concentraţiile de semnal, sau mesager primar, sunt atât de mici încât scapă detecţiei biochimice. In al doilea rând, celulele folosesc simultan sute de căi de semnalizare diferite, care pot fi separate sau parţial suprapuse, implicând sute sau mii de proteine intermediare. Fiecare dintre aceste căi poate evolua în mai multe direcţii, întrucât rareori există o singură cale directă, liniară, de semnalizare. De cele mai multe ori, aceste căi sunt divergente, multe dintre etape sunt noduri de control sau de amplificare, anse de feedback, etc. Toate aceste variaţii au raţiuni reglatorii şi de control, dar sunt dificil de urmărit, cu atât mai mult cu cât de obicei, evenimentele de semnalizare sunt evenimente tranzitorii, care 75

FIZIOLOGIE CELULARA

nu lasă urme caracteristice asupra celulei. Nu în ultimul rând, răspunsurile celulare sunt dependente şi de caracteristicile temporale ale stimulului, ceea ce se adaugă la complexitatea sistemelor. Pe lângă dezvoltarea extraordinară a tehnicilor de investigare, cele mai puternice concepte recent introduse pentru a depăşi asemenea dificultăţi de interpretare a funcţiilor într-o reţea complexă de semnalizare, sunt cele de complex local de semnalizare (colocalizare funcţională demonstrabilă) şi de direcţionare a informaţiei (information channeling). Identificarea sistemelor de semnalizare poate fi tentată folosind două căi de abord. Abordul tradiţional este reprezentat de cel biochimic şi farmacologic, în care se identifică biochimic o substanţă, se sintetizează sau se extrage din sursa sa naturală, după care se aplică asupra unui model celular şi se aşteaptă un răspuns. Compuşii respectivi pot stimula calea de transducţie, şi atunci se numesc agonişti sau o pot bloca şi atunci sunt antagonişti. Abordul genetic foloseşte identificarea sau crearea de mutanţi (celule sau organisme) cărora le lipseşte sau li se blochează o cale de răspuns. Prin clonarea şi secvenţierea genelor mutante, se pot identifica proteinele implicate, sistemele de semnalizare şi modalităţile lor de blocare. Receptori membranari Cea mai mare parte a receptorilor membranari sunt proteine membranare integrale, ce detectează şi răspund la stimuli. Cel mai frecvent stimulii sunt chimici; substanţele ce acţionează asupra receptorilor se numesc liganzi. Câteva tipuri de stimuli chimic, precum mediatorul gazos difuzibil monoxid de azot („oxid nitric”) şi o serie de hormoni liposolubili, trec prin membrană şi acţionează asupra unor sisteme de recepţie intracelulară. Nu se poate prezice efectul unui ligand din natura sa chimică. Acetilcolina, de exemplu, poate acţiona ca neuromediator sau inhibitor al activităţii celulare, prin cuplarea cu diverse tipuri de receptori. Poate activa contracţia musculară sau sinapsele neuro-neuronale prin cuplarea cu un canal ionic receptor-dependent, dar se cuplează şi cu receptori cu şapte domenii transmembranare ce activează căi de semnalizare GTP-dependente. Există două strategii de transfer a energiei de la cuplarea ligandului până la nivelul structurii ce activează semnalele intracelulare: modificări conformaţionale ale receptorului (sistem folosit la receptorii cu şapte domenii transmembranare) şi agregarea de subunităţi inactive pentru a 76

FIZIOLOGIE CELULARA

forma o unitate activă (dimerizarea receptorilor tirozin-kinazici). Cea mai mare parte a căilor de transducţie folosesc enzime pentru amplificarea semnalelor. Unii receptori sunt ei înşişi enzime (tirozin-kinazele) iar alţii interacţionează cu enzime separate (proteinele G trimerice, etc.). O serie de proteine-receptor pot fi descoperite pe suprafaţa celulei sau pot fi determinate prin tehnici de biologie moleculară, dar nu le sunt încă cunoscuţi liganzii. Aceste proteine sunt denumite generic receptori orfani. Noţiunea de conservare reprezintă gradul de omologie (asemănare) între proteinele de la diverse specii şi stadii de dezvoltare a individului. O proteină înalt conservată are o structură care s-a păstrat aproape neschimbată de la bacterii şi organisme rudimentare până la animalele superioare şi om. Interacţiunea dintre mesagerul extracelular şi receptorul specific necesită mobilitate deosebită a ambilor factori. A apărut astfel conceptul de receptor mobil care explică faptul că activarea receptorilor membranari presupune o serie de fenomene de migrare, agregare sau dezagregare moleculară. S-au descris astfel procese de migrare laterală şi formarea unor agregate din mai multe proteine solitare (subunităţi). In foarte multe cazuri activarea receptorului este urmată de cuplarea acestuia cu anumite proteine reglatoare care plutesc de asemenea liber în membrană. Procesele de migrare laterală a receptorilor dau posibilitatea acestora să realizeze densităţi diferite pe suprafaţa membranei celulare sau în diferite zone strâns legate de anumite compartimente plasmatice. Pe de altă parte există numeroase dovezi care arată că funcţionalitatea mecanismelor de transducţie depinde deseori de apropierea fizică a proteinelor participante într-o etapă a căii de semnalizare (co-localizare funcţională). Astfel de cuplări funcţionale sunt asigurate de exemplu de către microdomenii membranare în care mobilitatea componentelor este redusă, cum sunt plutele lipidice (cap. 5.1.2). Destul de frecvent activarea receptorilor este urmată de internalizare şi degradarea biochimică a acestora. In astfel de situaţii este necesar să se sintetizeze noi receptori. De altfel resinteza receptorilor reprezintă un proces permanent, urmat de transportul în membrană în vederea menţinerii capacitaţii de răspuns celular. Alt fenomen observat este cel care priveşte variaţia numărului diferitelor tipuri de receptori într-o celulă. In condiţii de echilibru numărul diferitelor tipuri de receptori dintr-o celulă este rezultatul raportului dintre rata de sinteză (regenerare) şi rata de consum a acestora. Aici se încadrează explicaţia majoră a fenomenului de adaptare prin 77

FIZIOLOGIE CELULARA

desensibilizare bazată pe scăderea densităţii membranare a receptorilor respectivi. Toate aceste aspecte sunt legate de fenomenul general de înoire permanentă a proteinelor celulare (turnover), de reglarea expresieii genice (vezi cap. 5.9.17.) şi de mecanismele direcţionării proteinelor în cadrul dinamicii celulare a membranelor lipidice (vezi cap. 5.11.). Capacitatea de activare de către aceiaşi stimuli a diverselor tipuri de receptori este variabilă de la o perioada la alta de activitate a celulei. Numărul de receptori activabili variază atât în funcţie de anumite condiţii legate de cei doi parteneri (mesager primar şi receptor) implicaţi în procesul de activare celulară cât şi datorită unor condiţii impuse de mediul în care se desfăşoară reacţia ligand-receptor. Capacitatea de activare a receptorilor se poate controla prin procese de reglare homologă şi heterologă. In cazul în care mesagerul primar depăşeşte o anumită concentraţie, scade numărul de receptori (sau creşte numărul de receptori refractari). Această reducere a numărului de receptori disponibili în urma unui exces de mesager primar este cunoscută sub denumirea de reglare inhibitoare, descendentă sau reductivă (downregulation). Administrarea de blocanţi determină o reacţie opusă, activatoare (upregulation). Aceste fenomene constituie reglarea homologă. Activarea receptorilor poate fi influenţată de către agenţi bioactivi exogeni sau endogeni; reglare heterologă. Exemplele în acest sens sunt numeroase; clasice sunt cele privind creşterea densităţii receptorilor pentru ocitocină de către hormonii estrogeni şi reducerea de către progesteron. Hormonii tiroidieni cresc numărul receptorilor β adrenergici, etc. Chiar în condiţii de stimulare maximală de către un mesager primar, nu toţi receptorii disponibili pentru acesta sunt ocupaţi. Există deci o rezervă de receptori care variază de la un ţesut la altul dar şi în funcţie de starea de activitate a ţesutului. Unul şi acelaşi mesager poate să inducă reacţii diferite în teritorii diferite, uneori aproape diametral opuse. Aceste fenomene au fost explicate prin existenţa mai multor tipuri sau subtipuri de receptori. Răspunsul celular reprezentând expresia interacţiunii dintre mesager cu tipul de receptor care predomină în teritoriul respectiv. Astfel pentru catecolamine se descriu 5 tipuri de receptori (α1, α2, β1, β2, β3), pentru acetilcolină se descriu două tipuri clasice de receptori (N şi M), iar în ultimul timp s-a descris şi un al treilea tip (intermediar, I), etc. Pluralitatea receptorilor pentru un mesager are o importanţă fiziologică şi farmacologică deosebită. Pe de o parte răspunsul 78

FIZIOLOGIE CELULARA

organismului la un anumit semnal este posibil a fi modulat în vederea adaptării cât mai adecvate a acestuia, iar pe de altă parte a apărut astfel posibilitatea sintezei unor substanţe farmacologic active deosebit de specifice, capabile să exercite acţiuni terapeutice de mare selectivitate. Anumiţi liganzi, substanţe endogene şi exogene, după cuplarea cu receptorul specific declanşează atât`reacţia primară ligand-receptor cât şi pe cea secundară, de activare a semnalizării, până la răspunsul propriu-zis. Aceste substanţe au primit numele de agonişti ai receptorilor. Alte substanţe se pot cupla specific cu receptorii celulari fără ca ulterior să se declanşeze reacţiile secundare intracelulare (liganzi cu “afinitate” pentru receptor, dar fără “eficacitate” a legării de acesta). Aceste substanţe care astfel împiedică accesul agoniştilor la receptori reprezintă antagonişti (competitivi dacă se leagă pe acelaşi situs), adică agenţi blocanţi sau inhibitori ai răspunsului natural indus de agoniştii endogeni. Intre aceste două extreme, agonişti şi antagonişti, există o gamă largă de agonişti parţiali (cu eficacitate diminuată, dar nu absentă ca în cazul agoniştilor) 5.9.1. Superfamilia receptorilor cuplaţi cu proteine G Aceşti receptori (G protein coupled receptors, GPCR) sunt proteine cu şapte domenii transmembranare (7TM). Datorită faptului că lanţul proteic face bucle (şerpuieşte) prin membrană, aceşti receptori mai sunt numiţi şi serpentini. Acest grup de proteine este prezent la toate Fig. 41. Receptor cuplat cu proteina G vieţuitoarele de pe Pământ, chiar şi la mucegaiuri şi alge, ceea ce dovedeşte că sunt mai vechi de un miliard de ani. Din familie fac parte receptorii muscarinici pentru acetilcolină, receptorii GABA, receptorii mGlu pentru glutamat, receptorii adrenergici şi mulţi alţii. Sunt înrudiţi din punct de vedere genetic cu pigmentul vizual rodopsină, ce se regăseşte sub forma bacterio-rodopsinei încă de la cele mai vechi arhebacterii halofile; sunt probabil cel mai vechi sistem de recepţie. Receptorul este alcătuit dintr-un lanţ proteic unic (fig. 41), cu şapte domenii TM unite alternativ de o parte şi de alta a membranei prin domenii 79

FIZIOLOGIE CELULARA

non-membranare (extracelular 3 scurte şi intracelular 2 scurte şi unul lung), cu capătul N-t în afara celulei şi capătul C-t în citosol. Capătul N-t variază de la 7 la 6000 reziduuri de aminoacizi, iar unele lanţuri mai mari participă la cuplarea ligandului. Capătul C-t variază de la 12 la 350 de reziduuri. Majoritatea liganzilor de dimensiuni mici se cuplează într-un Fig. 42. Buzunarul de fixare a buzunar central format printre marginile ligandului în receptorul 7TM. extracelulare ale anselor (fig. 42). Reziduurile aminoacidice care formează acest buzunar sunt extrem de variabile, ceea ce conferă specificitatea receptorilor pentru liganzi. Aceştia pot varia de la fotoni (cuante de lumină), neurotransmiţători (ex. noradrenalina, ce se cuplează între helixuri, cam la o treime în grosimea membranei), hormoni peptidici (ce se cuplează adânc în grosimea membranei) şi liganzi mari (precum moleculele glicoproteice, care au structuri receptoare ataşate de capătul N-t). Receptorii serpentini se pot găsi în două stări: stare inactivă, cu receptorul necuplat cu ligand şi starea activată, după ce receptorul a cuplat ligandul. Starea activată iniţiază transducţia semnalului prin activarea proteinelor G trimerice. Ansele citoplasmice ale receptorilor activaţi catalizează cuplarea GTP pe o unitate Gα inactivă. Un receptor poate activa până la o sută de proteine G. Proteinele G (G de la GTP-ază) membranare sunt trimerice; conţin trei subunităţi desemnate α, β, şi γ. In timpul semnalizării subunităţile β şi γ rămân cuplate între ele şi sunt numite complex βγ. Subunitatea α este o proteină-comutator (switch), care alternează între starea activă, cu GTP cuplat, şi starea inactivă, cu GDP cuplat. In fapt receptorul activat funcţionează ca factor de schimb nucleotidic (guanine nucleotide exchange factor, GEF) pentru subunitatea α. Forma α-GTP nu are afinitate pentru complexul βγ şi se disociază de acesta, ambele având astfel posibilitatea să activeze proteine efector. La exercitarea efectului asupra proteinei-ţintă subunitatea α-GTP se transformă în α-GDP. Se poate spune că proteina efector are asupra subunităţii α o acţiune de tip GAP (GTPase-activating

80

FIZIOLOGIE CELULARA

protein).17, energia eliberată aici fiind de fapt cea care asigură transducţia semnalului. Ulterior α-GDP se reasociază cu complexul βγ şi proteina G poate relua ciclul sub o nouă acţiune de tip GEF exercitată de un GPCR activat, oricare ar fi el. In concluzie, subunitatea α este o GTP-ază care poate să-şi manifeste această activitate numai în cadrul ciclului descris (fig. 43), în care legarea GTP în locul GDP este condiţionată de interacţiunea ansamblului α-βγ cu receptorul activat (*), iar hidroliza GTP este condiţionată de interacţiunea α cu efectoru (**)l.

34

Fig. 43. Ciclul funcţional al proteinelor G heterotrimerice

Proteinele efector sunt de obicei enzime ce catalizează formarea de mesageri secunzi (adenilat-ciclaza, guanilat-ciclaza, fosfolipaza C, etc.), dar pot fi şi canale ionice sau alte proteine. Pentru subunitatea α există mai multe izoforme: • αs stimulează adenilat-ciclaza, cu formarea de AMPc din ATP. • αi inhibă adenilat-ciclaza • αq/11 stimulează fosfolipaza C membranară (PLCβ), ce lizează fosfatidilinizitol-bifosfatul (PIP2), producând mesagerii secunzi IP3 şi DAG • α12/13 sunt implicate în semnalizarea prin familia de GTPaze Rho, care controlează remodelarea citoscheletului.

17

Există şi GAP specializate, care ar putea limita spaţial şi/sau ca amploare transducţia

81

FIZIOLOGIE CELULARA

Tab. 2. Sisteme de semnalizare activate de receptorii cuplaţi cu proteine G Proteina- Efector

Mesager secund

Exemple de receptor

Adenilat-ciclaza

Creşterea AMPc

Receptorul β-adrenergic Receptorul pentru Glucagon Receptorul pentru Serotonină Receptorul pentru Vasopresină

Adenilat-ciclaza

Scăderea AMPc

Receptorul a1-adrenergic Receptorul colinergic muscarinic

Adenilat-ciclaza

Creşterea AMPc

Receptorii olfactivi

Fosfolipaza C

Creşterea IP3, DAG

Receptorul a2-adrenergic

Fosfolipaza C

Creşterea IP3, DAG

Receptorul colinergic endotelial

Fosfodiesteraza cGMP

Scăderea GMPc

Receptorul rodopsinic din celulele cu bastonaşe

Numele de proteine G se poate referi la 2 familii distincte de proteine. Proteinele G heterotrimerice sunt cele menţionate mai sus. De asemenea, mai există şi proteinele G mici (20-25 kDa), care aparţin superfamiliei Ras de GTP-aze. Aceste proteine sunt omologe cu subunităţile α ale proteinelor G trimerice, cuplează de asemenea GTP şi GDP şi sunt implicate în transducţia semnalului (vezi cap. 7.3). 5.9.2. Receptorii tirozin-kinazici Fosforilarea unor resturi de tirozină Fig. 44. Receptor tirozin-kinazic din diverse proteine este implicată funcţional în diverse fenomene celulare, de la proliferare şi procese de creştere şi dezvoltare până la multiple funcţii celulare diferenţiate. Transducţia semnalului la nivel plasmalemal în acest sistem presupune două mecanisme asemănătoare, care au ca substrat molecular fie receptori membranari cu activitate tirozin kinazică, fie receptori cuplaţi cu tirozin-kinaze citoplasmatice distincte structural. Liniile de semnalizare celulară cuprind interacţiuni proteice, proteine G monomerice şi fosforilări proteice. Cea mai mare parte a factorilor de creştere acţionează prin intermediul unor receptori cu activitate tirozin-kinazică (RTK). Aceştia sunt proteine cu 82

FIZIOLOGIE CELULARA

un singur domeniu transmembranar, grupate perechi. Cuplarea ligandului produce dimerizarea (lipirea fizică) a celor două subunităţi, ceea ce produce juxtapoziţia domeniilor intra-celulare, ceea ce duce la unificarea domeniilor kinazice. Acest fenomen duce la fosforilarea reziduurilor tirozinice de la nivelul regiunii C-t, creând situri de legare fosfotirozinice pentru toate proteinele efector ce prezintă domenii denumite PTB (phosphotyrosinebinding) sau SH2. Activarea RTK activează proteinele efectori în două moduri: fie cuplarea PTB a unei enzime produce fosforilarea şi activarea ei (de ex. fosfolipaza C, ce activează calea IP3-DAG), fie se apropie proteinaefector de substratul său (de exemplu Ras-GTP-aza), cu activarea căii respective (fig. 45). RTK sunt proteine membranare integrale cu patru domenii majore (fig. 44, 45): extracelular de legare a ligandului, transmembranar, intracelular catalitic (cu acti-vitate tirozin-kinazică) şi intracelular reglator. Secvenţa de aminoacizi în cadrul RTK este foarte asemănătoare cu cea a PKA la nivelul situsurilor de legare a substratului şi ATP, uneori fiind prezentă la acest nivel şi secvenţa non-kinazică (insert). Proteinele RTK se clasifică în peste 14 familii, după acest aspect şi după caracterele structurale din porţiunea extracelulară, privind prezenţa de domenii: bogate în Cys/Leu, Fig. 45. Transferul de informaţie pe imunoglobulin-like, tip cadhe- calea receptorilor cu activitate tirozin-kinazică rina, Kringle, repetitive tip fi- presupune recunoaşterea siturilor tirozinice de autofosforilare Y-P de către domeniul SH2 al bronectină III, discoidin-like, proteinei de legătură Grb2, care aduce factorul acide, EGF-like. Domeniul ex- de schimb guanin-nucleotidic SOS la nivelul tracelular cu afinitate pentru membranei, une este localizată proteina ras. Ras activată prin legarea GTP continuă linia de ligand conţine în general re- semnalizare prin contact cu proteina raf, o giuni bogate în cisteină care serin-treonin kinază, cu declanşarea unei cas delimitează situsul propriu-zis cade de activări kinazice. 83

FIZIOLOGIE CELULARA

de legare în context monomeric (receptorul pentru factorul de creştere epidermică, EGF) sau dimeric (receptorul pentru insulină) sau conţine structuri imunoglobulin-like (receptorii pentru factorul de creştere derivat din plachete, PDGF şi factorul de creştere fibroblastică, FGF). Mulţi receptori care prezintă activitate tirozin-kinazică intrinsecă, precum şi tirozin-kinazele asociate cu receptori plasmalemali conţin resturi de tirozină, care prin fosforilare interacţionează cu alte proteine din cascada de semnalizare. Acestea din urmă conţin domenii omologe cu cele identificate iniţial în proto-oncogena c-Src şi numite SH2 şi SH3. Domeniul citoplasmic cu activitate tirozin-kinazică este foarte asemănător pentru diverşii receptori, dar recunoaşte substraturi diferite pentru a induce răspunul biologic specific, de exemplu stimularea captării glucozei de către receptorul pentru insulină sau stimularea proliferării de către receptorul pentru EGF. De ambele părţi ale domeniului catalitic propriu-zis se găsesc domenii variabile (uneori fiind prezente şi inserturi în domeniul kinazic respectiv) care furnizează situsuri reglatoare, pentru modularea activităţii TK de către diverşi factori. Activitatea crescută a tirozin-kinazelor este contracarată pe patru căi majore: inversarea reacţiei (refosforilarea ADP), acţiunea tirozinfosfatazelor, scăderea densităţii receptorilor în urma endocitozei induse de ligand, hidroliza GTP legat de ras (cu formare de ras-GDP). Mutaţii ale proteinelor implicate în această cale de semnalizare se produc frecvent în celule ce trec de la calea normală la cea neoplazică de creştere. Ele pot să altereze caracteristici reglatoare, încât kinazele devin active constitutiv. Kinazele pot fi supraexprimate (cel mai ades prin amplificare genică dar şi prin transcripţie intensificată), iar ligandul poate fi exprimat constitutiv, cu activarea continuă a receptorilor. In sfârşit, proteine ras mutante pot fi constitutiv active datorită unei activităţi GTP-azice scăzute sau defectului unei proteine ce stimulează această activitate. Oricare din aceste modificări converteşte o proteină reglatoare normală într-o oncoproteină, capabilă să determine transformarea neoplazică. Interacţiunea proteinelor ce conţin domenii SH2 cu RTK sau TK asociate cu receptori duce la tirozin-fosforilarea SH2. Dacă ele au activitate enzimatică, este modificată, cum este cazul PLCγ, proteinei activatoare a GTP-azei asociată cu proto-oncogena c-Ras (rasGAP), fosfatidil-inositol-3kinazei (PI-3K), protein fosfatazei-1C (PTP1C), TK din familia Src (PTK). 84

FIZIOLOGIE CELULARA

Tab. 3. Caracterele claselor majore de receptori tirozin-kinazici Exemple Caractere structurale receptorul pentru EGF, secvenţe bogate în cisteină NEU/HER2, HER3 II receptorul pentru insulină, secvenţe bogate în cisteină, characterizate prin receptorul IGF-1 heterotetrameri formaţi prin legături disulfidice III receptorii pentru PDGF, c- 5 domenii imunoglobulin-like; inserţia kinazică Kit IV receptorii pentru FGF 3 domenii imunoglobulin-like; inserţia kinazică; domeniu acid V receptorii pentru VEGF 7 domenii imunoglobulin-like; inserţia kinazică VI receptorii pentru factorul heterodimeric like the class II receptors except that de creştere hepatocitară şi one of the two protein subunits is completely pentru factorul de extracellular. The HGF receptor is a proto-oncogene dispersie that was originally identified as the Met oncogene (scatter factor) VII familia receptorilor pentru secvenţe bogate în cisteină puţine sau absente; neurotrofine (trkA, trkB, secvenţe bogate în leucină în cazul receptorului trkC) şi receptorul pentru pentru NGF NGF Clasa I

Tirozin-kinaze non-receptor (PTK) Există numeroase tirozin-kinaze intracelulare, ce fosforilează diverse proteine ca urmare a activării semnalelor pentru creşterea şi proliferarea celulară. In prezent sunt acceptate două famili distincte de PTK. Familia arhetipală este înrudită cu proteina Src, o TK iniţial identificată ca proteina transformatoare din virusul sarcomului Rous, izoforma din celula eucariotă fiind numită c-Src. De altfel numeroase proto-oncogene au fost identificate ca proteine retrovirale. Cealaltă familie este înrudită cu kinaza Janus (Jak). Majoritatea proteinelor din familiile de tirozin-kinaze non-receptor sunt cuplate cu receptori celulari care nu prezintă activitate enzimatică proprie, cum ar fi receptorii pentru citokine, glicoproteinele limfocitare de suprafaţă CD4 şi CD8 receptorul pentru antigene al limfocitelor T. Acest mod de cuplare a receptorilor cu tirozin-kinaze intracelulare seamănă cu o formă disociată de receptor tirozin-kinazic (RTK). Un alt exemplu de semnalizare prin interacţiune proteică este dat de receptorul pentru insulină (IR). Acesta are activitate intrinsecă de tirozinkinază dar nu interacţionează direct după autofosforilare cu proteine SH2 enzimatic active (PI-3K sau PLCγ), ci are ca substrat principal proteina IRS1 (care conţine mai multe secvenţe similare cu situsurile SH2 de legare a 85

FIZIOLOGIE CELULARA

subunităţii catalitice a PI-3K). Aceste domenii permit formarea de complexe între IRS-1 şi PI-3K. Astfel IRS-1 poate acţiona ca o proteină de andocare pentru a cupla IR cu proteine semnalizatoare SH2. Au fost identificate şi alte asemenea proteine adaptor, cea mai frecventă fiind proteina 2 de legare a receptorilor pentru factori de creştere (Grb2). Shc este o altă proteină utilizată ca şi cuplor molecular. Grb2 conţine două domenii SH3 ce funcţionează ca un receptacul pentru domenii bogate în prolină ale proteinei schimbatoare de guanin-nucleotide SOS. Aceste interacţiuni proteice de înaltă afinitate aduc SOS la plasmalemă, unde favorizează transformarea GDP-ras în GTP-ras prin schimb GTP/GDP. Astfel GTP-ras iniţiază o cascadă de fosforilări (raf-1, MEK, MAP), informaţia fiind direcţionată şi amplificată pentru a controla în final expresia genică şi diviziunea celulară. Un exemplu de implicaţie funcţională a asocierii receptorilor cu tirozin-kinaze intracelulare este dat de receptorul nicotinic. Acesta cuprinde un canal ionic tetrameric, iar legarea acetilcolinei duce la tirozin-fosforilarea subunităţilor α, β şi δ, ce favorizează desensibilizarea faţă de acetilcolină. In acest caz legarea ligandului pe domeniul extracelular determină o modificare conformaţională ce se transmite prin domeniul transmembranar unic şi activează domeniul citoplasmic cu activitate kinazică. O altă variantă de organizare funcţională receptorul transmembranar se cuplează cu o subunitate tirozin-kinazică citoplasmică distinctă, ca în cazul receptorului pentru somatotrop cuplat cu JAK2. 5.9.3. Receptorii citokinici Citokinele sunt factori de creştere peptidici şi hormoni de creştere ce reglează proliferarea şi dezvoltarea multor procese celulare. Printre acestea se numără eritopoetina, interleukinele, interferonul, etc. Receptorii pentru citokine (fig. 46) sunt heterotrimeri, cu 2 domenii Fig. 46. Receptorul citokinic extracelulare ce se cuplează la ligand şi unul singur ce traversează membrana, de obicei un α-helix. Domeniul citoplasmic nu are activitate enzimatică, dar se cuplează cu unul din mai multe tipuri de tirozin-kinaze numite JAK (just another kinase). Cuplarea 86

FIZIOLOGIE CELULARA

ligandului activează receptorii citokinici prin alipirea a două kinaze JAK, care se activează reciproc, prin trans-fosforilare. Forma activată circulă în citoplasma, unde fosforilează factori de transcripţie din familia STAT, care consecutiv activării migraează în nucleu, pentru a regla expresia genică. 5.9.4. Receptori serin-treonin kinazici Sunt reprezentaţi de două tipuri de subunităţi (receptori de tip I şi receptori de tip II). Fiecare secvenţă-receptor extracelulară este legată de un domeniu serin-treonin kinazic la interiorul celulei (fig. 47). Activarea acestor receptori este realizată de liganzi dimerici, ce trebuie să fie prezenţi amândoi în momentul cuplării. Receptorii de tip II se activează, cuplându-se cu receptorii de tip I, care la rândul lor se activează şi fosforilează nişte factori citoplasmici de transFig. 47. Receptor serin-treonin kinazic cripţie numiţi Smad. Aceştia vor migra către nucleu, unde cooperează cu alţi factori de transcripţie pentru a regla expresia genică a anumitor proteine. Dintre liganzii cunoscuţi, cel mai bine caracterizat pentru SrTK este TGF-β (factorul de creştere şi transformare-β). Există cca. 40 de proteine ce leagă rSrTK, dintre care importante mai sunt activina şi inhibinele (reglează activitatea hormonală a ovarelor şi testiculelor). 5.9.5. Receptorii guanilat-ciclazici (rGC) Există la vertebrate o familie de receptori membranari (cu mai multe izoforme) cu domenii intracelulare ce catalizează formarea de GMP ciclic din GTP. GMPc reglează o serie de ţinte intracelulare, printre care se numără canalele ionice GTP-dependente, protein-kinazele stimulate de GMPc şi fosfodiesterazele nucleotidelor ciclice. Toţi liganzii cunoscuţi pentru rGC sunt peptide, deşi există o serie de receptori cu cGC de tip orfan. De asemenea, mediatorii gazoşi oxidul nitric şi monoxidul de carbon activează guanilat-ciclaze citoplasmice înrudite. Există mai multe subtipuri de rGC, dintre care cei mai importanţi sunt următorii:

87

FIZIOLOGIE CELULARA

- receptorul GC-A, ce are ca ligand factorul natriuretic atrial (ANP), secretat de cord şi ca efect creştere eliminării de apă şi sodiu la nivel renal; - receptorul GC-C intestinal, ţintă pentru enterotoxinele bacteriene; - receptorul GC-D de la nivelul neuro-epiteliului receptorului olfactiv; - receptorii GC-E şi GC-F se găsesc doar la nivelul retinei, unde sunt implicaţi se pare în embriogeneza celulelor cu conuri şi bastonaşe. 5.9.6. Familia Receptorilor pentru TNF TNF (factor de necroză tumorală) este un factor de creştere proteic produs de celulele imune, care are nenumărate funcţii în: şoc, inflamaţie, uciderea celulelor tumorale, sindromul consumptiv din bolile infecţioase, etc. Atât TNF cât şi liganzii din aceeaşi familie sunt trimeri proteici cu subunităţi cu lanţuri β, cum sunt NGF (factorul de creştere nervoasă) sau ligandul Fas (semnalul pro-apoptotic). Receptorii au domenii similare cuplate cu Fig. 48. Receptor tip rTNF segmente transmembranare unice la domenii citoplasmice diferite. Ei prezintă prelungiri ca nişte degete ce apucă şi înglobează ligandul (fig. 48), iar mularea segmentelor transmembranare pe molecula de ligand produce activarea unei fosfolipaze membranare ce hidrolizează sfingomielina, producând mesagerul secund ceramida. Alte proteine efector ale acestor tipuri de receptor activează factorul transcripţional NFκB, iar ligandul Fas activează caspazele-iniţiator. 5.9.7. Receptorii de tip Toll Denumirea provine de la prima proteină de acest fel, descoperită la Drosophila şi denumită cu termenul toll (germ,); deosebit, interesant. Utilitatea acestor receptori este pentru a percepe şi răspunde la infecţii cu o multitudine de virusuri, bacterii, ciuperci şi protozoare. Receptorii de pe celulele cu potenţial imun şi de pe celulele fagocitare percep macromolecule associate cu microorganismele: ARN dublu de tip viral, flagellin bacterian (proteina flagelilor), LPS (lipopolizaharid) bacterian de la germenii Gnegativi, zymosan din peretele celular al ciupercilor patogene. Receptorii de tip toll din limfocite şi alte leucocite (inclusiv NK şi T citotoxice) precum şi 88

FIZIOLOGIE CELULARA

din celulele procesatoare de antigeni (celulele dendritice) se activează în prezenţa macromoleculelor invadatorilor şi produc secreţia de citokine proinflamatoare şi chemotaxice. 5.9.8. Receptorii de tip Notch Calea de semnalizare Notch este un sistem de semnalizare foarte conservat ce se găseşte la majoritatea animalelor multicelulare. Se numeşte astfel pentru că a fost descoperită iniţial la o subfamilie de drosofila ce prezenta o crestătură (notch) pe aripi. Receptorul Notch este o proteină cu un singur pasaj transmembranar cu o porţiune extracelulară mare şi o regiune intracelulară mică (fig. 49). Ligandul receptorului notch este o altă proteină transmembranară (ceea ce înseamnă că numai celulele învecinate pot să-şi Fig. 49. Receptor tip Notch activeze receptorii notch) numită delta. Proteinele delta, la interacţiunea cu receptorii Notch, vor orienta evoluţia celulei învecinate către un alt tip de celulă, deci stimulează diferenţierea celulară. Asfel celulele din grupuri învecinate se pot organiza, creând primele rudimente de vase de neoformaţie, de reţele neurale etc, adică celulele se influenţează unele pe altele pentru a alcătui structuri mari. 5.9.9. Cascada de semnalizare Hedgehog Gena „arici” (hedgehog) a fost identificată tot la drosofila de către cercetători ce încercau să identifice genele responsabile pentru segmentarea corporală. S-a observat că pierderea proteinei de semnalizare Hedgehog producea involuţia embrionilor de drosofila în nişte sferule cu prelungiri, precum nişte mici arici. Receptorii Hedgehog sunt de 2 tipuri: un receptor transmebranar cu 12 anse numit Patched (Ptc) şi un receptor cu 7 domenii transmembranare numit Smoothened (Smo). Calea de semnalizare indusă de activarea acestor proteine de către proteina hedgehog este deosebit de complexă, mai ales datorită faptului că de obicei receptorul Smo este activ constituţional şi activarea receptorului Ptc de către proteina Hdg îl inhibă. Calea hedgehog 89

FIZIOLOGIE CELULARA

reglează diferenţierea celulară în multe ţesuturi, inclusiv formarea tubului neural. Mutaţiile genei Ptc produc carcinom bazo-celular la nivel cutanat, cel mai frecvent cancer la persoanele cu pielea deschisă la culoare. Gena Smo umană este o protooncogenă. 5.9.10. Nucleotidele ciclice ca semnale intracelulare Cei mai cunoscuţi mesageri secunzi sunt nucleotidele ciclice: 3,5adenozin-mono-fosfatul ciclic (AMPc) şi 3,5-guanozin-monofosfatul ciclic (GMPc). Ambii acţionează prin cuplarea reversibilă cu anumite proteine. Nucleotidele ciclice difuzează în citosol, activând o multitudine de ţinte citoplasmice, dintre care cele mai importante sunt canalele ionice activate de AMPc sau GMPc, şi o serie de protein-kinaze din grupul serin/treonin kinazelor. Nucleotidele ciclice sunt degradate de către nişte enzime numite fosfodiesteraze, care le transformă în nucleozide inactive. Există mai mult de 40 de fosfodiesteraze la vertebrate. AMP ciclic

GPCR αs-GTP

ATP citosolic

adenilat ciclaza

Fig. 50. Formarea AMPc ca mesager secund

AMPc este sintetizat din ATP (fig. 50) de enzima numită adenilatciclază, o proteină ancorată în membrană (12TM), cu situsul catalitic în citoplasmă (format de domeniile numite C1A şi C2A; ansa citosolică C se află între domeniile 6TM şi 7TM). AMPc este principalul mesager secund care, alături de calciu, asigură cuplarea dintre excitaţie şi răspunsul celular specific (contracţie musculară, secreţie glandulară etc). Deci el transmite informaţia din exteriorul celulei în interiorul acesteia. AMPc astfel sintetizat la nivelul membranei celulare (sub acţiunea adenilatciclazei activată de interacţiunea ligand-receptor) se fixează ulterior pe receptorul său 90

FIZIOLOGIE CELULARA

intracitoplasmatic, care este o proteinkinază. Aceasta este alcătuită din două subunităţi: subunitatea reglatoare, capabilă să cupleze reversibil mesagerul secund (AMPc) şi subunitatea catalitică, enzimă inactivă în absenţa 3’,5’AMPc. In urma legării AMPc de subunitatea reglatoare a proteinkinazei se realizează eliberarea subunităţii catalitice care devine activă şi este capabilă să producă ulterior fosforilarea unor proteine citoplasmatice. Proteina fosforilată este de multe ori o enzimă, ce devine la rândul ei o moleculă informativă; permite transformarea chimică a unui substrat, fapt care reprezintă răspunsul celular. Activarea proteinkinazei intracitoplasmatice poate fi însoţită sau nu de disocierea AMPc de subunitatea reglatoare. Specificitatea de acţiune a mesagerului extracelular nu este asigurată de AMPc şi de acţiunile sale, ci de specificitatea receptorului membranar în raport cu mesagerul primar ce îl activează. Intreruperea reacţiei dintre primul mesager (semnalul extra-celular) şi receptorul specific se însoţeşte de revenirea la valorile de repaus a concentraţiei celui de al doilea mesager (AMPc). Acest proces este rezultatul degradării AMPc de către enzime numite fosfodiesteraze, care hidrolizează ciclo-esterul la AMP. In acest mod fosfodiesterazele participă la controlul efectelor interacţiunii semnalului extern cu celula (nivelul semnalului) întrucât modulează concentraţia AMPc. Ca orice sistem implicat în controlul nivelului semnalului, aceste enzime constituie un punct de impact pentru substanţe medicamentoase. Astfel cafeina, teofilina, etc., inhibă fosfodiesteraza şi determină acumularea intracelulară a AMPc, prelungind în timp efectele generate de primul mesager sau generând relaxarea musculaturii bronşice (teofilina) cu efect benefic în astmul bronşic. GMPciclic Un alt nucleotid ciclic cu rol de mesager secund pentru anumite semnale din mediul extern este GMPc. Existà diverse procese implicate în activarea guanilatciclazei în vederea sintezei GMPc cu rol de mesager secund, Guanilatciclaza nu se află în întregime în constituţia membranei celulare, activarea acestei enzime putându-se realiza pe multiple căi. Unele semnale extracelulare care determină creşterea concentraţiei intracelulare de GMPc, determină în acelaşi timp şi creşterea concentraţiei Ca++ în citoplasmă şi astfel ionii de calciu ar putea activa indirect guanilatciclaza 91

FIZIOLOGIE CELULARA

intracitoplasmatică. Tot ionii de calciu pot stimula producerea de endoperoxizi lipidici; sub acţiunea unei lipooxigenaze ar genera derivaţi intermediari şi concomitent eliberarea de radicali hidroxil şi derivaţi, care pot activa guanilatciclaza şi consecutiv formarea de GMPc din GTP. Guanilat ciclaza membranară este o proteină cu un domeniu TM, care funcţionează efectiv ca receptor pentru factorul natriuretic atrial. Izoforma solubilă este un heterodimer αβ, fiecare subunitate având un domeniu C-t implicat în activitatea de ciclază. Aceste domenii C-t catalitice de 250 aminoacizi sunt similare cu cel din ciclazele plasmalemale. Enzima conţine o grupare hem ataşată unui rest histidină din zona N-t a subunităţii β, domeniul reglator, care este de tip PAS18 şi permite reglarea de către monoxid de azot, cu mari creşteri de activitate (x400). La nivelul celulelor cu bastonaşe din retină există o proteină GTP– dependentă numită transducină, formată din aceeaşi subunitate β (βγ) legată de subunitatea α diferită faţă de proteinele Gs şi Gi modulatoare ale adenilatciclazic şi care a fost numită subunitatea “α–T”. Transducina activează o fosfodiesterază care hidrolizează specific GMPc determinând scăderea concentraţiei sale. In consecinţă are loc modificarea potenţialului de membrană a acestor celule şi generarea potenţialului de receptor. In acest mod ar avea loc activarea lanţului neuronal responsabil cu transmiterea şi prelucrarea informaţiei vizuale. Este ştiut faptul că membrana celulară a bastonaşelor este deosebit de permeabilă pentru Na+, ori în stare de repaus unele canale pentru Na+ sunt menţinute în stare deschisă de către GMPc. Protein kinaza specifică pentru această cale de semnalizare este kinaza G, cu două izoforme, una predominant citosolică (PKG-I19) şi una ancorată plasmalemal prin miristoilare N-t (PKG-II). Aceste serin/treonin kinaze sunt homodimeri, fiecare subunitate având 3 domenii funcţionale: catalitic; N-t care mediază dimerizarea, suspresia activităţii în absenţa GMPc şi interacţii cu alte proteine (inclusiv substrat); reglator cu 2 situsuri distincte de legare a GMPc; legarea GMPc înlătură auto-inhibiţia din partea domeniului N-t.

18

Numit după iniţialele primelor trei proteine în care a fost identificat, domeniul PAS este un sensor prezent în diverse proteine, care în funcţie de gruparea prostetică asociată este sensibil la lumină, stres oxidativ, gaze diatomice; gruparea hem determină sensibilitatea la monoxid de azot 19 cu 2 izoforme de realipire alternativă, diferite prin sensibilitatea faţă de cGMP

92

FIZIOLOGIE CELULARA

5.9.11. Mesageri secunzi de origine lipidică O serie de enzime situate în apropierea membranei pot fi activate de către receptorii pe care se cuplează liganzi. Aceste enzime acţionează asupra substratelor lipidice oferite de către foiţa internă a membranei celulare precum şi de membranele organitelor şi formează o serie de molecule lipidice ce vor acţiona apoi ca mesageri secunzi. Cele patru legături esterice ale fosfolipidelor pot fi rupte de către mai multe tipuri de fosfolipaze intracelulare: • Fosfolipaza A2 (PLA2) îndepărtează unul dintre acizii graşi, ce este eliminat în citoplasmă, şi rezultă o lizofosfogliceridă. • O enzimă corespunzătoare, numită ceramidază îndepărtează acidul gras de pe sfingomielină, lăsând o ceramidă în bistratul lipidic. • Fosfolipaza C (PLC) separă grupul fosforilat (precum inozitol 1,4,5trifosfatul, IP3) de pe o fosfogliceridă, rezultând diacilglicerolul (DAG) • Fosfolipaza D (PLD) îndepărtează capul polar de pe fosfolipide, producând acid fosfatidic.

Fig. 51. Mesagerii secunzi derivaţi din fosfatidil-inozitol-bifosfat

93

FIZIOLOGIE CELULARA

Ţintele mediatorilor lipidici Cea mai mare parte a mesagerilor secunzi lipidici (DAG, acidul arahidonic, acidul fosfatidic şi lizofosfatidilcolina) îşi realizează efectele fiziologice prin intermediul celor mai mult de 10 izoenzime PKC (proteinkinaza C). PKC sunt serin/treonin kinaze cu un domeniu catalitic la capătul C-terminal şi domenii reglatoare la capătul N-terminal. In stare inactivă pe situl activ este legat un pseudosubstrat, care inhibă enzima. Mesagerii secunzi lipidici activează PKC prin disocierea pseudosubstratului de pe situl activ. Forbol-esterii sunt substanţele farmacologice cu acţiune similară, care stimulează PKC şi produc apariţia de tumori. Există şi izoenzime Ca2+ dependente, care au un sit secundar unde se cuplează calciul, necesar pentru activarea enzimei. Ceramida este reţinută în bistratul lipidic, unde activează un alt tip de serin-treonin kinază, precum şi protein-fosfataze (1 şi 2A). Ceramida trece prin bistratul lipidic către zona citoplasmică şi activează serin-treoninkinaza care acţionează asupra unor protein-ţintă ce au secvenţa Ser/Thr-Pro, producând activarea ulterioară a MAP-kinazei şi a factorilor transcripţionali. Acidul fosfatidic activează o lipid-kinază numită PI5-kinaza, care fosforilează inozitolfosfatul. IP3 şi sfingozin-1-fosfatul eliberează calciu din depozitele sarcoplasmice, prin mecanisme variate. Aşa cum am văzut, în urma interacţiunii dintre un semnal extracelular şi receptorii membranari specifici se poate activa în membrana celulară “fosfolipaza C”, enzimă lipolitică care hidrolizează inozitolpolifosfatul intramembranar rezultând pe de o parte diacilglicerol (DAG), iar pe de altă parte inozitoltrifosfat (IP3) . Diacilglicerolul (DAG) rezultat în urma hidrolizei PIP2 membranar are dublu rol. Pe de o parte el reprezintă sursă de acid arahidonic precursor de prostaglandine, prostacicline, tromboxani şi leucotriene, cu toţii mediatori importanţi pentru numeroase funcţii celulare, iar pe de altă parte îndeplineşte rolul de mesager secund (fig. 51), întrucât activează în citoplasmă proteinkinaza C (PKC), care catalizează fosforilăril proteice intracelulare, având ca rezultat final răspunsul specific al celulei. Inozitoltrifosfatul (IP3) este un mesager secund implicat în eliberarea calciului stocat în compartimente intracelulare (în particular la nivelul reticulului endoplasmic). Cuplându-se cu un receptor specific din membrana reticulului endoplasmic IP3 activează un canal specific de Ca++ astfel încât 94

FIZIOLOGIE CELULARA

conform gradientului de concentraţie calciul ionic acumulat în reticulul endoplasmic pătrunde în citoplasmă. Foarte frecvent ambii mesageri secunzi derivaţi de inozitolpolifosfat (DAG şi IP3) acţionează în comun declanşând şi în acelaşi timp modulând diferite procese celulare (sinteza de ADH, proliferarea fibroblaştilor, cuplarea dintre excitaţie şi contracţie, etc.). 5.9.12. Căile MAP-kinazei Protein-kinaza activată de mitogeni (MAPK) transferă stimuli de la membrană către nucleu. Cascada MAPK include trei protein-kinaze, care se activează în secvenţă (fig. 52). Kinaza ce fosforilează MAPK este o MAP-kinaz-kinază (MAPKK), care la rândul ei este fosforilată de MAPKKK, care la rândul ei, este activată de către Ras. Mitogenii sunt substanţe chimice, care, prin intermediul unui receptor specific, transmit un semnal ce stimulează mitoza. O dată fosforilată, MAP-kinaza difuzează către nucleu şi fosforilează factori de transcripţie care stimulează transcripţia genelor pentru ciclina D şi alţi factori necesari pentru sinteza ADN-ului şi pentru diviziunea celulară. Calea MAPK poate fi activată de proteina G mică (guanozin-trifosfataza)-Ras, receptorii Fig. 52. Una din căile de tirozin-kinazici pentru factorii de creştere şi activare a cascadei MAPK insulină, GPCR, şocul osmotic şi altele. Multitudinea modurilor de activare a căii MAP-kinazei permite integrarea stimulilor proveniţi pe mai multe căi, iar complexitatea căii de activare face ca această cale să acţioneze ca un comutator de tip „tot-sau-nimic”. 5.9.13. Calea JAK-STAT Kinazele JAK (numite mai nou „Janus-kinaze”, de la zeul cu două feţe), activează proteinele STAT prin fosforilarea tirozinei, care promovează formarea de dimeri activi, care apoi intră în nucleu şi se leagă de anumiţi promoteri. La mamifere există 4 JAK şi 7 STAT, care realizează răspunsurile specifice la diversele citokine.

95

FIZIOLOGIE CELULARA

5.9.14. Receptori pentru hormonii steroizi O serie de substanţe ce funcţionează ca mesageri primari (hormoni), sunt de natură lipidică sau sunt liposolubili şi ca atare nu au nevoie de receptori membranari pentru a putea transmite mesajul către elementele responsive din citoplasmă sau nucleu. Aceştia sunt hormonii steroizi (derivaţi din colesterol), retinoizii (derivaţi din Fig. 53. Receptorii pentru hormonii steroizi β−caroten) şi hormonii tiroidieni. şi gradul lor de înrudire. Aceste molecule trec uşor prin ER – receptor pentru estrogeni; membrana celulară şi ajung la o AR – receptor pentru androgeni; GR – receptor pentru glucocorticoizi; serie de receptori nucleari, care au o MR – receptor pentru mineralocorticoizi; structură generică comună, alcătuită PR – receptor pentru progesteron dintr-un domeniu de ataşare pe ADN (DBD) localizat central, urmat de o regiune „balama” flexibilă şi un domeniu ce cuplează ligandul (LBD), localizat la capătul C-t al receptorului. LBD este alcătuit din 12 α-helixuri (H1-H12). LBD mai este important în translocaţia nucleară, cuplarea de proteine chaperone, dimerizarea receptorului. La capătul N-t există unul sau mai multe domenii de activare a transcripţiei. Hormonii steroizi (HS) ajung la celulele-ţintă prin sânge, unde sunt cuplaţi cu proteine transportoare. Ei vor trece prin membrană prin difuziune şi se vor cupla cu receptorii (fig. 53), care au localizări variabile în celule: receptorii estrogenici sunt găsiţi mai ales în nucleu, receptorii pentru glucocorticoizi şi pentru androgeni sunt găsiţi în citoplasmă, în vreme ce receptorii pentru mineralocorticoizi şi pentru progesteron au o distribuţie aproximativ egală în citoplasmă şi nucleu. Toţi receptorii pentru HS suferă o translocaţie nucleară (sunt introduşi în nucleu), imediat după cuplarea cu liganzii. Receptorii nucleari care cuplează HS formează homodimeri. După cuplarea cu ligandul şi translocarea către nucleu, complexul hormon-receptor se leagă de regiuni specifice al ADN-ului numite Elemente Responsive Hormonal (HRE). Fiecare HRE este alcătuit din două jumătăţi de situri care fiecare leagă un monomer al dimerului steroid-receptor (SHR). Pe lângă cuplarea cu HRE, 96

FIZIOLOGIE CELULARA

complexele hormon-receptor îşi mai pot exercita efectele şi prin legarea directă pe alţi factori transcripţionali. De exemplu, receptorul estrogenic se poate lega direct de fos/jun, şi astfel regla transcripţia genei pentru ciclina D. Efectele directe mai pot apărea şi asupra căii de semnalizare ERK1/2, sau asupra căilor MAPK şi PKA. Modul clasic de acţiune al HS implică cuplarea ligandului şi a ADNului, dar pentru ca să se producă transcripţia este nevoie de proteine coreglatoare. Acestea sunt de două tipuri, co-represori şi co-activatori, şi funcţionează printr-o multitudine de activităţi enzimatice de tip acetilare, deacetilare, metilare, ubiquitinare şi activitate kinazică. Evenimentul final este transcripţia, care este un proces complex, ce necesită zeci de proteine. Unele determinări au demonstrat recrutarea a cel puţin 46 de factori lângă un promoter gol pentru ca să aibă loc transcripţia. Odată ce complexul proteic a fost asamblat, se de-reprimă genele situate după promoter şi se activează sinteza proteică specifică (vezi cap. 5.9.17). Receptorii inactivi pot fi blocaţi să interacţioneze cu ADN-ul prin intervenţia unei proteine numite Proteine de Şoc Termic (Heat Shock Protein, HSP). Aceasta este o proteină de tip chaperone (de însoţire), ce păstrează domeniul de cuplare al ligandului într-o poziţie în care este capabil să se cupleze cu ligandul dar nu poate intra în nucleu. Cuplarea ligandului va elibera domeniul de cuplare cu ADN-ul, permiţând complexului să înceapă translocarea către nucleu. 5.9.15. Receptorii intracelulari protein-fosfatazici Sunt o serie de enzime prezente doar la eucariote, ce funcţionează prin îndepărtarea fosfaţilor de pe lanţurile laterale ale aminoacizilor. Există mai multe familii, care acţionează ca receptori fosfatazici. Familia PPP are trei subfamilii, cu enzime ce prezintă Fe2+ şi Zn2+ în nucleul activ. Acestea acţionează asupra unei multitudini de substrate, de importanţă vitală, printre care miozina II, unde defosforilarea lanţurilor uşoare relaxează muşchiul neted; enzimele glicogenazice (glicogen fosforilaza) care controlează metabolismul glicogenului sunt defosforilate de asemenea de PP1. PP2 se asociază de obicei cu o proteină de sprijin de 65 kDa şi defosforilează multe substrate, inclusiv unele kinaze din cascada MAP. PP2B, numită şi calcineurină, este singura fosfatază citoplasmică reglată de Ca2+. Inhibiţia indirectă a PP2B de către ciclosporină (un imunosupresor) reduce expresia 97

FIZIOLOGIE CELULARA

genelor ce motivează răspunsul imun. Supresia răspunsului imun de către ciclosporină a revoluţionat transplantul de organe la om. PTP (proteintirozin-fosfatazele) sunt enzime ce iau parte la o multitudine de procese, inclusiv activarea limfocitelor, reglarea ciclului celular prin defosforilarea Src tirozin-kinazei şi a CDK-dependent tirozin-kinazelor. Enzimele PTP sunt supresori tumorali; mutaţiile somatice ce inactivează unele dintre aceste enzime sunt frecvente în celulele neoplazice. 5.9.16. Monoxidul de azot Semnificaţiile funcţionale ale monoxidului de azot (NO), ca mesager recent descoperit ce mediază interacţiunile intercelulare, au beneficiat în ultimii ani de numeroase dovezi experimentele care tind să impună introducerea unui nou concept, cel de sistem nitrinergic şi mediaţie nitrinergică. NO este o moleculă gazoasă mică, reactivă şi cu o viaţă foarte scurtă (perioada de înjumătăţire sub secunde).

Fig. 54. Biosinteza monoxidului de azot.NOS – nitroxid-sintaza; RNOS – specii radicalare ale anzotului; ONOO• - peroxinitrit; ASS – arginin-aspartat sintaza; ASL – arginin-succinat liaza

98

FIZIOLOGIE CELULARA

Principalul precursor al sintezei de NO în organism (fig. 54) este arginina (produs intermediar în ciclul ureei), care, în prezenţa nitric oxid sintazei (NOS) se hidrolizează şi apoi se oxidează producând citrulină şi NO. Referitor la biosinteza NO, s-a stabilit că aceasta se realizează în două etape şi că NOS este de fapt o NADPH-diaforază prezentă sub formă solubilă nu numai în citoplasma celulelor endoteliale, ci şi în celulele epiteliale, mesangiale, musculare, nervoase şi gliale. Ea se găseşte sub două forme: cea constitutivă (cNOS, activabilă de către complexul calciucalmodulină ca urmare a creşterii calciului citosolic determinată de activarea GPCR sau în alte moduri de creştere) şi cea inductibilă (iNOS, activă calmodulin-dependent şi calciu-independent, în cazul căreia răspunsul constă în creşterea exprimării genei respective). Stimularea receptorilor muscarinici de tip M1 de la nivelul endoteliului vascular produce, prin intermediul proteinelor G şi a cascadei de transducţie ulterioară, activarea NOS endoteliale (eNOS, variantă de cNOS). Aceasta transformă L-arginina în ornitină şi sintetizează monoxid de azot (NO) cunoscut sub formă de EDRF, care este principalul mediator difuzibil de origine endotelială pentrual relaxaarea muşchiului neted vascular. Ţinta principală a NO este guanilat-ciclaza solubilă, enzima citoplasmică ce sintetizează GMPc. Monoxidul de azot se cuplează reversibil pe grupul hem al guanilat-ciclazei, producând o modificare conformaţională ce activează ciclaza. NO mai reacţionează de asemenea şi cu tiolii aminoacizilor sulfuraţi (mai ales cisteina), producând S-nitrozilare, fenomen ce inactivează proteinele prin modificarea structurii secundare şi terţiare. In muşchiul neted vascular, activarea sistemului guanilatciclaza-GMPc produce relaxarea musculară şi scăderea tonusului vascular, prin intermediul inhibiţiei influxurilor de calciu la nivel intracelular. Pe alt plan funcţional, NO îndeplineşte rolul de mediator chimic al fibrelor nervoase nitrinergice centrale şi periferice. Fiind un produs neuronal gazos cu moleculă mică uşor difuzibilă prin membrane celulare, NO asigură transmisia chimică a mesajelor atât în sens anterograd, postsinaptic, cât şi retrograd, presinaptic, cu participarea GMPc ca mesager secund. Cuplul NO-GMP ciclic are rol de sistem de transducere a semnalelor inter şi intracelulare şi realizează funcţii de substanţă neurotransmiţătoare precum şi de hormon local paracrin şi autocrin.

99

FIZIOLOGIE CELULARA

Odată sintetizat, prin acţiunea formei neuronale a cNOS asupra argininei, NO s-a dovedit a fi implicat în activitatea neuronală prin următoarele roluri funcţionale rezultate din activarea căii GMPc: neurotransmiţător retrograd, modificator al expresiei genice, mesager neuronal, scavenger al radicalilor liberi, modificator al lipidelor membranare, modificator al proteinelor intraneuronale, neurotoxic şi neuroprotector, principalul factor vasorelaxant endotelial. NO reglează tonusul muşchiului neted şi activitatea neuronală în mod diferit de neurotransmiţătorii clasici, prin capacitatea de a difuza liber spre ţintele intracelulare din celulele vecine datorită marii sale liposolubilităţi. 5.9.17. Controlul expresiei genice Funcţia şi structura unei celule sunt determinate de proteinele care o alcătuiesc şi funcţionează în ea, astfel că modificările de sinteză proteică sunt cele care pot regla activitatea celulară pe termen mediu şi lung. Sinteza proteică se numeşte „expresie genică” iar controlul acesteia este un aspect fundamental al Fig. 55. Etapele de producere ale unei proteine la o biologiei celulei. Decizia de celulă eucariotă şi punctele în care poate fi reglată a iniţia (activa) transcripţia unei gene ce codifică o anume proteină este mecanismul major de control al funcţiei acesteia. Prin controlarea iniţierii transcripţiei (activare), celula reglează proteinele pe care le produce şi cât de rapid se face această producţie. Invers, când se „reprimă” transcripţia unei gene, proteinele codificate se produc lent sau deloc. Noţiunea de „expresie genică” acoperă întregul proces, de la transcripţie până la sinteza proteică (fig. 55). Celulele eucariote sunt mult mai complexe decât procariotele, unul din exemplele evidente fiind existenţa nucleului, ce separă etapa transcripţională de cea translaţională, iar transcriptele la eucariote trebuie procesate înainte de a fi translate. Există 2 nivele esenţiale la care se realizează controlul sintezei genice: controlul 100

FIZIOLOGIE CELULARA

transcripţional (elucidat la procariote, încă incomplet cunoscut la om) şi controlul post-transcripţional sau translaţional (existent numai la eucariote, datorită caracterelor genomului acestora şi a sistemelor de sinteză proteică). Controlul transcripţional se realizează prin pornirea (activare) sau oprirea (reprimarea) transcripţiei. Există proteine care activează sau reprimă genele prin cuplarea pe anumite secvenţe adiacente secvenţelor ce codifică proteina sau ARN-ul genei respective. Acestea se numesc factori de transcripţie, ei reprezentând aproximativ 6% din genele umane şi sunt grupaţi în câteva familii cu structuri şi mecanisme de cuplare similare. Fiecare dintre etapele ciclului transcripţional poate fi ţinta unor molecule reglatoare, dar cel mai frecvent reglată este reacţia de iniţiere. Genele operator (operoni) sunt adiacente cu genele structurale şi le controlează, determinând dacă genele structurale pot fi reprimate de către represor (produs de gena reglatoare). Operonul este recunoscut de către proteina-represor, cu care se cuplează, formând un complex operatorrepresor. Genele promoter sunt în continuarea genei operator şi se continuă cu aceasta până la codonul stop al genei structurale (ACT la ADN sau UGA pe ARNm). Regiunea promoter conţine o secvenţă simetrică bilaterală, în care secvenţele de ADN la orice nivel al unui anume punct (axa simetriei bilaterale) sunt simetrice şi palindromice (nucleotidele sunt orientate într-o direcţie pe una din benzi, şi exact invers pe cealaltă bandă). Raţiunea acestor regiuni simetrice de ADN este că ar putea fi recunoscute de proteine cu unităţi aranjate simetric. Unul dintre cei mai cunoscuţi factori de sinteză a proteinelor este AMPc la toate tipurile de celula. Acest lucru este posibil prin prezenţa sitului CRP. Situl CRP este una din aceste zone bisimetrice, şi este numit astfel deoarece se leagă de o proteină numită CRP (cAMP Receptor Protein), esenţială pentru cuplarea enzimei ARN-polimeraza pe promoter. Proteina CRP este un dimer cu două subunităţi şi are o greutate moleculară de 45 kDa. Acest CRP se cuplează cu AMPc şi formează un complex, care se leagă de promoter, activând ARN polimeraza şi astfel crescând transcripţia şi sinteza proteică. Acest tip de control este numit pozitiv. Sisteme inductibile şi represibile Există situaţii în care condiţiile externe se schimbă, iar celula trebuie să-şi adapteze secreţia de proteine-enzime noilor condiţii. Sistemul de 101

FIZIOLOGIE CELULARA

sinteză proteică ce poate răspunde la astfel de condiţii variabile se numeşte sistem inductibil sau represibil şi este alcătuit din gene structurale + gene reglatoare + sinteză proteică. Genele reglatoare sunt cele ce produc sinteza unei proteine, ce poate fi un represor activ sau un represor inactiv (aporepresor). Aceste gene funcţionează în sisteme inductibile. In condiţii obişnuite, represorul activ formează un complex cu gena operatoare, blocând-o. în prezenţa unui inductor (de exemplu un substrat), proteina represor se leagă de acesta şi formează complexul represor-inductor, care eliberează calea pentru ARNpolimerază şi astfel începe transcripţia. Intr-un sistem represibil, proteina represor este inactivă şi nu blochează operonul. Aporepresorul însă poate fi activat în prezenţa unui co-represor, iar acest complex blochează activitatea ARN-polimerazei. Acest tip de control se numeşte control negativ. Sistemul de control transcripţional este esenţial atât la procariote cât şi la eucariote, dar în vreme ce la primele procesul de reglare genică se opreşte aici, la eucariote procesul de reglare este mult mai complex. Genele la eucariote nu sunt organizate în operoni, iar expresia genică este rareori reglată de represori, ci este un sistem de control pozitiv, bazat pe pe activatori transcripţionali, numiţi şi factori de transcripţie. Controlul transcripţiei la organismele superioare O transcripţie corectă şi completă necesită intervenţia concertată a unui promoter şi a cel puţin unei molecule de stimulare, numită amplificator (enhancer). Aceste proteine - enhancer stimulează gradat transcripţia unei gene peste nivelul bazal şi sunt responsabile şi pentru transcripţia ţesutspecifică (unele ţesuturi exprimă o proteină, în vreme ce altele nu, în funcţie de prezenţa sau nu a enhancer-ilor). Activitatea factorilor transcripţionali dintr-o celulă poate fi reglată de sinteza unei proteine (auto-control), de către semnalele din mediu (substrate crescute sau scăzute) şi de semnale de la alte sisteme (ex. hormoni). Factorii transcripţionali au un domeniu funcţional pentru cuplarea pe ADN şi unul pentru activarea transcripţiei. Ei se clasifică după structura domeniilor de cuplare pe ADN astfel: Proteinele cu „degete de zinc” (zinc finger): într-o anumită localizare, aceste proteine au o secvenţă peptidică ce include două reziduuri de histidină şi două de cisteină, ce cuplează un atom de zinc , producând o structură ca o buclă, numită „deget”, care se cuplează pe ADN. 102

FIZIOLOGIE CELULARA

Proteine helix-turn-helix: conţin trei α-helixuri cuplate de benzi curbe. Acestea alcătuiesc ceea ce se numeşte homeodomeniu, care este domeniul de cuplare pe ADN a factorilor de transcripţie necesari pentru dezvoltarea embrionului şi fătului. Proteinele cu „fermoar de leucină” (leucine zipper): pentru a se cupla cu ADN-ul, aceste proteine trebuie să se dimerizeze. Acest lucru se realizează prin interacţiunea reziduurilor de leucină de pe cei doi dimeri, care se face într-o manieră ce aminteşte de închiderea unui fermoar (zipper). Proteine helix-loop-helix: conţin două α-helixuri, cuplate printr-o ansă polipeptidică. Receptorii pentru steroizi: sunt proteine cu trei domenii funcţionale: unul ce cuplează ADN-ul, unul ce activează transcripţia şi al treilea pentru cuplarea hormonilor steroizi, intraţi în nucleu. Controlul procesării ARN (translaţional sau post-transcripţional) Primul tip de reglare post-transcripţională este dacă un ARNm va fi translat sau nu. Dacă nu este procesat, nu va fi transportat în afara nucleului şi nu va fi translat. Al doilea tip de reglare post-transcripţională este reglarea longevităţii ARNm. Dacă există de exemplu două molecule de ARNm, una care se degradează în cinci minute, şi alta care rămâne în citosol vreme de oră, este evident că cea mai longevivă (cu viaţa mai lungă), va fi translată în cantitate mai mare. ARNm provenind de la gene diferite au şi durata lor de viaţă codificată în propria lor moleculă, ceea ce serveşte la reglarea cantităţii de proteină produsă. Informaţia despre ciclul de viaţă se găseşte în regiunea 3' UTR (3'-untranslated regions), regiunile netranslate (reglatoare) de pe ARN. De exemplu secvenţa AUUUA, atunci când există în 3' UTR, este un semnal pentru degradare rapidă (viaţă scurtă). Cu cât secvenţa se repetă mai mult, cu atât viaţa ARM este mai scurtă. Al treilea nivel la care se poate realiza reglarea post-transcripţională este reglarea translaţiei. Se poate regla şi dacă o moleculă de ARNm se translează sau nu. Diversele mecanisme ale reglării translaţionale nu sunt încă suficient cunoscute, dar există multe situaţii, mai ales la nivel embrionar, când există multe molecule de ARNm în citosol, dar nu se translează decât în anumite condiţii. 5.9.18. Calciul citosolic ca semnal intracelular Semnalele citosolice de calciu participă la orice activitate celulară, de la cuplarea excitaţiei cu răspunsul (contractil şi secretor), controlul 103

FIZIOLOGIE CELULARA

metabolismului, al expresiei genice (diferenţiere şi adaptare) şi al ciclului celular (proliferare) şi până la alterări funcţionale şi moarte celulară fortuită (necroză) sau programată (apoptoză). Ionul de calciu este cel mai versatil mesager secund, implicat într-o multitudine de procese, ce includ transmisia sinaptică, fertilizarea, fenomenele secretorii, contracţia musculară, citokineza şi multe altele. Toate eucariotele (nu şi procariotele) folosesc semnalele de calciu, probabil datorită faptului că celulele depind în cel mai înalt grad de fosfaţi şi fosforilare pentru toate procesele biologice. Cum în prezenţa calciului fosfaţii precipită, celulele primordiale au trebuit să-şi dezvolte mecanisme de eliminare a ionilor de calciu din citoplasmă. Astfel, s-a creat un gradient de concentraţie a calciului între mediul intracelular şi cel extracelular, care poate fi folosit sub forma de micropulsuri de calciu, cu o dinamică foarte rapidă, pentru a se semnaliza anumite evenimente esenţiale din viaţa celulei. Calciul liber din citoplasmă reprezintă în numeroase celule mesagerul secund care traduce în răspuns celular interacţiunea dintre semnalele extracelulare şi celulă. Nivelul calciului liber citosolic (intracitoplasmatic) este rezultatul transferului transmembranar al ionului respectiv din afara în interiorul celulei şi invers, cât şi a mobilizării sale din depozitele sale intracelulare (mitocondrii, reticul endoplasmic etc) şi recaptării în rezerve (fig. 56). Pătrunderea calciului în interiorul celulei se realizează prin canalele receptor-dependente şi voltaj-dependente, iar extruzia sa în exteriorul celulei sau introducerea în depozitele intracelulare se realizează prin pompe de calciu (PMCA respectiv SERCA; vezi 5.7.1) precum şi prin antiportul sodiu-calciu plasmalemal. In stare de repaus celular calciul intracelular se găseşte în cea mai mare parte sub formă legată în diferite depozite şi în mică măsură, în jur de 10-7M, sub formă liberă. Numeroşi mesageri extracelulari sunt capabili să crească foarte mult (până la 10-5M) concentraţia intracelulară a calciului liber, condiţie în care ionul respectiv îndeplineşte rolul de mesager de ordinul doi pentru răspunsul specific al celulei (contracţie musculară, secreţie glandulară etc). In alte circumstanţe ionul de calciu îndeplineşte rolul de mesager de ordinul III sau generează mesageri de ordinul III. Astfel, inozitoltrifosfatul (IP3), care este considerat mesager de ordinul II, determină eliberarea calciului din depozitele intracelulare şi creşterea concentraţiei calciului ionizat din citoplasmă urmată de activarea sistemelor 104

FIZIOLOGIE CELULARA

Schimb

Fig. 56. Fluxurile majore de calciu plasmalemale şi intracelulare care determină nivelul calciului citosolic şi semnalele citosolice de calciu

enzimatice inductoare de răspuns celular specific (fig. 51). Pe de altă parte, creşterea concentraţiei calciului liber din citoplasmă ca urmare a interacţiunii dintre semnalele extracelulare şi celule, dă posibilitatea acestui ion să se cupleze cu numeroşi receptori intracelulari, de obicei de natură proteică (calciu-proteine) între care calmodulina este cel mai bine studiată. Complexul calmodulină-calciu activează o kinază care permite fosforilarea lanţurilor uşoare ale miozinei iniţiind astfel contracţia muşchilor netezi. In acelaşi sens poate fi citată şi troponina C din muşchiul striat scheletic şi cardiac. In acest caz deschiderea canalelor de calciu voltaj-dependente de către potenţialul de acţiune determină creşterea calciului citosolic (de la 107 M la 10-5M); acesta reprezintă mesagerul secund, care cuplându-se cu troponina C declanşează alunecarea miofilamentelor de actină printre cele de miozină, deci contracţia musculară. Canale de calciu plasmalemale voltaj-dependente Clasic20 se descriu 3 tipuri de astfel de canale (VOC): T (tranzitoriu); L (timp lung de inactivare); N (neuronal), dar de fapt sunt 2 mari clase: LVA (prag jos de activare; tip T); HVA (prag înalt; tip L, N, P, Q, R). 20

Pentru clasificarea actualizată vezi http://www.iuphar-db.org.

105

FIZIOLOGIE CELULARA

Pentru a doua clasă sunt cunoscuţi blocanţi specifici: 1, 4-dihidropiridine (DHP) pentru L, ω-conotoxină pentru N, ω-agatoxină cu afinitate mai mare pentru P decât pentru Q; HVA neblocate de vreuna din acestea sunt electrofiziologic de tip R şi non-R. Subunitatea α1 a VOC prezintă 6 varietăţi (A-E, S), ce corespund tipurilor L (C, D, S), N (B), P/Q (A), R (E). CaL se disting prin numeroşii blocanţi specifici, majoritatea din 3 clase (DHP, fenilalkilamine, benzotiazepine), situsurile fiind bine cunoscute. CaL este format din 3 subunităţi: α1, β şi α2δ (în muşchiul scheletic apare şi o subunitate γ). Subunitatea α1 (170-240 kDa; 6 gene) conţine calea hidrofilă, senzorul de voltaj şi situsurile pentru blocanţi, prezentând 4 regiuni omologe, de câte 6 domenii transmembranare (TM) legate prin domenii citoplasmice (DC), şi domeniile terminale amino (N-t) şi carboxi (C-t), citoplasmice. α1 face parte din familia canalelor voltaj-dependente alături de cele de Na+ şi K+. Biofizic diversitatea VOC este dată de α1, dar structura terţiară şi proprietăţile de canal sunt modulate de subunităţile asociate. Calciul citosolic are asupra CaL efect inhibitor direct, dar şi activator mediat de o kinază calciu-calmodulin-dependentă (CaMKII). Fosforilarea prin PKC este activatoare, iar nucleotidele ciclice au efecte variabile. Fosforilarea α1 mediată de PKA creşte probabilitatea de deschidere, iar cea mediată de PKC creşte incidenţa deschiderilor de durată. Există date privind modularea CaL de către tirozin-kinaze (TK) sau prin SH-nitrozilarea α1. Canale operate de rezerve In cadrul modelului capacitiv intrarea de Ca2+ dependentă de nivelul rezervelor intracelulare era considerată importantă doar pentru reumplerea depozitelor reticulare, dar azi e implicată şi ca sursă directă pentru semnalul citosolic de calciu. Mecanismul nu este elucidat, fiind implicate interacţiuni proteice directe sau mesageri difuzibili, cum ar fi IP4, cGMP, derivaţi de arahidonat dar mai ales factorul de influx al calciului (calcium influx factor, CIF). Ca posibile SOC, sau subunităţi ale acestora sunt considerate TRP (transient receptor potential), o familie mare şi diversă de proteine exprimate în diverse celule, cu implicaţii în răspunsul la stimuli chimici (osmolaritate, pH, feromoni, factori de creştere) şi fizici (mecanici, termici). Tendinţa actuală este de a distinge funcţional două categorii de SOC (fig. 57): IP3ROC sunt canale plasmalemale de tip TRP-C1, cuplate direct cu canalele operate de IP3 din reticulul superficial, iar SOC propriu-zise sunt 106

FIZIOLOGIE CELULARA

Fig. 57. Activarea canalelor de calciu operate de rezerve (după Bolotina V. M.) http://jp.physoc.org/cgi/content/full/586/13/3035

canale plasmalemale activate de CIF prin intermediul unei fosfolipaze submembranare inhibate de calmodulină (iPLA2β). Ambele mecanisme de influx capacitiv sunt rezultatul activării de către GPCR a căii PLC, cu eliberarea IP3-dependentă a calciului din reticul, iar varianta a doua presupune un grad de scădere a rezervelor reticulare (depleţie). Pompa de calciu plasmalemală Funcţionarea PMCA presupune un ciclu de reacţie: Ca2+ se leagă pe domeniul citosolic (DC1), urmând fosforilarea unui rest aspartat catalitic, transconformare cu expunerea Ca2+ pe faţa externă a membranei, eliberarea sa, defosforilare şi reconformare. DC2 cuprinde o secvenţă de 40 aminoacizi bazici pentru legarea fosfolipidelor acide, DC3 conţine Asp catalitic şi situsul de legare a ATP, iar DC4 (C-t) situsurile pentru calmodulină şi Ca2+ (alosteric) precum şi cele de fosforilare de către PKA şi PKC. Situsul pentru calmodulină leagă fosfolipide acide şi acizi graşi polinesaturaţi, cu efect modulator. PMCA se găseşte în cantitate relativ redusă (~103 molecule/hematie) şi are o afinitate mare pentru Ca2+. Pompa funcţionează 107

FIZIOLOGIE CELULARA

ca antiport Ca+/H+=1/1. Situsurile cu mare afinitate pentru Ca2+ din domeniul CaM nu sunt implicate direct în translocare. Stoichiometria Ca2+:ATP este 1:1 în cazul PMCA, faţă de 2:1 pentru SERCA (7). PMCA prezintă un situs pentru almodulină într-un fragment autoinhibitor similar fosfolambanului, cu acţiune pe situsuri din DC 2 şi 3, blocat de PKC. PMCA este stimulată de următorii factori: Ca2+ (pe 3 situsuri distincte), calmodulină, fosfolipide acide (asigură 50 % din activitatea bazală), acizi graşi polineasturaţi, PKA, PKC, cazein kinaza II, proteoliză limitată (calpaină), dimerizare. PMCA ar putea fi inhibată de complexul G-βγ. Se cunosc peste 20 izoforme, produse pe baza a 4 gene: 1 şi 4 exprimate similar (asigurând 75-98 % din total), iar 2 şi 3 exprimate restrictiv. Antiportul sodiu/calciu Na/Ca (de fapt 3Na/Ca) este bidirecţional (cu ciclu de tip consecutiv), cu afinitatea Ca2+ mai mare pentru situsul expus intracelular şi inactivare Na+-dependentă. Na/Ca funcţionează predominant în mod direct, cu expulzarea calciului din citosol, dar poate funcţiona şi în mod revers, vând concentraţia submembranară de sodiu este mare. Proteina antiporter izolată din miocard este prototipul acestei familii, NCX1: 970 aminoacizi, N-t extracelular glicozilat, 9 domenii TM grupate în 2 seturi legate printr-un lung domeniu citosolic. Na/Ca aparţine genic primei familii din 4 ale unei superfamilii, în care se regăsesc cele 3 NCX prezente la mamifere. Si a doua familie (NCKX) cuprinde 2 proteine prezente la mamifere, similare cu transportorul 4Na/CaK clonat din ţesut retinian. Prin mutaţii punctuale s-a evidenţiat importanţa Ser110, Glu113 şi a repetiţiilor pentru funcţia de transport, precum şi a domeniului TM 2 (Thr103) pentru selectivitate. Din multiplii factori ce reglează Na/Ca se disting Na+, Ca2+, PIP2 şi fosforilararea. Na/Ca prezintă un situs intern reglator cu afinitate mare pentru Ca2+, absolut necesar pentru funcţia de transport. Agenţii ce stimulează PLC pot să inducă creşteri de Cac şi prin inhibarea Na/Ca. Inhibarea de către mesageri primari poate fi mediată de PKA, PKC, kinaza calmodulin dependentă (CaMK), cGMP (în cazul NO). Stimularea Na/Ca prin fosforilare Ca2+-dependentă implică creşteri de afinitate pentru Ca2+ citosolic şi pentru Na+ extracelular.

108

FIZIOLOGIE CELULARA

Eliberarea calciului din reticul In cardiomiocite a fost pentru prima dată pusă în evidenţă eliberarea Ca2+ din reticulul endoplasmic de către calciul citosolic crescut în urma intrării din exterior (calcium-induced calcium release; CICR), eliberare bazată pe canale reticulare numite receptori pentru ryanodină (RyR). Inozitol-trifosfatul (IP3) eliberează Ca2+ acţionând asupra unor receptori (InR) ce sunt de asemeni canale reticulare activate de calciul citosoli. Din punct de vedere al eliberării calciului reticulul prezintă un compartiment profund şi unul superficial, intim corelat funcţional cu plasmalema; rezervele sensibile la IP3/ryanodină pot fi mai mult sau mai puţin suprapuse. Cunoştinţele generale despre canalele reticulare de Ca2+ pot fi rezumate astfel: deschise de creşterea calciului citosolic; două tipuri (blocate de ryanodină într-o stare deschisă, respectiv activate de IP3); modulate de calciul reticular; domeniile transmembranare (carboxi-terminal, C-t) asigură ancorarea în membrană şi funcţia de canal; capul hidrofil (amino-terminal, N-t) conţine situsurile de legare pentru Ca2+ şi alţi factori reglatori; IP3 recrutează populaţii de InR cu sensibilitate scăzută la Cac. InR şi RyR sunt proteine integrale din membrana reticulară şi fac parte din două familii ale unei superfamilii genice, care a apărut filogenetic la nematode. IP3 pare mediatorul eliberării în cazul activării receptorilor plasmalemali, iar CICR apanajul celulelor electric excitabile. RyR reprezintă canalele reticulare ce asigură în miocitul scheletic creşterea de calciu citosolic declanşată de potenţialul de acţiune. La om există 3 tipuri (~5000 aminoacizi, ~560 KDa). In receptorul-canal homotetrameric porul central este delimitat de domeniile C-t ale monomerilor şi de domenii transmembranare. Canalul RyR este cationic, cu conductanţă mare, selectivitate redusă şi funcţionare complexă, ce ar putea implica 4 bariere şi 3 situsuri de legare. RyR sunt baza moleculară a CICR în diverse celulule, iar cei din RE superficial prezintă şi o corelare cu canalele de calciu voltaj-dependente de tip L (CaL), mai importantă în muşchiul scheletic (cuplare directă) decât în miocard (predomină CICR) şi foarte redusă în MN, unde se vorbeşte de o cuplare laxă între CaL şi eliberarea reticulară. Calciul citosolic este activator natural pentru RyR, eliberarea fiind neglijabilă pentru valori 105 molecule/veziculă, faţă de pompa plsamalemală ~103 molecule/hematie). SERCA are afinitate mare pentru Ca2+ şi este permanent inhibată de fosfolambanul (PLB) nefosforilat în cazul izoformelor 1 şi 2 (fibre scheletice roşii şi miocardice), dar nu şi al SERCA3 din fibrele rapide. PLB este un polipeptid hidrofob de 52 aminoacizi ancorat membranar prin C-t, similar ca secvenţă şi funcţie cu fragmentul autoinhibitor din structura pompei de calciu plasmalemale (PMCA). PLB interacţionează cu un situs din apropierea centrului catalitic, dar şi cu unul din domeniul transmebranar 6 în SERCA1a. Activitatea bazală a SERCA este dependentă de sarcolipină, inhibată de ATP şi PKC, influenţată de calreticulină şi de o proteină citosolică modulatoare. SERCA funcţionând ca antiport electrogen (Ca/H=1/1), este necesar eflux de clor pentru compensarea de sarcină, iar activitatea pompei menţine un grad de alcalinizare a lumenului reticular. SERCA prezintă 10 domenii TM şi 3 citoplasmice: N-t, implicat în direcţionarea spre RE; un al doilea domeniu, din care lipseşte secvenţa încărcată pozitiv ce leagă fosfolipide acide în cazul PMCA; al treilea domeniu, ce conţine situsul activ. Domeniile TM 4, 5 şi 6 formează un pseudo-canal. SERCA-1 este exprimată în muşchiul scheletic, SERCA-2 predominant sub forma 2a în miocard şi 2b în muşchiul neted, iar SERCA-3 în miocite netede şi ţesuturi non-musculare. SERCA-2b se deosebeşte prin rată mai redusă de hidroliză a ATP, deci de transport al Ca2+, iar SERCA-3 are afinitate scăzută pentru Ca2+. Monoxidul de azot inhibă SERCA prin GMPc şi independent. Semnale citosolice de calciu Microscopia laser confocală a permis stabilirea naturii cuantale a semnalelor de calciu; semnalele elementare de Ca2+ se pot suma în semnale locale şi globale, cu relevanţă distinctă. Tehnicile de biologie moleculară permit stabilirea structurii funcţionale a proteinelor ce realizează şi controlează fluxurile de Ca2+. Sectoarele de calciu citosolice şi veziculare conţin proteine ce leagă Ca2+, care tamponează şi modulează semnalele de calciu, uneori specializate în transmiterea semnalului, cum este calmodulina. 111

FIZIOLOGIE CELULARA

Eliberarea din reticul duce la creşteri discrete de calciu, integrabile în creşteri globale, relativ uniforme spaţial, faţă de gradientele mari ce însoţesc influxul. Fiziologic sunt activate ambele surse; CICR recrutează rezervele când semnalul primar este influxul iar eliberarea nu este izolată, datorită SOC. Ideea de semnal de Ca2+ local a apărut în studii privind eliberarea neuromediatorilor şi influenţa calciului citosolic asupra canalelor ionice. Fiind autoregenerativ, SC ar trebui să fie de tip tot sau nimic, dar răspunsurile gradate indică natura cuantală. Sensibilitatea variabilă faţă de calciu a canalelor reticulare permite gradarea efectului prin recrutarea acestora. Semnale elementare autonome au fost evidenţiate în diverse celule, cu diverse denumiri (sparks, puffs, bumps, quantal emission domains). Există şi aspecte subquantale numite semnale unitare (quarks, blips). In general semnalele elementare durează ~0,5 ms şi ajung la concentraţii de 0,1-200 μM. In principiu frecvenţa globală şi amplitudinea medie a acestora contribuie la nivelul de repaus al calciului citosolic global, condiţionând astfel distanţa până la pragul de cuplare excitaţie-răspuns. Semnalele elementare participă la controlul unor activităţi zonale: canale ionice membranare, metabolismul mitocondrial, eliberarea neuromediatorilor. Ele se sumează sub formă de tranziente globale (spikes, waves), CICR asigurând amplificarea în avalanşă şi sincronizarea semnalelor în citosolul profund, pentru răspuns sinergic. 5.10. Joncţiuni celulare In cursul dezvoltării ontogenetice a unui organism multicelular, celulele progenitor se diferenţiază într-o multitudine de tipuri celulare, cu caracteristici, structuri şi funcţii specifice. Celulele de acelaşi tip se agregă în ceea ce se numeşte un ţesut pentru a coopera în realizarea unei funcţii (ţesut muscular pentru contracţie, glandular pentru secreţie, etc.). Mai multe tipuri de ţesuturi se agregă într-un organ, pentru a realiza o funcţie majoră a organismului. Nici una dintre aceste funcţii nu ar fi posibilă fără o largă gamă de molecule de adeziune, care să asigure legăturile fizice între celule sau între celule şi matricea extracelulară. 5.10.1. Matricea extracelulară Celulele nu pot sta izolate în ţesuturi, ele trebuiesc ancorate pe un eşafodaj care să le solidarizeze şi să creeze o reţea tridimensională în 112

FIZIOLOGIE CELULARA

ochiurile căreia să se găsească celulele. Această „armătură” se numeşte matrice extracelulară şi este alcătuită din biopolimeri de suport şi celulele care îi secretă. Celulele care produc matricea evoluează din celulele stem denumite celule mezenchimale primitive, ce proliferează şi evoluează în celulele ţesutului conjunctiv (fibroblaste, mastocite, celule adipoase, condrocite şi osteoblaste). Substanţele ce formează matricea extracelulară sunt împărţite în cinci clase: colageni, elastină, proteoglicani, hyaluroni şi glicoproteine adezive. Fibrele de colagen Colagenul este cea mai abundentă proteină din corpul uman. Există mai mult de 20 de variante de colagen; caracteristica generală este alcătuirea dintr-un triplu helix polipeptidic, rezultând fibrile în lungime de până la 500 de nm. Aceste molecule se asociază pentru a forma agregate (fig. 58). Unele agregate sunt longitudinale, formând filamente ce formează tendoane şi ligamente, altele se aranjează într-o reţea bidimensională, formând „foiţe” (ce se vor regăsi în membranele biologice) iar altele în reţea tridimensională, pe care se Fig. 58. Asamblarea depun proteoglicani (cartilaje) sau săruri minerale tri-fibrilară a (substanţa fundamentală a osului). colagenului Fibrele elastice Fibrele elastice sunt un material compozit, ce are capacitatea de a se alungi şi deforma în funcţie de forţele aplicate asupra lor, revenind la formele şi dimensiunile iniţiale, după ce forţele au încetat. Se găsesc în piele, cartilaje, ţesut subcutanat, peretele arterial şi venos. Sunt alcătuite dintr-o reţea de microfibrile, dintr-o proteină numită fibrilină încorporată într-un sistem de subunităţi de elastină, legate între ele de o a treia proteină, numită fibulină. Fibrele elastice sunt sintetizate numai în copilărie şi adolescenţă, iar turnoverul lor la adult este foarte limitat. Glucozaminoglicanii Se numeau înainte mucopolizaharide şi sunt polizaharide lungi, alcătuite din unităţi dizaharidice (de obicei acid hexaminic şi hexozamină) 113

FIZIOLOGIE CELULARA

înfăşurate pe o proteină-nucleară fibrilară. Nomenclatura proteoglicanilor este în continuă evoluţie, pe măsură ce sunt descoperite noi molecule. De exemplu, proteoglicanul principal al membranelor bazale se numea heparansulfat, ceea ce era imprecis, deoarece mai există şi alţi proteoglicani ce conţin heparan-sulfat şi de aceea se numeşte acum perlecan, după proteina sa nucleu. Proteinele-nucleu variază în dimensiune de la 100 la 4000 de aminoacizi, iar numărul de glucozaminoglicani ataşaţi variază de la unul (decorin) până la 200 (aggrecan). Alţi proteoglicani cunoscuţi sunt fibroglican, versican, glipican, serglican, syndecan, etc. Aceste molecule au capacitatea de a se hidrata, crescându-şi volumul foarte mult, în aşa fel încât 1 gram de proteoglican poate fixa 50 de grame de apă. Ca urmare, umpluturile de proteoglicani sunt esenţiale în restricţionarea fluxului de apă, limitarea difuziei solviţilor (mai des a macromoleculelor) şi în împiedicarea extinderii microorganismelor. Pe lângă funcţiile mecanice, proteoglicanii pot produce adeziunea celulelor şi le pot influenţa motilitatea. Syndecanul limfocitar fixează celulele migrate în ganglionii limfatici, decorina şi fibromodulina reglează asamblarea fibrilelor de colagen, syndecanul şi glipicanul acţionează ca şi co-receptori pentru factorii de creştere. Glicoproteinele de adeziune Sunt moleculele ce realizează „cleiul” intercelular. Dintre acestea, două sunt de importanţă majoră. Fibronectina este o proteină mare, organizată sub forma literei V. Se găseşte sub formă de fibronectină tisulară, ce leagă diversele molecule de adeziune între ele, şi fibronectină plasmatică solubilă. Tenascina este o proteină – gigant cu şase braţe, ce poate fi găsită doar la vertebrate, în embrioni, plăgi în curs de reparaţie şi tumori. Funcţiile ei nu sunt pe deplin cunoscute. 5.10.2. Adeziunea celulară Celulele organismelor multicelulare sunt dependente de adeziunea între ele şi cu matricea extracelulară. Există mai multe familii de molecule de adeziune (Cell Adhesion Molecule, CAM), iar nomenclatura nu este sistematică. Conform nomenclaturii moderne, toate sunt numite CD (cluster of differentiation) urmate de un număr. Numele tradiţionale definesc familiile: imunoglobulinele de adeziune (ICAM), caderinele, integrinele, selectinele. Toate aceste familii de proteine se exprimă sau nu pe suprafaţa 114

FIZIOLOGIE CELULARA

proteinelor, permanent sau temporar, sau expresia lor poate fi declanşată de anumite semnale biologice sau genetice. Moleculele aceleiaşi familii tind a se cupla una cu alta, în aşa fel încât celulele de acelaşi tip au o adeziune mai mare una cu alta ( în interiorul unui ţesut). Fenomenul se numeşte adeziune homofilă şi este Ca2+-dependentă. Celulele diferite se pot lega şi ele între ele, dar adeziunea va fi întotdeauna mai redusă (adeziuni heterofile). Motilitatea celulară este dependentă de expresia selectivă şi tranzitorie a CAM, ce permite migraţia leucocitelor, a fibroblastelor, a macrofagelor şi a altor celule mobile cu deplasare amoeboidă. Moleculele de adeziune interacţionează şi cu proteinele citoscheletice, pentru a permite modificările de formă şi dimensiune necesare pentru mişcarea celulelor. Moleculele de adeziune pot acţiona ca liganzi pentru diverşi receptori, declanşând inhibiţia de contact, secreţia, motilitatea şi o gamă largă de alte manifestări celulare, deci funcţionează şi ca transportor de informaţie. Familia ICAM (imunoglobulin-CAM) conţine sute de proteine de adeziune ce variază de la unul la 7 domenii transmembranare. Sunt proteine exprimate de celulele cu competenţă imună (leucocite, macrofage, celule dentritice, histiocite, etc) şi mediază fenomenele de marginaţie, adeziune, rulare endotelială, diapedeză şi fagocitoză. Caderinele (Calcium-Dependent Adhesion Proteins) sunt o familie de proteine căreia i s-au identificat până la ora actuală cel puţin 80 de membri. Ele alcătuiesc legături homofile, ce intră în componenţa joncţiunilor de tip aderent şi a desmozomilor. Domeniile lor intracelulare se leagă cu filamentele citoscheletului prin intermediul unor proteine adaptor numite catenine. Caderinele sunt liganzii ce produc inhibiţia de contact. Integrinele sunt principale molecule de adeziune între celule şi matricea extracelulară, fiind capabile de a se asocia cu toate celelalte molecule de adeziune. Sunt de asemenea semnale trofice, lipsa lor în cazul celulelor cultură ducând la oprirea celulelor în G1 şi în cele din urmă la moartea prin apoptoză. O funcţie particulară a integrinelor este de a asigura legătura plachetelor sanguine între ele şi cu moleculele de colagen, în cadrul fenomenelor de agregare şi aderare plachetară (vezi. cap. „Hemostaza”) Selectinele sunt proteinele implicate în fenomenele de aderenţă a leucocitelor circulante (marginaţie), rularea lor pe endoteliu şi în final diapedeză. Selectinele produc aderenţa la mucine, legături foarte puternice 115

FIZIOLOGIE CELULARA

din punct de vedere fizic, dar limitate temporal. Hormonii şi mediatorii inflamatori cresc expresia selectinelor, stimulând infiltrarea ţesuturilor inflamate cu celule fagocitare. 5.10.3. Joncţiunile intercelulare Legăturile între celule şi matricea extracelulară Se realizează prin hemidesmozomi şi contacte focale. Contactele focale (fig. 59) sunt alcătuite din integrine, fixate de citoschelet cu ajutorul unor proteine intermediare numite vinculină, talină, paxilină şi altele şi proteinele matricei extracelulare (fibronectină, colageni, laminine şi vitronectina). Hemidesmozomii sunt similari, cu diferenţa ca interacţiunile au loc între alte caderine şi fibronectină (fig. 60).

Fig. 59. Joncţiune de tip adeziune focală

Fig. 60. Hemidesmozom

116

FIZIOLOGIE CELULARA

Desmozomii Sunt organite ce leagă celulele între ele, mai ales între celulele epiteliale şi musculare. La microscopul electronic arată ca nişte suduri în puncte. Adeziunea celulară se realizează prin interacţiuni homofile între 2 familii de proteine, numite desmogleine şi desmocolline. Domeniile intracelulare ale acestor proteine se cuplează prin intermediul unei proteine numite plakoglobină pe filamentele intermediare ale citoscheletului. Joncţiunile aderente Se realizează prin interacţiuni homofile între caderine. Acestea sunt ranforsate citoscheletic de filamente de actină, pe care se prind prin intermediul unor proteine de legătura. Joncţiunile aderente sunt primele care se dezvoltă între diversele foiţe epiteliale chiar din viaţa embrionară. Joncţiunile strânse Se mai numesc şi zonula occludens. Se distribuie ca o centură în jurul polilor celulari apicali în epiteliile impermeabile, astfel reducând atât difuziunea paracelulară a fluidelor cât şi mişcările celulelor de o parte şi de alta a barierei. Proteinele care formează aceste joncţiuni realizează interacţiuni homofile între moleculele de occludină şi claudină . Joncţiunile comunicante (gap) Transportul de substanţe între celulele adiacente se poate face prin lichidul intercelular (paracrinie) sau prin structuri de tip canal (conexoni), grupate în ceea ce se numeşte joncţiuni comunicante (gap). Un conexon este alcătuit din şase molecule de conexină şi se cuplează cu alt conexon al unei celule adiacente, astfel formând un canal comun (fig. 61), prin care pot trece de la o celulă la cealaltă substanţe cu mase moleculare mici. Aceste substanţe pot fi ioni, precum Na+, Ca2+, sau o serie de substanţe organice, precum ATP sau molecule-semnal. Celulele sunt unite funcţional, pentru a forma un sinciţiu (epitelial, miocardic, glial, etc.) sau se pot forma sinapse electrice. Conexonii permit cuplarea electri117

Fig. 61. Joncţiune gap

FIZIOLOGIE CELULARA

că, adică propagarea variaţiilor de potenţial membranar de la o celulă la alta în cadrul sinciţiului. Conexonii se închid când nivelele Ca2+ sau H+ cresc anormal (leziuni celulare), pentru a izola celula afectată de celulele vecine. 5.11. Traficul celular al membranelor fosfolipidice Fosfolipidele membranare suferă un permanent proces de redistribuţie în cadrul sistemului de membrane al celulei, deoarece permanent au loc procese de endocitoză şi de exocitoză necesare pentru înoirea proteinelor membranare (fig. 62). Prin endocitoză porţiunile de plasmalemă ajung în final în membrana reticulară. In sens invers vezicule de origine reticulară transferă fosfolipide prin aparatul Golgi şi exocitoză la plasmalemă.

Fig. 62. Schema generală a traficului membranelor fosfolipidice

Aparatul Golgi Este parte a sistemului endomembranar; la acest nivel este locul modificării şi sortării proteinelor. Este constituit din discuri cu funcţii şi proprietăţi membranare diferite; principala modalitate de mişcare între discuri este prin vezicule. Aparatul Golgi este alcătuit din

Fig. 63. Organizarea aparatului Golgi

118

FIZIOLOGIE CELULARA

saci membranari numiţi cisterne; de obicei sunt între 5 şi 8, dar uneori au putut fi observaţi până la 60 de saci membranari. In jurul cisternelor principale există un număr de vezicule sferice care au înmugurit din cisterne (fig. 63). Stivele de cisterne au 5 regiuni funcţionale (reţele): reţeaua cisGolgi (CGN); cis-Golgi; Golgi medial; trans-Golgi şi reţeaua trans-Golgi (TGN). Fiecare regiune conţine diferite enzime, care modifică selectiv conţinutul veziculelelor. Aparatul Golgi modifică, sortează şi împachetează substanţele secretate pentru exocitoză sau folosire în celule; modifică proteinele produse de reticulul endoplasmic rugos, este implicat în transportul lipidelor şi formarea lizozomilor. La acest nivel au loc următoarele transformări chimice: glicozilare; fosforilare; adăugare de manozo-6-fosfat la proteinele lizozomale; sinteza de proteoglicani; ataşarea de polizaharizi liniari neramificaţi (glicozaminoglicani) la proteine pentru a forma proteoglicani; sulfatarea proteoglicanilor pentru formarea de acid sialic, heparan-sulfat şi condroitin-sulfat (componenţi de bază ai ţesutului conjunctiv); fosforilarea moleculelor, în special apolipoproteina cu formare de VLDL. La nivelul diverselor discuri ale aparatului Golgi au loc variante de alterări suferite de proteine după cum urmează. La nivelul RE are loc procesarea prin biosinteza unui miez de oligozaharid necesar glicozilării şi ataşarea acestui miez la rezidurile de asparagină. La nivelul CGN are loc iniţierea fosforilării proteinelor lizozomale prin ataşarea N-acetilFig. 64. Ansamblul proteic al veziculei în curs de înmugurire

Fig. 65. Utilizarea sistemului de trafic al fosfolipidelor pentru turnover

119

FIZIOLOGIE CELULARA

galactozamină la serină sau treonină. In cisternele Golgi mediale are loc declanşarea celei de-a doua etapă a fosforilării proteinelor lizozomale prin îndepărtarea manozei; ataşarea de N-acetilglucozamină şi adăugarea de molecule de galactoză şi acid sialic. La nivelul TGN are loc adăugarea de reziduri sulfat la treonină. Materialele sunt transportate între compartimente cu ajutorul veziculelor; veziculele înmuguresc cu ajutorul proteinelor specifice. Proteinele din vezicule comunică pentru a realiza sortarea şi înmugurirea. Semnalele veziculare folosesc manozo-6-fosfatul ca semnal. Cuplarea veziculelor urmăreşte următoarele etape: după formare, îmbrăcămintea veziculară este eliminată; aceasta expune markerii rab şi SNARE ce permit recunoaşterea şi fuziunea cu membrana ţintă. 5.11.1. Reticulul endoplasmic şi sinteza proteinelor Sistemul endomembranar, format din reticul, aparatul Golgi, lizozomi, endozomi şi vezicule de secretorii, este implicat în procesarea proteinelor destinate exocitozei, lizozomilor şi plasmalemei, precum şi a proteinelor ce pătrund în celulă, toate în cadrul unui trafic de membrane fosfolipidice sub formă veziculară, supus unui intens control. O dată ce o proteină din citosol a intrat în acest circuit, nu va mai reveni în citosol, ci va fi direcţionată către un anume compartiment al sistemului de membrane. Rolul bazal al sistemului este de a asigura înlocuirea permanentă a proteinelor din plasmalemă şi endomembrane, în condiţiile asigurării unei corecte direcţionări şi al reglării adaptative a numărului de molecule din fiecare proteină plasate într-o zonă plasmalemală sau endomembranară (vezi fenomenele de control al densităţii receptorilor membranari, cap. 9). Din punct de vedere funcţional sistemul descris se împarte în trei căi: de endocitoză, lizozomală şi de exocitoză (secretorie). Sinteza tuturor proteinelor este realizată practic în citosol de către ribozomi liberi, iar cele destinate căilor secretorie sau lizozomală sunt direcţionate (targeting) spre reticul printr-un semnal de direcţionare, adică o anumită secvenţă de aminoacizi hidrofobi din zona N-t, care se cuplează cu o particulă de recunoaştere (signal recognition particle, SRP), ce este recunoscută de un receptor specific, determinând legarea ribozomului de membrana reticulară şi inserarea polipeptidului prin aceasta în lumenul reticular. Proteinele în cauză pot fi de tip luminal (solubile, nemembranare), destinate secreţiei sau transferului spre lizozomi, sau pot fi 120

FIZIOLOGIE CELULARA

translocate parţial în lumenul reticular, proteinele de tip membranar, destinate organitelor delimitate de membrană sau plasmalemei. Receptorul SRP de care este ataşat ribozomul este şi canal de translocare pentru peptidul sintetizat; după ataşarea ribozomului SRP se detaşează de complex şi se reia translaţia. Proteinele de tip luminal sunt rezultatul separării proteolitice de secvenţa semnal de direcţionare, care rămâne ataşată la membrana reticulară. Proteinele de tip membranar sunt inserate în membrana reticulară la nivelul unor secvenţe hidrofobe, astfel încât domeniile care vor funcţiona ca domenii citosolice să fie de la început plasate în citosol. Când proteina trebuie să aibă mai multe domenii TM aceasta se realizează printr-o succesiune de rutine start-stop privind direcţionarea spre lumenul reticular a secvenţelor peptidice corespunzătoare. Semnalele de tip start sunt fie N-t, fie “interne”, ambele fiind capabile să lege SRP. Acest mecanism de sinteză a proteinelor membranare explică faptul că în citosol se găseşte întotdeauna capătul C-t al proteinelor respective. Evident că dacă o veziculă fuzionează cu alta sau cu plasmalema, această orientare transmembranară se păstrează. 5.11.2. Transportul şi direcţionarea veziculelor Vezicule ce conţin proteine înmuguresc din reticulul endoplasmic şi aparatul Golgi şi ulterior fuzionează cu membrane ţintă (endomembrane sau plasmalema). Veziculele trebuie să ducă încărcătura proteică la destinaţia corectă. Aceasta se realizează în două etape: selecţia şi concentrarea conţinutului vezicular (luminal şi membranar), ca parte a formării veziculei şi direcţionarea propriu-zisă a veziculei spre membrana de destinaţie cu care va fuziona, realizând simultan inserţia proteinelor din membrana veziculară în membrana ţintă şi contopirea conţinutului vezicular cu conţinutul veziculei ţintă sau cu mediul extracelular (deci incluziv inserţia de proteine în plasmalemă şi exocitoza). Cheia primei etape este învelişul vezicular, care poate fi COPI, COPII, sau clatrină. Veziculele învelite cu COP (coat protein, proteină haină) realizează transferul veziculelor între reticul şi Golgi şi în cadrul aparatului Golgi, iar cele învelite cu clatrină sunt specializate pentru transferul între plasmalemă şi endosomi sau Golgi şi plasmalemă. Toate proteinele de înveliş au funcţia de a modela mugurele în formare şi de a capta molecule pentru a fi transportate. Proteinele de înveliş interacţionează între ele pentru a forma configuraţia curbă a mugurelui. 121

FIZIOLOGIE CELULARA

Moleculele cargo sunt preluate de receptorul cargo, o proteină transmembranară, cu situsul de legare în domeniul luminal. Complexul cargo-receptor este recunoscut de adaptină, care se combină cu porţiunea citosolică a ei însăşi, care se leagă de proteine de înveliş. Dinamina “sugrumă” (ATP-depndent) pediculul mugurelui format, care apoi se desprinde sub formă de veziculă liberă. Urmează “dezvelirea” veziculei; proteinele de înveliş şi adaptina sunt eliberate şi reciclate; sunt expuse semnale de interacţiune pentru direcţionarea veziculelor. Ele se mişcă pe distanţe mici prin difuziune, iar pe distanţe mai mari sunt transportate pe microtubuli de kinezine sau dineină. Elementul cheie pentru ancorarea (docking, andocare) veziculei la ţintă este interacţiunea dintre proteinele SNARE veziculare şi cele înalt specifice ale ţintei (v-SNARE şi t-SNARE). Aceste proteine SNARE (SNAP and NSF Attachment Receptors21) există ca perechi complementare în membrana ţintă şi în cea a veziculei de transport. 5.12. Exocitoza ca mecanism secretor Exocitoza constitutivă se desfăşoară continuu în toate celulele, asigurând un flux continuu de vezicule ce furnizează lipide şi proteine pentru înoirea membranară permanentă şi pentru eliberarea de proteine şi glicoproteine componente ale matricii extracelulare. Agregate proteice conţinând proteine destinate exocitozei reglate există în vezicule ce înmuguresc din TGN. Agregarea aceasta este indusă de condiţiile acide din TGN. Astfel se formează cunoscutele vezicule de secreţie dense (dense core secretory granules), vezicule tipice de stocare pentru calea exocitozei controlate, folosită pentru secreţia comandată prin potenţial de acţiune sau în alt mod. Subliniem faptul că maturarea granulelor dense include procese de proteoliză a precursorilor produsului propriu-zis de secreţie. Veziculele cu conţinut dens sunt ancorate la situsuri de eliberare din plasmalemă. Exocitoza propriu-zisă este un proces de fuziune reversibilă între membrana veziculară şi plasmalemă (vezi cap. 6.3), în care complexul proteic de ancorare se transformă în complex de fuziune sub acţiunea unui puternic semnal de calciu citosolic. Acesta poate fi asigurată de influxul de calciu prin canale voltaj-dependente în cursul salvelor de potenţiale de acţiune. 21

Proteina asociată sinaptozomului (synaptosome-associated protein, SNAP); Proteina de fuziune sensibilă la N-etilmaleimidă (N-ethylmaleimide sensitive fusion protein)

122

FIZIOLOGIE CELULARA

6. Transmiterea sinaptică Sinapsele chimice sunt structuri specializate ce asigură transmiterea de mesaje între celule învecinate. Aşa-zisele sinapse electrice sunt de fapt bazate pe joncţiunea celulară comunicantă (nexus, gap-junction), structură proteică transmembranară ce delimitează un por care străbate două membrane adiacente. Ele permit difuzia ionilor de la o celulă la cealaltă, asigurând astfel direct propagarea potenţialului de acţiune. 6.1. Organizarea funcţională a sinapsei Sinapsa “chimică” presupune existenţa unui mediator chimic pentru semnalizarea intercelulară, eliberat în spaţiul sinaptic din teritoriul presinaptic şi acţionând asupra unor receptori specifici prezenţi în membrana postsinaptică. Componenta presinaptică este întotdeauna terminaţia unei prelungiri neuronale de tip axonic. Dacă celula receptoare este un neuron, sinapsa este neuro-neuronală, iar dacă aparţine altui tip celular sinapsa se numeşte neuro-efectoare. Fig. 66. Structura funcţională a sinapsei Etapele transmiterii sinaptice reprezintă tocmai parcursul moleculei semnal. Mediatorul sinaptic (neuromediator) este sintetizat la nivelul butonului terminal sau în ribozomii corpului celular al neuronului. In al doilea caz (neuropeptide), el este transportat cu ajutorul microtubulilor (neurofilamente) de-a lungul axonului. In cele mai multe cazuri eliberarea mediatorului în spaţiul sinaptic se produce prin exocitoză, ceea ce preupune prezenţa sa la nivel presinaptic în vezicule (de exocitoză). Apariţia unui potenţial de acţiune la nivelul butonului terminal (fiziologic prin propagare de-a lungul membranei axonale) determină un influx de calciu voltaj-dependent. Creşterea calciului citosolic la nivel submembranar presinaptic iniţiază fuziunea membranei veziculelor cu mediator, ancorate deja la nivelul situsurilor de eliberare, cu membrana presinaptică, deci exocitoza. Mediatorul eliberat în spaţiul

123

FIZIOLOGIE CELULARA

sinaptic poate fi recaptat la nivel presinaptic, poate fi inactivat enzimatic, poate difuza extrasinaptic. Aceste molecule sunt însă destinate să acţioneze la nivelul membranei postsinaptice, unde cuplarea cu receptori membranari specifici determină un răspuns excitator sau inhibitor. In termeni de potenţial electric transmembranar excitaţie înseamnă depolarizare, iar inhibiţie înseamnă hiperpolarizare, respectiv creşterea sau scăderea probabilităţii de apariţie a unui potenţial de acţiune pe baza fenomenului de sumaţie spaţio-temporală a acestor efecte. Eliberarea cuantală a mediatorului (cantităţi quasiconstante corespunzătoare încărcării veziculelor de exocitoză) face posibilă evidenţierea transmiterii sinaptice cu ajutorul microelectrozilor inseraţi intracelular la nivel postsinaptic, care detectează modificări tranzitorii de potenţial: potenţiale postsinaptice excitatorii, respectiv inhibitorii. Depolarizarea este de obicei rezultatul unui influx de sodiu şi / sau calciu, iar hiperpolarizarea poate fi determinată de eflux de potasiu sau de influx de clor. Multe sinapse folosesc mai mulţi mediatori pentru transmiterea şi modularea semnalului (cotransmisie), dintre care unul este de obicei neurotransmiţătorul principal, iar ceilalţi sunt cotransmiţatori, cu diverse efecte post- şi presinaptice. Chiar transmiţătorul principal poate acţiona pe receptori presinaptici, de obicei în sens auto-inhibitor. Datorită vitezei relativ mici a etapelor componente, transmiterea sinaptică presupune o întârziere, determinată mai ales de difuzia mediatorului. In cazul joncţiunii neuromusculare din muşchiul striat frecvenţa potenţialelor de acţiune din fibra motorie determină cantitatea de mediator eliberată, deci gradul de ocupare a receptorilor postsinaptici nicotinici şi în final, datorită sumaţiei temporo-spaţiale de la nivelul membranei postsinaptice, condiţionează probabilitatea declanşării potenţialelor de acţiune în fibra musculară (respectiv frecvenţa acestora). In cazul sinapselor interneuronale mecanismul integrativ este mult mai complex. Membana corpului celular este în general incapabilă să genereze potenţiale de acţiune; ea va reprezenta suportul sumaţiei spaţio-temporale a tuturor efectelor postsinaptice excitatorii şi inhibitorii, condiţionând frecvenţa de descărcare a potenţialelor de acţiune la nivelul conului de emergenţă al axonului. In joncţiunile neuro-efectoare vegetative, laxe, nu există o specializare strict delimitată ca membrană postsinaptică. Datorită spaţiului larg de 124

FIZIOLOGIE CELULARA

difuziune a mediatorului întreaga membrană a celulei efectoare este sub influenţa neuromediatorilor proveniţi din varicozităţi ale mai multor terminaţii neuronale. In funcţie de echipamentul de canale ionice, răspunsul postsinaptic poate fi o modificare globală a potenţialului membranar sau potenţial de acţiune, dacă este atins pragul într-o regiune membranară. 6.2. Placa motorie Sinapsa neuromusculară (placa motorie, joncţiunea neuromusculară) este un model clasic de studiu pentru transmiterea sinaptică şi de aceea este prezentat aici, ca introducere pentru următoarele detalii privind eliberarea mediatorului şi acţiunile sale, precum şi pentru capitolul de fiziologie a miocitului scheletic. Joncţiunea neuromusculară este o sinapsă cu transmitere chimică, având cele trei componente descrise: segmentul presinaptic, spaţiul sinaptic, membrana postsinaptică. Componenta presinaptică a sinapsei neuromusculare este reprezentat de arborizaţia terminală a axonului motoneuronului α. Terminaţiile axonice acoperite de celule Schwann se întind fiecare de-a lungul unei porţiuni din sarcolemă şi conţin axoplasmă în care se găsesc mitocondrii şi neurofibrile, precum şi numeroase vezicule care conţin acetilcolină. Arborizaţia terminală prezintă numeroşi butoni terminali; porţiunea din membrana neuronală care acoperă aceşti butoni şi se juxtapune perfect cu sarcolema fibrei musculare inervate se numeşte membrană presinaptică Membrana postsinaptică reprezintă o porţiune diferenţiată din sarcolema fibrei musculare juxtapusă membranei presinaptice şi care se prezintă ca un jgheab în care se găsesc numeroşi receptori colinergici de tip nicotinic, ce conţin fiecare câte un canal de sodiu. Intre segmentul pre şi postsinaptic se interpune un spaţiu de aproximativ 100 μm (spaţiul sinaptic), în care se găsesc molecule de acetilcolinesterază. Ansamblul format din membrana presinaptică, spaţiul sinaptic şi membrana postsinaptică este cunoscut sub numele de "placă motorie" sau sinapsă neuromusculară. Mediatorul chimic al joncţiunii neuromusculare este acetilcolina, care se sintetizează în cea mai mare parte la nivelul pericarionului (corpul celular) al motoneuronului α. De la nivelul corpului neuronal acetilcolina este transportată prin fluxuri axonale până la nivelul terminaţiei axonice unde este repartizată în anumite compartimente (liber disponibil şi de depozit) care se află în echilibru dinamic. Compartimentul liber disponibil 125

FIZIOLOGIE CELULARA

conţine pachete de molecule de acetilcolină (~7000 molecule/pachet) în vezicule situate în apropierea membranei presinaptice (de fapt vezicule încărcate şi pregătite pentru ancorare; vezi 6.3) în timp ce compartimentul de depozit se află în profunzimea terminaţiei axonice. In momentul activării motoneuronului α, potenţialul de acţiune generat la nivelul conului de emergenţă este condus până în terminaţiile axonice. Depolarizarea membranei butonului terminal ca urmare a invadării sale de către potenţialul de acţiune crează condiţii pentru deschiderea canalelor de Ca2+ voltaj dependente. Depolarizarea se însoţeşte deci de creşterea rapidă a concentraţiei ionului de calciu în acest sector ceea ce determină migrarea veziculelor cu mediator chimic către faţa internă a membranei terminaţiei axonice şi mai ales fuziunea reversibilă cu aceasta, prin care se realizează eliberarea acetilcolinei în spaţiul sinaptic. Acetilcolina se găseşte în veziculele din terminaţia axonică sub formă de pachete de molecule (quanta) de aceea eliberarea mediatorului este numită quantată. Creşterea concentraţiei calciului în axoplasma terminaţiei activează alte şi alte vezicule care îşi vor deversa conţinutul în spaţiul sinaptic. In acelaşi timp din compartimentul de depozit acetilcolina este mobilizată şi trecută în compartimentul imediat disponibil. Dacă acetilcolina este trecută în cantitate mai mare decât necesarul în compartimentul liber disponibil, aceasta va fi retrecută în compartimentul de depozit. Acetilcolina eliberată din butonii terminali difuzează în spaţiul sinaptic şi ajunge la nivelul membranei postsinaptice, unde se leagă reversibil de receptorii colinergici. Legarea a două molecule de acetilcolină de receptorul nicotinic determină modificări conformaţionale ale proteinei canal din structura acestuia (fig. 34), crescând permeabilitatea sarcolemei pentru ionii de sodiu. Desprinderea acetilcolinei de pe receptori o face accesibilă acetilcolinesterazei care o hidrolizează în colină şi acetat, producându-se astfel inactivarea mediatorului. Colina este recaptată de terminaţia axonică pentru a fi refolosită la sinteza de acetilcolina iar acetatul difuzează în lichidul extracelular. Toate aceste procese se desfăşoară pe parcursul a câtorva milisecunde şi se pot repeta de câteva ori într-o secundă fără pericol de instalare a oboselii. Acetilcolina este eliberată necontenit sub formă de quante din terminaţia presinaptică deci şi în repaus muscular. O quantă de acetilcolina eliberată în repaus muscular din interacţiunea cu receptorii postsinaptici 126

FIZIOLOGIE CELULARA

produce o depolarizare locală rapidă cu o amplitudine de aproximativ 0,4 mV numită "potenţial miniatural". Conducerea potenţialului de acţiune de la nivelul conului de emergenţă al axonului până la terminaţia axonică va creşte procesul de neurosecreţie, numărul de quante de acetilcolină exocitate va spori şi vor produce o depolarizare locală (potenţial postsinaptic excitator) mai amplă iar în momentul atingerii pragului critic se va declanşa un potenţial de acţiune. 6.3. Mecanismul eliberării mediatorilor sinaptici La nivelul butonilor terminali neurotransmiţătorii sunt stocaţi în vezicule cu mediator, care suferă un proces complex de pregătire pentru exocitoză (fig. 67), din care se detaşează ca importanţă faza de iniţiere (priming). In această fază sinapsina este fosforilată de o kinază calciucalmodulin dependentă (CaMKII) şi părăseşte membran veziculară, lăsând vezicula să intre în procesul de direcţionare şi ancorare la situsurile active din membrana presinaptică. Sinaptotagmina, o proteină de trafic membranar, realizează ancorarea iniţială a veziculei la situsul de fuziune, prin interacţiunea sa cu SNAP-25 şi β-neurexina.

Fig. 67. Procesarea veziculelor cu mediator şi eliberarea acestuia în spaţiul sinaptic

127

FIZIOLOGIE CELULARA

Ca2+

1 Sinaptotagmină

2 PIP2

sinaptobrevină SNAP-25 sintaxină

4

3

Fig. 68. Complexul de ancorare se trans-conformează în complex de fuziune, asigurând dinamica porului de fuziune, cu eliberarea neuromediatorului şi iniţierea procesului de reciclare a membranei veziculare (după Chapman E.R.) http://www.nature.com/nrm/journal/v3/n7/full/nrm855.html

Tot sinaptotagmina este cea care, în cadrul complexului proteic de ancorare (fig. 68), funcţionează ca senzor de calciu, iniţiind transformarea calciu-dependentă a complexului de ancorare în complex de fuziune (1-2 în fig. 68). Ulterior, în condiţiile inserţiei de către sinaptotagmină a domeniului său C2B în membrana presinaptică, sinaptobrevina, SNAP-25 şi sintaxina cooperează pentru menţinerea în contact foarte strâns a celor două membrane, fapt care permite formarea treptată a porului de fuziune şi eliberarea neuromediatorului. Reducerea calciului citosolic este sesizată evident tot de sinaptotagmină, care îşi încetează acţiunea şi veziculele nou ancorate în manieră sinapsin-dependentă nu iniţiază fuziunea. In urma fuziunii domeniul C2A al sinaptotagminei se găseşte alături de C2B în aceeaşi porţiune de membrană presinaptică şi este iniţiată formarea endosomului şi reciclarea membranei sinaptice. Pentru fiecare potenţial de acţiune izolat se eliberează mediatorul din ~100 vezicule, dar creşterea frecvenţei potenţialelor de acţiune potenţează cuplarea excitaţie-exocitoză, astfel încât apare o proporţionalitate între frecvenţa excitării şi cantitatea totală de mediator eliberată (pentru aceeaşi durată de activitate). Acest fenomen este explicat doar parţial prin creşterea nivelului de fond al calciului submemranar din regiunea presinaptică; este importantă disponibilitatea crescută a veziculelor pentru ancorare prin efectul de priming (vezi mai sus, fig. 67) dependent de sinapsină, care este fosforilată şi la nivele de calciu citosolic uşor crescute, care au efect minor asupra exocitozei propriu-zise, deoarece sinaptotagmina este sensibilă doar la concentraţii mai mari de calciu (semnale puternice). 128

FIZIOLOGIE CELULARA

6.4. Efectele postsinaptice şi presinaptice ale mediatorilor (pentru detalii vezi cap. Fiziologia sistemului nervos) Tab. 4. Receptorii principalilor neurotransmiţători şi efectele stimulării lor Transmiţător Transmiţător Receptor Efecte Ionotrope Metabotrope

Acetilcolină

ADH Colecistokinină Dopamină GABA Glutamat Aspartat Glicină Histamină Neurotensină Noradrenalină Adrenalină Neuropeptid Y Peptide opioide Ocitocină Purine Serotonină

Somatostatin Tahikinină (tradus şi adaptat după Despopoulos A., Color Atlas of Physiology, Thieme, 2003)

129

FIZIOLOGIE CELULARA

7. Motoarele moleculare şi contracţia musculară Viaţa înseamnă mişcare. Cea mai mare parte a mişcărilor în lumea vie şi realizează cu ajutorul unor minuscule maşinării proteice numite motoare moleculare. Ca definiţie un motor poate fi definit ca un instrument ce consumă energie sub o formă şi o converteşte în mişcare sau lucru mecanic. 7.1. Motoare moleculare Dintre proteinele ce pot fi incluse în această clasă se pot menţiona cele de mai jos, având implicaţii funcţionale mai importante. Proteine care mobilizează molecule includ: polimerazele, actina care este folosită pentru propulsie, topoizomerazele ce reduc supraspiralarea moleculei de ADN, motoarele de împachetare a ADN-ului viral, care îl injectează în capside. Fig. 69. Cuplul tubulină-kinezină

Proteinele motor Sunt proteinele care asigură mişcarea intracelulară, ATP-aze de 100500 kDa, care se ataşează de o încărcătură. Există 2 tipuri: care se mişcă dea lungul microtubulilor, respectiv de-a lungul actinei. Kinezina este o moleculă cu cap dublu care-şi mişcă încărcătura către capul (+) al microtubulilor. Dyneinele au două capete. Dyneina citoplasmică are funcţie similară cu a kinezinei, dar mişcă particulele către capătul (–) al microtubulilor. Dyneina axonemală oscilează permanent şi este responsabilă pentru mişcarea flagelilor şi cililor. Dynamina este responsabilă pentru separarea mugurilor cu clatrină de pe membrana celulară. Miozinele formează punţi transversale cu filamentele de actină. Miozina I este asociată cu actina la nivel subcelular în diverse formaţiuni. Miozina II este forma prezentă în fibrele musculare striate, sub formă de filamente groase fiind asociată cu filamentele subţiri de actină în miofibrile cu sispoziţie sarcomerică a miofilamentelor (vezi cap. 7.2) 7.2. Fiziologia miocitului striat scheletic Muşchii sunt organe care transformă energia chimică în energie mecanică. Celulele musculare se numesc striate sau netede, după aspectul 130

FIZIOLOGIE CELULARA

microscopic în secţiune longitudinală, dat de prezenţa sau respectiv absenţa unei organizări sarcomerice a miofilamentelor de actină şi miozină. Proprietăţile muşchilor sunt comune cu alte ţesuturi vii (excitabilitate, elasticitate) şi specifice (contractilitate, tonicitate). Muşchii scheletici sunt muşchi striaţi, reprezintă ~40% din greutatea unui adult şi sunt elementul activ al aparatului locomotor. Funcţiile musculaturii scheletice cuprind deplasarea corpului şi segmentelor sale în cadrul unor activităţi motorii reflexe şi voluntare (inclusiv acte comportamentale complexe ca gestualitatea, mimica şi vorbirea), precum şi participarea la funcţii vegetative (respiraţie, prin realizarea ventilaţiei pulmonare de către muşchii respiratori; digestie şi excreţie prin sfincterele striate, aflate sub control somatic, voluntar). Fibrele musculare scheletice sunt celule multinucleate cu diametrul de 8 μm şi câţiva centimetri lungime. Celulele musculare funcţionează relativ independent şi sunt aranjate în paralel (forţa totală produsă de muşchi este egală cu suma forţelor generate de celule). Numărul de celule este invariabil de la naştere, modificându-se doar volumul, în funcţie de vârstă, antrenament, nutriţie. Celula musculară este alcatuită din: membrană celulară (sarcolema), citoplasmă (sarcoplasma) şi mai mulţi nuclei periferici. Fig. 70. Morfologia musculară Alcătuirea muşchiului scheletic, de la nivel de organ, la nivel de miofilamente (stânga). Dispunerea miofilamentelor de actină şi miozină, privită în secţiune longitudinală (inclusiv reperele sarcomerului) şi transversală (jos)

131

FIZIOLOGIE CELULARA

7.2.1. Filamentele de miozină şi actină Aspectul striat se datorează faptului că miofibrilele sunt astfel organizate încât există o alternanţă de zone transversale întunecate (anizotrope, A) şi clare (luminoase, izotrope, I), vizibile la microscopul optic (fig. 70). La mijlocul discului clar se găseşte membrana Z, iar în centrul discului întunecat există banda H, aceasta prezentând la rândul său o linie centrală M, ce se evidenţiază numai în timpul contracţiei musculare. La microscopul electronic, aceste benzi izotrope şi anizotrope apar formate din miofilamente groase de miozină şi subţiri de actină. Discul clar este format din miofilamente de actină şi are o lungime de 1μm. Miofilamentul de actină are două extremităţi: una dintre ele pătrunde printre miofilamentele de miozină, iar cealaltă este fixată prin împletire pe membrana Z. Discul clar (două semidiscuri, de o parte şi de alta a membranei Z) are lungimea de 2 μm. Miofilamentele de miozină formează discul întunecat (1,5 μm). Aceste miofilamente sunt agregate moleculare cilindrice, cu o serie de proiecţii laterale. Excepţie face o zonă netedă centrală, de 0,2 μm, si o porţiune mijlocie a acestei zone îngroşată, reprezentând stria M. Sarcomerul este porţiunea cuprinsă între două membrane Z succesive, conţine un disc întunecat central şi două semidiscuri clare la extremităţi, şi reprezintă unitatea morfo-funcţională a miofibrilei. Lungimea sarcomerului depinde de starea funcţională a muşchiului.In stare de repaus sarcomerul are lungimea de 2,2 μm. In această situaţie filamentele de actină pătrund parţial printre cele de miozină, până la limita zonei centrale, unde lipsesc proiecţiile laterale (zona clară H, cu lungime de 0,2 μm). Intinderea prin tracţionare a muşchiului are ca efect ieşirea filamentelor de actină în afara discului întunecat şi alungirea discului clar; zona H se măreşte. In timpul contracţiei musculare filamentele de actină pătrund printre cele de miozină, în interiorul discului întunecat, se micşorează discul clar, stria H dispare, iar stria M devine evidentă (la nivelul ei filamentele de actină se suprapun). Din punct de vedere chimic, miofilamentele care alcatuiesc aparatul contractil miofibrilar sunt alcatuite din proteine contractile fundamentale (actina şi miozina) şi reglatoare (troponina, tropomiozina, α şi β actinina). Miozina ca filament este un polimer; 200 de monomeri alcătuiţi fiecare din 6 lanţuri polipeptidice, 2 grele (200 kDa) şi 4 uşoare (20 kDa), cu o configuraţie caracteristică de “crosă de golf” (fig. 71). Cele două lanţuri 132

FIZIOLOGIE CELULARA

grele longitudinale răsucite în dublu helix formează mânerul sau corpul. Extremităţile au forma de dublu cap polar cu structura globulară (legat de corpul moleculei printr-un scurt lanţ polipeptidic helicoidal) la care sunt ataşate 2 lanţuri uşoare. Fiecare dintre cele două capete polare are activitate ATP-azică şi afinitate pentru actină. Porţiunea longitudinală a moleculei este meromiozina usoara (LMM), iar capetele polare şi lanţul peptidic de legatura formează meromiozina grea (HMM). Pe lanţul peptidic care leagă capul polar de corpul moleculei există una sau două zone de flexibilitate moleculară, care au primit denumirea de “balama”, capul polar putând avea înclinaţii diferite faţă de corpul moleculei. Structura supramoleculară ordonată a filamentului gros este conferită de subunităţile LMM care se alătură longitudinal, alcătuind un cilindru gros, cu extremităţile libere ale moleculei orientate spre mijlocul filamentului şi capetele polare proeminând din această structură pe un traiect spiralat. Aceasta creează un aspect de “fascie romană”. Fig. 71. Molecula de niozină

Filamentul subţire este format din actină fibrilară (F), un polimer (dublu helix) format din subunităţi de actină globulară (G), cu greutate moleculara de 47 kDa. Filamentul de tropomiozină (dublu helix) rezultă din polimerizarea longitudinală a unor molecule de tropomiozină şi este legat de actină, fiind situat în şanţurile dintre cele două spirale ale filamentului subţire. In repaus tropomiozina acoperă fizic zonele active ale actinei, impiedicând interacţiunea cu miozina. Troponina este formată din trei subunităţi globulare situate la intervale regulate din lungimea filamentului de actina (40 nm). Se descriu: troponina T cu afinitate pentru tropomiozina, troponina I intermediară cu afinitate pentru actina, şi troponina C cu afinitate pentru ionii de calciu. 133

FIZIOLOGIE CELULARA

7.2.2 Mecanismul molecular al contracţiei în miocitul scheletic Contractilitatea fibrei musculare reprezinta proprietatea acesteia de a transforma energia chimica potenţială în energie mecanică şi de a dezvolta o tensiune la capetele sale, cu sau fără scurtarea muşchiului. La realizarea contracţiei musculare participa direct sistemul contractil şi sistemul de cuplare a excitaţiei cu contracţia, procesul fiind susţinut de sistemul energogen. Celula musculară este dotată cu un aparat contractil specific, cu organizare sarcomerică. Fixarea calciului pe troponina C are ca efect descoperirea zonelor active de pe filamentele de actină, permiţând fixarea capului polar al miozinei. Prin activarea ATP-azei miozinice se modifică încărcarea capului polar care, atras de corpul filamentului de miozină, determină flexia punţii transversale spre interiorul discului intunecat (fig. 72). Actina antrenată în această mişcare alunecă spre mijlocul sarcomerului, care astfel se va scurta (mecanism glisant). Desfacerea punţii transversale duce la revenirea în poziţie perpendiculară pe direcţia filamentului de miozină, refăcând o nouă legătură cu locusul următor de pe actină. Procesul încetează şi are loc relaxarea fibrei musculare când scade concentraţia calciului liber din sarcoplasmă la nivelul de repaus.

Fig. 72. Ciclarea punţilor transversale actină-miozină

Forta dezvoltată de muşchi este proporţională cu rata ciclării punţilor transversale. Lipsa ATP-ului este o situaţie anormală, când ciclul se opreşte şi se formează un complex permanent actină-miozină, ca în rigiditatea cadaverică sau în contractura fiziologică din oboseala musculară. Aceste fenomene se mai explică şi prin acumularea ionului de calciu în sarcoplasmă datorită ineficienţei pompelor de Ca2+. 134

FIZIOLOGIE CELULARA

7.2.3. Stimulul fiziologic pentru contracţia muşchiului scheletic Excitabilitatea muşchiului striat reprezintă proprietatea acestuia de a răspunde la un stimul prin contracţie, bazată pe generarea la nivel sarcolemal a unui potenţial de acţiune. Fibra musculară scheletică prezintă o sarcolemă cu permeabilitate selectivă şi deci polaritate electrică. Potenţialul membranar de repaus este cuprins între -70 şi -90 mV. Stimulul fiziologic pentru contracţia muşchiului scheletic este impulsul nervos din motoneuronii de tip α din coarnele anterioare ale substanţei cenuşii a măduvei spinării şi din nucleii somatomotori ai nervilor cranieni. Unitatea motorie este formată dintr-un astfel de motoneuron şi toate fibrele musculare scheletice pe care acesta le inervează. Mediatorul chimic ce asigură transmiterea sinaptică în joncţiunea neuromusculară (placă motorie) din muşchiul striat scheletic este acetilcolina (ACh) (vezi cap. 6.2). Ea acţionează la nivelul membranei postsinaptice prin receptori colinergici de tip nicotinic (N). Fiecare receptor de acest tip conţine un canal de sodiu, care se deschide prin legarea ACh. Influxul de sodiu determină depolarizare locală (potenţial postsinaptic excitator), care prin sumaţie spaţio-temporală poate duce la deschiderea canalelor de sodiu voltaj dependente din sarcolema obişnuită învecinată, cu declanşarea unui potenţial de acţiune. ACh este inactivată prin scindare de către acetilcolinesterază şi colinesteraze nespecifice. Legea “tot sau nimic”este valabilă pentru o singură unitate motorie sau fibră musculară. Muşchiul fiind format din mai multe unităţi motorii, are o excitabilitate heterogenă. Există astfel posibilitatea de gradare a efectului mecanic la creşterea intensităţii de stimulare, datorită recrutării progresive a unităţilor motorii. Pe durata PA la nivelul fibrei musculare intervenţia unor noi stimuli are consecinte diferite în funcţie de momentul acţiunii. Dacă stimulul acţionează în timpul depolarizării, acesta va ramâne fără răspuns. Fibra musculară se comportă diferit la acţiunea noilor excitanţi datorită existenţei perioadei refractare absolute şi relative. 7.2.4. Cuplarea excitaţiei cu contracţia Mesajul contractil este declanşat de factori endogeni (neuroumorali şi metabolici) sau exogeni (stimuli somato-senzitivo-senzoriali) şi este condus sub formă de impuls nervos la unităţile motorii. Activarea motoneuronului α se poate realiza pe cale reflexă (arc reflex) sau voluntară (cortico-medulară). 135

FIZIOLOGIE CELULARA

Impulsul nervos eliberează mediatorul chimic (ACh) la nivelul plăcii motorii. Depolarizarea membranei postsinaptice de către ACh determnă generarea unui potenţial de acţiune propagat, ce are ca efect eliberarea Ca2+ în sarcoplasmă şi astfel cuplarea excitaţiei cu contracţia. La nivelul zonei de contact între tubii T şi cisternele terminale ale reticulului sarcoplasmic (triadă) există numeroase conexiuni şi canale. Mecanismul esenţial de eliberare a calciului din reticul este prin deschiderea unor canale dependente de calciul citosolic (receptori pentru ryanodină de tip RyR1; vezi cap. 5.9.18). Deşi aceste canale sunt îndeobşte utilizate pentru CICR, în acest caz activarea lor nu se face de către calciul extravezicular. Există o cuplare directă a RyR1 cu o proteină plasmalemală care joacă rol de senzor de voltaj. Aceasta este subunitatea α1 a canalelor de tip L (CaL). Astfel, în timpul potenţialului de acţiune acest senzor de voltaj deschide RyR2, iar calciul eliberat se constituie ca element declanşator pentru CICR în avalanşă, ducând la un semnal citosolic de calciu global, de amplitudine mare, sinergic în ce priveşte activarea mecanismului contractil. Un singur potenţial de acţiune are ca efect eliberarea calciului suficient pentru declaşarea mecanismului contractil, dar acesta este foarte rapid pompat înapoi în reticul, înainte ca muşchiul să dezvolte forţa maximă, astfel că efectul contractil este tranzitoriu. Secusa este contracţia tranzitorie submaximală ca răspuns la un singur potenţial de acţiune. Potentialele de acţiune repetitive produc sumaţie temporală, conducând la tetanos parţial sau complet; contracţiile succesive fuzionează şi nu se mai disting ca secuse; concentraţia citosolică a calciului se menţine deasupra nivelului necesar cuplării excitaţie-contracţie. După atingerea frecvenţei critice de stimulare necesare tetanizării, orice creştere ulterioară a acesteia nu este urmată decât de creşteri mici ale forţei de contracţie. Contracţia musculară sheletică fiziologică este tetanosul. 7.2.5. Factori ce influenţează forţa de contracţie Elasticitatea reprezintă capacitatea muşchiului de a se alungi şi de a reveni la dimensiunile iniţiale, după încetarea acţiunii forţei de întindere. Aceasta proprietate are rol în evitarea rupturilor musculare ca urmare a contraţiilor bruşte. Dacă forţa de întindere depăşeşte o anumită limită, efectul este deformarea. La întinderi mai mari de ~3 ori decât lungimea de echilibru, muşchiul se rupe. Troficitatea musculară este specifică ţesutului 136

FIZIOLOGIE CELULARA

Fig. 73. Relaţia dintre lungimea sarcomerului şi forţa de contracţie

muscular în stare de funcţionare optimă, fiind urmarea unei stimulări permanente neuro-musculare prin influxuri nervoase. Tonusul muscular este starea permanentă de tensiune uşoară a oricărui muşchi în repaus. Forţa generată de un muşchi depinde de grosimea şi lungimea musculară, particularităţi de inserţie, tipul de fibre musculare (lente sau rapide), viteza de scurtare, gradul de oboseală. După condiţiile mecanice contracţiile musculare sunt: - izotonice; cu realizare de lucru mecanic şi deplasarea segmentelor corporale, caracteristice pentru majoritatea activităţilor motorii (mers, alergare, ridicare de greutăţi); - izometrice; lungime constantă deci mobilitate nulă, caracteristice pentru activitatea musculară posturală. Pentru acelaşi muşchi forţa de contracţie depinde de lungimea de repaus, în primul rând datorită gradului variabil de suprapunere a filamentelor de actină şi miozină funcţie de lungimea sarcomerului (fig. 73) Tipuri de fibre musculare scheletice După durata contracţiei, muşchii sunt rapizi sau lenţi, în funcţie de rolul muşchiului respectiv. In cazul muşchilor oculari o secusă durează 1/40 s, la gastrocnemian 1/15 s, iar la solear 1/5 s. Muşchii oculari au ca funcţie 137

FIZIOLOGIE CELULARA

fixarea ochilor asupra obiectelor privite, de aceea mişcarea ochilor trebuie să fie rapidă. Muşchiul gastrocnemian este adaptat alergării, săriturilor, în timp ce muşchiul solear se contractă lent continuu, pentru a realiza funcţia de suport a corpului împotriva gravitaţiei. Abilităţile aerobe sau anaerobe depind de tipul de fibră musculară. Din acest punct de vedere fibrele musculare se clasifică în: fibre de tip I, rapide, adaptate la respiraţie anaerobă şi fibre de tip II, lente, adaptate la respiraţie aerobă. In timpul activităţii musculare sunt folosiţi glicogenul muscular şi glucoza sanguină ca surse de energie suplimentare pe lângă acizii graşi. In timpul unei contracţii susţinute, ATP poate fi utilizat mai rapid decât producţia acestuia. Fibrele musculare se pot clasifica în funcţie de viteza de contracţie (timpul până la atingerea tensiunii maxime) în fibre rapide (I) şi fibre lente (II). Aceste diferenţe sunt asociate cu ATP-aze miozinice diferite (izoenzime rapide şi lente). Muşchii extraoculari de exemplu, sunt formaţi din fibre rapide, atingând tensiunea maximă în 7,3 ms, în timp ce muşchiul solear, ce conţine fibre lente, necesită 100 ms pentru a atinge tensiunea maximă. Alte caracteristici pentru fibrele lente, de tip I sunt: o capacitate mare de respiraţie aerobă, un număr mare de capilare, mitocondrii şi enzime respiratorii în cantitate crescută, ca şi mioglobina, de unde denumirea de “fibre roşii”. Fibrele rapide II au capilare şi mitocondrii puţine, şi mioglobină puţină, de aceea se numesc “fibre albe”. Aceste fibre sunt adaptate la respiratia anaerobă, cu o rezervă de glicogen şi enzime glicolitice importante. In afara de aceste două categorii există şi fibre de tip intermediar, rapide dar cu o capacitate mare aerobă. Rata de conducere a motoneuronilor care inervează fibrele rapide este mai mare ( 80-90 m/sec) decât în cazul fibrelor lente (60-70 m/sec). Tipul de fibre poate fi determinat în ţie de motoneuron. Toate fibrele musculare inervate de acelaşi motoneuron (care fac parte din aceeaşi unitate motorie ) sunt de acelaşi tip. Mărimea unităţilor motorii diferă; cele care contin fibre lente sunt mai mici. Unitatile motorii mici, cu fibre lente, sunt folosite mai des în activităţi de rutină. Unităţile motorii mari, cu fibre rapide, care pot sa genereze forţă mare, obosesc repede şi de aceea sunt folosite mai rar şi pe perioade scurte de timp.

138

FIZIOLOGIE CELULARA

Oboseala musculară Oboseala este o stare indusă de efortul susţinut şi prelungit, asociată cu scăderea excitabilităţii, forţei şi duratei contracţiei musculare. Aceasta se explică prin scăderea numărului de unităţi motorii antrenate în actul motor. Scade şi capacitatea de scurtare a fiecărei fibre. In timpul unei contracţii maximale susţinute, când toate unităţile motorii sunt folosite, rata influxului nervos este maximă, având ca efect acumularea K+ extracelular şi reducerea potenţialului fibrei musculare. In aceste condiţii scade abilitatea de a se produce potentialul de acţiune, dar oboseala durează puţin timp. După circa un minut tensiunea maximă poate fi produsă din nou, revenind capacitatea de producere a potenţialului de acţiune. Oboseala din timpul exerciţiilor moderate cu contracţii ritmice se produce datorită faptului că fibrele lente nu mai au rezerve de glicogen. In aceasta situaţie sunt recrutate din ce în ce mai multe fibre rapide. Acestea obţinând energia necesară prin metabolism anaerob, prin conversia glucozei în acid lactic, scade pH-ul intracelular. Aceste efecte la rândul lor inhibă activitatea unor enzime glicolitice cheie, astfel încât rata de producere a ATP este redusă. Scăderea ATP duce la oboseală din cauza interferenţei cu cuplul excitaţie-contracţie (cu cantităţi insuficiente de Ca2+ în reticulul sarcoplasmic, cuplarea excitaţie-contracţie nu poate fi realizată). Acesta pare a fi un mecanism de protecţie, iar dacă ATP ar fi semnificativ scăzut muşchiul ar intra într-o stare de tip rigor mortis. In timpul unui antrenament susţinut, preluarea maximă de oxigen este de 50 ml/min/kg la barbaţi, iar la femei cu 20% mai puţin. La atleţii de performanţă preluarea maximă de oxigen este superioară, în jurul valorii de 85 ml/min/kg. La nivele relativ mici de efort, cu consum de oxigen sub 50% din valoarea maximă, energia pentru contracţia musculară este obţinută mai ales prin metabolism aerob. Metabolismul anaerob, cu producere ulterioară de acid lactic, contribuie la realizarea energiei necesare creşterii performanţei fizice. Tipul de fibre musculare este determinat de inervaţie, de aceea prin antrenament tipul de fibră musculară nu se poate schimba. Fibrele se pot adapta prin antrenament, sporindu-şi cantitatea de mioglobină şi de enzime aerobice respiratorii; preluarea oxigenului poate fi crescută cu 20%. Fibrele îşi sporesc şi conţinutul de trigliceride, o sursă alternativă de energie, pentru a salva stocurile de glicogen.

139

FIZIOLOGIE CELULARA

Antrenamentele (contracţii musculare frecvente, contra unei rezistenţe mari) produc dezvoltarea musculaturii prin hipertrofie. Creşte mărimea celulelor, nu şi numărul; creşte diametrul fibrei prin sinteza de miofibrile noi. Hiperplazia (formarea de celule noi) este puţin importantă şi limitată. 7.2.6. Explorarea activităţii electrice a muşchiului scheletic Electromiografia (EMG) este o metodă de investigare ce studiază activitatea bioelectrică a muşchiului striat în stare de repaus sau de contracţie în condiţii normale sau patologice. Electromiografia se clasifică în: EMG globală, la nivel de muşchi, efectuată cu electrozi de suprafaţă, şi EMG elementară, la nivel de unitate motorie, care utilizează ace-electrod. Lanţul de măsură folosit cuprinde electrozii, sistemul de fitrare, sistemul de amplificare, oscilograf catodic pentru vizualizare / înregistrare (eventual şi redare acustică). Traseele EMG cuprind următoarele aspecte: - lipsa activităţii bioelectrice în repaus (linie izoelectrică), - traseu simplu la o contracţie uşoară (potenţiale de unitate motorie), - traseu intermediar la o contracţie medie (potenţiale de UM cu amplitudine şi frecvenţă mai mare), - traseu de interferenţă la o contracţie maximă (nu mai pot fi distinse potenţiale de UM), - ritm Piper la contracţie maximală cu contrarezistenţă (sinusoide). EMG de stimulo-detecţie examinează excitabilitatea şi conductibilitatea ansamblului neuromuscular la bolnavii paralizaţi, la pacienţii care nu colaborează şi simulează deficienţe motorii; stabileşte: - intensitatea de curent necesară stimulării fibrelor senzitive şi motorii, - timpii de latenţă, - viteza de conducere a influxului nervos în fibrele senzitive şi motorii, - particularităţile potenţialelor evocate motorii M (se stimulează nervul în două puncte ale traiectului şi se culege potenţialul motor M în unul din muşchii inervaţi) şi senzitivo-motorii H (potenţial evocat muscular care apare la stimularea fibrelor senzitive ale unui nerv după un timp de latenţă mult mai lung decât pentru potenţialul M; excitaţia parcurge arcul reflex).

140

FIZIOLOGIE CELULARA

7.3. Fiziologia miocitului neted Musculatura netedă are un rol important în organism, intrând în componenţa căilor respiratorii, digestive, urinare şi a vaselor sanguine. In organism muşchiul neted este localizat vascular sau non-vascular; în peretele viscerelor cavitare (gastro-intestinal, traheo-bronşic, ureterovezical, tubar-uterin) sau în structurile globului ocular (iris, muşchi ciliar). 7.3.1. Clasificare şi organizare tisulară Muşchiul neted are structură şi funcţii diferite muşchiului scheletic; nu prezintă aspectul striat caracteristic acestuia. Aceşti muşchi nu se inseră pe oase, iar forţa dezvoltată sau scurtarea acestora asigură motilitatea organelor interne. Muşchii netezi se clasifică în viscerali (unitari) şi multiunitari, după sinciţialitate şi caracterele joncţiunii neuromusculare. Muşchiul neted unitar formează sinciţii funcţionale (masă citoplasmatică rezultată din unirea mai multor celule, cu existenţa mai multor “punţi” intercelulare). Fibrele sunt unite în fascicule musculare, iar membrana lor intră în contact, formând joncţiuni (nexus, gap junction) ce permit fluxuri ionice intercelulare. Aceşti muşchi se numesc unitari pentru că fibrele musculare nu au inervaţie motorie individuală. Excitaţia se propagă de la o fibră la alta, cuprinzând porţiuni mari de muşchi (sau tot muşchiul) care acţionează ca o unitate. Muşchii unitari pot prezenta şi activitate automată, independentă de inervaţie (de exemplu muşchii din tubul digestiv, căile biliare, uretere, uter, trompele uterine). Muşchiul neted multiunitar este inervat de terminaţii nervoase individualizate ce controlează activitatea contractilă (exemple: muşchii ciliari, iris, muşchii piloerectori, parţial muşchiul neted vascular). Muşchiul neted este format din fibre mici (5-20 μm lungime şi 2-5 μm diametru). Celula musculară netedă este uninucleată. In pereţii organelor interne celulele musculare nu funcţionează independent, existând o interdependenţă celulară, datorită conectării celulare în serie şi în paralel. Muşchiul neted este dispus în straturi de formă tubulară (căi respiratorii, vase) sau în formă de sac. Celulele musculare sunt aşezate fie circumferenţial (circular); contracţiile acestor muşchi scad diametrul tubular şi cresc rezistenţa la curgerea conţinutului fluid fie circular şi longitudinal (dublu strat), structură mai complexă necesară acţiunilor mecanice (de exemplu, tractul digestiv); coordonarea acestora se face prin intermediul sistemului nervos local autonom din plexurile existente între cele două 141

FIZIOLOGIE CELULARA

straturi. La nivelul organelor interne, celulele musculare sunt separate de conţinutul acestor organe prin intermediul altor elemente celulare, constituind structuri tisulare de tip epitelial şi conjunctiv. Structura miocitelor netede este similară fibrelor musculare striate fiind alcătuite din miofilamentele de actină şi miozină fără o dispoziţie regulată. Printre filamentele de actină se găsesc împrăştiate rarele filamente de miozină. Celula musculară netedă mai posedă aparat Golgi, reticul endoplasmic rugos, mitocondrii şi un nucleu unic. In fibra musculara netedă, membranele Z sunt înlocuite de corpi denşi (locuri de ancorare pentru filamentele subţiri). O parte din corpii denşi sunt ataşaţi de membrana celulară, alţii sunt dispersaţi în interiorul celulei (fig. 74). Unii dintre corpii denşi sunt ataşaţi la membrana celulară adiacentă, fiind legaţi între ei prin punţi proteice intercelulare, având rol în transmiterea forţei de contracţie de la o celulă la alta. Intre filamentele subţiri există filamente intermediare (filamină, desmină şi vimentină).

placă densă

integrină

paxilină

actinină vinculină miozină

α-actină leiomodină tropomiozină

desmină

caldesmon

α- actinină corp dens

Fig. 74. Organizarea citoscheletului în miocitul neted se bazează pe asocierea celor două domenii fibrilare ce conţin actină, cel “citoscheletic” (filamină-actină-desmină) longitudinal şi cel “contractil” (actină-miozină) oblic.

Inervaţia muşchiului neted se poate clasifica în două categorii: extrinsecă (aparţinând sistemului nervos vegetativ, simpatic şi parasimpatic) şi intrinsecă (plexuri nervoase). Aici există neuroni aferenţi senzoriali 142

FIZIOLOGIE CELULARA

implicaţi în variate reflexe locale (ca în tractul gastro-intestinal). Inervaţia muşchiului neted visceral este realizată prin terminaţii nervoase prezentând varicozităţi ce conţin vezicule cu neurotransmiţători; spaţiul de difuzie spre fibrele musculare este mare, consecinţa fiind un răspuns difuz pe o porţiune mare. Inervaţia muşchiului neted multiunitar se realizează prin joncţiuni neuromusculare comparabile ca funcţie cu cele din muşchiul scheletic. Acestea se numesc joncţiuni de contact şi se caracterizează prin existenţa unui spaţiu sinaptic şi a unui răspuns limitat. Muşchii netezi pot fi stimulaţi prin mecanism nervos, cu producerea depolarizării şi uneori a potenţialelor de acţiune. Hormonii locali şi unele substanţe farmacologic active cu receptori specifici activează contracţia prin creşterea calciului citosolic pe alte căi decât generarea de potenţiale de acţiune şi uneori cu o depolarizare minoră sau chiar în absenţa acesteia. Activitatea majorităţii muşchilor netezi este controlată prin realizarea unei combinaţii ce se realizează între elemente nervoase şi diverse grade de producere şi acţiune a activatorilor şi inhibitorilor non-neuronali (locali şi hormonali). Acetilcolina este un transmiţător excitator al fibrei musculare netede din unele organe şi inhibitor în alte organe. De obicei fibrele excitate de acetilcolina sunt inhibate de noradrenalină şi invers, în funcţie de receptorii de la nivelul membranei musculare, care controlează canale ionice sau alte mecanisme excitatoare sau inhibitoare. Contractilitatea muşchiului neted trebuie neapărat privită ţinând seama de sinciţialitate, care însă este mult mai complexă decât în miocard deoarece implică şi endoteliul. Calciul şi moleculele mici (inozitol-trifosfat, nucleotide ciclice) pot trece prin joncţiunile comunicante (gap); cuplarea homocelulară permite amplificarea şi prelungirea semnalului de calciu, iar cea heterocelulară (cu celulele endoteliale) poate avea efecte modulatoare deosebit de complexe. 7.3.2. Potenţialul membranar In stare de repaus, potenţialul de membrană al fibrei musculare netede este cuprins între -50 şi -60 mV (cu 30 mV mai puţin negativ decât în muşchiul striat). Potenţialul de acţiune poate fi cu vârf (spike) sau cu platou. Potenţialul de acţiune cu vârf, similar celui din muşchiul scheletic, durează 10-15 ms, este caracteristic muşchiului neted visceral şi poate fi declanşat de mediatori de origine neuronală, locală sau sanguină, precum şi spontan. 143

FIZIOLOGIE CELULARA

Potenţialul de acţiune în platou se caracterizează prin întârzierea repolarizării cu câteva sute sau mii de ms (asemănător fibrei musculare miocardice) datorită kineticii mai lente a canalelor de calciu faţă de cele de sodiu. Depolarizarea în muşchiul neted apare şi sub formă de unde lente, cu variaţiile asociate ale excitabilităţii, adică ale probabilităţii de declanşare spontană sau stimulată a potenţialului de acţiune. Unda lentă nu este potenţial de acţiune, ci o variaţie locală a potenţialului membranar cu aspect sinusoidal cauzată de variaţiile ciclice ale activităţii pompei de sodiu sau ale conductanţei unor canale ionice. Undele lente nu pot cauza singure contracţia, dar pot iniţia potenţialul de acţiune, atunci când potenţialul de membrană ajunge la valoarea de -35mV. Acesta reprezintă pragul de descărcare al potenţialului de acţiune; este generat un potenţial de acţiune care se propagă şi are loc contracţia musculară în masă. Contracţiile de acest tip sunt ritmice (numite şi unde pace-maker), caracteristice de exemplu intestinului. Depolarizarea determinată de întindere facilitează apariţia potenţialului de acţiune pe fond de unde lente, determinând o reacţie de contracţie automată a organelor cavitare la întindere. Muşchiul neted multiunitar se depolarizează de obicei sub acţiunea stimulilor nervoşi, fără generarea unui potenţial de acţiune; se produce doar o depolarizare locală sub acţiunea mediatorului chimic nervos (potenţial joncţional), care se propagă electrotonic, producând contracţia. Cea mai mare parte a activităţii contractile a muşchiului neted se pare că este iniţiată fără potenţial de acţiune, sub influenţa unor factori stimulatori care nu acţionează pe cale nervoasă, ci direct asupra fibrei musculare, prin mecanisme de creştere a calciului citosolic şi de senzibilizare la calciu a mecanismului contractil. Aceşti factori stimulatori sunt factori tisulari locali şi diferiţi hormoni; mecanismul de acţiune este inhibarea canalelor de calciu, sau activarea canalelor de potasiu (efluxul de potasiu determinând hiperpolarizare, cu scăderea excitabilităţii). 7.3.3. Mecanismul general al contracţiei muşchiului neted Mecanismul contracţiei muşchiului neted este diferit comparativ cu cel al muşchiului striat. In timp ce mecanismul de cuplare excitaţiecontracţie la muşchiul striat este dependent de actină, la muşchiul neted este dependent de miozină. In muşchiul striat creşterea calciului înlătură inhibiţia exercitată de complexul troponină-tropomiozină asupra interacţiei actină144

FIZIOLOGIE CELULARA

miozină. In muşchiul neted în repaus miozina are afinitate scăzută pentru actină; pentru a se produce contracţia este necesară activarea miozinei prin fosforilarea lanţului uşor al miozinei de către o kinază specifică, activată de complexul calciu-calmodulină. Creşterea calciului citosolic se realizează în special prin intrare din mediul extracelular, dar şi prin eliberare din reticulul sarcoplasmic. Canalele de Ca2+ sunt de două categorii: receptor operate şi voltaj dependente. Se descrie un mecanism de eliberare a ionului de Ca2+ de la nivelul reticulului sarcoplasmic, cu intervenţia mai multor factori, printre care un mesager secund, inozitol 1, 4, 5, trifosfat (IP3), care se cuplează cu receptori specifici din membrana reticulară, determinând eliberarea calciului sau facilitând efectul de eliberare produs de calciul citosolic. IP3 mai poate fi generat şi de stimuli ce acţionează la nivel de sarcolemă, prin intermediul unor receptori cuplaţi cu o proteină G. Aceasta activează fosfolipaza C, cu hidrolizarea fosfatidil inozitol bifosfatului (PIP2) şi formare de IP3 şi diacilglicerol (DAG). Relaxarea se produce prin scăderea Ca2+ citosolic. Acest proces se realizează prin implicarea pompei de Ca2+ plasmalemală, pompei de Ca2+ reticulare, schimbului Na+/ Ca2+ plasmalemal. 7.3.4. Fluxurile de calciu în miocitul neted In celulele musculare netede cuplarea dintre excitaţie şi contracţie este asigurată de creşteri ale concentraţiei citosolice de calciu. La fel ca în alte tipuri celulare, această concentraţie este în domeniul submicromolar în repaus, fiind menţinută prin permeabilitatea extrem de redusă a plasmalemei pentru calciu, combinată cu activitatea mecanismelor de extruzie a calciului, respectiv pompa de calciu plasmalemală şi reticulară şi antiportul sodiu/calciu. Toate sectoarele citosolice şi veziculare conţin diverse proteine ce leagă calciul, care pot avea importanţă deosebită în simpla tamponare sau chiar modularea semnalelor de calciu; unele sunt specializate pentru transmiterea semnalului, ca în cazul calmodulinei. Calciul citosolic este crescut la nivele activatoare atât prin intrarea calciului din afară cât şi prin eliberarea sa din reticulul endoplasmic. Contracţia muşchiului neted poate fi tranzitorie (fazică) sau susţinută (tonică). Aceasta din urmă (menţinerea forţei) necesită intrare de calciu; în absenţa calciului extracelular componenta tonică a răspunsului contractil diminuă până la dispariţie. Căile de intrare a calciului sunt canale ionice cu o mai mare sau mai mică selectivitate. Canalele de calciu pot fi clasificate după principalul 145

FIZIOLOGIE CELULARA

mecanism de control al kineticii deschiderii, în voltaj-operate şi receptoroperate. Dintre numeroasele tipuri de canale voltaj-operate descrise, două sunt prezente în miocitele netede. Acestea sunt de tip T, fără rol funcţional bine stabilit, şi de tip L, esenţiale pentru intrarea calciului activator în orice circumstanţe ce presupun depolarizare (fenomen care creşte probabilitatea lor de deschidere) şi modulate prin numeroase alte mecanisme. Canalele de tip L se deschid şi ca răspuns la întinderea celulei musculare netede, ce se însoţeşte de o depolarizare a membranei determinată de activarea unor canale cationice neselective sensibile la întindere. Efectele multor agenţi contractanţi şi relaxanţi sunt însoţite şi în diverse măsuri mediate de modificări de potenţial membranar; depolarizare sau hiperpolarizare globală. Potenţialul de acţiune nu este în general necesar pentru contracţia muşchiului neted, dar sunt tipuri de miocite netede care utlizează şi acest fenomen membranar ca mecanism de activare a influxului de calciu în vederea răspunsului contractil. Unii agenţi endogeni contractanţi activează canale de calciu operate de receptori membranari. Acestea pot fi cuplate cu receptorii direct, prin proteine G, sau prin mesageri secunzi şi fosforilări proteice. Datele acumulate până în prezent arată că în miocitul neted, înafară de canalele de tip L, există doar două modalităţi de intrare a calciului influenţate de activarea receptorilor membranari: canalele cationice neselective cuplate direct cu receptorii şi canalele de calciu activate de eliberarea din reticul. Deci, o altă cale pentru influxul calciului, ce poate fi legată de activarea receptorilor membranari cuplaţi cu proteine G, este influxul capacitiv. Acesta se produce în condiţii de scădere a rezervelor reticulare de calciu şi este mediată de canale membranare speciale, numite canale operate de rezerve, activate sub acţiunea unui factor de influx al calciului eliberat din reticul sau prin simplă cuplare conformaţională cu receptorii pentru inositol trifosfat (IP3) în stare activată. Eliberarea de calciu din reticulul endoplasmic este dependentă de calciul citosolic (eliberare de calciu indusă de calciu), ca în muşchiul striat, dar predominant prin alt tip de canale reticulare, cu o importantă participare a IP3. Mulţi agenţi contractanţi determină activarea fosfolipazei C (PLC), mediată pe calea receptor - proteină G. PLC hidrolizează fosfatidil-inositolbifosfatul (PIP2) plasmalemal, rezultând IP3 şi diacilglicerol (DAG). IP3 determină eliberarea de calciu din reticul, prin acţiune asupra receptorilor 146

FIZIOLOGIE CELULARA

pentru IP3, care sunt şi canale de calciu. DAG activează protein kinaza C (PKC), calciu-fosfolipid-dependentă. In cele mai multe cazuri PKC are efecte de favorizare a contracţiei, prin fosforilarea canalelor de tip L sau a unor proteine care reglează ciclarea punţilor acto-miozinice. 7.3.5. Cuplarea excitaţie-contracţie şi mecanismul contracţiei Interacţiunea actină-miozină este activată de creşterea calciului citosolic printr-un mecanism dependent de filamentele groase. Miozina din muşchiul neted are afinitate mică pentru actină în repaus, deci nu este necesară inhibiţia interacţiunii lor, contrar prezenţei şi acţiunii inhibitorii a complexului troponină-tropomiozină în muşchiul striat. Mai mult, miozina trebuie activată pentru a interacţiona cu actina; lanţurile uşoare reglatorare sunt fosforilate de o kinază specifică (myosin light chain kinase; MLCK), care este activată de complexul calciu-calmodulină. Interacţiunea actinămiozină constă în ciclarea punţilor transversale, ce duce la alunecarea reciprocă a filamentelor, ca în muşchiul striat, dar cu multiple diferenţe. Filamentele de actină şi miozină nu au dispunere sarcomerică. In locul membranei Z filamentele de actină se leagă de structuri speciale numite corpi denşi. Contracţia este susţinută atâta timp cât prezenţa stimulului menţine intrarea calciului, dar aceasta este însoţită de valori scăzute (apropiate de cele bazale dar mai mici decât cele necesare pentru dezvoltarea forţei) pentru: calciul citosolic, activitatea MLCK şi fosforilarea MLC, ciclarea punţilor transversale. Contracţia este susţinută în asemenea circumstanţe prin punţile stabile actinăA + M* AM* miozină (fig. 75), ce rezultă din caracteristicile kinetice ale ciclului de reacţie (detaşarea lentă a punţilor în care lanţul A+M AM uşor este defosforilat). Uneori fosforilarea lanţului uşor este menţinută la un Fig. 75. Punţile stabile au rată mică anumit nivel chiar în absenţă de stimuli de rupere a legăturii A-M (M* = externi, rezultând tonusul bazal intrinsec. miozina cu lanţul uşor fosforilat) 7.3.6. Mecanismele relaxării miocitelor netede In contrast cu muşchiul striat, unde relaxarea este doar rezultatul repolarizării, în muşchiul neted aceasta se produce şi ca proces activ. Relaxarea determinată de simpla încetare (diminuare) a acţiunii stimulului 147

FIZIOLOGIE CELULARA

contractil este rezultatul scăderii calciului citosolic spre valorile de repaus, în condiţiile stopării (reducerii) afluxului şi activităţii crescute a mecanismelor de extruzie menţionate (acestea fiind dependente de concentraţia calciului pe faţa citosolică a membranelor). Indepărtarea Ca++ din citosol şi stimularea fosfatazei miozinice iniţiază şi favorizează procesul de relaxare a muşchiului neted. Agenţii relaxanţi utilizează multiple mecanisme pentru scăderea calciului citosolic, prin inhibarea mecanismelor de influx / eliberare sau prin activarea suplimentară a mecanismelor de extruzie. In aceste direcţii sunt folosite mai ales două căi: activarea canalelor de potasiu şi creşterea concentraţiei de nucleotide ciclice. Efluxul de potasiu determină hiperpolarizare, cu inhibarea CaL. Nucleotidele ciclice activează kinazele corespunzătoare, cu multiple efecte ce favorizează relaxarea PKA activează pompa de calciu plasmalemală şi reduce intrarea de calciu şi sensibilitatea la calciu la nivelul miofilamentelor. Aici acţionează şi PKG, care stimulează MLCP şi contracarează inhibiţia GTP-dependentă a acesteia, mediind acţiunea cGMP, dar şi a cAMP. PKG pare să determine relaxare mai ales prin activarea pompei de calciu reticulare, dar numeroase alte mecanisme au fost implicate: inhibarea canalelor de tip L direct şi prin hiperpolarizare dată de activarea canalelor de potasiu dependente de calciu, inhibarea ROC, stimularea antiportului Na/Ca, activarea pompei de sodiu (ATP-aza Na/K), inhibarea formării şi acţiunii IP3. 7.3.7. Sensibilitatea interacţiunii actină-miozină la calciul citosolic Opus faţă de muşchiul scheletic şi mai mult decât în miocard, agenţii contractanţi şi relaxanţi utilizează şi mecanisme sensibilizante, respectiv desensibilizate ale aparatului contractil faţă de calciu. Deşi există numeroase mecanisme ce modifică sensibilitatea aparatului contractil faţă de calciu, factorul principal de care depinde statusul contractil al miocitelor netede rămâne concentraţia calciului în imediata vecinătate a miofilamentelor. Sensibilizarea la calciu a proteinelor contractile este semnalizată mai ales pe calea RhoA/Rho-kinaza, prin inhibarea defosforilării lanţului uşor de către fosfataza lanţului uşor al miozinei (MLCP). Inafară de activarea calciucalmodulin-dependentă a MLCK, fosforilarea MLC este reglată de această MLCP. Când este fosforilată subunitatea MLCP de legare a miozinei se inhibă activitatea enzimatică a MLCP, permiţând lanţului uşor al miozinei 148

FIZIOLOGIE CELULARA

să rămână fosforilat, fapt ce favorizează contracţia, având şi efect calciusensibilizant. MLCP, controlată de PKC, exercită un efect moderator al contracţiei şi accelerează relaxarea.

Fig. 76. Cuplarea excitaţie-contracţie în muşchiul neted: NA = noradrenalina, Ang II = angiotensina II, ET1 = endotelin 1, IP3 = inozitol-trifosfat, DG = diacilglicerol, PKC = protein kinaza C, RhoGEF = factori de schimb nucleotidic pentru proteinele Rho, CaM = calmodulina, MLC = lanţul uşor al miozinei, MLCP = MLC fosforilat, MLCK = kinaza lanţului uşor al miozinei (după Somlyo A.P.)

RhoA este o proteină G citosolică monomerică, ce activează Rhokinaza, o serin/treonin kinază care fosforilează subunitatea de legare a MLCP, inhibând activitatea acesteia (fig. 76). RhoA poate fi activată în urma acţiunii unor semnale extracelulare pe receptori membranari, cu intervenţia factorilor de schimb GTP/GDP, care facilitează activarea RhoA şi astfel reglează durata şi intensitatea semnalizării prin proteina G cuplată cu receptorul. Activarea RhoA poate duce la inhibarea MLCP şi în mod separat de Rho-kinază. In plus, activitatea MLCP este stimulată de telokină (o proteină de 16 KDa) şi este inhibată de PKC. Există numeroase alte mecanisme de influenţare a sensibilităţii interacţiunii actină faţă de nivelul calciului citosolic în miocitul neted. De exemplu calciu-calmodulin-kinaza II (CaMKII) favorizează relaxarea muşchiului neted prin efect calciudesensibilizant la nivelul MLCK. Inafară de mecanismul contractil principal 149

FIZIOLOGIE CELULARA

(miozin-dependent) descris mai sus, în contracţia muşchiului neted intervin la nivelul miofilamentelor numeroase alte căi biochimice accesorii şi/sau reglatoare, din care unele sunt actin-dependente, cu implicarea unor proteine specializate ce leagă actina, cum sunt caldesmonul şi calponina. 7.3.8. Particularităţi şi implicaţii funcţionale Proprietăţi ale muşchilor netezi cu implicaţii funcţionale în adaptarea viscerelor cavitare la acţiunile motorii necesare activităţii lor sunt: capacitatea de a fi stimulaţi prin întindere, prin declanşarea unor mecanisme spontane (organele cavitare se evacuează prin conţinut excesiv), şi plasticitatea. Aceasta este o proprietate foarte importantă, prezentă la organele cavitare (vezica urinară, stomac), ce constă în adaptarea tonusului la conţinut. In acest mod volumul conţinutului creşte, în timp ce presiunea intracavitară nu se modifică. Relaxarea prin întindere (stress relaxation) este capacitatea de modificare a diametrului longitudinal, fără schimbări importante de tensiune, ce se explică prin rearanjarea filamentelor de actină şi miozină, în funcţie de gradul de tensionare. Funcţia contractilă a miocitelor netede din structuri de tip parietal este de a controla tensiunea mecanică parietală şi volumul cavitar, cu implicaţii fiziologice diverse legate de localizările menţionate, cum ar fi reglarea presiunii arteriale şi a debitului sanguin local, amestecarea şi propulsia conţinutului digestiv. Muşchiul neted se caracterizează prin realizarea unei mari economii de energie (fapt important pentru bilanţul energetic global din organism), deoarece organele interne trebuie să menţină o contracţie tonică, bazală, permanentă. Pentru a menţine o tensiune de contracţie egală cu cea a muşchiului scheletic, muşchiul neted are nevoie de numai 1/10 - 1/300 din energia consumată de muşchiul striat. Aceasta se datorează ritmului lent al ciclului de ataşare-desprindere al punţilor transversale şi faptului că pentru fiecare ciclu se consumă numai câte o singură moleculă de ATP (indiferent de durata ciclului). Muşchiul neted are o perioadă de latenţă mai mare necesară iniţierii unei contracţii decât muşchiul striat, iar timpul total de contracţie este de 30 de ori mai mare decât durata medie de contracţie a muşchiului scheletic (cu diferenţe şi în funcţie de tipul de muşchi luat în discuţie). Acest lucru este posibil din cauza faptului că procesul de ataşare-detaşare a punţilor transversale se desfăşoară lent, iar concentraţia ionului de calciu necesară 150

FIZIOLOGIE CELULARA

declanşării contracţiei se atinge mai greu decât la muşchiul scheletic. Cu toate acestea, forţa maximă de contracţie a muşchiului neted pe unitatea de suprafaţă de secţiune este similară. O altă diferenţă este capacitatea muşchiului neted de a se scurta faţă de lungimea de repaus, cu un procent mai mare decât muşchiul scheletic, păstrând aceeaşi forţă de contracţie, fapt important pentru îndeplinirea rolurilor specifice organelor cavitare (distanţa utilă de contracţie la muşchiul striat este 1/3 din lungimea sa de repaus, în timp ce la muşchiul neted contracţia îşi păstrează eficienţa atunci când acesta se scurtează cu 2/3 din lungimea sa de repaus. Altă caracteristică este că odată ce s-a atins maximul contracţiei, gradul de stimulare poate fi redus la valori cu mult mai mici, decat nivelul iniţial (energia necesară pentru continuarea contracţiei este foarte mică faţă de muşchiul striat).

151

FIZIOLOGIA SANGELUI

8. Introducere în fiziologia sângelui Sângele este un lichid complex, permanent circulat în organism în cadrul sistemului cardiovascular. Sângele este compus din plasmă şi “elemente figurate”, adică celule: hematii (“globule roşii”, eritrocite), leucocite (“globule albe”), plachete sanguine (trombocite). In ansamblul organismului uman sângele este implicat într-o multitudine de funcţii, care pot fi rezumate astfel. Sângele este un factor pasiv esenţial în asigurarea condiţiilor de viaţă pentru celule şi un factor activ în apărarea împotriva microorganismelor şi în hemostază (ansamblul mecanismelor de limitare a pierderilor de sânge). Viaţa celulelor depinde permanent de asigurarea unui mediu extracelular cu o compoziţie chimică adecvată şi care să permită schimburile de substanţă obligatorii pentru susţinerea metabolismului şi funcţiilor celulare (vezi cap. 1). Existenţa acestui “mediu intern” este posibilă numai datorită circulaţiei sângelui şi schimbului de substanţe dintre sânge şi fiecare ţesut (prin peretele capilarelor sanguine), precum şi datorită modului particular în care vasele limfatice intervin în controlul volumului şi compoziţiei proteice a lichidului interstiţial. De aceea pentru studiul fiziologiei sângelui, acesta trebuie întâi plasat corect în cadrul compartimentelor hidrice din organism. 8.1. Compartimentele hidrice ale organismului Apa este o componentă majoră a organismului uman, reprezentând ~60% din greutatea corporală la bărbaţii adulţi (cu variaţii legate de vârstă şi de ponderea ţesutului adipos). Din această cantitate totală ~2/3 se găseşte în celule (lichid sau compartiment intracelular), iar restul de ~1/3 în diverse spaţii extracelulare. Endoteliul vascular separă lichidul extracelular circulant din sistemul cardiovascular (plasma sângelui şi limfei, ~1/4 din volumul total extracelular) de restul lichidului extracelular (lichidul interstiţial, ~3/4 din volumul total extracelular). La aceste compartimente majore se adaugă un mic volum de „lichide transcelulare”, care se găsesc în anumite spaţii delimitate de structuri epiteliale (de exemplu lichidul pleural). Lichidul interstiţial, limfa şi plasma au o compoziţie foarte apropiată1 (cu excepţia 1

Celulele din corpul uman funcţionează într-un mediu care în majoritatea cazurilor este asemănător de la un organ la altul privind ionii majori, osmolaritatea, etc. Există însă şi diferenţe extreme, dictate de necesităţi funcţionale, cum este cazul celulelor de la vârful piramidelor renale, care suportă permanent o osmolaritate foarte mare.

152

FIZIOLOGIA SANGELUI

conţinutului proteic superior al plasmei şi variabil al limfei) şi reprezintă, împreună cu lichidele transcelulare ceea ce denumim de fapt mediu intern. Celulele care vin în contact cu mediul extern în mod obişnuit sunt celule epiteliale protejate la suprafaţa de contact respectivă, fie prin bariere mecanice cu caractere deosebite (cum este cazul epidermului), fie prin pelicule de lichid cu compoziţie şi proprietăţi speciale (de tip mucus sau alte variante de lichid protector); aceste lichide sunt produse de secreţie exocrină care, deşi asigură un mediu de viaţă adecvat pentru celulele respective la polul lor apical, nu sunt considerate ca parte din mediul intern. In mod evident conţinutul lichidian din viscere cavitare şi din canale secretorii, ca şi cel din tubii uriniferi şi din căile urinare nu face parte din mediul intern. 8.2. Rolul sângelui în susţinerea funcţiilor de nutriţie Sângele este componenta pasivă a sistemului hemodinamic şi astfel participă direct la funcţia circulatorie sub toate aspectele sale, inclusiv la asigurarea unei hemodinamici corespunzătoare prin însuşi volumul de sânge circulant (volemie). In acelaşi context, al rolului de lichid circulant, sângele susţine celelalte funcţii de nutriţie la nivelul organismului, participând la: - respiraţie, prin capacitatea crescută de transport pentru O2 şi CO2, precum şi prin mecanismele ce asigură schimbul de gaze respiratorii la nivel pulmonar şi tisular; - digestie, prin absorbţia nutrimentelor prin peretele tubului digestiv şi distribuţia lor în toate ţesuturile; - excreţie, prin îndepărtarea din ţesut a produşilor finali de catabolism şi a altor substanţe cu tendinţă de acumulare tisulară, asigurând transportul acestora la organele specializate pentru mecanisme excretorii. Un alt set de implicaţii fiziologice pasive ale sângelui se referă tot la asigurarea compoziţiei adecvate a lichidului extracelular, dar nu în sensul susţinerii directe a metabolismului celular, ci în sensul homeostaziei hidroelectrolitice şi a celei acido-bazice (vezi cap. “Fiziologia excreţiei”) precum şi al termoreglării (vezi cap. respectiv). Prin transportul unei varietăţi de substanţe bioactive de la locul de secreţie (sau formare extracelulară) la celulele ţintă2 sângele este elementul pasiv care intervine în diversele funcţii de reglare umorală pe care asemena substanţe le îndeplinesc. 2

Sângele asigură şi accesul medicamentelor la celule (cu excepţia aplicării locale), precum şi îndepărtarea lor, ca şi a unor substanţe străine pătrunse accidental în mediul intern.

153

FIZIOLOGIA SANGELUI

Funcţia de apărare împotriva microorganismelor (şi a altor structuri microscopice străine) se realizează prin prezenţa în compoziţia sângelui a elementelor figurate specializate (leucocite) precum şi a unor proteine specifice (anticorpi). O a doua funcţie activă, specială a sângelui este de limitare a pierderilor de sânge (hemostază) care pot să apară prin lezarea peretelui vascular. 8.3. Proprietăţi fizico-chimice ale sângelui Culoarea roşie a sângelui este conferită de prezenţa hemoglobinei la nivelul hematiilor; mai precis, de starea sa chimică. Legarea oxigenului de hemoglobină conduce la formarea unui compus labil numit oxihemoglobină care conferă culoarea roşu aprins a sângelui arterial. Sângele venos, unde cantitatea de oxigen legată de hemoglobină este mică, are o culoare roşu închis. Deci diferenţele de saturaţie în oxigen a hemo-globinei explică diferenţele de culoare ale sângelui. Densitatea sângelui, foarte apropiată de a apei, este determinată de concentraţia diverselor substanţe solvite în plasmă (proteine, lipide, etc.), precum şi de numărul elementelor figurate. Valoarea normală a acestui parametru este de 1061 g/l la bărbaţi şi 1057 g/l la femei. Temperatura sângelui la om variază în general între 37,70 C şi 380 C, cu un maxim de 400 C înregistrat la nivelul hilului hepatic şi un minimum de 360 C la nivel pulmonar şi în scrot. Diferenţele de temperatură a sângelui între sectoare stau la baza fenomenului de termoreglare prin care excesul de căldură produs de către ţesuturile active este transportat către periferie. Vâscozitatea sângelui este dată în special de numărul de elemente figurate (fig. 77). Valoarea vâscozităţii condiţionează rezistenţa periferică şi ca urmare presiunea arterială. Cu cât vâscozitatea este mai mare, cu atât viteza de curgere a sângelui este mai mică, uşurând schimburile prin peretele capilarelor. La viteze foarte mici interacţiunile dintre celule şi Fig. 77. Influenţa hematocritului dintre acestea şi proteine duc la valori asupra vâscozităţii relative a sângelui mai mari ale vâscozităţi aparente. Dacă 154

FIZIOLOGIA SANGELUI

viteza de curgere este foarte scăzută se pot produce fenomene de agregare a celulelor, crescând mult vâscozitatea. Valorile normale ale vâscozităţii relative (faţă de a apei) sunt de ~1,8 pentru plasma sanguină (variabil după compoziţia proteică) şi de ~4,6 pentru sângele integral, unde numărul de celule are efect determinant. pH-ul plasmei este de 7,4 cu variaţii între 7,30 şi 7,42, iar pH-ul intracelular este cuprins între 7,0 - 7,2. Menţinerea în limite normale a pHului are importanţă deosebită pentru desfăşurarea proceselor vitale, cu menţiunea că pH-ul lichidului interstiţial poate să varieze destul de mult de la o regiune la alta, în funcţie de particularităţile funcţionale şi de statusul metabolic şi de oxigenare (un grad de acidifiere tranzitorie intra-celulară şi chiar locală nu este un fenomen neobişnuit). In condiţii normale presiunea osmotică a plasmei este determinată în primul rând de concentraţia plasmatică a sodiului; valoarea normală a osmolarităţii plasmatice este ~285 mOsm/l. Presiunea coloid osmotică sau oncotică reprezintă presiunea conferită de proteinele din plasmă, în special albumina (vezi mai jos). Valoarea normală este 25-28 mm Hg. Presiunea osmotică şi cea coloidosmotică sunt factori importanţi ce determină transferul de apă şi electroliţi între spaţiile lichidiene, deci factori esenţiali pentru distribuţia apei între compartimentele hidrice ale organismului şi pentru homeostazia hidro-electrolitică. Volumul sanguin (volemia) este de aproximativ 70 ml/kgc, ceea ce reprezintă la un adult normal un total de aproximativ 5 l. Volemia este cu ~10% mai mare la bărbaţi în comparaţie cu femeile. In condiţii fiziologice, volumul de sânge circulant poate creşte în cursul efortului fizic, la altitudine, în sarcină. Ca mecanism aceste creşteri se realizează fie prin creşterea efectivă a volumului sanguin total, fie prin redistribuirea sângelui între diverse sectoare. In repaus, aproximativ ½ din volumul sanguin total se găseşte cantonat la nivelul viscerelor şi a plexurilor papilare, neparticipând efectiv la schimburile gazoase şi constituind volumul sanguin de rezervă. 8.4. Alcătuirea generală a sângelui Sângele este compus din celule (elemente figurate) care se găsesc întrun mediu apos complex numit plasmă. Plasma poate fi separată din sânge după ce acesta a fost amestecat cu un anticoagulant. Prin centrifugare amestecul respectiv se separă în supernatant (~55%), reprezentat de plasmă, 155

FIZIOLOGIA SANGELUI

şi sediment (~45%), reprezentat de elementele figurate. Doar 1% din acest volum este ocupat de leucocite şi plachete, restul fiind ocupat de hematii (fig. 78). Hematocritul este definit ca raportul dintre volumul de elemente figurate şi cel de sânge în care se găsesc. Valorile normale ale hematocritului variază între 42% (la femei) şi 46,5% (la bărbaţi). Cei mai utilizaţi anticoagulanţi Fig. 78. Determinarea hematocritului sunt heparina (complex de mucopolizaharide sulfatate, care se găseşte în mod normal în plămân şi în mucoasa intestinală, şi care inhibă enzimele ce induc coagularea) şi agenţii chelatori de calciu, cum ar fi citratul de sodiu sau EDTA (acidul etilen-diaminotetraacetic). In absenţa anticoagulantului sângele coagulează, adică îşi pierde fluiditatea. De fapt el se separă în cheag (care reţine elementele figurate) şi o fracţie fluidă numită ser sanguin. Serul diferă de plasmă prin faptul că-i lipseşte fibrinogenul (transformat în reţea de fibrină în ochiurile căreia se dispun elementele figurate), protrombina şi alţi factori ai coagulării. 8.5. Compoziţia chimică a plasmei sanguine Plasma este o soluţie apoasă în Tab. 5: Compoziţia ionică a plasmei care sunt dizolvate variate substanţe, Cationi (mEq/l) Anioni (mEq/l) atât anorganice (electroliţi, tab. 5), cât Na+ = 135 - 145 Cl- = 95 – 107 + K = 3,5 - 5 HCO3- = 22 – 26 şi organice: proteine, lipide, glucide ++ H2PO4- = 2 (în special, glucoză), hormoni, produşi Ca ++= 2,2 - 2,5 Mg = 1,5 – 2 HSO4- = 1 de catabolism (uree, acid uric), etc. Ionii cu concentraţii mari (în special cei de sodiu) determină practic osmolaritatea plasmatică (280 - 300 mOsm/l). Constituienţii ionici menţin în limite fiziologice pH-ul plasmatic3. Substanţele organice prezente în plasmă sunt obişnuit clasificate în proteine plasmatice şi substanţe neproteice (tab. 6). Plasma are o culoare galben pai, dată de prezenţa bilirubinei. Aspectul este clar înaintea ingestiei

3

Logaritmul cu semn schimbat a concentraţiei ionilor de hidrogen

156

FIZIOLOGIA SANGELUI

alimentare, dar devine opalescent după un prânz bogat în lipide, datorită prezenţei trigliceridelor, sub formă de particule numite chilomicroni. Tab. 6. Compoziţia organică a plasmei Proteică Globuline 2,2 - 4 g/dl Haptoglobină 50 - 100 mg/dl Feritină 15 - 300 μg/dl Albumină 3,4 - 5 g/dl Transferină 250 mg/dl Ceruloplasmină 25 - 45 mg/dl

Neproteică Glucoză Acid uric Fier Colesterol Uree Creatinină

70 - 110 mg/dl 4,1 – 8,5 mg/dl 50 - 150 μg/dl 140 - 250 mg/dl 6 - 23 mg/dl 0,7 - 1,4 mg/dl

Substanţele neproteice din plasmă Ureea rezultă în urma transformării amoniacului (toxic) prin procesul de dezaminare; se elimină pe cale renală; concentraţia plasmatică normală de uree este de 0,2 - 0,4 g/l. Acidul uric este un produs de catabolism al bazelor purinice; se elimină pe cale renală şi intestinală; concentraţia plasmatică este 2 - 5 mg/dl. Glucoza este un component important al plasmei sanguine; menţinerea constantă a glicemiei (concentraţia plasmatică a glucozei) fiind rezultatul echilibrului realizat pe de o parte, între aportul alimentar şi producere de glucoză (glicogenoliza hepatică şi gluconeogeneză) şi consumul tisular de glucoză (glicogenoliză). Principalul factor hipoglicemiant din organism este reprezentat de insulină, iar glucagonul, mineralocorticoizii, hormonul de creştere şi adrenalina exercită efecte hiperglicemiante. Concentraţia plasmatică normală a glucozei este 0,8 - 1,1 g/l. Creşterea concentraţiei glucozei peste valorile menţionate se numeşte hiperglicemie şi este caracteristică diabetului zaharat. Hipoglicemia reprezintă scăderea glucozei plasmatice sub valorile normale şi poate să apară după eforturi musculare exagerate, post sau subnutriţie prelungită. Corpii cetonici sunt produşi intermediari ai metabolismului glucidic (acid acetilacetic şi acid β-oxibutiric); apar în plasmă ca urmare a catabolismului lipidic exagerat în formele grave de diabet zaharat. Colesterolul prezent în plasmă este exogen (provenit din alimentaţie) sau endogen (produs la nivel hepatic din acetilcoenzima A). Concentraţia pasmatică normală este cuprinsă între 180 – 200 mg/dl; conţinutul în colesterol al plasmei depinde de ingestia zilnică de lipide precum şi de concentraţia hormonilor tiroidieni şi gonadali din sânge. Colesterolul este utilizat în principal la sinteza acidului colic, în vederea sintezei sărurilor 157

FIZIOLOGIA SANGELUI

biliare (vezi cap. “Secreţia biliară”); o mică parte este utilizat la formarea hormonilor corticosuprarenalieni şi gonadali. Trigliceridele sunt principalii constituienţi ai chilomicronilor; provin din alimentaţie sau din transformarea glucidelor şi proteinelor în acetil-CoA. Concentraţia trigliceridelor în plasmă este 125 – 150 mg/dl. Fosfolipidele sunt reprezentate de lecitine, cefaline şi sfingomieline; au rol în formarea şi transportul lipoproteinelor. Concentraţia plasmatică este de aproximativ 280 mg/dl. 8.6. Proteinele plasmatice In plasmă sunt dizolvate diferite proteine (concentraţie totală de aproximativ 7 g/dl). Studiul proteinelor aduce informaţii importante despre procesele fiziologice şi patologice din organism. Distribuţia proteinelor plasmatice se face prin schimburi între plasmă şi lichidul interstiţial. Proteinele plasmatice nu circulă numai intravascular; mai lent, acestea traversează peretele capilar către lichidul interstiţial şi ajung înapoi în plasmă pe cale limfatică. In plasmă se găsesc: albumină sintetizată la nivel hepatic, componente ale sistemului complement secretate de macrofage, apoproteine sintetizate de către celulele intestinale, precum şi proteine implicate în hemostază sintetizate la nivelul celulelor endoteliale. In funcţie de dimensiuni (masa moleculară), proteinele plasmatice sunt clasificate conform separării lor prin electroforeză (fig. 79, tab. 7) Tab. 7. Compoziţia proteică a plasmei proteinograma g/dl % proteine totale 6-8 100 albumine 4,5 - 5,7 55 - 70 globuline 1,46 - 2,54 30 - 45 α1 α2 β γ

Fig. 79. Electroforeza proteinelor din serul sanguin normal (proteinograma)

3-7 7 - 10 9 - 17 12 - 20

fibrinogen 0,2 - 0,4 (raport albumine/globuline = 1,5 - 2,5)

8.6.1. Albumina plasmatică Cea mai mare parte dintre proteinele plasmatice sunt de provenienţă hepatică. Excepţia majoră este reprezentată de imunoglobuline, care sunt

158

FIZIOLOGIA SANGELUI

fabricate de către limfocitele B activate4. Albumina este una din proteinele sintetizate la nivel hepatic în cantitate mare şi special pentru a intra în compoziţia plasmei, ea reprezentând 60% din totalul proteinelor plasmatice. Presiunea oncotică scăzută, precum şi creşterea concentraţiei aminoacizilor din plasmă (ca urmare a ingestiei alimentare bogată în proteine) stimulează hepatocitele să sintetizeze albumină. In inflamaţie substanţele secretate de monocite, în special interleukina 1, stimulează sinteza unor proteine plasmatice, dar este diminuată sinteza de albumină; Albumina este distribuită 2/5 în spaţiul intravascular şi 3/5 în cel extravascular. La un individ normal, de 70 kg, zilnic se produc 14 - 17 g de albumină. Acţiunea biologică a albuminei este de aproximativ 19 zile; catabolismul albuminei diferă fundamental de catabolismul altor proteine deoarece albumina este singura proteină plasmatică care nu are structură glicoproteică. Albumina traversează endoteliul capilar şi ajunge în spaţiul extracelular prin transcitoză mediată de receptor. Macrofagele preiau albumina prin pinocitoză şi este degradată lizozomal până în stadiul de aminoacizi, care vor fi disponibili sintezei proteice în macrofage. Numai 10% din albumină se pierde prin tractul digestiv, unde este scindată enzimatic până la stadiul de aminoacizi, care vor fi reabsorbiţi. Albumina este principala proteină din plasmă responsabilă de menţinerea presiunii oncotice, care guvernează trecerea apei şi a soluţiilor difuzibile prin peretele capilarelor. Când concentraţia albuminei scade mult sub valorile normale, se acumulează un exces de lichid extracelular în spaţii extra-vasculare, producând edemul. Albumina asigură transportul acizilor graşi din plasmă, al bilirubinei către fagocitele mononucleare şi către ficat, al medicamentelor. Ea este şi transportor secundar pentru tiroxină, cortisol şi hem, când capacitatea proteinelor lor specifice de transport este depăşită. 8.6.2. Proteine plasmatice specializate pentru transport

4

Expunerea repetată la un antigen stimulează puternic sinteza de imunoglobuline ca urmare a cooperării dintre mai multe tipuri de limfocite (vezi cap. 5.6.).

159

FIZIOLOGIA SANGELUI

Inafara albuminei, principala proteină transportoare, în plasmă se mai găsesc următoarele proteine transportoare cu implicaţii funcţionale majore5: transferina, haptoglobina, hemopexina, ceruloplasmina. Transferina este o proteină care transportă fierul (necesar sintezei de hemoglobină) prin plasmă până la nivelul măduvei hematogene. Fiecare moleculă de transferină poate transporta 2 atomi de fier. Concentraţia plasmatică de transferină este de 250 mg/dl. Transferina este distribuită în raport de 60/40 între spaţiul extravascular şi intravascular. Timpul său de acţiune este de 10 zile. Haptoglobina formează complexe cu dimerii de hemoglobină. In momentul în care hematiile îmbătrânite sunt lizate, hemoglobina este eliberată în plasmă unde este scindată în dimeri αβ. O moleculă de haptoglobină se combină cu doi dimeri (adică, cu echivalentul unei singure molecule de hemoglobină). Complexul hemoglobină-haptoglobină ajunge la ficat, străbate membrana hepatocitară şi sunt eliberaţi dimerii care sunt distruşi de lizozomi. Deci, funcţia haptoglobinei este de a conserva fierul în organism, transportându-l la ficat şi prevenind eliminarea lui prin urină în procesul de excreţie a dimerilor. Concentraţia normală de haptoglobină plasmatică este de 40-180 mg/dl. Hemoglobina din plasmă, rezultată din eritrocitele lizate, nu este scindată numai în dimeri ci şi în hem oxidat (methem) şi lanţuri de globină. Hemopexina leagă methemul formând complexul methem-hemopexină care este transportat la ficat şi catabolizat la acest nivel. Concentraţia normală de hemopexină este 50-100 mg/dl. In condiţii de hemoliză intravasculară accentuată se formează o mare cantitate de methem, care depăşeşte capacitatea de legare a hemopexinei. Methemul se va lega de albumină, formând methemalbumina (albumina funcţionează ca o proteină de stocare a hemului circulant). Când este produsă o nouă moleculă de hemopexină, methemalbumina îi cedează hemul pe care-l va transporta la ficat. Ceruloplasmina este proteină care transportă cuprul. Un alt rol al ceruloplasminei este acela de scavenger de radicali superoxid generaţi de leucocite în procese inflamatorii. De asemenea, ceruloplasmina funcţionează ca o peroxidază catalizând conversia fierului feros în fier feric, reacţie care 5

Informaţii conexe sunt prezentate în alte capitole: “Absorbţia fierului”, “Catabolismul hemoglobinei”, “Pigmenţii biliari”. Anumite proteine cu mare specificitate de legare sunt descrise în capitole referitoare la substanţele transportate (de ex. “Hormonii tiroidieni”).

160

FIZIOLOGIA SANGELUI

are loc înainte ca transferina să preia fierul şi să-l transporte prin plasmă. Concentraţia plasmatică este 30 mg/dl. Estrogenii reacţionează cu receptorii steroizi de pe hepatocite şi stimulează sinteza de ceruloplasmină; nivelele cresc în sarcină sau în tratamentul cu contraceptive orale ce conţin estrogen. 8.6.3. Proteinele de fază acută In cazul leziunilor tisulare şi a inflamaţiilor locale are loc secreţia de către macrofage a interleukinei 1 şi a factorului de necroză tumoral cu inducerea unui răspuns sistemic de fază acută. In mod obişnuit acest răspuns include febră, creşterea secreţiei unor hormoni, scăderea sintezei de albumină şi creşterea sintezei de proteine de fază acută. Aceste proteine sunt reprezentate de proteina C reactivă, fibrinogenul, proteina amiloid A serică, factori hemostatici, factorul von Willebrand, componentele C3 şi B ale complementului, haptoglobina, ceruloplasmina şi inhibitori proteazici (inhibitorul α1 proteazic, α1-antichimotripsina, α2antiplasmina). Proteina C reactivă se leagă de membrana celulelor lezate, activând calea clasică a complementului; această proteină plasmatică este determinată în practica medicală fiind considerată un marker suplimentar în reacţiile de apărare a organismului faţă de agresiunile bacteriene. 8.6.4. Sistemele proteolitice şi inhibitorii proteazici din plasmă Sistemele proteolitice plasmatice sunt reprezentate de: sistemul complement; sistemul kininic, sistemul de coagulare sanguin şi sistemul fibrinolitic. Inhibitorii proteazici din plasma sanguină aparţin familiei de proteine numite serpine, mai importanţi fiind α1-antitripsina şi α2macroglobulina. Inhibitorul α1 proteazic (α1-antitripsina) este prezent în plasmă în concentraţii mari (250 mg/dl); funcţia sa specifică este de a inhiba eliberarea de elastază şi catepsină G prin stimularea neutrofilelor în răspunsul inflamator. Funcţionează şi ca inhibitor major a două enzime implicate în procesul de coagulare: factorul XI activat şi proteina G activată. α2-macroglobulina este un alt inhibitor proteazic major din plasmă (250 mg/dl). α2-macroglobulina este un inhibitor al plasminei; ea acţionează atunci când capacitatea inhibitorului principal, inhibitorul α2-plasminic, este depăşită. Se găseşte la suprafaţa celulelor endoteliale vasculare şi serveşte

161

FIZIOLOGIA SANGELUI

ca protector a suprafeţei endoteliale de acţiunea enzimelor proteazice serinice. Alţi inhibitori proteazici plasmatici sunt prezentaţi mai jos (tab. 8). Tab. 8. Inhibitori proteazici plasmatici Inhibitor proteazic Concentraţie plasmatică 50 mg/dl α1 antichimotripsina antitrombina III 15 mg/dl inhibitor C1 18 mg/dl 7 mg/dl inhibitor α2 plasminic

Inhibitor al catepsinei G leucocitare trombinei, factorului IXa, Xa kalicreinei plasminei

8.6.5. Viteza de sedimentare a hematiilor Determinarea ratei de sedimentare naturală a hematiilor (VSH) într-o coloană de sânge în prezenţă de anticoagulant (citrat de sodiu 3,8%) este o metodă care aduce informaţii asupra compoziţiei proteice a plasmei. Eritrocitele vor sedimenta lent, părăsind plasma, care apare ca o coloană clară deasupra lor. Se disting trei faze ce au loc în cursul sedimentării: - faza iniţială, caracterizată prin creşterea treptată a vitezei de sedimentare, pe măsură ce hematiile se dispun în fişicuri sau rulouri; - faza de decantare, caracterizată prin viteza maximă de sedimentare datorită depunerii rapide a rulourilor formate; - faza de coborâre lentă, caracterizată prin viteza lentă de sedimentare, pe măsură ce se depun şi hematiile neagregate. Formarea şi dimensiunea agregatelor eritrocitare depinde de prezenţa unor proteine plasmatice cum ar fi: fibrinogen, α2-globulinele, imunoglobulinele. Creşterea concentraţiei plasmatice a acestor proteine determină formarea de agregate eritrocitare mari care vor sedimenta mai repede decât o singură hematie (deci, creşte viteza de sedimentare). Alte proteine plasmatice, cum ar fi albumina, inhibă formarea de rulouri prin creşterea forţei de respingere dintre hematii. VSH variază în funcţie de sex, vârstă şi condiţia fiziologică (tab. 9). Mai mare la femei decât la bărbaţi, Tab. 9. Viteza sedimentării hematiilor VSH creşte suplimentar în cursul valori normale mm la 1 h mm la 2 h 2-7 7-15 menstruaţiei şi sarcinii. Patologic, bărbaţi femei 4-9 12-17 VSH creşte în infecţii, fiind un sarcină 35 marker important pentru evoluţia nou-născuţi 0,5 procesului inflamator. sugari 9-12

162

FIZIOLOGIA SANGELUI

9. Hematopoeza Toate elementele figurate provin dintr-o singură clasă de celule primitive numite celule stem pluripotente (fig. 80). Hematopoeza are loc încă din viaţa intrauterină, mai întâi în ficat şi splină şi apoi în măduva hematogenă (din a 20-a săptămână a vieţii embrionare). Către sfârşitul vieţii fetale hematopoeza se realizează predominant în măduva hematogenă şi mai puţin la nivel hepatic şi splenic, iar după naştere elementele figurate sunt produse numai în măduva hematogenă, cu excepţia limfocitelor, care se maturează şi proliferează înafara măduvei hematogene (în timus şi ţesuturile limfoide periferice). La copii, măduva hematogenă activă hematopoetic se găseşte în oasele late (oase craniene, coaste, stern, vertebre şi pelvis), precum şi în epifizele oaselor lungi, iar la adult în oasele late şi epifizele proximale ale femurului şi humerusului.

Fig. 4. Hematopoeza

163

FIZIOLOGIA SANGELUI

Eritrocitele, neutrofile, eozinofilele, monocitele şi plachetele sanguine (trombocitele) au o viaţă limitată; o parte din aceste elemente figurate trebuie înlocuite zilnic. In plus, măduva hematogenă trebuie să răspundă intermitent la cererile crescute pentru producţia anumitor celule (de exemplu granulocite în caz de infecţii sau eritrocite în caz de hemoragii).

Fig. 80. Hematopoeza

9.1. Celula stem şi celulele progenitoare

164

FIZIOLOGIA SANGELUI

Celulele stem hematopoetice au două proprietăţi funcţionale de bază: formarea de noi celule stem prin diviziune celulară şi capacitatea lor de diferenţiere spre o celulă sanguină specializată matură. Tesuturile specifice de suport din măduva hematogenă permit creşterea şi diferenţierea celulelor stem, realizând un “micromediu hematopoetic” unde acţionează factorii de creştere hematopoetici. Celula stem se diferenţiază, devine celulă stem “orientată” pentru producerea de una sau mai multe linii celulare (fig. 81). Tansformarea implică participarea factorilor inductivi extracelulari, cum ar fi factorul de creştere hematopoetic sau moleculele de la suprafaţa celulei. Aceştia determină în micromediul hematopoetic modificări în interiorul celulei stem ce au drept consecinţă “orientarea” sa; probabilitatea de diferenţiere creşte cu fiecare diviziune a celulei stem.

Fig. 81. Dezvoltarea şi maturarea elementelor figurate SP - celule stem pluripotente SM - celula stem mieloidă orientată SL - celula stem limfoidă orientată

Se descriu trei tipuri de celule stem diferite funcţional: celula stem pluripotentă; celula stem mieloidă (din care rezultă eritrocite, toate tipurile de granulocite, monocite şi trombocite) şi celula stem limfoidă. Cu cât procesul de “orientare” progresează, capacitatea celulelor stem de a se înnoi diminuă până la dispariţie, transformându-se în celule progenitoare. Celulele progenitoare au capacitatea de a da naştere la colonii de celule diferenţiate. 165

FIZIOLOGIA SANGELUI

Aceste colonii pot conţine o linie de celule sau combinaţii de mai multe linii celulare; se pot găsi atât în măduva hematogenă cât şi în sângele circulant. 9.2. Factorii de creştere implicaţi în hematopoeză Factorii de creştere implicaţi în hematopoeză sunt citokinele (termen general pentru proteinele eliberate care acţionează ca mediatori celulari) care controlează creşterea, diferenţierea şi funcţia elementelor figurate sanguine. Factorii de creştere sunt prezenţi în sânge şi în lichidul interstiţial în concentraţii de 10-10 - 10-11 M; ei acţionează asupra celulelor ţintă prin legare de receptorii de suprafaţă. Marea majoritate a factorilor de creştere celulari au două modalităţi de acţiune: inducţia creşterii şi diferenţierii celulelor imature şi modularea funcţiilor efectoare în celulele mature. Majoritatea factorilor de creştere acţionează sinergic asupra celulelor precursoare in vivo. Macrofagele au rol important în controlul hematopoezei prin producţia de interleukină 1 (IL-1). Aceasta stimulează creşterea limfocitelor T (care produc IL-3) şi stimulează fibroblastele, celulele endoteliale şi celulele din micromediul medular să secrete factori de creştere pentru fibroblaste, celule endoteliale, limfocite T şi monocite. IL-1 are efect şi asupra celulelor mature; de exemplu, stimulează eliberarea de neutrofile din măduva hematogenă. 9.3. Eritropoeza Procesul de producere al hematiilor (eritropoeza) începe la făt în sacul embrionar şi se continuă în ficat, splină şi ganglionii limfatici. Către sfârşitul sarcinii şi după naştere procesul are loc numai în măduva hematogenă. Eritropoeza necesită prezenţa, în micromediul medular normal, a unei populaţii normale de celule stem hematopoetice; acestea se diferenţiază şi se maturează sub influenţa eritropoetinei şi necesită prezenţa vitaminei B12, acidului folic şi a fierului. Folatul şi cobalamina Folatul (acidul folic şi derivaţi ai săi) şi cobalamina participă la reacţii care fac disponibilă generarea de metil necesară conversiei deoxiuridilatului în deoximidilat în procesul de sinteză a ADN (în ADN, baza pirimidinică tiamină, care este 5-metiluracil, înlocuieşte în molecula de ARN uracilul).

166

FIZIOLOGIA SANGELUI

Fig. 82. Importanţa folatului şi cobalaminei pentru sinteza ADN

Reacţiile implicate sunt următoarele (fig. 82): 5,10-metilen-tetrahidrofolatul poate fi convertit în 5-metil-tetrahidro-folat sau poate utiliza metildeoxi-uridilatul pentru a se oxida la dihidro-folat. Condiţiile kinetice favorizează cea de-a doua reacţie, iar 5-metil-tetrahidro-folatul est reciclat în tetrahidrofolat, menţinând un supliment adecvat de 5,10-metilen-tetrahidrofolat pentru sinteza normală de deoxi-timidilat. Reciclarea este cuplată cu o reacţie secundară, metilarea homocisteinei la metionină (catalizată de metionin-sintază). Această reacţie necesită cobalamina ca şi coenzimă care preia o grupare metil de pe 5-metil-tetrahidro-folat şi o transferă către homocisteină. Moleculele de folat pot să conţină un rest glutamil terminal (monoglutamat) sau mai multe (poliglutamat). Acidul folic se găseşte în legume verzi, fructe, fasole, nuci, ficat. Aportul variază în funcţie de obiceiurile alimentare şi metodele de preparare a alimentelor. In alimente acidul folic este prezent ca poliglutamaţi, care trebuie deconjugaţi (de conjugaze intestinale) la forma de monoglutamaţi, pentru ca acidul folic să poată fi absorbit. Tesuturile stochează folaţi în cantitate de 5-10 mg. Necesarul zilnic de folaţi este de 50-100 μg. Deficitul de aport poate conduce la deficit de folat în aproximativ 3 luni. 167

FIZIOLOGIA SANGELUI

Cobalamina se găseşte în alimente de origine animală cu conţinut proteic bogat; necesarul zilnic este de 5-30 μg. O glicoproteină specifică secretată de celulele parietale din mucoasa gastrică, numită factor intrinsec Castle, are rolul de a lega cobalamina înainte de a fi absorbită prin tractul gastro-intestinal. Absorbţia are loc în ileon ca urmare a legării factorului intrinsec cu receptorii specifici ai marginii în perie (vezi cap. “Absorbţia vitaminelor”). Cobalamina este transportată la ţesuturi legată de o proteină specifică de transport numită transcobalamina II. Cobalamina se mai poate lega şi de o proteină plasmatică secundară, transcobalamina I, care este produsă şi la nivelul granulocitelor. La nivel tisular, cobalamina se găseşte sub două forme, coenzimele metil-cobalamină şi adenozil-cobalamină, în cantitate de 2-5 mg (cea mai mare parte se găseşte în ficat). Date fiind aceste rezerve, precum şi pierderile zilnice 2-5 μg, dacă aportul este sub un minim de ~3μg/zi, carenţa de cobalamină se instalează în decurs de câţiva ani6. Fierul Fierul se găseşte în hem, în hematii şi în celulele musculare; este stocat sub formă de feritină sau hemosiderină la nivelul fagocitelor mononucleare şi în celulele parenchimatoase hepatice. La un adult de 70 kg se găsesc aproximativ 2,5 mg de fier în hemoglobină, aproximativ 150 mg în mioglobină, aproximativ 15 mg la nivelul enzimelor tisulare şi aproximativ 1 g de fier este stocat. O cantitate foarte mică de fier (aproximativ 3 g) este prezentă în plasmă legată de transferină. La femei, rezerva de fier este mai redusă decât a bărbaţilor datorită pierderilor prin sângerarea menstruală şi sarcină (pierderea de fier în timpul sarcinii este de aprox. 500 mg, de aceea trebuie suplimentat medicamentos). Zilnic, fierul se pierde prin fecale, urină şi transpiraţie în cantitate mai mică de 1 mg. In timpul lactaţiei se pierd 0,5 - 1 mg/zi. Spre deosebire de aceste pierderi minore, hemoragia (sângerarea) produce pierderi substanţiale de fier. Un gram de hemoglobină conţine 3,4 mg de fier; la un individ normal cu 15 mg/dl hemoglobină, 100 ml de sânge conţine ~ 50 mg de fier. Fierul din carne este mai rapid absorbit decât cel din alte alimente (ouă, grâu); este absorbit la nivelul porţiunii superioare a intestinului subţire. Cantitatea absorbită depinde nu numai de conţinutul în fier al dietei 6

Absenţa unui aport alimentar adecvat duce uşor la forma clinică de anemie pernicioasă. Reversibilă prin dietă sau vitaminoterapie, afecţiunea poate determina sechele neurologice.

168

FIZIOLOGIA SANGELUI

dar şi de mecanismele reglatoare de la nivelul mucoasei intestinale. Fierul pătrunde în enterocite şi fie traversează enterocitul şi ajunge în sânge sau este reţinut în celulă sub formă de feritină. Când enterocitele se descuamează, fierul se pierde, de aceea aportul de fier prin alimentaţie trebuie să fie continuu. Zilnic, sunt necesare aproximativ 20 mg de fier pentru fabricarea unei noi molecule de hemoglobină, pentru a înlocui hemoglobina catabolizată în urma distrugerii eritrocitelor îmbătrânite. Acest fier este reciclat din catabolizarea hemoglobinei, transportat înapoi în plasmă sub formă de transferină de la fagocitele mononucleare la normoblaştii din măduva osoasă. Etapele eritropoezei Formarea eritrocitelor, plecând de la celula stem pluripotentă, parcurge următoarele etape: pronormoblast; normoblast bazofil, normoblast policromatofil, normoblast ortocromatic, reticulocit şi eritrocit matur. Cea mai tânără celulă a seriei eritrocitare este pronormoblastul. In măduva hematogenă, pronormoblastul apare ca o celulă de mărime variabilă, cu nucleu rotund ce ocupă cea mai mare parte din celulă, nucleoli coloraţi în albastru şi citoplasmă bazofilă. In cursul maturaţiei, mai întâi dispar nucleolii, rezultând normoblastul. Apoi dimensiunea normoblastului scade progresiv, nucleul regresează într-o masă picnotică care în final este expulzată, iar citoplasma îşi modifică culoarea din albastru în rozportocaliu. In decursul maturării creşte cantitatea de hemoglobină sintetizată. Diviziunea celulară se opreşte la stadiul de normoblast; ultimul stadiu de diviziune este reprezentat de reticulocit, care se găseşte şi în sânge. Sinteza de hemoglobină necesită trei condiţii: - cantităţi adecvate de ARNm pentru lanţurile polipeptidice de globină care trebuie sintetizate; - celula trebuie să sintetizeze cantităţi suficiente de protoporfirină; - fierul trebuie să fie disponibil pentru încorporarea în protoporfirină cu formarea hemului. Transferina plasmatică transportă fierul la celulele eritroide în creştere, care prezintă pe suprafaţa lor receptori membranari pentru aceasta. Reticulocitul este o celulă nucleată, mult mai mare decât eritrocitul adult, care prezintă tot echipamentul pentru sinteza de hemoglobină (ARN citoplasmatic, mitocondrii, receptori de suprafaţă pentru transferină). 169

FIZIOLOGIA SANGELUI

Reticulocitul normal se maturează în 1-2 zile la nivelul măduvei hematogene înainte de a intra în circulaţie, timp în care are loc sinteza continuă de hemoglobină pe măsură ce dimensiunile reticulocitului scad. Reglarea eritropoezei Eritropoetina este un factor major de reglare al eritropoezei. Ea este secretată de celulele juxtaglomerulare renale care sunt extrem de sensibile la hipoxia tisulară. Hipoxia tisulară poate avea următoarele cauze: scăderea conţinutului sanguin de hemoglobină (anemie); o încărcare deficitară a hemoglobinei cu oxigen la nivel pulmonar (boli pulmonare, boli congenitale de cord, altitudine); o eliberare deficitară a oxigenului de pe hemoglobină (în cazul concentraţiilor crescute de monoxid de carbon). Eritropoeza normală necesită un nivel bazal de stimulare a celulelor progenitoare eritroide prin eritropoetină. Eritropoeza poate fi estimată prin numărul de celule nucleate din seria roşie care se observă în proba de măduvă hematogenă. Eritropoeza efectivă (eritropoeza producătoare de celule roşii circulante) poate fi estimată prin numărul de reticulocite circulante. 9.4. Leucopoeza Producţia de granulocite şi monocite-macrofage Cea mai tânără celulă a seriei granulocitare identificabilă morfologic este mieloblastul. Acesta este o celulă mare, nucleată cu 1-5 nucleoli; citoplasma este colorată în albastru şi nu conţine granulaţii. Până la stadiul de celulă matură nucleul va condensa şi, în final se va segmenta; citoplasma va prezenta trei tipuri de granulaţii: granulaţii mari, azurofile, care apar primele şi care apoi sunt înlocuite de granulaţii specifice. Aproximativ 1/2 din granulocite sunt circulante (granulocitele tocmai eliberate din măduva hematogenă se constituie ca granulocite circulante pentru numai câteva ore), restul sunt aderente de peretele vascular sau cantonate la nivel tisular. Migrarea granulocitelor spre ţesuturi depinde de concentraţia de chemoatractanţi proces numit chemotaxie; odată ajunse în ţesuturi, granulocitele nu se mai reîntorc în circulaţie. Durata de viaţă în sânge este de trei ore. La nivelul măduvei hematogene granulocitele se găsesc în două compartimente: un compartiment mitotic care conţine celule care se divid (precursorii granulocitari suferă 4-5 diviziuni în acest compartiment) şi un compartiment postmitotic sau de maturaţie (până la stadiul de metamielocit 170

FIZIOLOGIA SANGELUI

şi granulocite mature) care nu mai este capabil de diviziune. Trecerea din compartimentul postmitotic către sânge are loc în decurs de 5-6 zile. Numărul de granulocite mature din acest compartiment este de aproximativ 3 ori mai mare decât granulocitele din sânge; astfel, măduva hematogenă conţine o rezervă de granulocite mature pentru 3 zile disponibilă la nevoie. Monocitele i-au naştere în măduva hematogenă din aceeaşi celulă progenitoare cu cea a granulocitelor. Monoblaştii, promonocitele şi monocitele reprezintă aproximativ 1-3% din celulele nucleate din măduva hematogenă. In urma diviziunii monoblaştilor rezultă promonocitele din care vor rezulta monocitele. Timpul de tranzit medular este de 6 zile; la nivelul măduvei hematogene nu sunt rezerve de monocite. Monocitele sunt eliberate din măduvă în sânge şi migrează către ţesuturi unde trăiesc aproximativ 3 zile. Aici ele suferă diferenţieri tisulare la nivelul sistemului mononuclear fagocitar (reticuloendotelial). Timpul de viaţă a macrofagelor este de câteva luni. Eozinofile, bazofile şi mastocite Eozinofilele reprezintă în mod normal ~ 3% din celulele nucleate din măduva hematogenă ; ele se maturează în măduva hematogenă trecând prin stadii similare cu cele ale seriei granulocitare. IL-3 şi IL-5 stimulează direct proliferarea şi maturarea eozinofilelor. Timpul de maturare la nivel medular este de 5-6 zile; ele se găsesc într-un compartiment intravascular (la marginea vasului) şi un compartiment circulant (cu o semi-viaţă de 8 ore). Eozinofilul matur conţine un nucleu bilobat şi granule mari, distincte, de culoare roşu-portocaliu; granulele sunt constituite dintr-un material numit proteină bazică majoră (MBP) (cea mai puternică toxină tisulară) cu rol important în capacitatea eozinofilelor de a distruge paraziţii precum şi cea puternică toxină bactericidă numită proteina cationică eozinofilică (ECP). In granulele fine eozinofilice se mai găsesc cantităţi mari de arilsulfataza B (enzimă care hidrolizează legăturile esterice S-O) şi care pot inactiva leucotrienele care sunt eliberate de mastocitele tisulare în cursul reacţiilor de hipersensibilitate imediată. Bazofilele sunt celule multilobate care conţin granule mari, metacromatice, de culoare maro-negre. Ele sunt cele mai reduse numeric din toate leucocitele sanguine. Bazofilele rezultă din celulele stem din măduva hematogenă şi urmează secvenţa de maturare similară cu neutrofilele şi 171

FIZIOLOGIA SANGELUI

eozinofilele. Citokinele reglează producţia de bazofile. Membrana bazofilelor conţine receptori pentru fragmentul Fc a moleculelor de Ig E. In reacţiile alergice acute, antigenul specific reacţionează cu Ig E legat de bazofile şi acestea eliberează conţinutul granulelor în care se găsesc mediatori chimici cum ar fi histamina. La nivel tisular se găseşte mastocitul, care conţine granule metacromatice (cu histamină) şi receptori membranari pentru Ig E. Mastocitele diferă morfologic de bazofile prin nucleul lor rotund şi prin granule care conţin heparină. Bazofilele sanguine nu sunt precursori ai mastocitelor tisulare. Mastocitele sunt bogat reprezentate în plămâni, piele, ţesut limfoid, stratul submucos al tractului digestiv. Mastocitele conţin sau pot sintetiza diverşi mediatori (histamină, prostaglandine, leucotriene, factor activator plachetar, proteaze şi alte enzime lizozomale) ca urmare a răspunsurilor imune şi inflamatorii. Prin activare şi degranulare după legarea antigenului pe suprafaţa lor receptoare, mastocitele au un rol central în declanşarea reacţiilor de hipersensibilitate imediată. De asemenea, mai participă şi la răspunsurile inflamatorii şi reparaţia tisulară. 9.5. Trombopoeza Plachetele derivă din celule gigante din măduva hematogenă care se numesc megakariocite, caracterizate prin dimensiunile lor mari, nucleul polilobat şi citoplasma abundentă. Megakariocitele rezultă dintr-o populaţie celulară numită megakarioblaşti. Maturarea megakariocitelor este caracterizată prin dezvoltarea granulelor şi mitocondriilor precum şi o creştere a masei membranei celulare sub formă de tubuli şi cisterne care comunică cu exteriorul celulei. Megakariocitele mature sunt celule ameboidale care întind pseudopode printre celulele endoteliale care tapetează sinusoidele medulare; pseudopodele apoi se fragmentează formând plachete. Plachetele rămân în spaţiul intravascular, dar în orice moment aproximativ 1/3 din ele este adunat într-un anumit loc (pulpa roşie a splinei). Timpul de viaţă al plachetelor sanguine este de 3 zile. Când numărul plachetelor circulante scade sub numărul normal este eliberată în plasmă o substanţă numită trombopoetină care va interveni în maturarea plachetară. In plus, la nivelul granulelor plachetare se găseşte TGF- β cu rol de a inhiba creşterea coloniilor megakariocitare. 172

FIZIOLOGIA SANGELUI

10. Hematiile (globule roşii, eritrocite) Hematia este cea mai simplă celulă din organismul uman. Formată ca celulă nucleată în măduva hematogenă, ea îşi pierde, în mod normal, nucleul înainte de a ajunge în circulaţie. Intrată în circulaţie, hematia încă mai prezintă ribozomi, mitocondrii şi aparat Golgi. Aceste organite citoplasmatice se pierd după 1-2 zile şi hematia va căpăta forma de disc biconcav (fig. 83). Dimensiunile hematiei: diametru 7,8 μm; grosime 0,81 μm în porţiunea subţire şi 2,6 μm în porţiunea groasă a discului biconcav; suprafaţă 135 μm2. Hematia prezintă o plasticitate remarcabilă, fiind capabilă să treacă repetat prin capilare (cu diametru mult mai mic decât cel al hematiei) şi apoi să revină la forma sa iniţială. Hematia matură poate fi văzută ca Fig. 83. Forma hematiei o membrană celulară care conţine proteine, electroliţi şi alte componente a sistemelor energetice. 95% din proteinele eritrocitare sunt reprezentate de hemoglobină, restul este reprezentat de enzime din sistemul energetic cu activitate catalitică. Hematiile au multiple funcţii dar cea mai importantă este de transport al gazelor respiratorii (O2 şi CO2). 10.1. Membrana eritrocitară Membrana eritrocitară, ca şi a altor celule are o structură lipo-proteică. Lipidele membranare sunt de trei tipuri: fosfolipide, colesterol şi cantităţi mici de glicolipide (fig. 84). Fosfolipidele au un pol hidrofil şi unul hidrofob care formează un strat bimolecular, cu grupările hidrofile orientate către exterior şi grupările hidrofobe orientate către interiorul stratului bipolar. Fosfolipidele care conţin colină, fosfatidilcolină (lecitină) şi sfingomielină sunt, în principal, localizate în interiorul bistratului; fosfolipidele conţinând grupări amino (fosfatiletanolamina şi fosfatilserina) sunt localizate în interiorul bistratului lipidic. Lungimea şi gradul de saturaţie a reziduurilor de acizi graşi din fosfolipide influenţează puternic fluiditatea membranei. Aproximativ 55% din lipidele membranare eritrocitare sunt fosfolipide şi restul este reprezentat de colesterol care este prezent liber, sub formă neesterificată. Colesterolul interacţionează cu fosfolipidele, dacă raportul 173

FIZIOLOGIA SANGELUI

colesterol/fosfolipide în membrană creşte, membrana eritrocitară devine mai rigidă. Glicolipidele membranare sunt formate dintr-o bază lipidică numite ceramide, reprezentate de sfingozine şi acizi graşi cu lanţ lung la care sunt ataşate molecule de hexoze.

Fig. 84. Organizarea mermbranei hematiei

Proteinele membranare sunt clasificate în două categorii: proteine periferice şi proteine integrale. Proteinele integrale traversează bistratul lipidic şi interacţionează cu lanţurile de glucide ale membranei. Proteinele periferice care nu pătrund în stratul hidrofob al bistratului lipidic sunt localizate, în principal, pe faţa citoplasmatică a membranei (fig. 84). Ele sunt legate prin legături electrostatice sau legături de hidrogen în mijlocul suprafeţei polare a bistratului lipidic. Electroforetic s-au descris 5 benzi de proteine aflate în structura membranei eritrocitare: banda 5 este reprezentată de actina eritrocitară; banda 6 este reprezentată de enzima numită gliceralaldehida - 3 - fosfat dehidrogenaza (G3PD), benzile 1 si 2 sunt reprezentate de două lanţuri de spectrină. De asemeni, se mai vizualizează şi monomeri sau dimeri a două glicoproteine numite glicoforina A şi B (proteine integrale majore). Inafară de G3PD, la nivelul membranei 174

FIZIOLOGIA SANGELUI

eritrocitare se mai găsesc şi alte enzime: ATP-aza Na+-K+ (care menţine concentraţii mari de K+ intracelular şi concentraţii mici de Na+ extracelular), ATP-aza de Ca++ (care scoate calciul din celulă împotriva unui gradient de concentraţie de 50 de ori mai mare), un transportor de glucoză spre interiorul celulei (GLUT1), protein kinaze. Majoritatea enzimelor se găsesc pe suprafaţa citoplasmatică a membranei: acetilcolinesteraza, glicozidaze şi acid fosfataze cu funcţii necunoscute. 10.2. Hemoglobina Producţia de hemoglobină este un proces complex care necesită sinteza coordonată a diferitelor lanţuri de peptide (care constituie globina) şi sinteza hemului. Sinteza de hemoglobină începe în măduva hematogenă, la nivelul eritrocitelor nucleate, se continuă la un nivel redus, timp de 1-2 zile la nivelul reticulocitelor, iar la nivelul eritrocitelor mature sinteza de hemoglobină este sistată. 10.2.1. Hemul Hemul (fig. 85), protoporfirina IX feroasă, este sintetizat într-o serie de etape care încep la nivel mitocondrial cu condensarea glicinei şi succinil coenzimei A cu formarea acidului aminolevulinic (ALA). Această reacţie este catalizată de δ aminolevulinat sintetaza şi necesită prezenţa piridoxal fosfatului. Următoarele etape au loc în citoplasmă unde, catalizat de o dehidrază specifică, două molecule de Fig. 85. Structura hemului ALA vor condensa şi vor forma porfobilinogen. Patru molecule de porfobilinogen vor condensa pentru a forma tetrapirol linear, care apoi va cicliza. O parte din lanţurile inelului tetrapirolic vor fi succesiv reduse prin reacţii enzimatice suplimentare rezultând protoporfirina IX. La nivel mitocondrial, Fe+2 este inserat în inelul protoporfirinic, reacţie catalizată de o enzimă numită ferochelatază. Produsul, hemul este oprit prin sinteza primei enzime a acestui proces - δ 175

FIZIOLOGIA SANGELUI

aminolevulinat sintetaza. Astfel, sinteza hemului este reglată prin sinteza sa proprie. 10.2.2. Proprietăţile structurale ale hemoglobinei Molecula de hemoglobină este un tetramer cu greutate moleculară de 64400 Da. Prezintă două perechi de lanţuri polipeptidice care au o izomerizare conformaţională cu oxigenarea. Hemoglobina A (95% din hemoglobina adultului uman) conţine două lanţuri α şi două lanţuri β. Hemoglobina fetală umană (Hb F) conţine două lanţuri α şi două lanţuri γ, care diferă de lanţurile β prin secvenţa şi numărul de aminoacizi. Hemoglobina A2 se întâlneşte la 2-3 % din hemoglobina adultului; este compusă din două lanţuri α şi două lanţuri δ (lanţurile δ diferă prin 10 aminoacizi faţă de lanţurile β). Mecanismul prin care are loc transformarea Hb F în Hb A nu este cunoscut; pare să fie corelat cu maturitatea fetală şi are loc la scurt timp după naştere. Lanţurile individuale de hemoglobină (α, β şi γ) au proprietatea de a lega oxigenul (similar cu lanţul unic din mioglobină). Proprietăţile funcţionale ale hemoglobinei care îi permit să funcţioneze ca o proteină transportoare de oxigen necesită ca această proteină să fie asamblată sub formă de tetramer de lanţuri neidentice (α cu β sau δ cu γ). Hemoglobinele normale astfel formate (A, A2 şi F) diferă puţin în ceea ce priveşte proprietăţile lor funcţionale prin aceea că Hb F are o capacitate mai mică de a lega fosfaţii organici. Defecte în sinteza lanţurilor polipeptidice specifice apar clinic sub forma unor afecţiuni numite talasemii. 10.2.3. Proprietăţile funcţionale ale hemoglobinei Concentraţia hemoglobinei la nivel eritrocitar este de 32 g/dl. In eritrocit, hemoglobina transportă eficient oxigenul fără a exercita un efect osmotic aşa cum fac proteinele plasmatice. Proprietatea hemoglobinei de transportor de oxigen se explică în primul rând prin afinitatea mare a hemoglobinei pentru oxigen, astfel încât aceasta devine pe deplin saturată cu oxigen în plămâni. In al doilea rând legarea iniţială a oxigenului de hemoglobină facilitează legările ulterioare. Această caracteristică a legării de hemoglobină se numeşte interacţiunea hem-hem (legarea oxigenului de un hem afectează proprietăţile de legare ale altor molecule de hem). 176

FIZIOLOGIA SANGELUI

Modificarea afinităţii de legare a oxigenului de hemoglobină cu oxigenarea determină o curbă sigmoidă (vezi cap. ap. respirator) unde gradul de oxigenare sau procentul de saturare a hemoglobinei cu oxigenul este în funcţie de presiunea parţială a oxigenului (pO2) şi se numeşte curba de disociere a oxigenului de hemoglobină (vezi cap. “Fiziologia Respiraţiei”); In sfârşit, afinitatea hemoglobinei pentru oxigen se modifică în funcţie de pH-ul intracelular. Această proprietate a hemoglobinei a fost descrisă pentru prima dată de Bohr în 1904. Din capilarele tisulare, bioxidul de carbon trece în plasmă şi se leagă şi la nivelul eritrocitelor. Eritrocitele conţin anhidraza carbonică care transformă rapid bioxidul de carbon în acid carbonic, un acid slab care disociază în H+ şi HCO3-, scăzând pH-ul intracelular. Această creştere a concentraţiei de H+ scade afinitatea oxigenului pentru hemoglobină (efect Bohr) şi facilitează descărcarea oxigenului la ţesuturi. Deoxihemoglobina leagă H+ eliberaţi de acidul carbonic. Creşterea concentraţiei ionilor HCO3- determină difuzia acestora înafara eritrocitelor şi sunt înlocuiţi cu clorul. La nivel pulmonar procesul este invers; bioxidul de carbon este pierdut de către sânge, pH-ul creşte şi are loc şi creşterea afinităţii hemoglobinei pentru oxigen. Principalii modulatori al afinităţii oxigenului pentru molecula de hemoglobină este concentraţia ionilor de hidrogen (efect Bohr), temperatura, fosfatul organic (2,3 DPG-ATP) şi cel prezent în eritrocite (legat de magneziu). Creşterea temperaturii determină scăderea afinităţii oxigenului pentru molecula de hemoglobină. La nivel eritrocitar, 2,3 DPG se găseşte la o concentraţie echimolară cu hemoglobina (5mM); ea modifică afinitatea pentru oxigen prin două mecanisme: prin legarea la deoxihemoglobină şi prin efectul său asupra pH-ului intracelular (2,3 DPG este un anion puternic, impermeant care scade pH-ul intracelular). 10.2.4. Methemoglobina Fierul din structura hemului normal este în formă feroasă, în timpul legării reversibile a oxigenului fierul rămâne în stare feroasă. Când fierul feros din hem este oxidat la fier feric are loc formarea methemoglobinei care nu este capabilă prea mult timp să reacţioneze cu oxigenul. In soluţii acide, locul de legare a oxigenului este ocupat de apă, iar în soluţii alcaline este ocupat de grupări hidroxil. Methemoglobinemia apare în următoarele circumstanţe: 177

FIZIOLOGIA SANGELUI

- după expunerea hematiilor la substanţe toxice cum ar fi nitriţi, coloranţi anilinici şi unele droguri oxidante; - la heterozigoţi (statusul homozigot este letal), varianta M de hemoglobină în care substituirea aminoacizilor afectează hemul, produce oxidarea fierului; - la homozigoţii cu deficienţa reductazei NADH dependentă. Nivele de methemoglobină între 10-25% determină cianoză care, în mod obişnuit necesită tratament. La nivel de 35% pacienţii prezintă dispnee şi cefalee, nivelele de 70% sunt letale. Toxicitatea methemoglobinei este dată nu numai de incapacitatea sa de a transporta oxigenul ci şi de efectele sale privind echilibrul oxigenului în tetramerii de hemoglobină. 10.2.5. Carboxihemoglobina Monoxidul de carbon (CO), ca şi oxigenul, se leagă de fierul din hem, dar afinitatea hemoglobinei pentru CO este de 200 ori mai mare decât pentru oxigen; CO interferă cu transportul de oxigen pe următoarele două căi: CO poate ocupa fierul din toate moleculele de hem ale tetramerului şi astfel acesta nu mai poate lega oxigen. Simptomele toxicităţii cu CO apare la un nivel de 5-10% carboxihemoglobină; la 40% apare pierderea cunostinţei până la moarte. Afinitatea mare a CO pentru hemoglobină se datorează ratei reduse de disociere a CO de hem. Timpul de înjumătăţire a dispariţiei CO la un individ cu funcţie ventilatorie normală este de aproximativ 4 ore; administrarea de oxigen pur poate scurta timpul de înjumătăţire la 1 oră. 10.3. Distrugerea eritrocitelor Imbătrânirea normală şi moartea eritrocitelor este în funcţie de vârsta lor; modificările moleculare care stau la baza îmbătrânirii eritrocitare probabil determină alterări ale membranei eritrocitare. Fagocitele mononucleare din splină, ficat şi măduvă recunosc şi îndepărtează hematiile îmbătrânite. Hemoglobina, alte proteine şi lipidele membranare fagocitate sunt catabolizate în interiorul fagocitelor mononucleare. Hemul este disociat de globină şi este oxidat (într-o reacţie catalizată de enzime microsomale de tip hem-oxidaz cu ruperea structurii inelare a porfirinei şi eliberarea de fier). De aici fierul este preluat de transferină şi este transportat înapoi în normoblaşti pentru încorporarea într-o nouă moleculă de hemoglobină. 178

FIZIOLOGIA SANGELUI

Ruperea nucleului porfirinic duce la eliberarea unei molecule de oxid de carbon, care este eliminat prin plămâni. Molecula de biliverdină este redusă în bilirubină şi transportată prin plasmă, legată de albumină, pentru a fi excretată prin ficat. Aproximativ 3% din lipidele membranei eritrocitare se constituie ca glicolipide numite globoside care conţin lanţuri scurte de carbohidraţi. Degradarea globosidelor constă în clivarea moleculelor de glucide din lanţul de glucide. 10.4. Constante eritrocitare O clasă importantă de analize hematologice se referă la capacitatea sângelui de a transporta oxigen. Parametrii respectivi sunt numiţi, impropriu dar în mod curent, constante eritrocitare. Parametrii de bază din această categorie, care se determină direct, sunt hematocritul, numărul de hematii (dintr-un mm3 de sânge) şi, cel mai important, hemoglobina (concentraţia hemoglobinei, exprimată în grame pe decilitru de sânge). Pe baza acestora se calculează un număr de parametri derivaţi, utili pentru evaluarea aprofundată a capacităţii sângelui de a transporta oxigen şi în consecinţă ca elemente de analiză de laborator pentru clasificarea anemiilor şi încadrarea diagnostică a unei anemii. Valoarea globulară (indice de culoare) este un indice relativ care permite aprecierea încărcării procentuale cu hemoglobină a sângelui de cercetat în funcţie de numărul de eritrocite. Se calculează după relaţia: Val. Globulară = concentraţia Hb / Nr. hematii Valori normale = 0,85 – 1,15 Scăderea sub 0,85 se numeşte hipocromie (încărcare insuficientă cu hemoglobină a hematiilor), iar creşterea peste 1,15 se numeşte hipercromie (nu exprimă o situaţie reală deoarece hematiile nu se pot încărca cu hemoglobină peste 34%). Volumul eritrocitar mediu se calculează astfel: VEM = valoarea hematocritului x 10/număr hematii Valori normale: 82 - 92 μ3 (normocite). Pentru valori de 110 - 140 μ3 celulele se numesc macrocite (până la megalocite), iar pentru valori de 50 - 70 μ3 se numesc microcite

179

FIZIOLOGIA SANGELUI

Conţinutul eritrocitar mediu în hemoglobină reprezintă cantitatea de hemoglobină conţinută într-un eritrocit. Se calculează astfel: HEM = cantitatea de hemoglobină /numărul de hematii x 10-6 Valori normale = 26 – 31 µg Valori crescute apar la macrocite, iar valori scăzute apar la microcite. Concentraţia eritrocitară medie de hemoglobină reprezintă procentul din volumul eritrocitar ocupat de hemoglobină. Se calculează după formula: CHEM = 15 x 100/45 Valorile normale sunt cuprinse între 32% şi 34%. 10.5. Grupele sanguine Membrana hematiilor (vezi cap. 10.1) prezintă pe suprafaţa sa antigene specifice numite aglutinogene. Cele mai importante şi cele mai cunoscute sunt aglutinogenele A şi B; în funcţie de prezenţa acestor aglutinogene se descriu 4 grupe sanguine (0, A, B şi AB). Inafara acestor antigene mai sunt câteva sute de antigene slabe; sunt utile pentru stabilirea paternităţii. Antigenele A şi B se găsesc şi în alte ţesuturi (înafară de sânge): glanda salivară, pancreas, rinichi, ficat, plămân, testicul, lichid amniotic. Din punct de vedere structural, aglutinogenele A şi B sunt glicoproteine care se deosebesc între ele printr-un singur reziduu glucidic. Anticorpii (de clasă IgM) împotriva aglutinogenelor se numesc aglutinine şi se găsesc în plasmă. Ei pot fi naturali (moşteniţi) sau pot fi produşi prin expunerea hematiilor la un alt tip sanguin (prin transfuzie sau în cursul sarcinii). Aglutininele împotriva aglutinogenelor A şi B sunt moştenite. Astfel, persoanele cu grupa sanguină A (care prezintă aglutinogene A pe hematii) vor avea întotdeauna un titru ridicat de anticorpi împotriva aglutinogenului B numite aglutinine anti-B sau β. Persoanele cu grupa sanguină B vor avea un titru ridicat de aglutinine anti-A sau α. In sfârşit, persoanele cu grupa sanguină 0 prezintă aglutinine anti-A şi anti-B, iar cei cu grupa sanguină AB nu prezintă aglutinine. Determinarea grupei de sânge se realizează prin amestecarea hematiilor unui individ cu antiserul corespunzător pe o lamă de sticlă şi se observă dacă are loc sau nu aglutinarea. Aglutininele din plasmă sunt γ-globuline (IgG şi IgM) şi fabricarea lor este determinată de pătrunderea în organism a unor cantităţi mici de antigene de grup A şi B odată cu alimentele, bacteriile etc; aceste substanţe 180

FIZIOLOGIA SANGELUI

iniţiază dezvoltarea aglutininelor anti-A şi anti-B. Unele persoane cu aglutinogen A pe hematii mai prezintă un aglutinogen suplimentar numit aglutinogenul A1; din acest motiv grupa sanguină A este subîmpărţită în subtipul A1 (sunt prezente ambele aglutinogene A) şi subtipul A2 (este prezent numai un aglutinogen A). Prezenţa acestui aglutinogen suplimentar a determinat descrierea a 6 grupe sanguine în sistemul AB0: 0, B, A1, A2, A1B şi A2B (tab. 10). Dintre toate grupele sanguine, grupele 0 şi A sunt cele mai frecvente şi sunt la aproximativ 85% din populaţia Europei. Antigenele A1, A2 şi B se transmit mendelean; aceste antigene fiind dominante. De exemplu, un individ cu grupa sanguină B poate moşteni antigenul B de la fiecare părinte sau un antigen B de la un părinte şi 0 de la celălat părinte; astfel, persoana a cărui fenotip este B poate avea genotipul BB (homozigot) sau genotipul B0 (heterozigot). Când grupa sanguină a părinţilor este cunoscută se poate estima genotipul copilului. Când ambii părinţi au grupa sanguină B, genotipul copilului poate fi BB (un antigen B de la fiecare părinte), B0 (un antigen B de la un părinte şi 0 de la celălalt părinte heterozigot) sau 00 (un antigen 0 de la fiecare părinte heterozigot). De asemenea, când grupa sanguină a mamei şi a copilului sunt cunoscute se poate preciza grupa sanguină a tatălui (test de paternitate folosit în medicina legală). Imediat după naştere cantitatea de aglutinine din plasmă este aproape zero. Intre 2-8 luni de viaţă extrauterină încep să se producă aglutininele (aglutinine anti-A când aglutinogenele de tip A nu sunt prezente pe hematii şi aglutinine anti-B când aglutinogenele de tip B nu sunt prezente pe hematii). Titrul maxim se întâlneşte la vârsta de 8-10 ani şi scade gradat către sfârşitul vieţii. Tab. 10. Grupele sanguine din sistemul AB0 Grupa sanguină Aglutinine (plasmă) 0 Anti-A şi Anti-B A1 Anti-B A2 Anti-B B Anti-A A1B A2B -

Aglutinogene (hematii) A1B, A2B A1B, A2B B A1, A1B, A2, A2B A1, A1B, A2, A2B

10.5.1. Compatibilitatea transfuzională Inainte de a efectua o transfuzie de sânge este necesar să se determine grupa sanguină a primitorului şi să se stabilească dacă sângele donatorului 181

FIZIOLOGIA SANGELUI

se “potriveşte” cu cel al primitorului. Această potrivire poartă numele de compatibilitate sanguină (transfuzională). Hematiile din grupul 0 nu au aglutinogene şi nu vor reacţiona cu serul anti-A sau anti-B. Hematiile din grupul A au aglutinogene A şi vor aglutina cu serul anti-A. Tipul B de sânge are aglutinogene B şi va aglutina cu serul anti- Tab. 11. Grupele sanguine AB0 B. Tipul AB de sânge are aglutinogene A Grupa Ser anti-A Ser anti-B 0 şi B şi aglutinează cu ambele seruri. A + Stabilirea grupei sanguine se bazează pe B + AB + + prezenţa (+) sau absenţa (-) aglutinării la contactul cu serurile hemotest (tab. 11). Reacţiile transfuzionale apar când este transfuzată o cantitate de sânge incompatibil. Cu alte cuvinte, când în plasma primitorului se găsesc aglutinine împotriva hematiilor donatorului are loc aglutinarea hematiilor şi hemoliza acestora. Hemoglobina de pe hematiile hemolizate va fi eliberată în plasmă. Severitatea reacţiei transfuzionale poate varia de la o creştere minoră asimptomatică a nivelului de bilirubină din plasmă până la icter sever cu afectare tubulară renală însoţită de anurie şi moarte. Persoanele cu grupa sanguină AB sunt considerate ”primitori universali” deoarece ei nu prezintă aglutinine circulante şi pot primi sânge (maximum 500 ml) de la orice grup sanguin fără a dezvolta o reacţie transfuzională de incompatibilitate sanguină. Persoanele cu grupa sanguină 0 sunt considerate “donatori universali” deoarece ei nu prezintă aglutinine. Totuşi acest lucru nu înseamnă că poate fi transfuzată o cantitate mare de sânge fără a determina producerea reacţiilor transfuzionale de incompatibilitate sanguină deoarece există posibilitatea producerii unor astfel de reacţii de subtipurile de grupe sanguine înafară de cele din sistemul AB0. Pentru a testa compatibilitatea sanguină, o picătură din sângele primitorului se amestecă cu o picătură din sângele donatorului şi se observă dacă apare aglutinarea. Se transfuzează sânge izogrup şi izoRh în orice cantitate are nevoie primitorul. In situaţia când nu avem la dispoziţie sânge izogrup şi izoRh se foloseşte sânge din grupe compatibile cu condiţia ca volumul transfuzat să fie sub 10% din volumul total sanguin al pacientului (maximum 500 ml).

182

FIZIOLOGIA SANGELUI

10.5.2. Factorul Rh Ca şi sistemul AB0, sistemul Rh prezintă o importanţă clinică majoră. Factorul Rh, numit după maimuţa Rhesus deoarece a fost pentru prima dată studiat pe sângele acestui animal, este un sistem compus din mai mulţi antigeni. Pe hematiile umane se găsesc trei antigene Rh (C, D şi E); antigenul D este cel mai important; numele de Rh pozitiv înseamnă că persoana respectivă prezintă aglutinogenul D pe hematii (85% din populaţie), iar Rh negativ sunt persoanele care nu au acest antigen (15% din populaţie). Transmiterea antigenului D se face dominant astfel încât genotipurile Dd sau DD vor determina Rh pozitiv. Un primitor Rh negativ poate prezenta un răspuns imun împotriva unui sânge Rh pozitiv transfuzat; dar, spre deosebire de aglutininele din sistemul AB0, în plasma persoanelor Rh negative nu se găsesc anticorpi anti-Rh. Aşadar, la un prim contact cu sânge Rh pozitiv nu are loc aglutinarea hematiilor primitorului, dar această expunere sensibilizează sistemul imun la antigenul Rh şi la o nouă transfuzie cu sânge Rh pozitiv apare aglutinare şi hemoliză. Sensibilizarea Rh are loc şi când mama Rh negativă dă naştere unui copil Rh pozitiv (factorul Rh se transmite de la tată). Eritrocitele fetale, separate în mod normal de circulaţia maternă prin placentă, pot intra în circulaţia maternă în timpul în timpul naşterii când placenta este îndepărtată de pe peretele uterin. Aceasta va determina o producţie crescută de anticorpi anti-Rh de către mamă şi la o nouă sarcină aceşti anticorpi (de clasă Ig G) trec în circulaţia fetală determinând hemoliza hematiilor fetale, care stă la baza bolii hemolitice a nou-născutului (eritroblastoza fetală). Dacă hemoliza e severă copilul poate muri in utero sau poate dezvolta anemie, icter sever şi edem cerebral (hidrops fetal). Boala hemolitică a nou-născutului apare la aproximativ 17% din feţii Rh pozitivi născuţi de mame Rh negative care au mai avut sarcini anterioare. Acest fenomen poate fi prevenit prin administrarea de anticorpi anti-D sub formă de globulină umană imediat după naştere. Hematiile D pozitive circulante sunt “învelite” cu anticorpi exogeni şi sunt distruse înainte ca ele să poată stimula sistemul imun matern. Această imunizare pasivă temporară (conferită de Ig G injectate) nu este dăunătoare pentru mamă şi va preveni formarea de anticorpi activi la mamă.

183

FIZIOLOGIA SANGELUI

11. Leucocitele (globulele albe) Sângele conţine aproximativ 4000 - 8000 leucocite/mmc. In funcţie de aspectul histologic se pot deosebi 5 tipuri principale de leucocite împărţite în două grupuri morfologice. Granulocitele polimorfonucleare au un nucleu neregulat, multilobat şi o mare densitate de granulaţii în citoplasmă; din acestă categorie fac parte neutrofilele (40 - 75%), eozinofilele (1 - 6%) şi bazofilele (sub 1%). Agranulocitele sunt lipsite de granulaţii şi prezintă un nucleu mare, regulat; din acestă categorie fac parte limfocitele (20 - 45%) şi monocitele (2 - 10 %). Aspectele descrise aici pot fi observate în fig. 80. 11.1. Neutrofilele Neutrofilele sunt celule care prezintă o citoplasmă de culoare7 roz “neutru”, granulaţii roşii şi un nucleu cu 2 - 5 lobi. O parte din neutrofilele circulante prezintă un nucleu nelobat şi sunt descrise ca fiind celule tinere. Granulaţiile neutrofilelor pot fi primare, care conţin diverse enzime printre care lizozim (digeră peretele bacterian) şi peroxidază (cu rol reducător al apei oxigenate) şi granulaţii secundare sau granulaţii specifice care, pe lângă enzimele prezente în granulaţiile primare mai conţin lactoferină, substanţe bactericide cationice şi proteine care leagă vitamina B12. Toate aceste substanţe proteice din componenţa granulaţiilor neutrofilelor interferă cu metabolismul bacterian având drept consecinţă distrugerea bacteriilor. La ~12 ore de la producerea lor de către măduva hematogenă, neutrofilele migrează în ţesuturile extravasculare unde trăiesc 4 - 5 zile. Ele sunt atrase la locul leziunii extravasculare de agenţii chemotactici; aceşti agenţi chemotactici sunt eliberaţi de către microorganisme, ţesuturi lezate, macrofage şi chiar de către granulocitele prezente deja la locul leziunii. Fenomenele de bază implicate în funcţia neutrofilelor în cadrul sistemului de apărare împotriva micro-organismelor (diapedeza, fagocitoza) sunt detaliate mai jos (cap. 12). 11.2. Eozinofilele Aceste celule au cel mai adesea nucleul bilobat, citoplasma lor conţine granulaţii mari de culoare roşu strălucitor. După ce sunt eliberate în circulaţie, eozinofilele migrează în ~30 minute în ţesuturile extravasculare 7

Descrierile de culoare din acest capitol se referă strict la apectul dat de coloraţia standard hematoxilină-eozină

184

FIZIOLOGIA SANGELUI

unde supravieţuiesc câteva săptămâni. Ca şi neutrofilele, eozinofilele sunt celule mobile; mişcarea lor este direcţionată de agenţii chemotactici. Eozinofilele sunt fagocite; ele distrug microorganismele prin mecanisme oxidative asemănătoare cu cele descrise la neutrofile. Creşterea numărului de eozinofile (eozinofilie) în sângele periferic este caracteristică infestărilor parazitare. Eozinofilele sunt incapabile să ingere paraziţii, iar mecanismul prin care ele acţionează este exercitarea de efecte citotoxice. De asemenea, eozinofilia se mai întâlneşte şi la pacienţii alergici sau cu hipersensibilitate cum ar fi astmul, unde expunerea la antigene endogene sau exogene declanşează reacţia imunologică imediată mediată prin eliberarea de leucotriene şi de factor activator plachetar. 11.3. Bazofilele Bazofilele sunt celule cu nucleu polilobat, iar în citoplasmă prezintă granulaţii de culoare albastră. Ca şi neutrofilele şi eozinofilele, bazofilele sunt celule mobile cu proprietăţi fagocitare. Ele migrează în ţesuturile extravasculare unde sunt stimulate de complexele antigenice. Aceste complexe reacţionează cu receptorii specifici pentru IgG de pe suprafaţa bazofilelor determinând eliberarea din granulaţiile lor specifice a mediatorului chimic (histamina). Histamina este răspunzătoare de apariţia unui răspuns anafilactic sistemic puternic sau de apariţia unei vasodilataţii locale şi creşterea permeabilităţii vasculare (edemul local). 11.4. Monocitele Monocitele sunt cele mai mari leucocite (diametrul lor este de 15 – 20 μm). Ele prezintă un nucleu reniform şi granulaţii citoplasmatice fine de culoare roz. Monocitele sunt eliberate în circulaţie din măduva hematogenă atunci când sunt mature şi apoi migrează în ţesuturi (ficat, splină, noduli limfatici, plămân) unde pot sta zile sau chiar ani, intrând în componenţa sistemului reticulo-endotelial. Altfel spus, macrofagele fac parte dintr-un ansamblu circulant denumit complex monocite-macrofage; celulele acestui complex prezintă particularităţi în funcţie de ţesutul în care ajung şi acţionează. Monocitele sunt celule mobile; ele putând fagocita microorganisme, celule lezate sau moarte precum şi proteine denaturate. Monocitele mai participă şi la elaborarea răspunsurilor imune prin ingerarea antigenelor şi sunt stimulate să secrete IL-1 care declanşează proliferarea şi 185

FIZIOLOGIA SANGELUI

maturarea limfocitelor T. Alte roluri ale monocitelor: eliberarea de tromboplastină tisulară, de activator al plasminogenului, de enzime proteolitice etc. Funcţiile macrofagelor includ: procesarea antigenului şi modularea activităţii limfocitelor în răspunsul imun; fagocitarea diverselor microorganisme, celule şi ţesututuri moarte; curăţirea sângelui8 de proteine denaturate, celule bătrâne, microbi. Macrofagele active secretă citokine multifuncţionale (IL-1 şi factorul de necroză tumoral) cu rol important atât în răspunsul general al organismului împotriva agenţilor infectioşi cât şi în reglarea hematopoezei. 11.5. Limfocitele Limfocitele reprezintă un grup heterogen de celule care au nuclei mari, iar citoplasma este lipsită de granulaţii. Limfocitele B sunt recunoscute prin prezenţa imunoglobulinelor de pe suprafaţa lor; prin stimulare cu antigen ele sunt transformate în plasmocite care sintetizează şi secretă anticorpi specifici (imunoglobuline). Limfocitele T pot fi identificate deoarece au pe suprafaţa lor receptori pentru eritrocitele de oaie. Ele participă la răspunsurile imune mediate celular şi nu depind de prezenţa anticorpilor circulanţi. Limfocitele T helper sau celulele supresoare, stimulează sau inhibă transformarea limfocitelor B în celule producătoare de anticorpi. Limfocitele citotoxice produc liza celulară când sunt sensibilizate de antigenele de pe suprafaţa celulelor participând la fenomenele de rejet a grefei tisulare incompatibile cu cele ale gazdei. Limfocitele killer sunt capabile să distrugă diverse celule tumorale sau celule infectate viral. Sunt celule asemănătoare limfocitelor cu granulaţii în citoplasmă. Mecanismul nu este specific vreunui virus particular sau unui anumit tip de tumoră; expunerea antigenică anterioară nu este necesară. 12. Ansamblul reacţiilor de apărare Apărarea imună a organismului este subîmpărţită clasic în: apărare nespecifică (înăscută) şi apărare specifică (dobândită). Apărarea nespecifică cuprinde mecanismele de apărare care acţionează împotriva oricăror celule străine; este înăscută deoarece nu depinde de expunerea anterioară a organismului la antigenul respectiv. Procesele imune nespecifice includ: 8

macrofagele asociate cu capilarele sinusoide din ficat, splină şi măduva hematogenă

186

FIZIOLOGIA SANGELUI

barierele fizice (pielea, epiteliul care căptuşeste tractul gastro-intestinal, genito-urinar şi respirator), inflamaţia (inclusiv fenomene de diapedeză şi fagocitoză), activarea sistemului complement şi activitatea celulelor nativ citotoxice (NK = natural killer). 12.1. Inflamaţia Urmare a prezenţei ţesuturilor distruse, inflamaţia reprezintă un ansamblu de răspunsuri celulare şi vasculare care au drept scop accelerarea distrucţiei celulare şi îndepărtarea micro-organismelor răspunzătoare de acest fenomen. O primă etapă a procesului inflamator este migrarea macrofagelor tisulare adiacente, a neutrofilelor şi a monocitelor la locul invaziei bacteriene ca urmare a substanţelor eliberate de ţesuturile lezate şi celulele infectate (chemotaxine). Neutrofilele şi monocitele se dispun pe un singur rând lângă endoteliul capilar din zona afectată (marginalizare), şi apoi trec prin peretele capilar (diapedeză) prin mişcări amiboidale, ajungând la locul invaziei bacteriene (fig. 86). Acest proces de concentrare a leucocitelor în ţesutul inflamat este accelerat de creşterea debitului sanguin prin vasoFig. 86. Marginaţia şi diapedeza dilataţie locală. Modificările vasculare apar ca urmare a producerii de substanţe vasodilatatoare de către ţesuturile lezate (kinine, amine, prostaglandine). Kininele activează cascada enzimelor proteolitice cunoscute ca sistemul kinină-kalicreină cu producere de kinine vasoactive, în special bradikinină. Bazofilele şi celulele mastocitare eliberează vasodilatotori cum ar fi serotonina, histamina precum şi un anticoagulant (histamina). Prostaglandinele amplifică reacţiile inflamatorii. In inflamaţia acută sosesc la locul inflamaţiei întâi granulocitele şi apoi macrofagele.

187

FIZIOLOGIA SANGELUI

Macrofagele provin în principal din monocitele sanguine atrase de chemoatractanţii din zonele inflamate şi sunt reţinute la locul inflamat prin mecanisme care produc aderarea celulară la suprafeţe şi diferenţiere. Acest proces implică creşterea suprafeţei celulare prin fenomenul numit împrăştiere. Imprăştierea rezultă din reacţii ale suprafeţei monocitare în care sunt implicate două componente ale sistemului complement (factorii B şi C5) precum şi plasmina. Al doilea mecanism pentru aderare şi reţinerea macrofagelor la locul inflamat implică legarea monocitelor-macrofagelor de suprafeţele celulare printr-o proteină numită fibronectină. Legarea de fibronectină creşte activitatea receptorilor de suprafaţă ai monocitelor-macrofagelor implicaţi în fagocitoză şi induce secreţia de proteaze şi de activator al plasminogenului necesar pentru funcţia de scavenger a macrofagelor. In aria de inflamaţie se poate forma o celulă multinucleată, gigantă stadiul terminal al dezvoltării monocitelor-macrofagelor - prin fuziunea aparentă a mai multor macrofage. Celulele gigantice multinucletate au un rol deosebit în procesul inflamator şi constituie granulomul, unde limfocitele T, plasmocitele şi monocitele sunt organizate într-o relaţie spaţială cu celulele gigantice multinucleate. Interferonul (secretat de limfocitele T) intervine în formarea celulelor gigantice multinucleate din structura granulomului. Aceste celule au proprietăţi fagocitare. Răspunsul inflamator are efecte locale şi sistemice caracteristice locului inflamaţiei precum şi tipului de infecţie. Local, se produc următoarele modificări: roşeaţă şi creşterea temperaturii locale prin creştere de flux sanguin; edem local ca urmare a creşterii permeabilităţii capilare ce permite lichidelor să treacă în ţesuturi; eliberarea unor substanţe din ţesuturile lezate, având ca rezultat stimularea receptorilor pentru durere. Proteinele plasmatice şi factorii de coagulare contribuie la formarea reţelei de fibrină care va constitui o barieră împotriva împrăştierii infecţiei. Reacţiile sistemice ca urmare a infecţiei includ următoarele aspecte. Temperatura corpului poate creşte ca rezultat al resetării hipotalamice. Febra (pirexia) va determina creşterea activităţii fagocitelor; ea este declanşată de producerea de pirogeni exogeni (de către bacterii) şi endogeni (de către fagocite). Creşterea numărului de leucocite în sânge (leucocitoză), pe seama neutrofilelor (neutrofilie). Aceasta reflectă atât mobilizarea rapidă a

188

FIZIOLOGIA SANGELUI

neutrofilelor prezente deja în măduva hematogenă precum şi o creştere a ratei de producere a măduvei hematogene. 12.2. Fagocitoza Rolul major al neutrofilelor este de apărare (nespecifică) împotriva infecţiilor prin înglobarea şi apoi distrugerea microorganismelor; acest proces se numeşte fagocitoză. Distrugerea bacteriilor de către neutrofile începe prin ataşarea lor la suprafaţa neutrofilului; proces care se datorează proteinelor de adeziune (în special fibronectina), precum şi anticorpilor şi opsonine care se găsesc pe suprafaţa bacteriei. Neutrofilele emit pseudopode care vor încercui bacteriile care sunt ataşate de neutrofile şi va avea loc includerea bacteriei într-o vacuolă numită fagozom. Bacteria este distrusă în interiorul fagozomului prin acţiunea enzimelor eliberate de granulaţiile neutrofilelor. Aceste enzime sunt reprezentate de lizozim, care este Fig. 87. Fagocitoza răspunzător de ruperea membranei externe a bacteriei precum şi de enzime care induc o creştere a consumului de oxigen de către neutrofil cu consecinţă imediată în producerea de apă oxigenată, ioni superoxid şi radicali hidroxil (fig. 87). Dintre aceste specii, principalul agent bactericid este apa oxigenată care oxidează componentele bacteriene prin generarea de acid hipocloros ca urmare a interacţiunii ionilor de clor cu mieloperoxidaza (o enzimă eliberată de granulaţiile primare). Lactoferina contribuie la distrugerea bacteriilor prin legarea fierului utilizat de bacterii şi generarea de radicali hidroxil. In acest proces de fagocitoză are loc şi eliberarea enzimelor de la nivelul neutrofilelor precum şi a metaboliţilor oxigenului, ca urmare a distrugerii neutrofilelor, în mediul înconjurător care vor determina modificări tisulare însoţite de reacţii inflamatorii. Creşterea numărului de neutrofile circulante (neutrofilie) reprezintă răspunsul caracteristic la infecţia cu diverse 189

FIZIOLOGIA SANGELUI

microorganisme. Această creştere se datorează mobilizării neutrofilelor marginale precum şi prin stimularea producerii acestor celule. 12.3. Activarea sistemului complement Bacteriile prezintă pe suprafaţa lor molecule care activează sistemul complement al proteinelor plasmatice; ele reprezintă o familie de precursori inactivi care sunt activaţi prin clivaj proteolitic. Sistemul este organizat ca o cascadă în care fiecare component activat îl activează pe următorul din secvenţă (fig. 88). Activarea complementului are scop de apărare împotriva infecţiei direct prin celulele killer şi prin declanşarea fagocitozei (fig. 89). Ultimele 5 componente din sistem (C5-C9) se combină în complexul proteic de atac membranar, care se inseră în membrana celulei ţintă, formând un por larg. Când densitatea porilor este mare are loc liza celulară. Activarea complementului duce şi la formarea unor fragmente de complement active ce Fig. 88. Activarea complementului, calea clasică facilitează fagocitoza. 12.4. Imunitatea specifică sau dobândită Imunitatea specifică implică mecanisme prin care susceptibilitatea la infecţie a unui organism este mult redusă în urma expunerii sale la infecţii. Faptul este demonstrat de bolile copilăriei în care imunitatea dobândită la prima infecţie protejează organismul pentru un nou contact cu acelaşi agent infecţios (fig. 89). Vaccinurile stimulează imunitatea fără a produce boala. Imunitatea specifică creşte capacitatea sistemului imun de a răspunde la prezenţa antigenelor, iar mecanismele activate sunt ţintite împotriva unui anumit antigen. Antigenele sunt în general molecule mari (greutate moleculară peste 10000 Da), complexe. Moleculele mici, numite haptene, pot şi ele stimula un răspuns imun numai dacă au ataşate câte o proteină. 190

FIZIOLOGIA SANGELUI

După sensibilizare răspunsul imun poate fi stimulat chiar şi de către moleculele de haptene. Răspunsurile imune specifice implică participarea limfocitelor şi sunt mediate atât prin anticorpi (răspuns umoral) sau celular. Limfocitele sunt celule efectoare pentru răspunsurile imune la imunogene; de exemplu, materiale care nu sunt Fig. 89. Expunerea la antigen şi titrul Ac recunoscute ca self şi astfel sunt declanşate reacţii desemnate pentru a neutraliza sau distruge structuri non-self. Răspunsurile imune intervin în combaterea invaziei de către microorganisme a organismului, stau la baza reacţiei de respingere a organelor transplantate de la indivizi cu antigene de histocompatibilitate diferite de cele ale primitorului şi afectează creşterea celulelor maligne. Răspunsurile imune sunt de două tipuri: răspuns imun mediat celular şi răspuns imun mediat umoral (de anticorpi); la aceste 2 tipuri de răspunsuri imune este necesară participarea atât a limfocitelor cât şi a macrofagelor. Limfocitele se clasifică în trei clase funcţionale: - limfocite T, care intervin în reglarea şi medierea reacţiilor imune precum şi în sinteza anticorpilor; - limfocite B, care produc unii anticorpi şi care sunt precursori ai plasmocitelor, principalele celule formatoare de anticorpi; - celulele natural killer (NK), care constituie o fracţiune redusă din limfocite; distrug anumite celule ţintă fără o stimulare antigenică anterioară. Macrofagele şi celulele accesorii înrudite (celulele dendritice din nodulii limfatici şi celulele Langerhans din piele) realizează procesele necesare de prelucrare şi prezentare a antigenelorr, secretă citokine care susţin răspunsul imun şi, după activarea macrofagelor de către limfocitele T, distrug microorganismele. 12.5. Complexul major de histocompatibilitate şi imunitatea Recunoaşterea imunitară implică interacţiunea limfocitelor T cu moleculele specifice de la suprafaţa celulară numite molecule de clasă I şi 191

FIZIOLOGIA SANGELUI

molecule de clasă II. Acestea sunt produse de genele de pe cromosomul 6, grupate (cluster). Clusterul respectiv a fost numit complex major de histocompatibilitate (CMH) deoarece determinanţii antigenici de clasă I şi II apar dacă organul sau ţesuturile transplantate sunt recunoscute ca self sau non-self şi astfel sunt acceptate sau respinse. La om complexul major de histocompatibilitate mai este cunoscut şi sub numele de HLA (antigen leucocitar uman), deoarece a fost mai întâi recunoscut prin analiza reacţiilor dintre limfocitele din sângele periferic şi serul care conţine anticorpi. Sistemul HLA conţine patru locusuri: HLA-A; HLA-B; HLA-C şi HLA-D. De asemenea, HLA-D prezintă, la rândul lui, trei locusuri numite DP, DQ şi DR. Genele de la HLA- A, B şi C codifică lanţurile grele a moleculelor de clasă I, iar genele de la DB, DQ şi DR codifică moleculele de clasă II. Marea majoritate a celulelor nucleate posedă molecule de clasă I pe suprafaţa lor membranară. Acestea sunt legate necovalent de heterodimeri (complexe cu două lanţuri polipeptidice neidentice) constituind un lanţ mic (β2-microglobulinic) şi un lanţ greu mare. Lanţul β2-microglobulinic, care este codificat de gene de pe cromosomul 15, este invariabil (toate lanţurile β2-microglobulinice ale moleculelor de clasă I sunt aceleaşi). Lanţurile grele sunt codificate de gene înalt polimorfe (mai multe gene alele există pentru fiecare locus). Deşi o persoană moşteneşte 3 gene pentru lanţurile grele de la fiecare părinte, moleculele de clasă I ale unui individ constituie un uriaş amestec de molecule care conţin mai mult de 6 lanţuri grele diferite. Moleculele de clasă II sunt exprimate normal numai în unele tipuri de celule: celule stem hematopoetice, limfocite B, monocite şi macrofage, precum şi celule dendritice şi celule Langerhans. Când sunt activate limfocitele T exprimă şi moleculele de clasă II; limfocitele activate pot secreta limfokine, γ-interferon care amplifică expresia moleculelor de clasă II pe macrofage şi pot produce molecule de clasă II exprimate în alte celule cum ar fi celulele endoteliale. Moleculele de clasă II sunt heterodimeri de lanţuri α şi β, dar diferă de heterodimerii clasei I prin ambele polipeptide. In reglarea producţiei de anticorpi şi iniţierea reacţiilor imune mediate celular, limfocitele T helper recunosc fragmentele imunogenice ale antigenelor procesate la nivelul moleculelor de clasă II de pe suprafaţa macrofagelor sau limfocitelor B. Moleculele de clasă I sunt implicate în sensibilizarea diferitelor tipuri de limfocite T la antigenele virale sau celulare care apar în asociaţie cu moleculele de clasă I pe suprafaţa celulelor 192

FIZIOLOGIA SANGELUI

infectate cu diverşi viruşi. Deci, are loc nu numai sensibilizarea evenimentelor iniţiale dar şi atacul ulterior al limfocitelot T citotoxice pe celula ţintă, care depinde de recunoaşterea de către limfocite a antigenului în asociaţie cu moleculele de clasă I de pe suprafaţa celulară. 12.6. Limfocitele T Precursorii celulei T migrează din măduva osoasă în cortexul timic unde celulele suferă o diviziune celulară cu un ritm extrem de mare. Marea majoritate a acestor timocite tinere mor în interiorul cotexului timic. O mică parte din limfocitele provenite din locul de diviziune de la nivelul cortexului timic migrează la nivelul medularei timice unde vor suferi diferenţieri ulterioare. Celulele T care trăiesc la acest nivel posedă pe suprafaţa lor un receptor cu proprietăţi de recunoaştere: - receptorul face distincţia între proteinele CMH străine (altele decât moleculele de clasă I şi II) şi proteinele CMH proprii; el reacţionează cu primele şi le tolerează pe ultimele; - cu toate că receptorul nu reacţionează cu proteinele CMH proprii, acesta recunoaşte şi reacţionează cu un complex formând un peptid derivat din antigen legat de proteina CMH proprie; - receptorul de la fiecare celulă T va fi clonotipic; de exemplu, va recunoaşte numai un singur determinant imunogenic specific (epitop) a peptidului derivat din antigenul legat de o proteină CMH. Receptorul antigenic al celulei T este un complex cu multe subunităţi (fig. 90); în aproximativ 95% din celulele T complexul receptor conţine lanţuri polipeptidice legate prin punţi disulfidice numite lanţuri α şi β, care mediază recunoaşterea antigenului. Aceste lanţuri sunt legate necovalent la 5 lanţuri invariabile (α, δ, ε şi două lanţuri γ) care sunt implicate în transducerea semnalului; se trimite un semnal spre interiorul celulei al cărui receptor este ocupat. Anticorpii monoclonali funcţionează pentru recunoaşterea unui antigen cu lanţuri Fig. 90. Limfocit T invariabile a complexului; acest antigen este numit şi CD3, iar 193

FIZIOLOGIA SANGELUI

complexul cu lanţuri invariabile se numeşte complexul CD3. Lanţurile polipeptidice α şi β a fiecărei celule au segmente “hipervariabile” care conţin o secvenţă unică de aminoacizi care permite receptorului antigenic al acestei celule să recunoască epitopul specific al fragmentului antigenic legat de proteina CMH. In timpul procesării timice a limfocitelor T are loc achiziţionarea unor molecule glicoproteice de suprafaţă care, pe o cale necunoscută, determină dacă receptorul antigenic al celulei T va reacţiona cu un peptid antigenic legat de moleculele de clasă I sau de moleculele de clasă II. Aceste două glicoproteine de suprafaţă pot fi identificate prin reacţia lor cu anticorpii monoclonali care recunosc un antigen numit CD4 prezent pe una din glicoproteine şi un antigen CD8 prezent pe altă glicoproteină. Cu toate că celulele T existente posedă atât antigenul CD4 cât şi CD8, celulele T eliberate din timus pentru a intra în ţesutul limfoid periferic conţin numai unul din antigene; de exemplu, CD4+ (referindu-se la celulele T4) sau CD8+ (referindu-se la celulele T8). 12.6.1. Recunoaşterea antigenului şi activarea celulei T Celulele T eliberate din timus circulă liber prin organism, deplasânduse între sângele circulant şi ţesuturile limfoide periferice. Fiecare celulă este programată să recunoască un determinant antigenic specific care va fi procesat în interiorul celulei şi exprimat la suprafaţa celulei în asociere cu proteine CMH. Astfel, celulele T ar trebui să se găsească în proximitatea fizică a antigenului pentru a-l recunoaşte şi a se activa. Celulele CD4+ recunosc peptidele antigenice exprimate pe suprafaţa celulelor în asociere cu moleculele de clasă II şi astfel antigenul va fi o procesat în/şi exprimat de macrofage sau limfocite B. Celulele CD8+ recunosc determinanţi antigenici de suprafaţă exprimaţi alături de moleculele de clasă I într-o varietate de celule, inclusiv unele celule infectate cu virusuri. In plus, atât celulele CD4+ cât şi CD8+ interacţionează cu celulele care prezintă antigen prin intermediul unui al doilea mecanism de recunoaştere, implicând o interacţiune între moleculele numite CD2/T11 din limfocite şi moleculele numite α FA3 (antigen asociat funcţiei limfocitare) de pe celulele prezentatoare de antigen. Activarea prin mecanismele descrise, la care se adaugă efectul de suport al citokinelor secretate de macrofage, produce transformarea 194

FIZIOLOGIA SANGELUI

celulelor activate prin antigen; dezvoltarea receptorilor pentru un factor de creştere autocrin, interleukina 2 (IL-2) şi secreţia de IL-2. Ca o consecinţă, iniţial sunt doar câteva celule T care recunosc un număr mic de epitopi care vor determina creşterea numărului de celule fiice. Extinderea proliferării reflectă efectul combinat al concentraţiei de IL-2 secretat, durata secreţiei şi densitatea receptorilor pentru IL-2 exprimaţi pe suprafaţa celulelor T activate. Aceste celule sunt reprezentate de celulele T: - helper, ajută formarea din celule B de plasmocite secretoare de anticorpi; - care mediază sensibilitatea intârziată în imunitatea mediată celular; - citotoxice care distrug celulele ţintă; - care induc formarea celulelor supresor; - supresor care menţin răspunsurile imune. Celulele T activate îşi exercită funcţiile imunoreglatoare şi efectoare prin secreţia de proteine numite limfokine, care sunt active în concentraţii foarte mici şi nu au restricţii antigenice sau genetice ale efectelor biologice. 12.6.2. Celulele natural killer Celulele natural killer (NK) sunt o populaţie diferită de limfocite implicate în răspunsuri imune mediate celular (fig. 91). Celulele NK diferă de celulele T citotoxice prin aceea că ele lizează celulele ţintă la primul contact, fără să fie necesară sensibilizarea lor la antigen. Ontogenia NK este neclară; nu provin din celula stem limfoidă ca şi celulele T şi B. Celulele NK nu necesită procesare timică şi nu exprimă receptori pentru antigen ca ai celulelor T. Celulele NK reprezintă mai puţin de 10% din Fig. 91. Limfocite natural killer limfocitele sanguine circulante. 12.7. Limfocitele B Diferenţierea celulei B de la precursorul primar până la plasmocit are loc în două faze. Prima fază (se referă la faza ne-antigenică) are loc în 195

FIZIOLOGIA SANGELUI

interiorul ţesutului limfoid central (măduva osoasă la mamifere). In cursul acestei faze celulele precursoare prezintă o diviziune rapidă şi o rată mare de distrugere. Această imensitate de celule care sunt analogul celulelor pre-T din timpul formării celulelor T în cortexul timic, reprezintă o consecinţă a multiplelor rearanjamente ale ADN necesare menţinerii unei diversităţi de celule B în ţesutul limfatic periferic capabil să recunoască şi să răspundă la o multitudine nelimitată de antigene. Celulele cu rearanjări aberante ale ADN sau cu rearanjări pentru determinanţi foarte asemănători vor muri în cursul procesului. S-au identificat câteva stadii ale fazei de diferenţiere independentă de antigen: - se începe cu rearanjarea segmentelor genelor pentru imunoglobuline şi cu formarea de gene funcţionale pentru lanţurile grele a Ig M; - apoi are loc sinteza lanţurilor grele de Ig M numite lanţul μ; - gena pentru lanţul uşor al moleculelor de imunoglobulină este rearanjată şi are loc sinteza lanţului uşor; lanţul uşor se combină cu lanţul μ, care apoi se deplasează de la nivel citoplasmatic şi se inseră în membrana celulară ca parte a moleculei de Ig M; - urmează sinteza celui de-al doilea lanţ greu numit lanţul δ; aceasta conduce la formarea moleculei de IgD care de asemenea se va insera în membrana celulară. Celula prezintă acum atât molecule de Ig M cât şi molecule de Ig D, legate prin gruparea carboxi-terminală la nivelul membranei celulare şi extinse către mediul extern prin regiunea variabilă NH2-terminală. Acestea servesc ca loc de recunoaştere la suprafaţa celulei pentru determinanţi antigenici specifici pentru care celula a devenit programată să răspundă. Astfel, celula B este gata să funcţioneze ca o celulă competentă imunologic. Alături de receptorii imunoglobulinici pentru antigene, celula B prezintă şi molecule de clasă II a CMH pe suprafaţa sa membranară. In timpul formării celulei B exprimă şi alte molecule membranare de suprafaţă, cu funcţii fiziologice incomplet cunoscute. Acestea includ receptori pentru porţiunea Fc a Ig G, receptori pentru un component activat al complementului numit C3b şi pentru fragmentul degradat al C3b numit C3d (acest ultim receptor prezintă un interes clinic deosebit deoarece el serveşte ca receptor pentru virusul Epstein-Barr). Faza dependentă de antigen a diferenţierii celulei B are loc prin activarea la nivelul ţesutului limfatic a celulei B competentă imunologic, 196

FIZIOLOGIA SANGELUI

prin contactul cu antigenele pe care este programată să le recunoască în prezenţa citokinelor din celulele T activate şi din macrofage. Acest antigen care declanşează proliferarea conduce la formarea a două tipuri de celule: celula secretoare de Ig M şi celule în care Ig M şi Ig D de suprafaţă sunt înlocuite (ca urmare a schimbării genice a lanţului greu) cu Ig G, Ig A sau Ig E de suprafaţă (fig. 92).

Fig. 92. Dezvoltarea celulelor B şi răspunsul la stimularea prin antigen

Continuarea expunerii la antigen a celor mai multe din aceste celule B determină diferenţierea ulterioară şi secreţia de Ig G, Ig A sau Ig E, dar şi crearea de celule B cu memorie. Ultimele reţin pe suprafaţa lor Ig G, Ig A sau Ig E şi pot determina apariţia, la o nouă expunere la antigen, de clone de plasmocite cu mare afinitate pentru anticorpi. Celulele B care au ratat faza dependentă de antigen a diferenţierii în ţesutul limfoid periferic mor rapid şi vor fi înlocuite cu noi celule B. Structura moleculelor de imunoglobuline Unicul rol cunoscut al limfocitelor B şi plasmocitelor este să secrete proteine cu activitate de anticorpi, adică imunoglobuline (Ig). Acestea au o structură proteică în care lanţurile polipeptidice alei unei molecule de 197

FIZIOLOGIA SANGELUI

imunoglobulină produsă de o clonă de plasmocite vor fi diferite la capătul NH2-terminal faţă de Ig produse de alte clone de plasmocite. Aceasta conduce la molecule de imunoglobuline cu specificitate antigenică. Moleculele de imunoglobuline sunt constituite dintr-o unitate de bază, compusă din două lanţuri polipeptidice uşoare identice şi două lanţuri polipeptidice grele identice legate prin legături disulfidice (fig. 93). Majoritatea moleculelor de Ig sunt monomeri ai acestei unităţi de bază; unele Ig sunt polimeri cu 2-5 unităţi de bază. Ig polimerizate sunt alcătuite din unităţi de bază identice la care se adaugă un singur lanţ suplimentar (J), care menţine polimerii uniţi. Lanţurile J sunt sintetizate de plasmocite. Aminoacizii ce compun lanţurile uşoare şi grele nu sunt aranjaţi liniar, ci formează anse (domenii). Numai un singur domeFig. 93. Moleculă de imunoglobulină niu, din cele dinspre capătul N-t cunoscute ca regiuni variabile, conţine ~110 aminoacizi. In interiorul regiunii variabile există regiuni hipervariabile constituite din secvenţe unice de aminoacizi pentru acest lanţ polipeptidic. Regiunile hipervariabile din lanţurile uşoare şi grele adiacente şi lanţurile grele a moleculei de imunoglobulină formează un “buzunar” de legare a antigenului. Diverşi determinanţi antigenici pot ocupa acest spaţiu (reactivitate încrucişată), dar va fi legat preferenţial un singur determinant antigenic, specific. Segmentele carboxi-terminal ale lanţurilor polipeptidice uşoare şi grele sunt numite regiuni constante. Lanţurile uşoare au o regiune constantă cu un singur domeniu, pe când lanţurile grele au o regiune constantă cu 3-4 domenii. Lanţurile uşoare sunt împărţite în 2 tipuri, k şi δ, pe baza diferenţelor în secvenţa de aminoacizi din regiunea lor constantă. Papaina (enzimă proteolitică) clivează moleculele de imunoglobuline la nivelul unei regiuni a lanţului greu numită “balama”. Se formează două 198

FIZIOLOGIA SANGELUI

fragmente care se combină cu anticorpul (Fab); fiecare fiind alcătuit dintr-un întreg lanţ uşor, din domenii variabile şi din prima regiune constantă a lanţului greu (fig. 92). Un fragment, numit fragmentul Fc, este format din domeniile restante ale regiunii constante ale ambelor lanţuri grele; el determină proprietăţile biologice ale moleculelor de imunoglobuline. De exemplu, macrofagele prezintă receptori de suprafaţă care vor recunoaşte situsul de legare prezent pe fragmentul Fc al unor imunoglobuline (nu al tuturor imunoglobulinelor). Imunoglobulinele sunt clasificate, pe baza diferenţelor între lanţurile grele, în 5 clase majore: IgM (lanţ μ); IgG (lanţ γ), IgA (lanţ α), IgD (lanţ δ) şi IgE (lanţ ε). Aceste clase majore de imunoglobuline pot fi împărţite în subclase, pe baza diferenţelor serologice şi fizico-chimice. Astfel, există două subclase de IgM conţinând lanţuri μ1 sau μ2, două subclase de IgA conţinând lanţuri α1 şi α2 şi patru subclase de IgG conţinând lanţuri γ1, γ2, γ3 şi γ4. Moleculele lanţurilor uşoare sunt distribuite în clase şi subclase diferite. Fiecare persoană conţine în plasmă un spectru larg de izotopi imuno-globulinici, fiind posibilă combinarea unui tip sau subtip de lanţ uşor cu o clasă sau subclasă de lanţ greu. Fiecare imunoglobulină este sintetizată de plasmocite diferite şi este imunologic diferită deoarece diferă prin secvenţa de aminoacizi a regiunilor hipervariabile. Această diferenţă antigenică conferită fiecărei molecule de imunoglobulină reprezintă idiotipul imunoglobulinei. In mod normal, nici o specie de imunoglobulină nu este prezentă în concentraţie suficient de mare pentru ca idiotipul său să acţioneze ca imunogen. Când un răspuns imun determinat de antigen creşte producţia de imunoglobuline specifice, regiunile lor hipervariabile pot însă să funcţioneze nu numai ca loc de legare al antigenului dar şi ca antigene idiotipice capabile să inducă răspuns imun. Tab. 11. Caracteristicile diferitelor clase de imunoglobuline Caracteristici IgG IgA IgM Greutate moleculară (kDa) 150 170 900 Concentraţie plasmatică (md/dl) 700-1500 250 100 T1/2 intravascular (zile) 21 6 5 Trecerea barierei placentare + -

IgD 180 3 3 -

IgE 200 0,03 2 -

Anticorpii IgM sunt primii anticorpi formaţi după expunerea la antigen. IgM circulă ca pentamer cu 10 situsuri de legare a antigenului pe fiecare moleculă; funcţionează ca un activator al căii clasice de activare a 199

FIZIOLOGIA SANGELUI

complementului. IgM plasmatică este considerată o macroglobulină datorită moleculei sale mari (greutate moleculară de 900 kDa). Pentru cei mai mulţi antigeni producţia este direcţionată spre alte clase de imunoglobuline, de obicei IgG sau IgA, deoarece puţine antigene continuă să determine un răspuns IgM la o expunere continuă sau la o co-expunere. IgG este un anticorp major din plasmă şi din lichidul extracelular; este singura clasă de imunoglobuline care poate traversa bariera placentară umană. Fagocitele au receptori pentru locul de legare a porţiunii Fc a IgG1 şi IgG3. Fagocitele au receptori pentru fragmentul iC3b al complementului. Dacă anticorpii din subclasa IgG1 sau IgG3 se leagă de antigenii de pe suprafaţa microorganismelor şi prin această legare activează complementul şi aduc iC3b la suprafaţă, atunci granulocitele sau monocitele-macrofagele pot rapid fagocita microorganismul sau celula. IgA este un anticorp major descoperit în secreţiile tracturilor respirator, gastro-intestinal şi genito-urinar, unde se leagă de antigene străine, împiedicând astfel intrarea lor în organism. In secreţii IgA există ca polimer a două molecule de imunoglobuline plus un lanţ J la care se adaugă o altă proteină, numită componenta secretorie. Componenta secretorie este sintetizată de către epiteliul mucoasei şi ajută la transportul moleculelor de IgA prin celulele epiteliale în secreţii. In plasmă IgA există atât ca monomer cât şi ca polimer conţinând un lanţ J, dar nu şi componenta secretorie. IgD şi IgE se găsesc în cantităţi reduse în plasmă. IgD de pe suprafaţa celulelor B servesc ca loc de recunoaştere a antigenului. IgE este secretată în cantităţi crescute la pacienţii cu infecţii helmintice şi la pacienţii cu alergie atopică. IgE se leagă prin regiunea sa Fc la mastocite şi pot declanşa reacţiile de hipersensibilitate imediată. 12.8. Mecanismele răspunsurilor imune Răspunsurile imune umorale sunt importante pentru protecţia împotriva infecţiilor bacteriene acute. Bacteria este coafată cu anticorpul şi prin intermediul complementului este fagocitată cu o eficienţă crescută. Răspunsurile imune mediate celular suprimă infecţiile determinate de microorganismele care se găsesc şi se multiplică în celule. In această categorie sunt incluse cele mai multe infecţii virale şi infecţii cu diverse bacterii (micobacterii şi fungi). In cazul pacienţilor cu SIDA, unde celulele CD4+ sunt deprimate, microorganismele care în mod normal nu produc 200

FIZIOLOGIA SANGELUI

boală la om pot produce boli fatale atunci când răspunsurile mediate celular sunt absente. 12.8.1. Sinteza anticorpilor şi reglarea producţiei de anticorpi Producţia de anticorpi necesită în mod obişnuit interacţiunea dintre macrofage, celule T şi celule B. Antigenele timus-independente induc formarea de anticorpi de către celulele B fără ajutorul celulelor T. Aceste antigene sunt molecule mari cu unităţi structurale repetitive (de ex. Polizaharidele bacteriene) ce funcţionează aparent ca mitogen al limfocitului B. Antigene timusindependente determină numai sinteza de anticorpi IgM şi induc o memorie imunitară redusă (grupele sanguine din sistemul ABO sunt exemplu de antigene timus-independente). Pentru marea majoritate a antigenelor producţia de antiFig. 94. Sinteza anticorpilor corpi necesită atât prezenţa antigenului cât şi celule T helper care interacţionează cu celulele B; este vorba de antigenele timus-dependente. Fragmentele de antigen conţinând determinanţi imunogenici sunt prezentate în asociere cu moleculele de clasă II de la suprafaţa celulară a celulelor T helper. Celulele prezentatoare sunt macrofage sau celule înrudite cu macrofagele (celula dendritică sau celula Langerhans), precum şi celule B. Celula B poate recunoaşte antigenul prin utilizarea receptorului pentru imunoglobulina legată de membrană, internalizează şi procesează antigenul şi apoi “afişează” peptidele antigenice pe suprafaţa sa celulară, în asociere cu moleculele de clasă II. Aşa cum s-a menţionat mai devreme, în prezenţa macrofagelor secretoare de IL-1 sau IL6, celulele T CD4+, activate de antigenul prezent la nivelul macrofagelor sau celulelor B, proliferează şi secretă multiple citokine (IL-2; IL-4; IL-5, γinterferon). Sub influenţa acestor limfokine, a IL-6 de la nivelul macro201

FIZIOLOGIA SANGELUI

fagelor şi a continuării expunerii la antigen, clonele de celule B se extind şi se diferenţiază în plasmocite secretând cantităţi mari de anticorpi (fig. 94). Activarea celulelor T prin antigene induce şi formarea de celule supresor care controlează răspunsul secretor de anticorpi prin scăderea sau prin proliferarea celulelor T helper sau B. Scăderea antigenului disponibil modulează suplimentar răspunsul imun, deoarece clonele reactive intră în competiţie pentru cantităţi scăzute de antigen. Când se acumulează suficiente molecule de imunoglobuline ale unui idiotip dat, acesta poate acţiona ca un antigen şi are loc formarea de anticorpi; ei au un buzunar de legare a antigenului cu aceeaşi configuraţie spaţială ca şi determinantul antigenic care stimulează formarea de Ig originale. 12.8.2. Răspunsurile imune mediate celular Răspunsurile imune mediate celular includ reacţii de hipersensibilitate întârziată şi reacţii citotoxice în care celulele T şi NK distrug celulele ţintă. Cel mai bine studiat test de hipersensibilitate întârziată este testul cutanat la tuberculină. Injecţia intradermică cu tuberculină (un antigen extras din bacilul Koch) determină acumularea la locul inoculării a unui număr mic de limfocite T sensibilizate prin expunerea anterioară la antigen. Acestea interacţionează cu antigenul de la suprafaţa macrofagelor sau a celulelor Langerhans; interacţiunea este CMH restricţionată, fiind necesar ca receptorul pentru antigen al celulei T să recunoască antigenul în asociere cu molecula de clasă II. Limfocitele T activate de către antigen secretă citokine care declanşează pasul următor al reacţiei. Citokinele determină acumularea de monocite la locul de inoculare şi diferenţierea lor în macrofage; ele inhibă migrarea macrofagelor de la locul inoculării; activează macrofagele crescând proprietăţile lor microbicide, capacităţile lor de a secreta enzime proteolitice şi de a genera metaboliţi de oxigen (toxici), γ- interferon şi alţi factori activatori ai macrofagelor, precum şi de a exprima molecule de clasă II. Alte citokine, numite limfotoxine, distrug direct celulele din vecinătatea antigenului. In 24-48 ore după injecţia de antigen reacţia produce o zonă de eritem şi induraţie la locul inoculării. Dacă se biopsiază se va observa un infiltrat de celule mononucleare (în special macrofage), edem şi depozite de fibrină. In unele arii răspunsul imun localizat constă în multiple macrofage (celule histiocitare) şi limfocite organizate sub formă de granulom.

202

FIZIOLOGIA SANGELUI

Reacţiile de hipersensibilitate întârziată, în care este declanşat un mecanism în care un număr mare de macrofage devin active la locul unde se găseşte antigenul, cresc capacitatea organismului de a se lupta cu infecţiile. Odată activate, macrofagele prezintă o activitate bactericidă crescută, nu numai împotriva organismului care a iniţiat reacţia de hipersensibilitate întârziată, ci şi împotriva altor microorganisme. Un al doilea răspuns imun mediat celular determină liza celulelor celulele infectate cu viruşi de către limfocitele T citotoxice. Spre deosebire de bacteriile intracelulare, care invadează numai monocitele (macrofagele), virusurile pot invada o varietate de celule (exemplu: virusul hepatitic invadează hepatocitele, virusurile gripale invadează celulele epiteliului respirator). Când virusurile infectează celulele antigenele virale sunt translocate la suprafaţa acestora. Celulele T citotoxice CD8+ devin sensibile la aceste antigene virale în conjuncţie nu numai cu moleculele de clasă II (care sunt absente în cele mai multe celule) dar şi cu moleculele de clasă I. Odată sensibilizate, celulele T citotoxice pot liza celulele infectate printr-o reacţie în care, încă odată, celulele T citotoxice trebuie să recunoască atât antigenele virale şi moleculele de clasă I de pe suprafaţa celulară. Această liză celulară, prin prevenirea replicării virale intracelulare, poate juca un rol important în rezistenţa la infecţii virale. 13. Hemostaza fiziologică Hemostaza reprezintă fenomenul de oprire a hemoragiei (extravazarea sângelui prin peretele vascular lezat). Se discută de hemostaza fiziologică care reprezintă oprirea hemoragiei ca urmare a lezării vaselor mici şi mijlocii şi de hemostaza medicamentoasă / chirurgicală în cazul lezării vaselor mari. La procesul de hemostază participă vasele sanguine, plachetele şi factorii plasmatici ai coagulării; fiind iniţiată de contactul sângelui cu suprafeţe rugoase sau de produşi de citoliză. Hemostaza fiziologică prezintă mai multe componente / faze suprapuse în timp şi intricate: - reacţia vasculară; - aderarea şi agregarea plachetară cu formarea unui dop plachetar; - coagularea (formarea şi retracţia cheagului de fibrină); - fibrinoliza (disoluţia cheagului) cu reparaţia conjunctivă a peretelui vascular sau perforarea cheagului voluminos de către vase de neoformaţie.

203

FIZIOLOGIA SANGELUI

Reacţia vasculară Reacţia vasculară hemostatică cuprinde constricţia vaselor lezate; spasm miogen şi vasoconstricţie reflexă simpatică; mediatorii implicaţi în acest proces sunt histamina (5HT), tromboxanul A2, adrenalina, fibrinopeptidul B (FPB), la care se adaugă şi vasodilataţia în teritoriile învecinate. Spasmul este mai puternic cu cât aria lezată este mai întinsă. In cazul acumulării interstiţiale a sângelui creşterea presiunii tisulare are şi ea efect hemostatic. 13.1. Aderarea, agregarea şi secreţia plachetară Plachetele sanguine (trombocitele), au un diametru de 2-3 μm, 1/3 din ele sunt depozitate în splină. In sânge se găsesc în număr de 180000400000/mm3; scăderea sub 150000/mm3 se numeşte trombocitopenie, iar creşterea peste 500000/mm3 se numeşte trombocitoză. Trombocitele sunt formaţiuni anucleate, cu o durată medie de viaţă de ~8 zile, delimitate de plasmalemă; ele sunt formate prin ruperea (intra- sau extravasculară) de fragmente citoplasmatice din megacariocite. Plachetele prezintă trei zone: o zonă periferică, care emite pseudopode şi care are rol în procesul de adeziune plachetară; o zonă sol-gel, constituită din hialoplasmă, cu rol în contactilitate şi o zonă granulomer, constituită din organite, granule şi corpi denşi secretori. Granulele dense conţin ADP, histamina (5-hidroxitriptamină, 5-HT) şi factori agreganţi. La nivelul membranei trombocitare se găsesc proteine importante: contractile (actina, miozina, trombostenina), coagulante (fibrinogen, factorii plasmatici V, VIII, XI, XIII, şi factorii plachetari f2, f3). Plachetele sunt strict specializate pentru hemostaza, la care participă prin formarea unui dop plachetar şi eliberarea de factori plachetari ai coagulării. Distrugerea endoteliului expune structurile subendoteliale la contactul cu plachetele; aceasta este prima etapă în formarea dopului plachetar (fig. 95). Aderarea plachetară necesită participarea obligatorie a factorului von Willebrand (vWF), o proteină sintetizată la nivelul celulelor endoteliale care este prezentă atât în plasmă cât şi la nivel subendotelial. vWF face parte dintr-un grup de proteine numite proteine de adeziune, care conţin o anumită secvenţă de aminoacizi (Arg-Gly-Asp-RGD).

204

FIZIOLOGIA SANGELUI

Această secvenţă permite proteinelor de adeziune să se lege la unul sau mai mulţi membri ai familiei de proteine de suprafaţă numite integrine (care prezintă situsul de recunoaştere pentru RGD). vWF poate lega, la situsul de recunoaştere pentru RGD, un complex de două glicoproteine care se găsesc la suprafaţa membranei plachetare (GP IIbIIIa) care se exprimă numai după activarea plachetară. După lezarea vasului (a celulelor endoteliale) vWF se leagă de matricea subendotelială precum şi de membrana plachetelor neactivate (situs de legare numit GP Ib) determinând aderarea lor la endoteliul lezat. După aderarea plachetelor la endoteliul lezat ele se vor activa; alte plachete din circulaţie vor veni la locul leziunii, se vor activa şi vor Fig. 19. Fazele formării dopului plachetar adera la plachetele deja existente. Astfel, masa plachetară începe să crească ducând la formarea dopului plachetar. Activarea plachetară implică o serie de evenimente cum ar fi: modificări de formă, agregare, eliberarea şi oxidarea acidului arahidonic, eliberarea conţinutului granulelor granulelor α şi a granulelor dense, reorganizarea suprafeţei membranare şi o contracţie centripetă orientată a actomiozinei de la nivelul citoscheletului membranar. Primele evenimente ale activării plachetare sunt reprezentate de modificările de formă plachetară; acestea sunt reversibile (agregatele plachetare libere pot fi îndepărtate din dopul plachetar şi pot reintra în circulaţie). Activarea plachetară este declanşată de doi agonişti principali: trombina (formată la locul leziunii) şi colagenul expus (subendotelial).

205

FIZIOLOGIA SANGELUI

Fig. 96. Căile de oxidare a acidului arahidonic şi produşii generaţi de plachete

ADP şi produşii de oxidare ai acidului arahidonic menţin şi amplifică activarea plachetară. Aceşti agonişti interacţionează cu receptorii membranari specifici ceea ce are ca rezultat activarea proteinei G de la nivelul membranei plachetare ce conduce apoi la activarea fosfolipazei C cu formarea de doi mesageri secunzi: IP3 şi DAG. DAG activează PKC, o enzimă care catalizează transferul fosfatului de pe ATP la rezidurile serinice sau treoninice ale proteinelor; substratul major al PKC plachetare este o proteină de 47 kDa; fosforilarea sa este esenţială pentru activarea plachetară. IP3 acţionează ca un ionofor de calciu care produce intrarea calciului în citosol dintr-un rezervor plachetar intern (sistemul tubular dens) cât şi din exteriorul plachetelor. Creşterea concentraţiei calciului citosolic determină activarea şi fosforilarea kinazei lanţului uşor al miozinei (fenomen necesar reorientării proteinelor citoscheletice responsabile de modificarea de formă, secreţiei şi contracţiei plachetare; activarea unei proteaze calciu-dependente numită calpaină (activează şi alte enzime plachetare) şi activarea fosfolipazei A2. Activarea fosfolipazei A2 conduce la eliberarea de acid arahidonic la nivelul membranei plachetare; acesta este oxidat pe două căi (fig. 96). O cale, catalizată de lipooxigenază, conduce la formarea de derivaţi ai acidului eicosatetranoic (HPETE şi HETE) cu funcţii necunoscute. O altă cale, catalizat de ciclooxigenază, conduce la formarea a doi compuşi cu rol important în amplificarea activării plachetare (protaglandina H2 şi metabolitul său, tromboxanul A2). PG H2 acţionează ca un co-factor care creşte capacitatea colagenului de a acţiona ca agonist plachetar. Tx A2 206

FIZIOLOGIA SANGELUI

se leagă specific la receptorul membranar plachetar având ca rezultat activarea fosfolipazei C şi generarea de DAG şi IP3. Plachetele conţin trei tipuri de granule: granule α, granule dense şi granule lizozomale. Aceste granule sunt distribuite randomizat în plachetele nestimulate; ele se vor deplasa spre centrul plachetelor după ce acestea sunt activate. Membranele veziculare fuzionează cu membrana plachetară realizând un sistem canalicular deschis constituit din invaginaţii ale suprafeţei membranei plachetare. Conţinutul granulelor este secretat prin acest sistem canalicular; mai întâi de la nivelul granulelor α şi al granulelor dense şi, mai târziu, când plachetele fuzionează, de la nivelul granulelor lizozomale. Granulele dense conţin ADP, ATP, calciu şi serotonină. ADP funcţionează ca un agonist fiziologic important care amplifică activarea plachetară; pacienţii cu afectări ereditare în care nu se realizează stocarea unor cantităţi normale de ADP în granulele dense prezintă o diateză hemoragică moderată rezultată din formarea inadecvată a cheagului. Serotonina este un agonist plachetar slab; nu are funcţii în hemostază. Granulele α conţin două categorii de proteine: proteine care se găsesc şi în plasmă şi proteine absente în plasmă până în momentul în care sunt secretate de plachete. Acestea, la rândul lor, pot fi împărţite în două grupe. Din prima categorie fac parte proteine dintre care albumina şi Ig G sunt cele mai importante şi care sunt preluate de plachete prin mecanisme nespecifice. Concentraţia lor plasmatică determină concentraţia acestora în granulele α plachetare. Proteinele din acest grup au funcţii hemostatice necunoscute. A doua categorie este reprezentată de proteine care sunt prezente în plachete într-o concentraţie destul de mare. Aceste proteine pot fi sintetizate sau preluate din plasmă prin maturarea megakariocitelor. Ele includ fibrinogen, factor von Willebrand şi factor V; fiecare din acestea, după secreţia lor în urma activării plachetare se leagă de suprafaţa membranei plachetare; fenomen care le face disponibile în concentraţii mari pentru a participa la reacţiile hemostatice în timpul formării cheagului. Proteinele granulelor α care sunt absente în plasmă până când sunt secretate în urma activării plachetare sunt trombospondina, β-tromboglobulina, factorul plachetar 4 (PF4), factorul de creştere derivat din plachete (PDGF) şi factorul de creştere β transformat (TGF-β). PF4 este un polipeptid cu rol de a neutraliza activitatea anticoagulantă a heparinei, poate 207

FIZIOLOGIA SANGELUI

intra în competiţie cu antitrombina III pentru situsul de legare de la nivelul celulelor endoteliale şi a ţesutului subendotelial. PF4, PGDF şi TGF-γ sunt chemoatractanţi pentru leucocite, celule musculare netede, fibroblaşti; activează aceste celule şi accelerează vindecarea leziunii, conntribuind astfel la reducerea procesului inflamator şi reparaţia tisulară. Pe măsură ce agregarea plachetară progresează are loc contracţia citoscheletului plachetar ceea ce are drept consecinţă fuzionarea plachetelor. In plus trombina declanşează formarea reţelei de fibrină în ochiurile căreia se vor dispune plachetele; aceste fenomene converg către formarea unui dop plachetar permanent şi stabil. Formarea trombului plachetar parcurge trei stadii: agregare provizorie (val primar de trombocite), faza de remisiune, agregare definitivă (metamorfoză vâscoasă). 13.2. Coagularea sângelui Procesul esenţial în coagularea sângelui este activarea protrombinei de către un complex enzimatic, urmată de acţiunea trombinei asupra fibrinogenului; astfel rezultă monomerii ce vor constiuti reţeaua de fibrină, Factorii coagulării poartă diverse denumiri care provin de la numele pacienţilor în a căror plasmă lipsea factorul respectiv (Christmas, Stuart etc.) sau denumiri care reflectă funcţia lor (de exemplu, activatorul plasminogenului tisular). Pentru a nu se crea confuzii se utilizează numerotarea lor cu cifre romane; în literatura medicală este utilizată adesea nomenclatura numerică (tab. 12). Tab. 12. Factorii coagulării Cifre romane Nume proprii Factorul I Fibrinogen Factorul II Protrombina Factorul III Tromboplastina tisulară Factorul IV Calciul Factorul V Proaccelerina Factorul VII Factorul VIII Factor antihemofilic; von Willebrand Factorul IX Factor Christmas Factorul X Factor Stuart Factor XI Tromboplastina plasmatică Factor XII Factor Hageman Factor XIII Factor stabilizator al fibrinei Prekalicreină plasmatică

208

Stare activată / inhibată Fibrina Trombina Proaccelerina inhibată Factor VIIa Factor VIIIa Factor IXa Factor Xa Factor XIa Factor XIIa Factor XIIIa kalicreină plasmatică

FIZIOLOGIA SANGELUI

Sinteza factorilor coagulării Marea majoritate a factorilor coagulării sunt sintetizaţi la nivel hepatic, cu excepţia factorului von Willebrand şi proaccelerinei (factorul V), care sunt sintetizaţi la nivelul celulelor endoteliale, ca şi trombomodulina şi kininogenul; tromboplastina tisulară denumeşte un amestec de fosfolipide şi lipoproteine de origine endotelială. Factorii IX, VII, X şi II sunt sintetizaţi de hepatocite numai în prezenţa vitaminei K; sinteza acestor factori ai coagulării se desfăşoară în două etape. In prima etapă, hepatocitele sintetizează precursori polipeptidici pentru fiecare factor al coagulării, proces care nu necesită prezenţa vitaminei K; în a doua etapă, vitamina K acţionează ca un co-factor pentru o carboxilază microsomală specifică, care va determina ataşarea unor reziduri unice de acid glutamic care servesc ca punct de legare a ionilor de calciu; aceşti ioni sunt necesari transformării factorilor coagulării în formele lor enzimatic active. 13.2.1. Fibrinogenul plasmatic şi formarea fibrinei Fibrinogenul este o proteină plasmatică în concentraţie de 270 – 300 mg/dl, sintetizată la nivel hepatic. Timpul de înjumătăţire al acestei proteine este 3 – 4 zile; ~ 15% din fibrinogenul plasmatic este înlocuit zilnic prin sinteza sa continuă la nivel hepatic. Creşterea concentraţiei sale plasmatice are loc în cursul sarcinii şi în afecţiuni inflamatorii, leziuni tisulare sau neoplasm (reprezintă un reactant de fază acută). De asemenea, creşterea concentraţiei plasmatice de fibrinogen accelerează viteza de sedimentare a hematiilor (vezi cap. 9.1.5). Coagularea sângelui are ca punct important transformarea fibrinogenului (factor I) într-o reţea insolubilă de fibrină. Fibrinogenul este o glicoproteină dimerică cu greutate moleculară de 340 kDa; fiecare jumătate de dimer este alcătuit din trei lanţuri polipeptidice denumite Aα, Bβ şi γ unite între ele prin punţi disulfidice. Transformarea fibrinogenului în fibrină se desfăşoară în trei etape; prima etapă constă în proteoliza limitată a fibrinogenului de către trombină, fenomen care are loc precoce în cursul procesului de coagulare. In urma acestui proces rezultă monomerii de fibrină, alături de fragmente polipeptidice mici, denumite fibrinopeptid A (obţinut din fragmentul amino-terminal al fiecărui lanţ Aα) şi fibrinopeptid B (eliberat ca urmare a scindării fragmentului amino-terminal Bβ). 209

FIZIOLOGIA SANGELUI

Odată formaţi monomerii de fibrină, se declanşează cea de-a doua etapă, în care aceştia împreună cu fibrinogenul încă nescindat, formează complexe libere. Când se acumulează mai mulţi monomeri de fibrină, echilibrul se schimbă către formarea de monomeri de fibrină care vor polimeriza. In acelaşi timp complexele de fibrinogen disociază în continuare formând mai mulţi monomeri de fibrină disponibili polimerizării. In final, monomerii de fibrină se leagă covalent rezultând polimeri de fibrină, care în prezenţa factorului XIIIa (factor stabilizator al fibrinei) formează o reţea tridimensională. Ionii de calciu nu sunt absolut necesari în procesul de transformare a fibrinogenului în fibrină, dar prezenţa lor în concentraţie normală în plasmă accelerează polimerizarea monomerilor de fibrină. Plasma conţine o pro-enzimă numită factor stabilizator al fibrinei (factor XIII) care trece în stare activă în prezenţa trombinei (factor XIIIa). Rolul acestui factor activat este de induce formarea de legături covalente între monomerii de fibrină şi de a stabiliza aceste legături; proces care se desfăşoară în prezenţa ionilor de calciu. Inafara acestui rol principal al factorului XIIIa se descriu alte acţiuni: stabilizează legăturile dintre moleculele de proteine contractile musculare; leagă moleculele de fibronectina între ele şi de fibrină sau colagen; leagă inhibitorul α2-plasminic de fibrină. 13.2.2. Formarea trombinei Trombina, enzima responsabilă de formarea monomerilor de fibrină, este generată în urma scindării catalitice a protrombinei în prezenţa factorului Stuart activat (factor Xa). In condiţii fiziologice activarea factorului Stuart (factor X) se desfăşoară în cadrul a două secvenţe enzimatice: calea intrinsecă şi calea extrinsecă (fig. 97). Activarea factorului Stuart (factor X) pe calea intrinsecă este rezultatul unei serii de reacţii care se declanşează când sângele vine în contact cu suprafeţele încărcate negativ. Evenimentele declanşate de suprafeţele încărFig. 97. Rolurile trombinei în coagularea sângelui cate negativ includ gene210

FIZIOLOGIA SANGELUI

Fig. 98. Calea intrinsecă şi extrinsecă a coagulării

rarea de trombină şi medierea altor mecanisme de apărare a organismului împotriva agresiunii, cum ar fi inflamaţia, răspunsurile imune şi fibrinoliza. Sunt implicate patru proteine în iniţierea acestor reacţii de apărare mediate de contactul cu suprafaţele încărcate negativ: factorul Hageman (factor XII), prekalicreina plasmatică (factor Fletcher), PTA (factorul XI; plasma thromboplastin antecedent) şi kininogenul cu greutate moleculară mare (factor Fitzgerald, Williams sau Flaujeac). Primul pas în iniţierea evenimentelor din cadrul căii intrinseci (fig. 98) este conversia factorului Hageman (factor XII) în forma sa activată (factor XIIa) care are rolul de a activa PTA (factor XI). Conversia PTA (factor XI) în starea sa activată (factor XIa) în prezenţa factorului Hageman necesită prezenţa kininogenului cu greutate moleculară mare; reacţia este accelerată de prezenţa prekalicreinei plasmatice dar nu este absolut necesară pentru declanşarea acestui stadiu. Conversia PTA (factor XI) în starea sa activată (factor XIa) în prezenţa factorului Hageman necesită prezenţa kininogenului cu greutate moleculară mare; reacţia este accelerată de prezenţa prekalicreinei plasmatice, care nu este absolut necesară pentru declanşarea acestui stadiu. Inafară de 211

FIZIOLOGIA SANGELUI

rolul lor extrem de important în procesul de coagulare, atât prekalicreina plasmatică cât şi kininogenul cu masă moleculară mare au rol şi în producerea reacţiei inflamatorii. In prezenţa kininogenului cu greutate moleculară mare, factorul Hageman activat (factor XIIa) transformă prekalicreina (factor Fletcher) în kalicreină (forma enzimatică), care va scinda kininogenul plasmatic în kinine mici cum ar fi bradikinina. Bradikinina determină vasodilataţie, creşte permeabilitatea vaselor mici şi induce durere fiind răspunzătoare de semnele caracteristice ale reacţiei inflamatoare: căldură locală, roşeaţă, edem, durere. In prezenţa PTA activat (factor XIa) are loc activarea factorului Christmas (factor IX) în prezenţa ionilor de calciu. In acest moment are loc intersectarea căii intrinseci cu calea extrinsecă a coagulării. Factorul Christmas activat (factor IXa) acţionează asupra factorului antihemofilic (factor VIII). Factorul antihemofilic face parte dintr-un complex molecular numit complexul factor VIII/factor von Willebrand. Acest complex este rapid scindat în două componente: una cu greutate moleculară mare reprezentată de factorul von Willebrand şi una cu greutate moleculară mică reprezentată de factorul VIII. Factorul von Willebrand funcţionează ca un transportor pentru factorul antihemofilic şi determină creşterea adezivităţii plachetare la structurile subendoteliale expuse sângelui în cazul leziuniilor vasculare. Factorul VIII conţine secvenţe de aminoacizi necesari coagulării sanguine. Concentraţia plasmatică a complexului factor VIII/factor von Willebrand este sub control hormonal; efortul fizic exagerat, stresul, sarcina, administrarea de estrogeni, hipersecreţie de vasopresină pot determina creşterea concentraţiei plasmatice a factorului antihemofilic. Factorul Christmas activat (factor IXa), alături de factorul antihemofilic activat şi ionii de calciu, activează factorul Stuart. Activarea factorului Stuart se poate realiza şi pe cale extrinsecă, necesitând prezenţa tromboplastinei tisulare, a factorului VII şi a ionilor de calciu. Rolul esenţial al factorului Stuart activat (factor Xa) este de a genera trombină, ultima protează responsabilă de formarea trombului de fibrină. Trombina rezultă din scindarea protrombinei în prezenţa factorului Stuart activat (factor Xa); reacţia este accelerată de prezenţa proaccelerinei (factor V) şi calciului. Protrombina (factor II) este o glicoproteină dependentă de prezenţa vitaminei K. Trombina scindează protrombina în două părţi: un segment amino-terminal (fragment 1) şi un segment carboxi-terminal (pretrombina 212

FIZIOLOGIA SANGELUI

1). Fragmentul 1 conţine reziduuri de acid glutamic care serveşte ca punct de legare pentru ionii de calciu. Pretrombina 1 este scindată de factorul Stuart activat (factor Xa) într-un fragment amino-terminal (fragment 2) şi un fragment carboxi-terminal cu o buclă disulfidică internă (pretrombina 2).

Fig. 99. Formarea trombinei din protrombină

Formarea trombinei are loc astfel: factorul Stuart activat (factor Xa; fie pe calea intrinsecă fie pe cea extrinsecă a coagulării), împreună cu ionii de calciu se leagă de reziduurile de acid glutamic ale fragmentului 1 de protrombină (fig. 99), determinând scindarea lentă a protrombinei în două locuri (între fragmentul 2 şi pretrombina 2 şi în interiorul buclei disulfidice interne a pretrombinei 2). Această a doua scindare transformă pretrombina 2 în trombină. Trombina formată acţionează asupra proaccelerinei (factor V), scindând lanţul polipeptidic al acesteia. In stare nativă, proaccelerina nu are proprietăţi coagulante; forma sa activată (factor Va) se ataşează de fragmentul 2 al moleculei de protrombină acţionând ca un accelerator al producţiei de trombină. Rolul esenţial al trombinei este de a transforma fibrinogenul în monomeri de fibrină; de asemenea, activează factorul stabilizator al fibrinei (factor XIII), factorul VII şi proteina C; determină agregarea plachetară. 213

FIZIOLOGIA SANGELUI

13.2.3. Rolul endoteliului vascular în coagularea sângelui In mod normal, celulele endoteliale dispuse pe faţa internă a vaselor sanguine realizează o suprafaţă netedă care nu induce coagularea sângelui sau aderarea plachetară. Mai mult, celulele endoteliale au rolul de a întârzia formarea cheagului de sânge prin eliberare de co-factori pentru doi inhibitori plasmatici ai trombinei: antitrombina III şi co-factorul heparinic II. In anumite circumstanţe patologice endoteliul poate participa la declanşarea procesului de coagulare, prin activarea căii intrinseci sau extrinseci. Factorul XI activat, în contact cu celulele endoteliale lezate va determina activarea factorului Christmas cu formarea de fibrină prin reacţiile căii intrinseci. De asemenea, suprafaţa endotelială afectată (de exemplu, endotoxină microbiană) poate căpăta activitate tromboplastin-like tisulară, interacţionează cu factorul VII şi din nou are loc formarea de fibrină dar, de data aceasta prin reacţiile căii extrinseci. 13.2.4. Fibrinoliza Agentul responsabil pentru disoluţia fibrinei este plasmina, o protează care reprezintă forma activată a plasminogenului. Plasminogenul este un polipeptid sintetizat la nivel hepatic; este transformat în plasmină de către mai mulţi factori (nu toţi fiziologici). Activatori ai plasminogenului se găsesc în plasmă, lapte, lacrimi, salivă, lichid seminal; de asemenea mai poate fi produs de către celule endoteliale, monocite sau celele tumorale. Streptokinaza, o proteină produsă de către streptococul β-hemolitic, prezintă un interes particular ca activator al plasminogenului deoarece este utilizată în clinică pentru dizolvarea trombilor. Streptokinaza se combină stoikiometric cu plasminogenul şi formează un complex care transformă plasminogenul în plasmină prin scindare la nivelul unei bucle disulfidice interne. Stafilococul sintetizează şi el un activator al plasminogenului numit stafilokinază. Urina normală conţine o protează serică produsă şi excretată de către rinichi numită urokinază; aceasta transformă plasminogenul în plasmină prin aceeaşi secvenţă de reacţii ca şi streptokinaza. Plasma însăşi poate transforma plasminogenul în plasmină “spontan” prin unul sau mai mulţi factori: kalicreina plasmatică, factorul XIa şi factorul Hageman activat (factor XIIa); astfel, activarea căii intrinseci de formare a trombinei iniţiază reacţii care conduc şi la fibrinoliză.

214

FIZIOLOGIA SANGELUI

Plasmina nu are acţiune specifică; scindează fibrina dar şi diverse alte substanţe precum fibrinogenul, factorul antihemofilic (factor VIII), proaccelerina (factor V) şi alţi factori ai coagulării; fragmentează factorul XII inactivându-l; scindează kininogenul ducând la formarea de kinine. Plasmina participă la reacţii imune de apărare a organismului activarea primului component al complementului (C1). Cea mai importantă funcţie a plasminei este de a scinda fibrinogenul şi Fig. 100. Fibrinoliza fibrina. Generarea plasminei se face la suprafaţa cheagului deoarece plasminogenul şi activatorii săi aderă la fibrină; în această situaţie plasmina poate acţiona asupra fibrinei fără a fi împiedicată de inhibitorii acestei enzime din plasmă (avantaj practic al injecţiei cu streptokinază, urokinază sau cu activator al plasminogenului tisular care va dizolva cheagul fără a avea efect major asupra fibrinogenului circulant) (fig. 100). Scindarea fibrinogenului de către plasmină are loc în mai multe etape. In primul rând are loc scindarea fragmentelor C-terminale din lanţurile α şi a fragmentelor N-terminale din lanţurile β. Rezultă fragmentul X, care încă mai prezintă proprietăţi coagulante. Fragmentul X este supus în continuare acţiunii acţiunii plasminei rezultând fragmente denumite Y, D şi E, cu proprietăţi inhibitoare ale coagulării prin interferenţa lor cu formarea de trombină şi cu acţiunile acesteia precum şi polimerizarea monomerilor de fibrină. Plasmina este inactivată de către inhibitori specifici cum ar fi inhibitorul α2-plasminic. 13.2.5. Inhibitori ai coagulării şi fibrinolizei In plasmă se găsesc o multitudine de substanţe care pot inhiba enzimele implicate în procesul de coagulare precum şi enzimele fibrino-

215

FIZIOLOGIA SANGELUI

litice. Cea mai mare parte din aceşti inhibitori fac parte din categoria serpinelor, cu excepţia α2 – macroglobulinei. Antitrombina III este principalul inhibitor al trombinei şi al factorului Stuart activat (factor Xa). Proprietăţile inhibitorii ale antitrombinei III sunt puternic potenţate de heparină cu care formează complexe. Heparina este un polizaharid sulfatat încărcat negativ care este sintetizat în principal la nivelul mastocitelor; se mai găseşte şi multe ţesuturi cum ar fi plămâni; ficat, mucoasa intestinală şi nu este un component normal al plasmei. In absenţa antitrombinei III heparina nu îşi manifestă acţiunea sa anticoagulantă. In plasmă se găsesc co-factori cu acţiune inhibitoare secundară asupra trombinei prin heparină numiţ co-factorul II heparinic şi co-factorul A heparinic a căror acţiune nu implică participarea altor proteaze. Inhibitorul α2-plasminic reprezintă inhibitorul major al plasminei; plasmina se combină stoichiometric şi covalent cu acesta formând o legătură ireversibilă blocând astfel acţiunile plasminei. De asemenea, inhibitorul α2plasminic mai inhibă şi adsorbţia plasminogenului la fibrină inhibând suplimentar fibrinoliza. Activatorii plasminogenului tisular sunt inhibaţi de către trei componenţi plasmatici: inhibitorul 1 al activatorului plasminogenului tisular şi inhibitorul 2 al activatorului plasminogenului tisular (sintetizat de către placentă). Glicoproteina bogată în histidină este o proteină plasmatică care circulă cuplată cu plasminogenul; ea inhibă activitatea plasminogenului prin reducerea legării sale la fibrină şi neutralizează proprietăţile anticoagulante ale heparinei. α2-Macroglobulina este o proteină plasmatică care inactivează lent proprietăţile proteolitice ale plasminei, trombinei, kalicreinei şi a activatorului plasminogenului tisular. Ea se leagă de inhibitor şi îl scindează parţial astfel încât enzima este modificat`a şi capacitatea ei de a acţiona asupra substratului proteic este mult redusă. α1-Antitripsina este o glicoproteină sintetizată de către ficat; are rolul de a inactiva proteina C, trombina şi kalicreina plasmatică. Proteina C este o pro-enzimă plasmatică dependentă de vitamina K care se transformă într-o formă activă enzimatic prin acţiunea trombinei sau factorului Stuart activat (factor Xa). Activarea prin trombină este puternic accelerată, de către proaccelerina activată (factor Va), la suprafaţa celulelor endoteliale care secretă trombomodulina cu rol de legare a trombinei la suprafaţa celulară (fig. 101). Proteinei C activată inhibă proprietăţile

216

FIZIOLOGIA SANGELUI

coagulante ale factorului antihemofilic (factor VIII) şi neutralizează factorii inhibitori ai activatorului plasminogenului tisular.

Fig. Activareaproteinei proteineiCC Fig. 101. 25. Activarea

Proteina S este o proteină plasmatică non-enzimatică dependentă de vitamina K; ea circulă sub forma unui complex reversibil cu proteina de legare C4b (inhibitor al sistemului complement); este un co-factor pentru activarea proteinei C; inactivează formele coagulante ale factorului antihemofilic (factor VIII) şi proaccelerinei (factor V).

217