Carte LP Genetica 2003 PDF [PDF]

Zitiervorschau

INTRODUCERE Orice lucrare care se respectă debutează cu definirea domeniului cunoaşterii abordat. În cazul geneticii definiţia este simplă: “genetica este ştiinţa eredităţii şi a variabilităţii”. Totuşi, această definiţie ascunde o complexitate extraordinară, ale cărei limite nu sunt, încă, nici măcar întrevăzute. De altfel, genetica, cea mai nouă dintre ştiinţele biologice, a avut cea mai explozivă evoluţie, fiecare an al ultimei jumătăţi de secol fiind marcat de anunţarea a cel puţin unei noi descoperiri majore în acest domeniu. Această evoluţie a fost confirmată, printre altele, şi de acordarea în ultimele trei decenii a majorităţii Premiilor Nobel pentru Medicină unor cercetători, care au abordat teme de genetică. Genetica umană este pe de o parte disciplină fundamentală, înţelegerea fenomenelor genetice fiind obligatorie în pregătirea studenţilor de astăzi, iar pe de altă parte o disciplină clinică şi medicală, neexistând domeniu al medicinei în care să nu existe cel puţin câteva afecţiuni ereditare sau condiţionate genetic. Genetica umană este, de asemenea, şi disciplină medico-socială, programele sale de profilaxie fiind importante pentru societate deoarece asigură prevenirea apariţiei şi transmiterii bolilor genetice. Lucrarea se adresează în primul rând studenţilor Univeristăţii de Medicină şi Farmacie “Grigore T. Popa” Iaşi, dar ea poate reprezenta un punct de plecare în descifrarea tainelor geneticii şi pentru medici rezidenţi în diverse specializări, în contextul absenţei, în ultima perioadă, a unor cărţi în domeniul abordat şi al existenţei în orice articol ştiinţific valoros al unei componente genetice. Lucrarea se bazează pe programa analitică a disciplinei de Genetică umană a Facultăţii de Medicină Iaşi, reprezentând o completare necesară a problematicii abordate la cursul predat studenţilor în cadrul aceleiaşi discipline. Acest manual se doreşte a fi un îndrumar util pentru deprinderea unor aptitudini practice, utile medicilor din oricare domeniu medical. Astfel, orice viitor medic care va practica în mileniul III trebuie să ştie să întocmească o anchetă familială şi să realizezea un arbore genealogic, să înţeleagă importanţa acordării sfatului genetic şi să fie capabil să evalueze riscul de recurenţă al unei afecţiuni. De asemenea, medicii din ziua de astăzi trebuie să ştie care sunt analizele genetice, începând cu banalul test al cromatinei sexuale şi terminând cu cele mai sofisticate metode de analiză genetică moleculară, dar mai ales să cunoască situaţiile când aceste determinări sunt utile, precum şi să fie capabili să interpreteze rezultatele furnizate de laboratoarele de specialitate. Lucrarea este elaborată în 14 capitole distincte, fiecare dintre acestea fiind în conexiune cu tematica lucrărilor practice ale disciplinei de Genetică umană. Fiecare capitol este structurat în trei părţi: noţiuni teoretice, elemente cu aplicabilitate practică, respectiv exerciţii şi probleme care vizează întărirea cunoştinţelor acumulate de studenţi. Ponderea celor trei categorii de probleme este diferită, existenţa în anumite capitole a unei prezentări mai ample a datelor teoretice fiind determinată de necesitatea înţelegerii depline a noţiunilor, importantă pentru abordarea aplicaţiilor practice şi a evaluării cunosştinţelor dobândite. Primele cinci capitole ale lucrării abordează elemente de citogenetică umană normală şi patologică, fiind prezentate noţiuni referitoare la aparatul genetic al celulei, ciclul celular, diviziunea celulei, cromatina sexuală, cromosomii umani, anomaliile cromosomice, respectiv bolile cromosomice. Următoarele trei capitole vizează probleme de ereditate normală şi anormală, fiind axate pe studiul caracterelor monogenice, respectiv al celor poligenice

2

Introducere

(multifactoriale). Ultimele şase capitole ale lucrării prezintă elemente de patologie genetică, fiind prezentate noţiuni de: genetica populaţiilor, consultul genetic, diagnosticul molecular al afecţiunilor genetice, sfatul genetic, respectiv modalităţile de profilaxie a maladiilor genetice, prin screening populaţional şi diagnostic prenatal. În completarea acestei lucrări, autorii pregătesc o culegere de probleme, teste şi cazuri clinice, utilă pentru autoevaluarea şi ameliorarea activităţii individuale a fiecărui student. Sperăm ca această culegere să apară cât mai curând, pe parcursul anului 2004. În contextul dezvoltării fulminante a Geneticii umane, necesitatea apariţiei acestui cărţi este de la sine înţeleasă. Datorită dinamicii deosebite a domeniului abordat, elaborarea lucrării a fost deosebit de dificilă, reprezentând rodul unor strădanii depuse pe parcursul a mai mult de un deceniu, iar majoritatea capitolelor au fost revizuite de mai multe ori, în conexiune cu cele mai noi descoperiri ale geneticii. De altefel, actuala formă a lucrării constituie o armonizare a viziunii autorilor, la elaborarea ei fiind luate în considerare observaţiile oricărui membru al colectivului de autori. În plus, formatul actual al cărţii a fost “testat” pe generaţiile anterioare de studenţi, dovedindu-şi valoarea şi actualitatea. Un alt element, care a îngreunat munca colectivului de autori, a fost legat de încercarea, sperăm noi reuşită, de abordare concisă, exactă şi cât mai completă a acestui domeniu fascinant care este Genetica umană. În încheierea acestei scurte prezentări, exprimăm mulţumirile şi consideraţia noastră celor care ne-au îndrumat continuu la elaborarea acestui manual. Astfel, ne exprimăm recunoştinţa Domnului Profesor Doctor Mircea Covic, iniţiatorul acestui proiect şi cel care a fundamentat catedra şi şcoala de Genetică medicală ieşeană, precum şi Doamnei Conferenţiar Doctor Ortansa Felicia Stoica, care a fost întotdeauna alături de noi cu un sfat bun şi o încurajare. Autorii Iaşi, septembrie 2003

1. APARATUL GENETIC AL CELULEI I. DATE TEORETICE A. GENETICA - ŞTIINŢA EREDITĂŢII ŞI VARIABILITĂŢII 1. DEFINIŢII a. EREDITATEA Ereditatea reprezintă capacitatea unui individ de a transmite la urmaşi caracterele sale personale, precum şi pe cele ale speciei căreia îi aparţine. Deoarece copiii nu sunt niciodată identici cu părinţii lor, ereditatea este procesul prin care se realizează similitudinea biologică între părinţi şi descendenţi. Părinţii, însă, nu transmit la copii caractere, ci informaţiile necesare pentru realizarea lor. În acest context, ereditatea este un proces informaţional care presupune stocarea, transmiterea şi expresia informaţiei ereditare pentru formarea caracterelor morfofuncţionale specifice unui individ. b. VARIABILITATEA Variabilitatea cuprinde fenomenele care produc diferenţele genetice dintre indivizii unei populaţii precum şi dintre populaţii diferite. Principalele surse de variabilitate genetică sunt: mutaţiile, recombinările genetice şi migraţiile. Datorită acestor procese, fiecare individ are o structură genetică unică.

2. ADN - SUBSTRATUL BIOCHIMIC AL EREDITĂŢII Ereditatea este o funcţie care are ca substrat molecular acidul deoxiribonucleic (ADN). ADN-ul îndeplineşte trei funcţii majore, care reprezintă esenţa eredităţii (figura 1.1.): ADN-ul deţine informaţia genetică codificată pentru realizarea caracterelor specifice unui organism. Unitatea de informaţie ereditară este gena, un segment de ADN ce deţine informaţia necesară pentru realizarea unui caracter ("o genă  un caracter"). Alterarea accidentală a structurii genei se numeşte mutaţie şi poate duce la modificarea caracterului respectiv (caracter mutant). ADN-ul exprimă informaţia genetică, prin sinteza unor proteine specifice care determină caracterele organismului ("o genă  o proteină") (figura 1.1. A). La realizarea acestor caractere participă însă şi factorii de mediu. Ansamblul de caractere manifeste şi specifice unui organism, determinate de ereditate şi mediu, se numeşte fenotip. ADN-ul transmite informaţia genetică în succesiunea generaţiilor de celule sau organisme, prin replicare (biosinteza, pe baza informaţiei conţinute de cele două catene ale moleculei de ADN iniţiale, a două molecule noi de ADN identice) urmată apoi de distribuirea egală a moleculelor de ADN în cursul diviziunii celulei (figura 1.1. B).

Aparatul genetic al celulei

Catenă sens

4

A B Figura 1.1. Reprezentarea schematică a funcţiilor ADN A. Gena este un segment de ADN care deţine codificat, sub forma unei secvenţe de nucleotide, informaţia genetică pentru realizarea unui caracter. Această informaţie este copiată (pe bază de complementaritate) în ARNm şi apoi decodificată (translată) sub forma unei secvenţe specifice de aminoacizi, constituind o proteină care stă la baza unui anumit caracter fenotipic. B. Transmiterea informaţiei genetice prin biosinteza ADN-ului (replicare semiconservativă) şi diviziunea celulei. Genetica este ştiinţa eredităţii şi variabilităţii Ereditatea este proprietatea unui individ de a transmite la urmaşi caracterele sale personale, precum şi cele de specie. Variabilitatea cuprinde fenomenele care produc diferenţele genetice dintre indivizii unei populaţii şi dintre populaţii diferite.

Aparatul genetic al celulei

5

Substratul molecular al eredităţii este ADN. ADN-ul conservă, exprimă şi transmite informaţia genetică

B. APARATUL GENETIC AL CELULEI Structurile celulare care conţin ADN (nucleul şi mitocondriile) precum şi cele care intervin în realizarea funcţiilor sale (ribosomii – implicaţi în sinteza proteică – respectiv centriolii – participă la diviziune prin formarea fusului de diviziune) alcătuiesc aparatul genetic al celulei (figura 1.2.).

Mb.c R RE

M L C Mb.Nc Nc CR CRT. X CRM

Microscop electronic

membrana celulară ribosomi reticul endoplasmatic mitocondrii lizozom centriol membrană nucleară nucleol cromocentri cromatina X cromonemă

Microscop optic

Figura 1.2. Schema morfologiei nucleului interfazic

1. NUCLEUL Elementul principal al aparatului genetic este nucleul; el conţine 99,5% din ADN celular şi este centrul de comandă şi control al tuturor activităţilor celulare. În nucleu, fiecare moleculă de ADN se asociază specific cu anumite proteine (histonice şi nehistonice) şi formează, prin spiralizări succesive, fibrele de cromatină. La începutul diviziunii fibrele de cromatină se condensează şi formează cromosomii, substratul morfologic al eredităţii. Numărul şi forma cromosomilor sunt elemente caracteristice fiecărei specii. La om, în celulele somatice sunt 46 cromosomi (2n = set diploid). Informaţia genetică conţinută de genele din cei 46 de cromosomi este denumită genotip. În celulele sexuale mature (ovulul şi spermatozoidul) numărul de cromosomi este redus, prin meioză, la 23 cromosomi (n = set haploid)1. Informaţia genetică dintr-un set haploid de cromosomi se numeşte genom. Cantitatea de ADN a genomului nucleului haploid este denumită valoare C şi este caracteristică şi constantă pentru fiecare specie. Conţinutul de ADN al celulelor diploide poate fi 2C sau 4C în funcţie de stadiul ciclului celular (figura 1

Termenul de genom este folosit pentru a descrie totalitatea informaţiei genetice din celula umană. El este alcătuit din genomul nuclear şi din genomul mitocondrial. Pentru o mai bună distincţie se folosesc termenii de genom diploid şi genom haploid

6

Aparatul genetic al celulei

1.3.). Anumite celule diferenţiate din organismul uman sunt tetraploide (hepatocitele, cardiomiocitele) sau chiar poliploide (celulele musculare scheletice) în timp ce altele sunt lipsite de nucleu şi de cromosomi (hematii mature, trombocite) ca fenomen adaptativ pentru o mai bună realizare a funcţiilor celulare caracteristice.

2. MITOCONDRIILE Mitocondriile conţin 0,5 % din ADN-ul celular, responsabil de ereditatea citoplasmatică. Informaţia genetică din ADN mitocondrial se numeşte plasmotip şi provine exclusiv de la mamă (zigotul moşteneşte mitocondriile ovulului). Structurile celulare care conţin ADN (nucleul şi mitocondriile) precum şi cele care participă la realizarea funcţiilor sale (ribosomii şi centriolii) alcătuiesc aparatul genetic al celulei. Elementul principal al aparatului genetic este nucleul, care conţine 99,5% din ADN şi a cărui morfologie depinde de fazele ciclului celular. Cromosomii reprezintă substratul morfologic al eredităţii.

C. CICLUL CELULAR 1. DEFINIŢIE. PERIOADE. DURATĂ Ciclul celular reprezintă succesiunea de evenimente biochimice şi morfologice care se produc în viaţa unei celule, din momentul formării şi până la sfârşitul diviziunii sale. Ciclul celular are două mari perioade: interfaza şi diviziunea (figura 1.3.). a. INTERFAZA Interfaza reprezintă perioada cuprinsă între două diviziuni succesive, în care se desfăşoară activităţile specifice unei celule. Evenimentul cel mai important al interfazei este sinteza de ADN prin procesul de replicare. Interfaza poate fi subdivizată în trei etape succesive: faza G1 (presintetică), faza S (de sinteză) şi faza G2 (postsintetică sau premitotică). b. DIVIZIUNEA CELULARĂ Diviziunea celulară sau faza M ("mitotică") este alcătuită dintr-o serie de procese secvenţiale prin care materialul genetic (ADN) replicat în interfază, se distribuie egal şi total (segregare cromatidiană) formând doi nuclei distincţi, iar celula se împarte în două celule fiice (citokineză); identice genetic cu celula din care provin (figura 1.1.B). Prin replicarea ADN-ului şi diviziune se asigură transmiterea fidelă a informaţiei genetice în succesiunea generaţiilor celulare. c. DURATA CICLULUI CELULAR Durata ciclului celular poate varia mult între diferite ţesuturi, datorită duratei fazei G1, celelalte faze fiind relativ constante ca durată. În celulele eucariote, duratele aproximative ale fazelor interfazei sunt: G1 = 10 ore, S = 9 ore, G2 = 4 ore, M = 1 oră.

2. FAZELE CICLULUI CELULAR MITOTIC a. FAZA G1 În faza G1 (engl. gap - interval) sunt sintetizate intens substanţe (ARN, proteine) necesare creşterii şi funcţionării celulei (tabelul 1.1.). Fiecare cromosom (despiralizat) este

Aparatul genetic al celulei

7

monocromatidian, fiind alcătuit dintr-o moleculă de ADN. Cantitatea de material genetic este 2C molecule de ADN, sub forma a 2n (46) cromosomi despiralizaţi (figura 1.3.). 4 catene de ADN per cromosom 46 cromosomi condensaţi bicromatidieni

4 catene de ADN per cromosom

2 catene de ADN per cromosom 92 de cromosomi monocromatidieni, ce vor fi împărţiţi la cele două celule fiice

46 cromosomi despiralizaţi

Sinteză de ADN

2 catene de ADN 46 cromosomi per cromosom monocromatidieni 2C Figura 1.3. Ciclul celular mitotic (adaptat după Strachan şi Read, 1999) În prima parte a fazei G1 (G1A), celulele acumulează ARN şi proteine până la o concentraţie prag, numită punct de restricţie "R", după care trec în subfaza G1B, fiind pregătite să intre în faza S (figura 1.4.). În anumite condiţii (lipsa factorilor de creştere, a aminoacizilor sau prezenţa unor inhibitori ai sintezei proteinelor etc.) celulele aflate în subfaza G1A trec într-o fază de activitate metabolică redusă, numită faza G0 sau G1Q (engl. "quiescent" - inert, liniştit) în care rămân viabile şi pot supravieţui timp îndelungat. Dacă condiţiile restrictive dispar, celulele G0 pot reveni în G1 şi apoi pot progresa spre faza S, deoarece îşi păstrează capacitatea de diviziune. Fazele G1 şi G0 sunt două stări fiziologice distincte ale celulei. Unele celule aflate în subfaza G1A părăsesc definitiv ciclul celular şi trec în faza G1D, ce corespunde celulelor diferenţiate; ele nu se mai divid şi mor după un anumit timp.

8

Aparatul genetic al celulei Tabelul 1.1. Caracteristicile principale ale fazelor ciclului celular mitotic2

PERIOADA

Interfază

Diviziune

FAZA ŞI EVENIMENTE CANTITATE ASPECT LA MICROSCOPUL DURATA ADN ELECTRONIC (ore) G1 10h Sinteză intensă de ARN 2C 2n cromosomi monocromatidieni şi proteine S 9h Sinteză de ADN şi 4C histone G2 4h Sinteza proteinelor 4C 2n cromosomi bicromatidieni fusului de diviziune despiralizaţi Sinteza factorului de declanşare al mitozei M 1h Profază 4C Cromosomi bicromatidieni Metafază 4C condensaţi (vizibili la microscopul Anafază optic) Telofază 2C 2C Cromosomi monocromatidieni

Figura 1.4. Fazele ciclului celular mitotic şi evoluţia celulelor rezultate prin diviziune b. FAZA S Faza S (engl. "synthesis" - sinteză) se caracterizează prin sinteza de ADN (realizată prin replicare semiconservativă) şi sinteza de histone; se produce astfel o dublare a cantităţii de material genetic (4C), condiţie obligatorie pentru desfăşurarea diviziunii celulare. Numărul de cromosomi rămâne 46, dar fiecare cromosom va fi bicromatidian, alcătuit din două cromatide identice ("surori") ce conţin două molecule identice de ADN. Replicarea ADN în faza S este asincronă: unele segmente de ADN (bogate în perechi de baze G-C) se replică precoce, la începutul fazei S, iar alte segmente (bogate în perechi de baze A-T) se replică tardiv, la sfârşitul fazei S. 2

Ciclul celular meiotic are o serie de particularităţi (vezi capitolul 2)

Aparatul genetic al celulei

9

c. FAZA G2 Faza G2 se caracterizează prin sinteza unor proteine specifice şi a unor mici cantităţi de ADN (necesar în procesul de "corectare" a erorilor de replicare). Fiecare cromosom este bicromatidian (cantitatea de ADN este 4C) dar despiralizat. Spre sfârşitul fazei G2 se activează/ sintetizează "factorul de declanşare a mitozei" (MPF) ce determină condensarea filamentelor de cromatină în cromosomi şi formarea fusului de diviziune. În lipsa factorului de condensare, celulele se opresc în faza G2 şi pot abandona ciclul celular, formându-se celule tetraploide (4n cromosomi); unele dintre ele devin prin amitoză, celule binucleate (de exemplu, o parte din cardiomiocite adulte) (figura 1.4.). d. FAZA M Faza M corespunde mitozei şi durează aproximativ 1 oră. Ea începe cu diviziunea nucleului (mitoză) şi se termină cu diviziunea citoplasmei (citokineză). În această etapă, materialul genetic dublat în interfază (4C molecule ADN - 46 cromosomi bicromatidieni) segregă, adică se distribuie în mod egal şi total celulelor "fiice" (2C molecule ADN - 46 cromosomi monocromatidieni) care vor fi identice cu celula din care provin. Procesul de "distribuţie" (segregarea cromatidelor surori) a materialului genetic prin diviziune se desfăşoară, de obicei, cu mare precizie asigurând fidelitatea transmiterii informaţiei genetice în succesiunea generaţiilor de celule (vezi capitolul 2).

3. EVOLUŢIA CELULELOR REZULTATE PRIN DIVIZIUNE Celulele rezultate după diviziune pot evolua în trei direcţii: proliferare, diferenţiere şi trecerea în stadiul de repaus. a. PROLIFERAREA Celulele parcurg un nou ciclu celular şi se divid repetat; aceste "celule ciclice" alcătuiesc compartimentul proliferativ al organismului şi se găsesc în ţesuturile embrionare, măduva hematogenă, stratul bazal al epidermului ş.a. b. DIFERENŢIEREA Celulele părăsesc definitiv ciclul celular şi se transformă în celule specializate, cu anumite structuri şi funcţii, care nu se mai divid şi mor după un timp determinat. De exemplu: neuronii, celulele musculare, granulocitele, hematiile mature etc. c. STADIUL DE REPAUS Unele celule părăsesc ciclul celular în faza G1 şi rămân în faza G0, având o activitate metabolică minimă, dar păstrându-şi capacitatea de diviziune. Aceste celule formează compartimentul neproliferativ. În condiţii speciale, ele reacţionează la anumiţi stimuli din mediu (factori de creştere, unii hormoni, substanţe mitogene etc.) şi pot reintra în ciclul de diviziune. Un exemplu edificator îl reprezintă activarea limfocitelor T din sângele periferic sub acţiunea fitohemaglutininei (PHA); ele se transformă în limfoblaste, celule tinere, care se divid intens. Acest fenomen este utilizat pentru studiul cromosomilor prin culturi de limfocite (vezi capitolul 3).

4. CONTROLUL CICLULUI CELULAR Progresia ordonată şi desfăşurarea normală a ciclului celular sunt realizate prin reacţii biochimice în care multiple kinaze dependente de cicline (CDK)(1-7) sunt activate, prin fixarea unor proteine numite cicline (A-H). După activare, fiecare complex proteic CDKciclină fosforilează anumite proteine sepecifice, necesare pentru reacţiile care au loc într-o

10

Aparatul genetic al celulei

anumită fază a ciclului. Apoi, complexul CDK-ciclină poate fi inactivat, fie prin degradarea proteolitică a ciclinei (de către ubiquitină) fie prin intervenţia unor molecule inhibitoare CKI (p27, p21 ş.a) . Interacţiunea dintre activarea şi inactivarea activităţilor CDK, în diferite momente cheie, asigură progresia normală şi reglarea ciclului celular. Fiecare fază a ciclului are un control specific (figura 1.5.) realizat în G1 de complexul CDK4-ciclina D, la tranziţia G1/S de complexul CDK2-ciclină E, în faza S de complexul CDK2-ciclină A, iar în fazele G2 şi M de complexul CDC2-ciclină B. Mitogeni, factori nutriţionali, factori de creştere P CAK (ciclină H/CDK7)

Ciclină D

Mitoză 4C/2

CDK4

p15, p16, p18, p19 P

Ciclină B CDC

MPF

G2 4C

p21, p27, p57 Rb

E2F

G1 2C

G0 2C

P

CDK2 Ciclină A

Faza S 2C

p21, p27, p57 Ciclină A

Ciclină E

p21, p27, p57

CDK2

puncte de restricţie sau de control

CDK2

Figura 1.5. Reprezentare schematică a reglării fazelor ciclului celular prin intermediul complexelor CDK-ciclină (adaptat după Jameson et al., 1998) Tranziţia de la o fază la alta a ciclului celular este controlată prin mecanisme specifice, care acţionează în anumite puncte de control şi verifică dacă anumite procese sunt terminate corect sau dacă nu există erori; în cazul identificării unor defecte se blochează progresia în ciclul celular (prin inactivarea CDK) şi se induce ”repararea” sau, dacă aceasta nu este posibilă, apoptoza (moartea celulară programată). Pe parcursul ciclului celular se produc următoarele evenimente: Celulele aflate în faza “de start” G1 reacţionează la stimuli externi (mitogeni, factori de creştere) formându-se complexul CDK4-ciclină D, care fosforilează şi deci activează diferite proteine ce funcţionează în această fază. Printre acestea, un rol important îl are proteina Rb, care (după fosforilare) eliberează un factor activator (E2F) al transcripţiei genelor ce funcţionează în faza S şi realizează replicarea ADN.

Aparatul genetic al celulei

11

Intrarea în faza S este determinată de un semnal activator, complexul CDK2-ciclină E. Formarea acestui complex este însă blocată de inhibitorul p27 al CDK; trecerea în faza S implică mai întâi degradarea p27 (de către ubiquitină) În punctul de control G1/S are loc o verificare a parametrilor de evoluţie normală a celulei: orice alterare a ADN, depleţie de oxigen / metaboliţi / energie sau pertrurbare fiziologică declanşează sinteza proteinei p53 (“gardianul” genomului uman) care activează transcripţia genei ce codifică proteina p21, un inhibitor al complexelor CDK-ciclină. Celulele sunt oprite în G1, oferindu-li-se timp de corecţie; dacă alterările (în special cele din structura ADN) nu sunt reparate, celula va fi direcţionată spre apoptoză Progresia ulterioară prin faza S şi replicarea ADN sunt reglate de către CDK2-ciclina A. În faza G2, la punctul de control G2/M, se decide dacă celula intră în mitoză; acest lucru este determinat de activarea bruscă a complexului CDC2-ciclină B (numit anterior şi factorul MPF). Celulele cu aberaţii cromosomice sau defecte ale aparatului mitotic sunt oprite să intre în mitoză (prin acţiunea p53 p21, care blochează formarea complexului CDC2-ciclina B)). În cursul mitozei, în metafază, mai există un punct de control M în care diviziunea se opreşte şi este verificată alinierea perfectă a cromosomilor, înaintea separării cromatidelor surori. Acţiunea este realizată de către o proteină inhibitoare ISS; degradarea proteolitică a acestei proteine (determinată de ubiquitină) declanşează anafaza prin separarea cromatidelor. La sfârşitul mitozei are loc degradarea bruscă a ciclinei B (produsă de către ubiquitină) şi inactivarea CDC2, fenomene ce permit celulei să treacă într-o nouă fază G1. Proliferarea celulară este reglată pe o durată limitată de factori extracelulari (hormoni, factori de creştere etc.) precum şi de anumite gene de proliferare sau "mitogene" (ce codifică cicline, receptori ai factorilor de creştere, proteine necesare sintezei de ADN, etc.). Deoarece prin mutaţia şi activarea lor anormală se produce o proliferare celulară anormală şi cancer, aceste gene normale mai sunt numite şi proto-oncogene. O altă categorie de gene, numite antiproliferative, au rolul de a inhiba proliferarea celulară. De aceea aceste gene mai sunt numite gene supresoare de tumori sau antioncogene. În cancer se produce o perturbare a desfăşurării normale a ciclului celular. Celulele canceroase, purtătoare de mutaţii, "scapă" de controlul mecanismelor care reglează proliferarea normală, parcurg rapid şi repetat ciclul celular, multiplicându-se permanent şi anarhic. Multe medicamente anticanceroase (citostatice) determină "blocarea" proliferării celulelor, prin oprirea evoluţiei lor în diferite faze ale ciclului celular. Ciclul celular reprezintă o succesiune de evenimente biochimice şi morfologice care se produc în viaţa unei celule. El prezintă două perioade: interfaza şi diviziunea. Interfaza, perioada cuprinsă între două diviziuni, este alcătuită din trei faze succesive: G1, S, G2; în faza S, se produce sinteza de ADN, prin replicare semiconservativă, iar cantitatea de material genetic se dublează (4C). Prin diviziune (faza M) conţinutul nuclear dublat în interfază se distribuie egal şi total celulelor fiice. Prin aceasta se asigură transmiterea fidelă a informaţiei genetice în succesiunea generaţiilor celulare. Celulele rezultate după diviziune pot evolua în trei direcţii: proliferarea (printr-o nouă diviziune) diferenţierea (specializarea celulelor), trecerea în stadiul de repaus G0 (celule cu activitate metabolică redusă).

12

Aparatul genetic al celulei

Ciclul celular este reglat prin intervenţia genelor proliferative (proto-oncogene) şi a genelor antiproliferative (gene supresoare de tumori) a căror mutaţie produce cancer.

D. NUCLEUL Elementul principal al aparatului genetic este nucleul, centrul de comandă şi control al tuturor activităţilor celulelor eucariote. În nucleu, fiecare moleculă de ADN se asociază specific cu anumite proteine (histonice sau nehistonice) şi constituie un complex supramolecular deoxiribo-nucleoproteic. El formează prin spiralizări succesive fibre de cromatină (cromoneme) din care, printr-o condensare progresivă, se formează la începutul diviziunii cromatida unui cromosom (figura 1.6.). Fiecare cromatidă a unui cromosom bicromatidian este alcătuită dintr-o singură moleculă de ADN. La sfârşitul diviziunii se produce fenomenul invers, de despiralizare a cromosomilor. Cromosomii sunt structuri permanente ale nucleului, dar ei sunt vizibili la microscopul optic numai în diviziune. În interfază cromosomii sunt despiralizaţi şi nu se observă la microscopul optic. 80 Mb de 80 Mb de Cromatide surori ADN ADN

Dublu helix 2 nm

Centromer 600 nm

600 nm 600 nm

Nucleosomi

10 nm Fibre de cromatină pliate în bucle laterale (75 kb)

Zonă internucleosomală 300 nm

30 nm 10 nm Fibră de cromatină Filament cu nucleosomi Figura 1.6. Relaţia ADN - fibre de cromatină - cromosomi (după Strachan şi Read, 1999)

1. NUCLEUL INTERFAZIC Nucleul interfazic este alcătuit din membrana nucleară, nucleoplasmă, cromatină şi nucleol(i) (figura 1.2.). Constituentul cel mai important este cromatina, forma interfazică a materialului genetic.

Aparatul genetic al celulei

13

a. COMPOZIŢIA CHIMICĂ A CROMATINEI Cromatina este alcătuită din ADN, proteine histonice, ARN, ioni bivalenţi etc. Dintre acizii nucleici predomină ADN, care se evidenţiază histochimic prin reacţia Feulgen (ADN se colorează în roşu-violet) sau coloraţia cu verde de metil pironină (ADN se colorează în verde, iar ARN din nucleol şi citoplasmă, în roşu cărămiziu). b. ASPECTUL CROMATINEI LA MICROSCOPUL OPTIC La microscopul optic cromatina se observă sub forma unor granule mici, fine, slab colorate, printre care se găsesc corpusculi mari, condensaţi şi intens coloraţi bazofil, numiţi cromocentri; ei reprezintă părţi din cromosomi care nu s-au despiralizat în interfază. Cromatina se prezintă sub două forme sau stări morfo-funcţionale: eucromatină şi heterocromatină, diferenţiate prin gradul de condensare, intensitatea coloraţiei, momentul replicării. Heterocromatina poate fi de două feluri: heterocromatină constitutivă, prezentă în toate celulele în poziţii identice la ambii cromosomi omologi, fie la centromer, fie în diferite segmente cromosomice; heterocromatină facultativă, este prezentă fie numai în anumite celule sau ţesuturi, fie numai la un anumit sex (de exemplu cromatina sexuală X la femei şi cromatina sexuală Y la bărbaţi - vezi capitolul 3). Tabelul 1.2. Caracteristicile eucromatinei şi heterocromatinei CARACTERISTICI Condensare Colorare Replicare în faza S Activitate genetică Compoziţie chimică

EUCROMATINĂ Fin dispersată Slabă Precoce Activă Predomină p.b. C-G şi ADN nerepetitiv

HETEROCROMATINĂ Puternic condensată (cromocentri) Intensă Tardivă Inactivă Predomină p.b. A-T şi ADN repetitiv

c. ASPECTUL CROMATINEI LA MICROSCOPUL ELECTRONIC La microscopul electronic cromatina apare ca o aglomerare de filamente de grosimi diferite, spiralizate şi condensate neregulat3. Filamentele cele mai groase, din care la începutul diviziunii se formează cromosomii, se mai numesc cromoneme (figura 1.6.).

2. NUCLEUL ÎN DIVIZIUNE Nucleul în diviziune îşi pierde aspectul interfazic. Materialul genetic este organizat în cromosomi. Ei rezultă printr-o accentuare a spiralizării cromonemelor, care se condensează, se scurtează şi se "acoperă" cu un înveliş proteic, devenind vizibili la microscopul optic (figura 1.6.). a. NUMĂRUL CROMOSOMILOR Numărul şi morfologia cromosomilor sunt elemente caracteristice fiecărei specii. La om în celulele somatice sunt 46 de cromosomi (2n = număr diploid). Celulele sexuale mature (gameţii) au 23 de cromosomi (n = număr haploid); după fecundarea gameţilor, la zigot se reface numărul diploid de 46 cromosomi.

3

Relaţia ADN → fibre cromatină → cromosomi va fi discutată la curs

14

Aparatul genetic al celulei

În celulele somatice cromosomii se găsesc în perechi de omologi, identici ca mărime şi formă, dar diferiţi ca origine (unul matern, altul patern). Din cele 23 de perechi de cromosomi, 22 sunt identice la cele două sexe - autosomi - iar o pereche diferă la cele două sexe, XX la femeie şi XY la bărbat, numindu-se gonosomi (heterosomi sau cromosomi sexuali). Cromosomii X şi Y, deşi au "omologie" funcţională (în determinismul sexual) se prezintă morfologic diferit: cromosomul Y este mult mai mic decât cromosomul X. b. MORFOLOGIA CROMOSOMILOR Morfologia cromosomilor poate fi uşor analizată în metafază, când cromosomii ajung la condensare maximă, sunt bine individualizaţi şi se găsesc în acelaşi plan. Cromosomul metafazic (figura 1.7.) este alcătuit din două cromatide paralele, identice ca mărime şi formă (“cromatide surori"), unite într-o regiune, mai slab colorată, numită centromer. El conţine două structuri specializate numite kinetocori, prin care cromosomul se fixează pe filamentele fusului de diviziune (vezi figura 2.2.A). Telomer Cromatide

Satelit

Centromer

Metacentric

Submetacentric

Acrocentric

Figura 1.7. Morfologia şi clasificarea cromosomilor după poziţia centromerului (după Thompson, 2001) În zona centromerului se realizează o îngustare pe traiectul cromosomului numită constricţie primară. Centromerul împarte cromatidele în două braţe, egale sau inegale, notate convenţional cu "p" - braţul scurt - şi "q" - braţul lung. Poziţia centromerului (figura 1.7.) poate fi: mediană, la cromosomii metacentrici (M); submediană, la cromosomii submetacentrici (SM) aproape terminală, la cromosomii acrocentrici (A). Pe unii cromosomi se observă şi constricţii secundare (h), produse prin îngustarea cromatidelor; ele conţin heterocromatină. Părţile terminale ale cromatidelor sunt denumite telomere. Cromosomii acrocentrici prezintă constricţii secundare aproape de extremitatea braţelor scurte; ele determină separarea unor mici mase de heterocromatină, cunoscute sub numele de sateliţi. În nucleul interfazic materialul genetic se găseşte sub formă de cromatină, alcătuită din ADN, proteine şi ARN. La microscopul optic cromatina se prezintă sub două forme: eucromatină (activă genetic) şi heterocromatină (inactivă genetic). La microscopul electronic cromatina apare formată din fibre de ADN şi proteine.

Aparatul genetic al celulei

15

La începutul diviziunii fibrele de cromatină se condensează, transformându-se în cromosomi. În celulele somatice se găsesc 46 de cromosomi (2n = număr diploid). Celulele sexuale mature (gameţi) au 23 de cromosomi (n= număr haploid). După fecundarea gameţilor, la zigot se reface numărul 2n = 46 de cromosomi. De aceea, în celulele somatice, cromosomii se găsesc în perechi de cromosomi omologi, identici ca mărime, formă şi conţinut genetic, dar diferiţi ca origine (unul matern şi altul patern). Din cele 23 de perechi de cromosomi omologi, 22 sunt identice la cele două sexe şi se numesc autosomi; o pereche este diferită: XX la femeie şi XY la bărbat, numindu-se cromosomi sexuali sau gonosomi. Cromosomul metafazic este alcătuit din două cromatide, unite prin centromer; acesta împarte cromatidele în braţe scurte (notate cu "p") şi lungi (notate cu "q").

II. APLICAŢII PRACTICE A. ASPECTUL CELULELOR PE PARCURSUL CICLULUI CELULAR Analizaţi (la microscop sau pe fotografii) preparate obţinute din culturi de limfocite şi stabiliţi în ce faze ale ciclului celular se găsesc diferite celule din seria limfocitară. Precizaţi criteriile pe care se bazează opţiunile Dv.

B. SCHIMBURILE DINTRE CROMATIDELE SURORI Uneori, în faza S se produce un "schimb egal de material genetic între cromatidele surori" (SCE - engl. ”sister chromatides exchanges”) care poate fi evidenţiat prin tehnici speciale aplicate în metafază. Acest fenomen are importanţă practică, deoarece frecvenţa schimburilor (normal 7-10 per metafază) creşte în anumite boli sau după expunerea organismului la substanţe mutagene. Astfel SCE reprezintă o metodă de evaluare a acţiunii mutagene a diferiţilor agenţi din mediul ambiant.

1. PRINCIPIUL METODEI SCE Celulele în cultură efectuează două cicluri de replicare în prezenţa unui analog al timinei, numit 5-bromodeoxiuridină (BrdU). BrdU se încorporează, în locul timinei, în moleculele de ADN nou sintetizat, modificând proprietăţile de colorare ale cromatidelor. Folosind soluţia Giemsa sau colorantul fluorescent Hoechst 33258 se colorează exclusiv cromatida în a fost încorporat BrdU (figura 1.8.). În zonele în care se produce SCE se observă aspectul particular ("arlechin") al cromatidelor, cu zone colorate alternând cu zone necolorate.

2. IDENTIFICAREA SCE Identificaţi pe fotografii şi/sau preparate cromosomice "schimburile între cromatidele surori"; calculaţi numărul de schimburi per metafază şi evaluaţi dacă rezultatul obţinut este normal sau nu.

C. COMPOZIŢIA CHIMICĂ A CROMATINEI Observaţi la microscop sau pe fotografii preparate celulare colorate prin reacţia Feulgen şi reacţia cu verde de metil pironină. Precizaţi diferenţele observate şi explicaţi-le ţinând cont de specificitatea acestor reacţii.

16

Aparatul genetic al celulei

Figura 1.8. Principiul metodei BrdU Săgeţile indică cromosomii la nivelul cărora există schimburi între cromatidele surori (după Emery’s, 1998)

D. ASPECTUL CROMATINEI LA MICROSCOPUL OPTIC Examinaţi la microscop şi pe fotografii aspectul nucleului interfazic la diferite tipuri de celule. Precizaţi tipurile de cromatină care se observă şi caracterizaţi-le morfologic.

E. MORFOLOGIA CROMOSOMILOR Analizaţi la microscop şi pe fotografii morfologia cromosomilor umani în metafaze obţinute prin culturi de limfocite. Desenaţi o metafază şi identificaţi elementele principale descrise în morfologia cromosomilor, precum şi diferitele tipuri de cromosomi după poziţia centromerului.

III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR A. DEFINIŢI NOŢIUNILE URMĂTOARE: - Ereditate - Genotip - Genom - Plasmotip - Fenotip - Ciclu celular

- Interfaza - Faza G1 - Faza S - Faza G2 - Faza G0 - Diviziune

- Cromatină - Eucromatină - Heterocromatină - Cromosomi - Cromatidă - Centromer

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. 2. 3. 4.

Părinţii transmit la descendenţi caracterele lor (adevărat/fals?) De ce un individ are o structură genetică unică, specifică? Nucleul, mitocondriile, centriolii şi ribosomii alcătuiesc aparatul genetic deoarece conţin ADN (adevărat/fals?) Genotipul este informaţia genetică a celulei somatice. (adevărat/fals?)

Aparatul genetic al celulei 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

17

Genomul constituie ansamblul genelor din cromosomii gameţilor. (adevărat/fals?) Contribuţia maternă la ereditatea copilului este reprezentată de genomul ovulului (adevărat/fals?) Ce eveniment major are loc în faza S a ciclului celular? Celulele din faza G0 se pot divide (adevărat/fals?) Cancerul poate fi considerat o boală produsă prin perturbarea mecanismelor de control ale ciclului celular (adevărat/fals?) În eucromatină se găseşte ADN inactiv genetic. (adevărat/fals?) Câţi cromosomi se găsesc în nucleul celulelor somatice? Câţi provin de la mamă? Câte cromatide se observă la cromosomii metafazici? Gonosomii sunt cromosomii celulelor sexuale. (adevărat/fals?) Toţi cromosomii au o constricţie primară. (adevărat/fals?)

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun din cele enunţate ("complement simplu"): 1. Care din următoarele organite celulare NU face parte din aparatul genetic al celulei: A. Nucleul; B. Centriolii C. Mitocondriile; D. Lizozomii; E. Ribosomii. 2. Care este cea mai scurtă fază a ciclului celular: A. Faza G1; B. Faza G0; C. Faza S;

D. Faza G2

E. Faza M.

3. Cromocentrii reprezintă: A. Corpusculi de cromatină cu replicare precoce a ADN; B. Porţiuni de cromatină mai condensată şi mai intens colorată; C. Zona cu care cromosomul se fixează pe filamentele fusului de diviziune; D. Organitele care formează fusul de diviziune; E. Zonele terminale ale cromosomilor. II. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("complement grupat"): A - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3; B - dacă sunt corecte răspunsurile 1,3; C - dacă sunt corecte răspunsurile 2,4; D - dacă este corect răspunsul 4; E - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3,4. 4. Care din următoarele organite celulare conţin ADN: 1. Nucleul; 3. Mitocondriile; 2. Centriolii; 4. Ribosomii. 5. În ce faze ale ciclului celular o celulă somatică umană normală are 92 de molecule de ADN: 3. Profaza şi metafaza; 1. Sfârşitul fazei S şi faza G2; 2. Fazele S şi anafază; 4. Fazele G2 şi G1. 6. Heterocromatina facultativă este: 1. Prezentă numai în anumite celule; 2. Prezentă numai la sexul feminin; 3. Inactivă genetic; 4. Constituită din ARN şi proteine. 7. Care din următoarele afirmaţii privind centromerul sunt corecte: 1. Formează constricţia secundară; 2. Împarte cromosomul în două braţe; 3. Separă sateliţii de telomer; 4. Poziţia sa clasifică cromosomii în trei categorii. III. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("teste tip cauză-efect"):

18

Aparatul genetic al celulei

A - dacă ambele propoziţii sunt adevărate şi între ele există relaţie cauză-efect; B - dacă ambele propoziţii sunt adevărate, dar între ele nu există relaţie cauză-efect; C - dacă prima propoziţie este adevărată, iar a doua falsă; D - dacă prima propoziţie este falsă, iar a doua este adevărată; E - dacă ambele propoziţii sunt false. 8. ADN este substratul material al eredităţii deoarece conţine informaţia genetică codificată. 9. În faza G2 cromosomii sunt bicromatidieni, deoarece a apărut factorul de condensare al cromosomilor. 10. Cromosomii submetacentrici au sateliţi deoarece, centromerul realizează o constricţie aproape de extremitatea braţelor scurte. IV. Asociaţi enunţurilor din coloana din stânga, notate cu cifre, enunţurile corespunzătoare din coloana din dreapta, notate cu litere: Asociaţi structurile celulare din coloana din stânga cu definiţiile sau caracteristicile (funcţiile) care le corespund, din coloana din dreapta: 11. Nucleul A. Formează fusul de diviziune 12. Mitocondriile B. Aspectul materialului genetic în interfază 13. Ribosomii C. Elementul principal al aparatului genetic 14. Cromatina D. Participă la sinteza proteinelor 15. Centriolii E. Conţin 0,5 % din ADN-ul celulei

2. DIVIZIUNEA CELULEI I. DATE TEORETICE A. GENERALITĂŢI Diviziunea celulei reprezintă ansamblul evenimentelor prin care se produce multiplicarea celulară şi se asigură, prin intermediul cromosomilor, transmiterea informaţiei ereditare în succesiunea generaţiilor de celule sau organisme (figura 1.1.B). Prin diviziune, materialul genetic se transmite: de la o celulă somatică la celulele fiice, prin mitoză, rezultând celule noi identice cu celula din care provin; de la un organism adult la descendenţi, prin intermediul gameţilor haploizi, rezultaţi în urma meiozei.

B. MITOZA Mitoza este o diviziune caracteristică celulelor somatice ale organismului. Ea asigură creşterea organismului, reînnoirea celulară şi repararea unor leziuni tisulare. Prin mitoză, materialul genetic, dublat în interfază, se distribuie total şi egal celulelor fiice. Mitoza este o diviziune ecvaţională, deoarece din celula iniţială (celula “mamă”) cu 46 cromosomi rezultă două celule “fiice” care au, de asemenea, 46 cromosomi (celule diploide). Mitoza permite transmiterea cu mare fidelitate a informaţiei genetice în succesiunea generaţiilor de celule, ceea ce asigură stabilitatea proceselor ereditare.

1. FAZELE MITOZEI Mitoza se desfăşoară în cinci etape succesive: profaza, prometafaza, metafaza, anafaza şi telofaza (figura 2.1.). a. PROFAZA La începutul profazei, în nucleu are loc condensarea fibrelor de cromatină, numite şi "cromoneme", prezente sub forma unor filamente fine, care se scurtează şi se îngroaşă, devenind intens colorate şi vizibile sub formă de cromosomi. Fiecare cromosom este alcătuit din două cromatide surori, datorită replicării materialului genetic în faza S a interfazei. Fiecare din cele două cromatide conţine în regiunea centromerului o secvenţă specifică de ADN repetitiv, unde cromatidele sunt unite prin intermediul unor proteine. La acest nivel se asamblează complexe proteice specializate, numite kinetocori (figura 2.2.A) cu care cromosomul se va fixa pe filamentele fusului de diviziune. În citoplasmă, centrosomul (un organit citoplasmatic perinuclear) se divide; cei doi centrosomi rezultaţi se deplasează în direcţii opuse, formând polii fusului de diviziune. Ei sunt uniţi prin filamente alcătuite din microtubuli (figura 2.2.B). Nucleolii diminuă ca mărime şi în cele din urmă se dezintegrează.

20

Diviziunea celulei

Figura 2.1. Fazele mitozei Reprezentare diagramatică pentru o celulă ipotetică cu două perechi de cromosomi: 1 - Profaza; 2 - Prometafaza; 3 - Metafaza; 4 - Anafaza; 5 - Telofaza (adaptat după Thompson, 2001)

A

B Figura 2.2. Microtubuli kinetocorici A. Fixarea microtubulilor la cromosomul metafazic. B. Diferite clase de microtubuli. Fusul mitotic

b. PROMETAFAZA Prometafaza este un stadiu intermediar între profază şi metafază, caracterizat prin: fragmentarea membranei nucleare, ataşarea cromosomilor (prin kinetocori) la filamentele fusului de diviziune, condensarea cromosomilor şi deplasarea lor spre ecuatorul celulei.

Diviziunea celulei

21

c. METAFAZA În metafază cromosomii bicromatidieni îşi continuă procesul de spiralizare şi condensare. Ei se aliniază independent unul de altul la ecuatorul fusului de diviziune, în acelaşi plan, formând aşa-numita placă metafazică. Metafaza este stadiul optim pentru studiul cromosomilor, deoarece aceştia sunt contractaţi, bine individualizaţi morfologic şi dispuşi într-un singur plan. d. ANAFAZA În anafază se produce “clivarea” longitudinală a centromerului şi separarea celor două cromatide, proces numit disjuncţie (segregare) cromatidiană. Din fiecare cromosom bicromatidian se formează doi cromosomi monocromatidieni (figura 2.3. A).

Figura 2.3. Disjuncţia (A) şi nedisjuncţia (B) cromatidiană în mitoză După separare, cromosomii monocromatidieni sunt traşi spre polii fusului de diviziune prin scurtarea fibrelor kinetocorice4. Deplasarea cromosomilor spre poli se face simultan, cu aceeaşi viteză. Astfel, se produce împărţirea totală şi egală a materialului genetic între celulele fiice. e. TELOFAZA Se caracterizează prin evenimente opuse celor din profază. Cromosomii suferă un proces de decondensare şi despiralizare, îşi pierd structura vizibilă la microscopul optic, devenind cromoneme subţiri, vizibile doar la microscopul electronic. Fusul de diviziune se dezasamblează, se reface membrana nucleară şi reapare nucleolul. Începe diviziunea citoplasmei (citokineză) şi, în final, cele două celule fiice se separă, fiecare conţinând 2n cromosomi monocromatidieni cu aspect interfazic.  Diviziunea este de două tipuri: mitoza - în celulele somatice şi meioza - în celulele sexuale.  Mitoza este o diviziune ecvaţională deoarece dintr-o celulă diploidă (2n=46) rezultă două celule fiice tot cu 2n=46.

4

Funcţia microtubulilor este demonstrată prin tratament cu colchicină, care inhibă formarea lor şi împiedică aranjarea cromosomilor în plan ecuatorial, precum şi migrarea lor anafazică.

22

Diviziunea celulei

 Mitoza cuprinde cinci faze: profaza, prometafaza, metafaza, anafaza şi telofaza  În profază, cromosomii bicromatidieni se condensează, se formează fusul de diviziune şi nucleolii dispar.  În prometafază, membrana nucleară se dezasamblează şi cromosomii se ataşează prin centromer la filamentele fusului de diviziune.  În metafază, cromosomii dispuşi la mijlocul celulei formează placa ecuatorială; este stadiul optim pentru studiul cromosomilor.  În anafază, materialul genetic se împarte total şi egal prin fenomenul de disjuncţie cromatidiană; are loc migrarea cromosomilor spre polii celulei, simultan şi cu aceeaşi viteză.  În telofază, se produc evenimente opuse celor din profază şi se formează în final, prin citokineză, două celule fiice diploide (2n).

2. ERORI DE DISTRIBUŢIE A MATERIALULUI GENETIC ÎN MITOZĂ Pentru a înţelege mai bine consecinţele unor erori de distribuţie a materialului genetic este necesară clarificarea unor termeni (caseta 2.1.). Caseta 2.1. Set diploid de cromosomi (2n) = semnifică prezenţa a câte unei perechi din fiecare cromosom în celulele somatice; la om 2n = 46 cromosomi. Set haploid de cromosomi (n) = prezent în celulele sexuale mature, caracterizat prin existenţa a câte unui singur cromosom din fiecare pereche; la om n = 23 cromosomi. Aneuploidie = starea de dezechilibru genetic produsă prin existenţa în plus sau prin lipsa unor cromosomi. Monosomie = absenţa unui cromosom dintr-o pereche de cromosomi omologi (2n-1=45). Nulisomie = absenţa ambilor cromosomi ai unei perechi (2n-2=44). Trisomie = prezenţa unui cromosom în plus faţă de cei doi cromosomi omologi care se găsesc normal într-o celulă diploidă (2n+1=47). Tetrasomie = prezenţa în plus a doi cromosomi din aceeaşi pereche (2n+2=48). Pentasomie = prezenţa în plus a trei cromosomi din aceeaşi pereche (2n+3=49). Principalele erori de distribuţie a materialului genetic în mitoză sunt: nedisjuncţia cromatidiană, întârzierea anafazică şi clivarea transversală a centromerului. a. NEDISJUNCŢIA CROMATIDIANĂ Nedisjuncţia cromatidiană apare când cele două cromatide ale unui cromosom nu se separă în timpul anafazei mitozei, ci rămân unite şi migrează împreună în una din cele două celule fiice (figura 2.3. B). Consecinţa acestei erori este apariţia unor celule anormale: una cu un cromosom în plus (2n+1) = trisomică (47 cromosomi) alta cu cromosomul respectiv lipsă (2n-1) = monosomică (45 cromosomi). Dacă celulele rezultate sunt viabile şi se multiplică ulterior, rezultă o clonă (grup de celule ce au o particularitate comună şi provin prin mitoze repetate dintr-o celulă iniţială modificată) iar în organism apar mozaicuri cromosomice, cu trei linii celulare, de tipul 2n-1/2n/2n+1 (la om = 45/46/47) cromosomi, numite mixoploidii (Figura 2.4.). După tipul de cromosomi implicaţi în producerea lor, mozaicurile cromosomice pot fi: autosomale, gonosomale sau mixte.

Diviziunea celulei

23

cromosomi

Figura 2.4 Mecanismele de producere a mozaicurilor cromosomice prin nedisjuncţie cromatidiană în mitoză A. Diviziune mitotică normală; B. Nedisjuncţie în prima diviziune a zigotului - rezultă un mozaic 45/47; C. Nedisjuncţie în diviziunile ulterioare - rezultă un mozaic 46/45/47 (viabilitatea şi dezvoltarea depind de cromosomul implicat)

b. ÎNTÂRZIEREA

ANAFAZICĂ

Întârzierea anafazică constă în migrarea cu întârziere a unuia sau mai multor cromosomi monocromatidieni, care vor rămâne în afara nucleilor celulelor fiice, în momentul formării membranelor nucleare. Ei formează “micronuclei” care dispar la următoarea diviziune. Rezultă linii celulare cu 2n-1/ 2n, adică 45/46 cromosomi (figura 2.5.).

crs

Figura 2.5. Apariţia unui mozaic cromosomic prin întârziere anafazică mitotică Micronucleii se găsesc în citoplasma celulei. Ei se formează din cromosomi sau fragmente de cromosomi care nu au migrat şi care nu au fost incluşi în nici unul din nucleii fii. Prezenţa lor, evidenţiată prin aşa numitul test al micronucleilor, indică tulburări ale

24

Diviziunea celulei

desfăşurării mitozei. Testul este utilizat pentru depistarea mutaţiilor cromosomice induse de radiaţiile ionizante sau alţi factori mutageni (vezi aplicaţii practice). c. CLIVAREA TRANSVERSALĂ A CENTROMERULUI Clivarea transversală a centromerului produce isocromosomi (“cromosomi cu braţe egale”) alcătuiţi numai din braţe scurte (p) sau braţe lungi (q) (figura 2.6.). Ei sunt anormali, deoarece au duplicate genele de pe braţul prezent şi le lipsesc genele de pe braţul pierdut.

Figura 2.6 Mecanismul formării isocromosomilor A. Clivarea normală (longitudinală) a centromerului. B. Clivarea transversală a centromerului cu formarea unui isocromosom de braţ lung (q) şi unui isocromosom de braţ scurt (p); (adaptat după Friedman, 1992)

d. ABSENŢA CITOKINEZEI După duplicarea ADN-ului în interfază (2n cromosomi bicromatidieni = 4C) celulele somatice se divid mitotic formând celule diploide (2n cromosomi monocromatidieni = 2C). Dacă citokineza nu se produce rezultă o celulă cu 4n cromosomi monocromatidieni (4C) celulă tetraploidă. Acest proces, numit şi endomitoză, se observă în mod normal în procesul de regenerare hepatică. e. CONSECINŢELE ERORILOR MITOTICE Erorile de distribuţie a materialului genetic în mitoză determină apariţia unor anomalii de număr şi structură ale cromosomilor din celulele fiice. Ele vor influenţa evoluţia celulelor, modificând viabilitatea şi capacitatea de multiplicare. Celulele cu monosomie autosomală sunt, de obicei, eliminate, iar celulele cu trisomie pot fi păstrate (funcţie de cromosomul implicat), formând un mozaic de tipul 46/47. Dacă se pierde cromosomul X dintr-o celulă 46,XY aceasta este eliminată, în timp ce prin eliminarea cromosomului Y apare o linie celulară aneuploidă (45,XO) potenţial viabilă. Apariţia unor clone celulare anormale la un organism, prin oricare din erorile amintite, determină efecte diferite în raport cu momentul ontogenetic în care s-a produs accidentul şi cu proporţia celulelor anormale care se formează. Perturbarea precoce şi apariţia unui număr mare de celule anormale în primele stadii de dezvoltare are consecinţe negative majore asupra fenotipului purtătorilor de anomalii cromosomice.  Importanţa genetică a mitozei constă în transmiterea cu mare fidelitate a informaţiei ereditare de-a lungul generaţiilor de celule; prin ea se asigură creşterea organismului, reînnoirea celulară şi repararea unor leziuni tisulare.  În mitoză se pot produce erori de distribuţie a materialului genetic: nedisjuncţia cromatidiană (rezultă mozaicuri cromosomice 45/46/47),

Diviziunea celulei

25

întârzierea anafazică (rezultă mozaic 45/46) şi clivarea transversală a centromerului (rezultă isocromosomi de braţe scurte şi lungi). Mozaicurile cromosomice sunt caracterizate prin prezenţa în acelaşi organism a unor linii celulare cu număr diferit de cromosomi.  Erorile de distribuţie a materialului genetic în mitoză produc anomalii de număr sau structură ale cromosomilor, cu consecinţe asupra viabilităţii şi capacităţii de multiplicare a celulelor.

C. MEIOZA Meioza este un proces complex care are loc în gonade şi care se realizează prin două diviziuni succesive: meioza I (diviziunea meiotică primară, heterotipică, reducţională) şi meioza II (diviziunea meiotică secundară, homotipică, ecvaţională) neseparate de interfază. Meioza I este o diviziune reducţională, caracteristică spermatogenezei şi ovogenezei. Caracteristica principală a meiozei constă în înjumătăţirea numărului de cromosomi, gameţii haploizi rezultaţi conţinând numai câte un cromosom din fiecare pereche (la om n = 23). Astfel, meioza, urmată de fecundare, contribuie la menţinerea constantă a numărului de cromosomi caracteristic speciei la fiecare individ. În meioză au loc însă şi fenomene de recombinare cromosomică, care sunt o sursă importantă de variabilitate genetică.

1. MEIOZA I Este foarte complexă şi are o durată lungă, în special la organismele feminine. Prezintă patru etape: profaza I, metafaza I, anafaza I, telofaza I, fiecare cu anumite particularităţi (figura 2.7.A). a. PROFAZA I Profaza I este foarte lungă (90 % din durata meiozei I) şi cuprinde cinci stadii. Leptoten. Prin condensarea fibrelor de cromatină, cromosomii devin vizibili ca filamente subţiri şi lungi, ataşate prin telomere la membrana nucleară. Astfel, datorită lungimii mari şi grosimii mici a cromosomilor, deşi cromosomii sunt bicromatidieni, ei apar monocromatidieni la examinarea la microscopul optic. Zigoten. Cromosomii omologi (matern şi patern) se apropie, se dispun paralel de-a lungul cromatidelor, fenomen numit sinapsă sau conjugare cromosomică; se realizează astfel o aliniere "genă la genă" rezultând structuri numite bivalenţi (în realitate fiecare unitate este o tetradă, deoarece prezintă patru cromatide). Cromosomii omologi sunt uniţi (lipiţi) în anumite regiuni la nivelul complexului sinaptonemal, vizibil la microscopul electronic. O excepţie de la acest model de sinapsă, este prezentă la sexul masculin, la care cromosomii X şi Y, nefiind omologi, fac sinapsă "cap la cap", printr-o mică regiune omologă ("regiune pseudoautosomală") aflată la capătul braţelor scurte, şi formează o structură specifică - vezicula sexuală. Pahiten. Cromosomii se scurtează şi se îngroaşă. Din loc în loc devin vizibile nişte puncte mai intens colorate numite cromomere, a căror număr şi poziţie sunt caracteristice fiecărui cromosom5. În faza de pahiten are loc fenomenul de încrucişare cromosomică între cromosomii omologi - crossing-over - care constă în "ruperea" cromatidelor nesurori în anumite puncte şi schimbarea reciprocă (încrucişată) a unor fragmente egale; astfel, un fragment de

5

Dispoziţia cromomerelor coincide cu cea a benzilor G (vezi capitolul Cromosomii umani)

26

Diviziunea celulei

cromatidă de pe un cromosom matern se transferă pe omologul său patern şi invers, realizând o nouă combinaţie genică.

Figura 2.7.A. Fazele meiozei I Reprezentare diagramatică a două perechi de cromosomi şi a unui crossing-over 1-4 profaza; 5 (a,b) posibilităţile de aranjare a celor două perechi de cromosomi în metafază; 6 (a,b) anafaza; 7 (a,b) telofaza; 8 (a,b) combinaţiile posibile ale cromosomilor parentali.

Diviziunea celulei

27

Figura 2.7. B Fazele meiozei II 9a1, 9a2, 9b1,9b2 metafaza; 10a1, 10a2, 10b1,10b2 anafaza; 11a1, 11a2, 11b1, 11b2 cele 8 combinaţii cromosomice posibile în gameţi. (modificat după Thompson, 2001) Recombinare implică numai două din cele patru cromatide, care vor conţine gene de la ambii părinţi; se realizează astfel o recombinare intracromosomică, care reprezintă o sursă de variabilitate genetică, datorită noilor combinaţii de gene care apar şi se transmit la descendenţi. Rareori, crossing-over-ul este inegal, determinând deleţia sau duplicaţia unor segmente cromosomice (figura 2.8.). La om se produc 1-3 recombinări per cromosom, dependent de dimensiunea cromosomului. În meioza masculină totalul recombinărilor este de circa 50/ celulă, în timp ce meioza feminină se caracterizează printr-un număr mai mare de recombinări (aproximativ 70/celulă). Reducerea numărului de recombinări în meioza feminină a fost corelată cu o incidenţă crescută a anomaliilor cromosomice numerice la descendenţi, datorită favorizării nedisjuncţiei meiotice.

28

Diviziunea celulei

Figura 2.8 Fenomenul de încrucişare cromosomică şi recombinare genică Diploten. Cromosomii omologi încep să se separe longitudinal, ca şi cum "s-ar respinge" reciproc. Cromatidele lor rămân în contact la nivelul chiasmatelor6, care marchează localizarea crossing-over-ului. Diakineza. Cromosomii devin mai scurţi şi mai groşi, omologii se separă aproape complet, iar chiasmatele se observă numai la capetele lor (terminalizarea chiasmatelor). În această fază se observă clar că fiecare bivalent conţine patru elemente: cromatidele surori sunt unite prin centromer, iar cromatidele nesurori sunt unite prin chiasmatele la nivelul cărora s-a produs crossing-over-ul. b. METAFAZA I Membrana nucleară dispare complet şi se formează fusul de diviziune. Bivalenţii, formaţi din cromosomi bicromatidieni, se fixează cu centromerul pe filamentele fusului la ecuatorul celulei formând placa metafazică. Metafaza I este etapa optimă de studiu a cromosomilor în meioză. c. ANAFAZA I Cuprinde un fenomen genetic foarte important: disjuncţia cromosomilor. Cei doi cromosomi bicromatidieni ai fiecărui bivalent se separă şi se repartizează câte unul la fiecare celulă fiică. Spre deosebire de mitoză, cromatidele surori nu se despart, ci rămân ataşate la nivelul centromerului. Urmează migrarea anafazică prin deplasarea cromosomilor (bicromatidieni) simultan şi cu aceeaşi viteză, spre polii opuşi ai celulei. În final, se produce o reducere a numărului de cromosomi, de la 2n la n şi fiecare celulă va avea numai un exemplar din perechea de omologi. Acest fenomen stă la baza primei legi a lui Mendel, legea segregării. Segregarea sau separarea aleatorie a fiecărei perechi de cromosomi omologi determină asortarea independentă a omologilor, fenomen enumit recombinare intercromosomică. Deoarece fiecare pereche de cromosomi se separă independent de celelalte, rezultă un număr mare de combinaţii cromosomice în gameţi, în raport direct cu numărul de perechi de cromosomi ai speciei. Se formează 2x tipuri de gameţi (x = numărul de perechi de cromosomi) (figura 2.9.). La om existând 23 perechi de cromosomi se formează 223 (peste 8,3 milioane) de tipuri de gameţi diferiţi, la fiecare din cele două sexe. Asortarea independentă a cromosomilor omologi, prin fenomenul de recombinare cromosomică, asociată cu recombinarea intracromosomică prin crossing-over, explică marea variabilitate a gameţilor. Ea confirmă cea de a doua lege a lui Mendel, referitoare la combinarea liberă a "factorilor ereditari" (genelor) astfel că fiecare gamet, care rezultă în urma meiozei, are un set unic de gene, diferit de al celorlalţi. Prin combinarea, pe bază de 6

Chiasma (pl. chiasmate) – punctul cromosomic în care se produce crossing-over-ul

Diviziunea celulei

29

probabilitate, a gameţilor masculini cu cei feminini în procesul de fecundare are loc formarea unor zigoţi diferiţi din punct de vedere genetic, iar indivizii rezultaţi vor fi unicate genetice. d. TELOFAZA I Are loc reasamblarea nucleilor; citokineza se realizează fără separarea completă a celulelor fiice, care rămân ataşate printr-o punte citoplasmatică, formând o diadă. După meioza I urmează o scurtă interfază, lipsită de replicarea ADN-ului, în care cromosomii nu se decondensează.

2. MEIOZA II Se aseamănă cu o diviziune mitotică dar care se realizează în celule cu număr haploid de cromosomi. Este o diviziune homotipică, ecvaţională. Ea cuprinde, de asemenea patru stadii: profaza II, metafaza II, anafaza II şi telofaza II (figura 2.7. B). a. PROFAZA II. În profaza II cromatidele surori ale cromosomilor bicromatidieni devin vizibile distinct, iar membrana nucleară dispare. b. METAFAZA II. Cromosomii se condensează şi se ataşează fiecare pe câte un filament al fusului de diviziune, formând placa ecuatorială. c. ANAFAZA II.

Figura 2.9 Recombinarea intercromosomică - sursă de variabilitate genetică

Prin diviziunea centromerelor disjuncţie cromatidiană fiecare cromosom se separă în două cromatide; acestea devin cromosomi independenţi şi se deplasează spre polii opuşi ai celulelor.

d. TELOFAZA II. Din cele două celule fiice se formează patru seturi haploide de cromosomi monocromatidieni (câte două pentru fiecare celulă). În final, prin reorganizarea nucleilor şi

30

Diviziunea celulei

separarea celulelor rezultate apar patru celule haploide, care prin maturare se transformă în gameţi fecundabili. Gameţii rezultaţi nu sunt identici, fiecare având o altă combinaţie de gene datorită fenomenelor de crossing-over şi segregare independentă a cromosomilor.  Meioza prezintă două diviziuni succesive: meioza I - reducţională şi meioza II - ecvaţională; se desfăşoară în gonade şi are ca rezultat formarea gameţilor haploizi.  Rolurile meiozei constau în: menţinerea constantă a numărului de cromosomi caracteristic speciei, conservarea însuşirilor ereditare la descendenţi şi variabilitatea genetică în populaţie, prin recombinări intra şi intercromosomice.  Meioza I are profaza foarte lungă, cu cinci stadii: leptoten, zigoten, pahiten, diploten şi diakineză.  În zigoten, prin conjugarea cromosomilor omologi genă la genă se formează bivalenţi; excepţie fac cromosomii X şi Y la bărbat, care fac sinapsă prin braţele scurte, formând vezicula sexuală.  În pahiten, prin schimbul reciproc de segmente cromatidiene între cromosomii omologi - crossing-over - are loc un fenomen de recombinare intracromosomică.  În metafaza I cromosomii bicromatidieni formează placa metafazică la ecuatorul celulei.  În anafaza I cromosomii omologi se separă şi migrează spre polii celulei disjuncţie cromosomică (recombinare intercromosomică).  Fiecare pereche de cromosomi se separă independent de celelalte, fiind posibilă formarea unui număr de 2x combinaţii gametice, unde x este numărul de cromosomi caracteristic speciei;  La sfârşitul meiozei I se formează doi nuclei fii, fiecare având un set haploid de cromosomi (n).  În metafaza II, cromosomii se fixează pe filamentele fusului de diviziune.  În anafaza II, fiecare cromosom bicromatidian se desparte în cele două cromatide, care migrează în spre polii celulei - disjuncţie cromatidiană.  În telofaza II se formează gameţii haploizi.

3. PARTICULARITĂŢILE MEIOZEI LA BĂRBAT ŞI FEMEIE Meioza prezintă o serie de particularităţi la cele două sexe, legate de cronologia, desfăşurarea şi finalitatea ei. La bărbat se formează în final patru spermatozoizi, în timp ce la femeie, prin eliminarea globulilor polari, rezultă doar un ovul (figura 2.9.). Meioza masculină are următoarele particularităţi: debutează la pubertate şi continuă întreaga viaţă; dintr-o spermatogonie, prin cele două diviziuni meiotice, rezultă patru spermatozoizi funcţionali; jumătate dintre spermatozoizii formaţi au cromosom X, iar cealaltă jumătate are cromosom Y; meioza masculină este un proces rapid, durata sa fiind de circa 60 zile; meioza masculină este un proces intens, 1 ml de spermă conţinând în mod normal circa 70 de milioane de spermatozoizi; meioza masculină este un proces autoreglabil, ce se autoîntreţine; meioza masculină este sensibilă la acţiunea factorilor de mediu (căldură etc.) în meioza masculină există un risc scăzut de apariţie al erorilor de distribuţie a materialului genetic, deoarece durata procesului este scurtă, în schimb, odată cu creşterea vârstei,

Diviziunea celulei

31

bărbaţii au un risc crescut de a avea copii cu afecţiuni monogenice, deoarece o mutaţie apărută este copiată neîntrerupt. Ovare

Celule germinale primordiale

Testiculi

Spermatogonie

Ovogonie

Mitoze repetate ale ovogoniilor şi spermatogoniilor

Creştere şi diferenţiere Ovocit de ordinul I (2n) Ovocit de ordinul II (n)

Spermatocit de ordinul I (2n) Meioza I

Spermatocit de ordinul II (n)

Meioza II Ovul (n) Al doilea Primul globul polar globul polar

Spermatidă (n)

Spermatozoizi (n) Figura 2.9. Schema meiozei feminine (stânga) şi masculine (dreapta)

Meioza feminină are următoarele particularităţi: este un proces ce debutează prenatal (luna a III-a de viaţă intrauterină) după care se blochează în luna a VII-a prenatal, în dichtioten, etapă intermediară între diploten şi diakineză; în acest moment toate ovogoniile (circa 300.000) sunt deja formate; procesul este reluat la pubertate şi decurge ciclic, în fiecare lună eliberându-se câte unul sau maximum două ovocite de ordin II, care vor fi eliberate în trompa uterină; acest ovocit începe meioza II, dar procesul se încheie doar dacă se produce fecundarea; meioza feminină se opreşte definitiv la menopauză; în cazul meiozei feminine dintr-o ovogonie, prin cele două diviziuni meiotice, rezultă o singură celulă funcţională (ovulul) ce conţine aproape întreaga citoplasmă a celulei iniţiale şi doi globuli polari (celule nefuncţionale); toate ovulele au doar cromosom X; meioza feminină este un proces lent, care durează între 10 şi 50 de ani;

32

Diviziunea celulei

meioza feminină este un proces puţin intens, în ficare lună maturându-se maximum câţiva foliculi ovarieni; meioza feminină este un proces reglat hormonal, fiind dependent de nivelul de FSH şi LH, secretaţi de hipofiză; creşterea vârstei materne favorizează accidentele de distribuţie a materialului genetic în meioză (anomalii cromosomice numerice) deoarece ovogoniile rămân blocate o perioadă lungă în dichtioten; în schimb probabilitatea de apariţie a mutaţiilor genice este redusă, deoarece pe parcursul vieţii se maturează doar câteva sute de ovocite.

4. ACCIDENTE DE DISTRIBUŢIE A MATERIALULUI GENETIC ÎN MEIOZĂ ŞI CONSECINŢELE LOR Desfăşurarea evenimentelor genetice poate fi tulburată în meioza I sau II prin aşa numitele "accidente anafazice" a căror consecinţă este fie blocarea meiozei, ce determină sterilitate, fie formarea unor gameţi neechilibraţi genetic, care după fecundare vor da zigoţi anormali. În funcţie de evoluţia acestor zigoţi se pot produce avorturi spontane, nou-născuţi morţi sau nou-născuţi vii plurimalformaţi. Mecanismele principale de apariţie a acestor erori sunt: nedisjuncţia cromosomică, nedisjuncţia cromatidiană, pierderea unor cromosomi ca urmare a migrării întârziate în anafază, nesepararea citelor de ordinul II. a. NEDISJUNCŢIA Nedisjuncţia poate surveni în decursul meiozei primare (nedisjuncţie cromosomică), secundare (nedisjuncţie cromatidiană) sau în ambele (nedisjuncţie dublă sau succesivă) şi poate afecta, atât autosomii, cât şi gonosomii (figura 2.10.).

Figura 2.10. Consecinţele nedisjuncţiei în meioza I şi II (după Thompson, 2001) Prin nedisjuncţie meiotică rezultă gameţi disomici şi nulisomici. Gameţii disomici, rezultaţi prin nedisjuncţie în meioza I, vor avea în cazul perechii afectate, un cromosom de origine maternă şi unul de origine paternă. Prin nedisjuncţie în meioza II, gametul disomic conţine doi cromosomi cu origine identică maternă sau paternă (disomie uniparentală). Consecinţele nedisjuncţiei meiotice sunt diferite la bărbat şi la femeie, datorită particularităţilor gametogenezei la cele două sexe. Pentru înţelegerea acestor diferenţe vom considera nedisjuncţia gonosomilor la cele două sexe.

Diviziunea celulei

33

La bărbat, deoarece dintr-un spermatocit primar rezultă patru spermatozoizi, nedisjuncţia cromosomilor sexuali în prima meioză determină numai apariţia unor spermatozoizi anormali: disomici (XY) sau nulisomici (O). În schimb, nedisjuncţia gonosomilor în meioza II determină formarea de gameţi normali (X şi Y) şi gameţi disomici XX sau YY, respectiv nulisomici. În schimb, diviziunea meiotică feminină este asimetrică prin formarea globulilor polari, care de obicei sunt eliminaţi. La femeie nedisjuncţia, fie că apare în prima, fie în a doua meioză, va produce ovule anormale: disomice (XX) sau nulisomice (O). În unele situaţii apar trisomii duble, produse prin nedisjuncţie multiplă la acelaşi părinte, fiind afectaţi, de exemplu, gonosomii şi o pereche de autosomi (ovulul XX,+21 fecundat cu un spermatozoid normal va forma zigoţi 48,XXX,+21 sau 48,XXY,+21); acelaşi rezultat se produce şi când nedisjuncţia are loc la ambii părinţi, dar afectează cromosomi diferiţi (fecundarea unui ovul anormal XX de către un spermatozoid anormal X,+21 sau Y,+21). b. ÎNTÂRZIEREA ANAFAZICĂ Întârzierea anafazică constă în pierderea unui cromosom în cursul anafazei meiozei I sau II. În consecinţă, apar gameţi nulisomici (n-1) care prin fecundare, vor forma zigoţi monosomici (2n-1) unii incompatibili cu supravieţuirea, mai ales când sunt implicaţi autosomii. c. NESEPARAREA "CITELOR" DE ORDIN II Nesepararea citelor de ordinul II este un eveniment prin care se formează gameţi diploizi, care au întregul set de cromosomi (2n). Prin fecundare cu gameţi normali apar zigoţi triploizi, neviabili (3n = 69 cromosomi).  În meioză se pot produce erori de distribuţie a materialului genetic prin nedisjuncţie cromosomică, întârziere anafazică - în meioza I - sau nedisjuncţie cromatidiană, întârziere anafazică şi nesepararea citelor de ordinul II - în meioza II. În toate cazurile se formează gameţi neechilibraţi genetic (nulisomici, disomici, diploizi) care, prin fecundare cu gameţi normali vor forma zigoţi cu anomalii cromosomice omogene (monosomii, trisomii, triploidii).

II. APLICAŢII PRACTICE 1. a) Identificaţi pe diapozitive, la microscop şi pe fotografii fazele mitozei, pe preparate de celule vegetale şi animale. Descrieţi caracteristicile fiecărei faze observate şi comentaţi evenimentele genetice care pot avea loc în cursul acesteia. b) Precizaţi care sunt erorile de distribuţie ale materialului genetic în anafaza mitozei şi consecinţele lor asupra evoluţiei celulelor. 2. Exemplificaţi schematic formarea unui mozaic cromosomic prin nedisjuncţia mitotică a unei perechi de cromosomi, având ca model schema generală. 3. Întocmiţi diagrama nedisjuncţiei şi comentaţi formarea, la un bărbat, a unui mozaic cromosomic de tipul 45,X/46,XY/47,XYY. 4. Explicaţi formarea mozaicului cromosomic de tipul 46,XY/47,XXY. Cu acest prilej comentaţi rezultatele nedisjuncţiei gonosomilor în mitoză la bărbat. 5. Identificaţi şi analizaţi pe diapozitive, la microscop şi pe fotografii fazele meiozei. Caracterizaţi profaza I, metafaza I, anafaza I, metafaza II, anafaza II şi telofaza II. 6. Cum se poate face deosebirea între celulele aflate în următoarele stadii: a. o celulă aflată în metafaza mitozei şi una aflată în metafaza meiozei primare; b. o celulă în anafaza mitozei şi una în anafaza meiozei primare;

34

Diviziunea celulei

c. o celulă în profaza mitozei şi una în profaza meiozei primare. 7. La om, o gonie normală conţine 46 de cromosomi. Precizaţi numărul de cromosomi (autosomi şi gonosomi) în fiecare din următoarele tipuri de celule: a. o celulă rezultată printr-o diviziune mitotică a spermatogoniei; b. un ovocit primar; c. un spermatocit secundar; d. un globul polar rezultat în urma diviziunii unui ovocit II; e. o spermatidă; f. o celulă rezultată în urma spermatogenezei. 8. Într-un cromosom nereplicat este prezentă o singură moleculă de ADN. Dacă celulele umane au 2N = 46 cromosomi, precizaţi care este numărul moleculelor de ADN, al cromosomilor şi al bivalenţilor pentru o celulă aflată în fiecare din următoarele stadii: Stadiul meiotic Pahiten Diploten Diakineză Telofaza I Profaza II Telofaza II

Număr molecule ADN

Număr cromosomi

Număr bivalenţi

9. Întocmiţi separat diagrama nedisjuncţiei cromosomilor sexuali în spermatogeneză şi ovogeneză (anafaza I şi II) şi arătaţi care sunt consecinţele la un bărbat normal (XY) şi la o femeie normală (XX). Stabiliţi cu acest prilej stadiul în care se produc spermatozoizi YY, XY sau fără gonosom şi ovule XX sau fără cromosom sexual. Concomitent stabiliţi ce tipuri de zigoţi anormali rezultă prin participarea la fecundare a acestor gameţi neechilibraţi genetic, utilizând drept model figura 2.11.

Figura 2.11. Consecinţele nedisjuncţiei meiotice în gametogeneză: la bărbat şi la femeie şi rezultatul fecundării 10. Analizaţi pe diapozitive şi fotografii celule cu micronuclei; explicaţi semnificaţia lor şi importanţa practică a testului micronucleilor. 11. Calculaţi probabilitatea de asortare independentă a patru perechi de cromosomi (notaţi cu Aa, Bb, Cc, Dd) prin fenomenul de recombinare intercromosomică.

Diviziunea celulei

35

12. Câte tipuri de ovule cu genomuri diferite poate produce o femeie dacă este: a) heterozigotă pentru un singur locus; b) heterozigotă pentru patru loci independenţi; c) heterozigotă pentru n loci independenţi7. 13. Demonstraţi schematic distribuţia materialului genetic în meioză în cazul a) nedisjuncţiei perechii de cromosomi 21 în meioza I; b) nedisjuncţiei perechii de cromosomi 21 în meioza II; c) explicaţi consecinţele fecundării gameţilor rezultaţi. 14. Analizaţi figura 2.12 şi stabiliţi care sunt principalele asemănări şi deosebiri între mitoză şi meioză.

Figura 2.12. Diferenţele dintre mitoză şi meioză

III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR A. DEFINIŢI NOŢIUNILE URMĂTOARE: - Mitoză - Meioză - Anafază 7

- Recombinare intracromosomică - Recombinare intercromosomică - Mozaic cromosomic

- Haploidie - Diploidie - Trisomie

Heterozigot – individ care pe cromosomii omologi, într-un locus, prezintă variante genice diferite

36

Diviziunea celulei

- Diviziune reducţională - Monosomie

- Nedisjuncţie cromosomică - Nedisjuncţie cromatidiană

- Crossing-over

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. 2. 3.

Care sunt rolurile mitozei? Care este cea mai importantă etapă a mitozei? De ce? Care sunt erorile care pot avea loc pe parcursul mitozei? Ce fel de anomalii cromosomice rezultă prin erori mitotice? 4. Care este semnificaţia genetică a meiozei? 5. Cancerul poate fi considerat consecinţa unor mitoze necontrolate (adevărat/fals?). 6. Crossing-over-ul este o modalitate de reasortare a genelor în noi combinaţii (adevărat/fals?). 7. Fiecare diviziune mitotică şi fiecare diviziune meiotică secundară sunt precedate de o replicare semiconservativă a ADN-ului (adevărat/fals?). 8. Sinapsa cromosomilor omologi are loc numai în meioză, nu şi în mitoză (adevărat/fals?). 9. În care tip de diviziune celulele nou formate au cromosomi monocromatidieni? Dar bicromatidieni? 10. Ce fel de anomalii cromosomice pot fi observate la descendenţii unei persoane a cărei meioză s-a desfăşurat anormal?

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun din cele enunţate ("complement simplu"): 1. Care dintre următoarele fenomene este anormal în anafaza mitozei? A. Împărţirea totală şi egală a materialului genetic; B. Disjuncţia cromatidiană; C. Clivarea transversală a centromerului; D. Migrarea simultană şi cu aceeaşi viteză a cromatidelor; E. Clivarea longitudinală a centromerului. 2. Mozaicul cromosomic de tipul 47/46/45 se formează prin: A. Nedisjuncţie cromosomică în meioza I; B. Nedisjuncţie cromatidiană în meioza II; C. Nedisjuncţie cromatidiană în mitoza; D. Nedisjuncţie cromatidiană în mitoză sau meioza II; E. Nici unul din răspunsuri nu este corect. 3. Ce zigoţi vor rezulta prin fecundarea unui ovul normal cu gameţi produşi prin nedisjuncţia în meioza I a gonosomilor la tată? A. 45,X; 47,XXY; B. 45,X; 46,XY; 47,XXX; C. 45,X; 47,XXY; 47,XYY; D. 45,X; 46,YY; 47,XYY; E. 46,XY; 47,XXX; 47,XYY. II. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("complement grupat"): A - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3; B - dacă sunt corecte răspunsurile 1,3; C - dacă sunt corecte răspunsurile 2,4; D - dacă este corect răspunsul 4; E - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3,4. 4. Importanţa genetică a mitozei constă în faptul că: 1. Asigură dezvoltarea ontogenetică a organismului; 2. Este unica legătură materială între părinţi şi descendenţi; 3. Asigură transmiterea informaţiei genetice în succesiunea generaţiilor de celule;

Diviziunea celulei

37

4. Recombinarea mitotică asigură variabilitatea gameţilor şi unicitatea individului. 5. Clivarea transversală a centromerului unui cromosom în anafaza mitozei determină: 1. Pierderea cromosomului; 2. Formarea unui isocromosom p şi a unui isocromosom q; 3. Formarea unui mozaic 46/45; 4. Formarea de celule care prezintă duplicarea parţială a unui cromosom, concomitent cu deleţia parţială a aceluiaşi cromosom. 6. Gameţii diploizi: 1. Se produc prin nesepararea celulelor fiice în cursul mitozei; 2. Se produc printr-o eroare de distribuţie a materialului genetic în anafază; 3. Duc la formarea de zigoţi cu mozaicuri cromosomice; 4. Duc la formarea de zigoţi triploizi. III. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("teste tip cauză-efect"): A - dacă ambele propoziţii sunt adevărate şi între ele există relaţie cauză-efect; B - dacă ambele propoziţii sunt adevărate, dar între ele nu există relaţie cauză-efect; C - dacă prima propoziţie este adevărată, iar a doua falsă; D - dacă prima propoziţie este falsă, iar a doua este adevărată; E - dacă ambele propoziţii sunt false. 7. În mitoză cromosomii omologi suferă o disjuncţie cromosomică, deoarece prin mitoză materialul genetic se împarte total şi egal la cele două celule fiice. 8. Meioza este o sursă de variabilitate genetică, deoarece în meioză au loc fenomene de recombinare intra- şi intercromosomică. IV. Asociaţi enunţurilor din coloana din stânga notate cu cifre, enunţurile corespunzătoare din coloana din dreapta, notate cu litere: În ce tip de diviziune celulară: 9. Se formează celule cu număr haploid de cromosomi; 10. Are loc în mod normal clivarea transversală a centromerului; 11. Se produce asortarea independentă a cromosomilor; 12. Se formează celule cu cromosomi monocromatidieni; 13. Se pot forma mozaicuri cromosomice.

A. Mitoza; B. Meioza I; C. Meioza I şi II; D. Mitoza şi meioza II E. Nici una.

3. CROMATINA SEXUALA I. DATE TEORETICE A. GENERALITĂŢI Cromatina sexuală este un corpuscul de heterocromatină (cromocentru prezent în nucleul celulelor interfazice) cu particularităţi morfologice bine definite, care permit stabilirea sexului genetic (în mod normal XX sau XY) şi identificarea unor anomalii de număr ale gonosomilor. Cromatina sexuală reprezintă o formă de heterocromatină facultativă, care se prezintă diferit la cele două sexe, deoarece rezultă prin mecanisme diferite. La femeie, cromatina sexuală, denumită cromatină X, este un cromocentru intranuclear, rezultat prin inactivarea genică şi heterocromatinizarea unuia din cei doi cromosomi X. La bărbat, cromatina sexuală, denumită cromatină Y, se prezintă sub forma corpusculului F, care poate fi observat în nucleul interfazic, prin examinare la microscopul cu lumină ultravioletă, datorită afinităţii heterocromatinei braţului lung al cromosomului Y pentru diferite substanţe fluorescente. Apariţia cromatinei X a fost explicată prin ipoteza Lyon (1961). Conform acesteia la persoanele normale de sex feminin unul din cei doi cromosomi X este inactivat genetic, deoarece între gonosomii X şi Y există diferenţe importante de mărime şi conţinut genic, care, în absenţa inactivării, ar genera o inegalitate genetică între sexe (figura 3.1.). Cromosomul X este un cromosom mijlociu care conţine atât gene de sexualizare, cât şi gene care codifică diferite proteine/enzime neimplicate în procesul de sexualizare. Cromosomul Y este un cromosom mic care conţine genele implicate în formarea testiculilor şi spermatogeneză, precum şi câteva gene omologe unor gene de pe cromosomul X (localizate în regiunea “pseudoautosomală”). În rest, cromosomul Y prezintă o întinsă regiune de heterocromatină localizată în cele 2/3 distale ale braţului lung şi formată din secvenţe de ADN repetitiv. Astfel, comparativ cu persoanele XY, persoanele XX au o “doză” dublă de gene, care codifică diferite proteine8. “Egalizarea genetică” se produce prin inactivarea prin heterocromatinizare şi condensare a unuia din cei doi cromosomi X ai femeii, astfel încât, atât bărbaţii, cât şi femeile au un singur cromosom X activ. Postulatele ipotezei Lyon susţin următoarele: La femeile normale (XX) unul dintre cei doi cromosomi X se inactivează total; Inactivarea se produce precoce (în perioada embrionară) şi este definitivă (ireversibilă); Inactivarea este întâmplătoare (în unele celule se inactivează cromosomul X de origine maternă, în timp ce în altele se inactivează cromosomul X patern) şi independentă în celule diferite9. 8

Mutaţiile acestor gene au efecte fenotipce mai severe la bărbaţi, deoarece la persoanele de sex feminin pentru apariţia unui fenotip anormal este necesară modificarea genelor de pe ambii cromosomi X 9 Mecanismul incativării şi unele particularităţi vor fi prezentate la curs

Cromatina sexuală

39

Figura 3.1. Morfologia şi conţinutul genic al cromosomilor X şi Y Gene omologe – AMELX, AMELY (codifică o proteină similară amelogeninei); ZFY şi ZFX (codifică o proteină cu conformaţie în “degete de zinc”); SMCX şi SMCY (codifică antigenul H-Y); Gene specifice cromosomului X – XIC (centrul de inactivare al cromosomului X) Gene specifice cromosomului Y – DAZ (deleted in azoospermia) AZF (azoospermia factor) (după Jameson et al., 1998)

Cromatina sexuală este un corpuscul de heterocromatină cu particularităţi morfologice distincte, care permite stabilirea sexului genetic (XX sau XY) şi a unor anomalii ale numărului cromosomilor sexuali. Cromatina sexuală este o formă de heterocromatină facultativă, fiind specifică fiecărui sex: cromatina X se întâlneşte în mod normal numai în celulele provenite de la sexul feminin, în timp ce cromatina Y este caracteristică bărbaţilor. Ipoteza Lyon susţine că la persoanele de sex feminin unul din cei doi cromosomi X se inactivează total, inactivarea fiind precoce, definitivă, întâmplătoare şi independentă în celule diferite

B. CROMATINA X Cromatina X poate fi observată în majoritatea ţesuturilor provenite de la o persoană de sex feminin (46,XX). În mod obişnuit, ea este studiată în celulele din frotiuri de mucoasă bucală sau sânge periferic10, mai rar în celulele bulbului pilos, în celulele amniotice fetale sau alte tipuri de celule.

10

Celulele mucoasei bucale sau cele sanguine sunt mai uşor de obţinut

40

Cromatina sexuală

1. STUDIUL CROMATINEI X PE FROTIUL DE MUCOASĂ BUCALĂ a. MORFOLOGIE La nivelul mucoasei bucale, corpusculul de cromatină X este denumit corpuscul Barr11. Acesta are următoarele particularităţi morfologice (figura 3.2.): condensare şi colorare bazofilă intensă; poziţie, cel mai frecvent, periferică, lipit de faţa internă a membranei nucleare; uneori corpusculul pare situat central (lângă nucleol) sau liber în nucleoplasmă; formă ovală sau plan convexă; în funcţie de incidenţa optică sub care este privit, poate apare uneori triunghiular, sferic, bipartit (în halteră); mărime medie de 1 micron (± 0,3). Uneori, corpusculul Barr poate fi confundat cu unii cromocentri nespecifici (fără semnificaţie sexuală) sau cu nucleolul. În aceste cazuri, diagnosticul diferenţial se face astfel: nucleolul are frecvent o poziţie centrală, este rotund şi mai mare decât corpusculul Barr, şi, prin reacţia cu verde de metil pironină se colorează roşu cărămiziu (ARN), diferit de restul nucleului (ADN) care este Figura 3.2. Aspectul schematic al corpusculului Barr verde; într-o celulă epitelială a mucoasei bucale cromocentrii nespecifici sunt mai mici sau mai mari, au o formă neregulată şi pot fi localizaţi în diferite zone din nucleu. În practică, pentru a evita erorile de interpretare, se consideră drept cromatină X numai corpusculii lipiţi de faţa internă a membranei nucleare, cu forma şi mărimea indicată mai sus. b. FRECVENŢA Teoretic, toţi nucleii celulelor provenite de la persoanele normale de sex feminin (XX), trebuie să aibă un corpuscul de cromatină X. În realitate, frecvenţa medie normală a celulelor "cromatin X pozitive" este de aproximativ 20 - 40%, datorită: selecţiei corpusculilor situaţi periferic şi excluderii celor dispuşi central; calităţilor improprii ale unor nuclei (cromatină condensată, numeroşi cromocentri, membrană nucleară distorsionată) determinate, fie de poziţia lor în straturile superficiale ale mucoasei, fie de unele defecte de colorare; existenţei reale a unor celule "cromatin X negative", în care, datorită unor condiţii metabolice celulare sau generale, cromosomul X, deşi inactiv, nu se condensează. Pentru stabilirea corectă a frecvenţei se numără cel puţin 300 de nuclei. Au fost descrise şi alte cauze, mai puţin semnificative, care pot influenţa frecvenţa cromatinei X: variaţii legate de vârstă, ciclul ovarian, unele boli sau tratamente etc. c. INTERPRETARE 11

Termenul de corpuscul Barr a fost dat în onoarea unuia din cei doi descoperitori ai cromatinei X – Barr şi Bertram, 1949

Cromatina sexuală

41

Deoarece, conform ipotezei Lyon, în fiecare celulă rămâne activ un singur cromosom X, iar restul se inactivează transformându-se în cromatină X, rezultă că: Numărul de corpusculi Barr = Numărul de cromosomi X - 1

Aplicând relaţia de mai sus, devine evident faptul că, în mod normal, cromatina X se găseşte în nucleul celulelor interfazice numai la persoanele de sex feminin (un singur corpuscul Barr) şi lipseşte la persoanele de sex masculin. Datorită acestor particularităţi testul cromatinei X este folosit pentru stabilirea sexului genetic (XX sau XY) În diferite stări patologice, datorate unor anomalii de număr sau structură ale cromosomilor X, posibile atât la femeie, cât şi la bărbat, pot apare modificări ale numărului şi mărimii corpusculului de cromatină X (figura 3.3.).

B Corpuscul Barr > 1,5 μm

Corpuscul Barr < 1 μm

A Figura 3.3. Modificările de număr (A) şi de mărime (B) ale cromatinei X, în funcţie de mărimea şi structura cromosomilor X. Astfel, absenţa din celule a unuia dintre cromosomii X (45,X - monosomie X), asociată unui fenotip feminin (sindrom Turner) se însoţeşte de un test Barr negativ, în timp ce prezenţa unor cromosomi X suplimentari (polisomii X), fie la femeie (47,XXX; 48,XXXX) fie la bărbat (sindrom Klinefelter – 47,XXY sau 48,XXXY) face ca în celule să fie identificaţi mai mulţi corpusculi Barr (figura 3.3. A). Pornind de la acest fapt, pe baza numărului corpusculilor Barr se poate preciza numărul cromosomilor X existenţi în celulă: numărul cromosomilor X este mai mare cu 1 decât cel al corpusculilor Barr. Atunci când pe o lamă cu frotiu de mucoasă bucală, provenind de la o anumită persoană, se întâlnesc celule cu număr diferit de corpusculi Barr, pentru a calcula numărul de cromosomi X, se ia întotdeauna în consideraţie numărul maxim de corpusculi Barr, deoarece unii dintre cromosomii X inactivaţi pot să nu fie vizibili în toate celulele analizate. Mărimea cromatinei X poate depăşi valoarea obişnuită de 1 micron în cazul existenţei unor cromosomi X anormal de lungi (isocromosomi X de braţ lung) sau poate fi

42

Cromatina sexuală

mai mică, în cazul unor cromosomi X mai mici decât în mod normal (isocromosomi X de braţ scurt, deleţii Xq- sau cromosomi inelari X) (figura 3.3. B)12.

2. STUDIUL CROMATINEI X PE FROTIUL DE SÂNGE PERIFERIC ÎN POLIMORFONUCLEARE NEUTROFILE a. MORFOLOGIE Pe frotiul de sânge periferic, colorat cu soluţie May-Grünwald-Giemsa, cromatina X poate fi evidenţiat în leucocitele polimorfonucleare (PMN), unde este prezentă sub forma particulară a unor apendici nucleari. Aceştia sunt de două feluri (figurile 3.4. şi 3.5.): apendice tip A, în "băţ de tobă" (în limba engleză drumstick) format dintr-un "cap" oval sau rotund, de aproximativ 1,5 microni, mai intens colorat decât nucleul şi ataşat de restul nucleului, printr-un filament subţire; apendice tip B sau "nodul sesil", asemănător ca mărime, formă şi colorabilitate cu nodulul A, dar fixat direct la nucleu printr-o bază largă de implantare.

Figura 3.4. Apendici nucleari în polimorfonuclearele neutrofile

a

b

c

Figura 3.5. Aspectul la microscopul optic al cromatinei X în polimorfonuclearele neutrofile din frotiul de sânge periferic (coloraţie May-Grunwald-Giemsa) a– apendice sexual de tip A; b – apendice sexual de tip B; c – doi apendici sexuali de tip A b. FRECVENŢA Frecvenţa medie a apendicilor sexuali la femeia normală este de 1 la 38 PMN, iar variaţiile sunt cuprinse între 1 la 6 şi 1 la 98 PMN; ele se datoresc gradului de lobulare al nucleului, tehnicii de executare a frotiului şi probabil unor factori metabolici celulari. În

12 Isocromosom –cromosom caracterizat prin existenţa unuia dintre braţe în dublu exemplar şi absenţa celuilalt braţ; Deleţie – anomalie cromosomică caracterizată prin absenţa unui fragment cromosomic; Cromosom inelar – cromosom cu configuraţie circulară (vezi capitolul Anomalii şi boli cromosomice)

Cromatina sexuală

43

practică, pe o lamă cu frotiu de sânge periferic se numără atâtea neutrofile până ce se totalizează 6 apendici A; pentru a afirma absenţa lor se numără cel puţin 500 neutrofile13. Apendicii sexuali A şi B trebuie diferenţiaţi de alte formaţiuni asemănătoare fără semnificaţie sexuală (figura 3.4.): nodulii mici, au formă similară apendicilor A, dar sunt mai mici (sub 1 micron) şi mai slab coloraţi; apendicii în "rachetă de tenis" sunt asemănători ca mărime cu apendicii A, dar au centrul decolorat; lobii mici ai nucleului, seamănă cu apendicii B, dar sunt mai mari, conturul fiind neregulat, iar culoarea este la fel cu cea a nucleului. c. INTERPRETARE Interpretarea corelaţiei dintre numărul sau mărimea apendicilor A şi B din PMN şi numărul sau mărimea cromosomilor X din care provin se face întocmai ca la corpusculii Barr din frotiul de mucoasă bucală. În celulele epiteliale din frotiuri de mucoasă bucală cromatina X apare sub forma corpuscului Barr, un corpuscul de heterocromatină intens bazofil, lipit de faţa internă a membranei nucleare, cu formă ovală sau plan-convexă şi mărime de un micron. Frecvenţa medie normală a celulelor cromatin X pozitive în frotiul de mucoasă bucală este de 20 - 40%. Deoarece cromatina X se produce prin inactivarea şi heterocromatinizarea unuia dintre cei doi cromosomi X la femeie numărul de corpusculi de cromatină X este egal cu suma cromosomilor X minus 1. Pe frotiul de sânge periferic, cromatina X apare în polimorfonucleare neutrofile sub formă de apendici nucleari tip A (în băţ de tobă) sau tip B (nodul sesil). Ei sunt mai intens coloraţi decât restul nucleului, au 1,5 microni şi au o frecvenţă medie de 6 la 500 PMN.

C. CROMATINA Y 1. MORFOLOGIE Cromatina Y poate fi evidenţiată pe frotiuri de mucoasă bucală sau pe secţiuni din ţesuturi prelevate de la persoane de sex masculin şi se evidenţiază, după colorare cu fluorocromi (quinacrină, atebrină, acridin-orange) şi examinare în lumina ultravioletă, la microscopul cu fluorescenţă, sub forma unui corpuscul de cromatină intens fluorescent. Aceste corpuscul a fost numit "corpuscul F". Mărimea corpusculului F este de 0,25 microni, corespunzătoare mărimii celor 2/3 din braţul q al cromosomului Y. Mărimea poate fi diferită datorită variaţiilor lungimii braţului lung al cromosomului Y la persoane fenotipic normale (vezi capitolul "Cromosomii umani"). Corpusculul F se găseşte în nucleu, fixat la membrană sau liber în nucleoplasmă.

2. FRECVENŢA Frecvenţa cu care este observată cromatina Y în celulele masculine depinde de ţesutul studiat, fiind de 70 - 80% în fibroblaşti, 75 - 85% în celulele amniotice, 40 - 45% în nucleul spermatozoizilor şi 25 - 50% în celulele mucoasei bucale. Existenţa de celule cromatin Y 13

Când numărul de apendici sexuali identificaţi în 500 PMN este între 1 şi 5 se repetă testul

44

Cromatina sexuală

negative se datorează probabil unor defecte tehnice de fixare a fluorocromilor sau dispariţiei rapide a fluorescenţei.

3. INTERPRETARE Interpretarea rezultatelor obţinute se face folosind următoarea formulă: Numărul de corpusculi F = Numărul cromosomilor Y

Aplicând relaţia de mai sus, este evident faptul că femeiile (indiferent de numărul de cromosomi X) nu prezintă niciodată corpuscul F, în timp ce bărbatul normal prezintă un singur corpuscul F. La bărbaţii cu un cromosom Y suplimentar (47, XYY) se evidenţiază doi corpusculi F. Cromatina Y apare numai în nucleul celulelor provenite de la sexul masculin, şi reprezintă heterocromatina din cele 2/3 distale ale braţului lung al cromosomului Y. Ea se colorează cu fluorocromi (quinacrină), este studiată la microscopul cu fluorescenţă şi poartă denumirea de corpuscul F. Numărul de corpusculi F este egal cu suma cromosomilor Y.

D. VALOAREA PRACTICĂ A TESTULUI CROMATINEI SEXUALE (indicaţii şi limite) Testul cromatinei sexuale asigură aprecierea numărului de gonosomi X sau Y, permiţând identificarea sexului genetic şi diagnosticul anomaliilor numerice ale cromosomilor sexuali, care produc sindroame cu disgenezie gonadică. Testul se foloseşte în practica medicală în următoarele situaţii: 1. Diagnosticul prenatal al sexului fătului Testul cromatinei sexuale, efectuat în celulele fetale amniotice, este util în situaţiile în care mama, aparent sănătoasă, este purtătoarea unei gene mutante recesive gonosomale (XNXa) pe care ar putea să o transmită la 50% din băieţi, aceştia urmând să manifeste fenotipic afecţiunea (de exemplu: hemofilie, miopatie Duchenne etc.). Cunoaşterea sexului fătului permite luarea unei decizii privind cursul ulterior al sarcinii, datorită riscului crescut de apariţie a bolii doar la băieţi (vezi capitolul “Sfatul genetic”). În prezent, testul cromatinei sexuale a fost înlocuit de tehnicile moderne de diagnostic molecular prenatal, care permit atât identificarea sexului fătului, cât şi evidenţierea prezenţei genei mutante în genotipul fătului, pentru multe dintre afecţiunile genetice legate de cromosomul X. 2. Stabilirea sexului genetic în stările intersexuale la nou-născut Prezenţa unor malformaţii ale organelor genitale externe la nou-născut, mai ales atunci când testiculii nu se palpează în scrot, poate duce la erori de apreciere a sexului civil (sexul declarat în certificatul de naştere). Aceste erori au consecinţe importante pe termen lung. De aceea, în cazul unui nou-născut cu organe genitale externe ambigue (care nu permit stabilirea sexului civil) sau a unui băiat cu hipospadias şi/sau testiculi necoborâţi în scrot (criptorhidie), respectiv fată cu hipertrofie clitoridiană este obligatoriu testul cromatinei sexuale (şi, ulterior, analiza cromosomilor). Identificarea corectă şi rapidă a sexului genetic, prin testul cromatinei sexuale, permite în aceste situaţii declararea adecvată a sexului civil şi constituie un element de bază pentru stabilirea tipului de stare intersexuală (pseudohermafroditism feminin sau masculin), premisă obligatorie pentru tratamentul chirurgical corectiv precoce şi educarea corespunzătoare a copilului.

Cromatina sexuală

45

Diagnosticul etiologic al anomaliilor de sexualizare poate fi uneori necesar postnatal, la pacienţi de diferite vârste, fie ca urmare a unei evaluări incorecte sau incomplete la naştere, fie datorită manifestării tardive a afecţiunii. În aceste situaţii testul cromatinei sexuale, urmat de analiza cromosomică este decisiv pentru diagnostic. 3. Diagnosticul unor anomalii de număr sau structură ale cromosomilor sexuali care determină disgenezii gonadice, testiculare (la bărbat) sau ovariene (la femeie). Disgeneziile gonadice sunt afecţiuni caracterizate prin dezvoltarea şi funcţionarea necorespunzătoare a gonadelor şi pot avea drept factor patogenic prezenţa unor anomalii de număr sau structură ale gonosomilor X sau Y (47,XXY; 48,XXXY; 47,XYY; 45,X; 47,XXX; 46,XXp-; 46,XXq-; 46,X,i(Xq) etc.). În practica medicală, cele mai frecvente disgenezii gonadice sunt cele din sindroamele Klinefelter (47,XXY) – la bărbat - şi Turner (45,X) – la femeie. Ele pot fi evocate de următoarele semne clinice (detaliate în capitolul "Anomalii cromosomice"): la bărbat, testiculi mici, caractere sexuale secundare slab dezvoltate, ginecomastie, azoospermie (sindrom Klinefelter); la femeie: talie mică, amenoree primară, caractere sexuale secundare insuficient dezvoltate (sindrom Turner). 4. În medicina legală Testul cromatinei sexuale poate stabili provenienţa masculină sau feminină a unor pete de sânge, fragmente de ţesuturi, fire de păr etc., uşurând anumite anchete criminalistice. În prezent, testul este înlocuit de metodele de realizare a “amprentei” ADN, care permit identificarea precisă a persoanei de la care provin probele biologice. 5. Limitele testului cromatinei sexuale Testul cromatinei sexuale este o metodă de investigare citogenetică utilă14, întrucât permite un diagnostic orientativ rapid. Totuşi, acest test este un test subiectiv, a cărui interpretare ţine în mare măsură de priceperea şi experienţa examinatorului, nu poate da indicaţii exacte despre existenţa unor mozaicuri cromosomice gonosomale şi nici despre anomaliile cromosomice autosomale. De aceea, pentru obţinerea unui rezultat riguros exact, se recurge la studiul cromosomilor (efectuarea cariotipului) metodă mai laborioasă şi mai scumpă, dar în acelaşi timp, mult mai precisă. Testul cromatinei sexuale se utilizează în practica medicală, pentru identificarea sexului genetic şi stabilirea numărului de cromosomi sexuali, în următoarele situaţii: diagnosticul prenatal al sexului genetic al fătului în cazul bolilor recesive legate de X, pentru care mama purtătoare de genă mutantă va avea 50% dintre băieţi afectaţi şi toate fetele sănătoase; diagnosticul anomaliilor de sexualizare la nou-născut şi copil (hipospadias ± testicul necoborât congenital, hipertrofie clitoridiană); diagnosticul unor anomalii de număr (45,X; 47,XXX; 47,XXY) sau structură ale cromosomilor sexuali care produc disgenezii gonadice testiculare (manifestate prin: caractere sexuale secundare reduse, ginecomastie, testiculi mici, sterilitate, spermogramă anormală,) şi ovariene (caractere sexuale secundare reduse, amenoree primară, sterilitate); în medicina legală, pentru a stabili dacă o pată de sânge, un fir de păr sau anumite fragmente de ţesut provin de la un bărbat sau de la o femeie.

14

Alte avantaje ale testului Barr sunt costul mic şi dotarea tehnică redusă

46

Cromatina sexuală

II. APLICAŢII PRACTICE A. TEHNICA DE STUDIU A CROMATINEI X PE FROTIUL DE MUCOASĂ BUCALĂ 1. Materiale şi substanţe necesare: lame de recoltare rodate; lame de microscopie pentru frotiuri; comprese sterile; baie de fixare; amestec fixator (alcool metilic absolut şi acid acetic glacial în proporţie 9/1); băi cu alcool de 70 şi 50 băi cu apă distilată; soluţie de colorant (carbol-fuxină, orceină ş.a.); microscop, obiectiv cu imersie (x 90), ulei de cedru. 2. Prelevarea celulelor de mucoasă bucală Se marchează indicativul şi codul bolnavului pe lamele pentru frotiu. Cu o lamă rodată se raclează mucoasa bucală de pe faţa internă a obrajilor, iar la copii şi pacienţii dificili de pe faţa internă a buzei inferioare (în prealabil gura este clătită cu apă pentru îndepărtarea resturilor alimentare). Iniţial, se face o raclare uşoară pentru îndepărtarea salivei şi a stratului superficial de celule de descuamaţie; materialul obţinut se îndepărtează cu o compresă sterilă. Apoi, fără ca pacientul să închidă gura, se face o raclare fermă, trecând lama apăsat peste mucoasa bucală, de mai multe ori în aceeaşi direcţie şi în acelaşi loc. Lama cu materialul obţinut se aşează deasupra lamei de microscopie marcată cu indicativul bolnavului şi se întinde un frotiu relativ gros, pe o suprafaţă mică, în 1/3 medie a lamei. Apoi fără a se usca lama, aceasta este introdusă rapid în baia de fixare. La fiecare pacient se fac minimum două frotiuri, fiind recoltate celule din regiuni diferite ale mucoasei bucale. 3. Fixarea şi colorarea frotiurilor  Fixarea se face cu amestec de alcool metilic absolut şi acid acetic glacial (9/1) timp de o oră (minimum 30 de minute şi maximum 12 ore) la temperatura camerei. Este indicat ca lamele fiecărui pacient să fie fixate separat, pentru a împiedica trecerea celulelor dislocate pe lamele altei persoane.  Hidratarea are ca scop îndepărtarea fixatorului, precum şi recuperarea apei tisulare pierdute în timpul fixării; se face trecând succesiv lamele fixate, prin băile de alcool 70 şi 50, apă distilată I şi II, câte 5 minute în fiecare.  Colorarea frotiurilor este de preferat să se realizeze imediat, fără ca lamele să se usuce. Atunci când recoltarea este făcută la distanţă de laborator, iar lamele sunt ulterior examinate, ele vor fi uscate la aer, sub o placă Petri, pentru a evita depunerea prafului. Rezultatele nu sunt însă la fel de bune. Colorarea se face timp de 2 – 5 minute; timpul optim se tatonează de obicei cu prima lamă care se ţine 2 minute. Apoi lamele se spală cu apă de robinet şi, dacă este cazul, se îndepărtează excesul de colorant prin acoperirea lor cu alcool etilic absolut timp de 30 – 60 secunde (în funcţie de grosimea frotiului). Se usucă, se clarifică, trecându-le prin două băi cu xilol şi apoi se usucă din nou. 4. Examinarea preparatelor la microscop  Examinarea se face la microscopul optic cu obiectiv de imersie, cu ocular 7 X şi filtru verde. Cromatina apare colorată roz, iar cromocentrii roşu-carmin intens.  Un frotiu corespunzător trebuie să aibă un număr suficient de celule, să fie bine fixat şi colorat suficient de contrastant, dar nu excesiv. Dacă condiţiile nu sunt satisfăcute, este bine să se repete recoltarea şi examinarea.  Celulele optime trebuie să fie: bine etalate, fără superpoziţia altor celule, cu membrana nucleară intactă, regulată, cu cromatina fin dispersată, fără condensări excesive, cu corpusculii de cromatină X intens coloraţi şi net contrastanţi de restul cromatinei. Vor fi excluse de la analiză celulele provenite din straturile superficiale cu: nuclei picnotici, cromatină condensată; membrana nucleară ondulată, discontinuă; cromocentri numeroşi.  Pe celulele care îndeplinesc aceste condiţii de analiză se vor determina: prezenţa corpusculului Barr, cu particularităţile morfologice descrise: intens bazofil, situat pe faţa internă a membranei nucleare şi cu mărime de aproximativ 1 micron;

Cromatina sexuală

47

-

numărul corpusculilor per nucleu; mărimea corpusculului, normală sau anormală (mai mică sau mai mare de 1 micron); frecvenţa celulelor cromatin X pozitive pe minimum 300 nuclei analizaţi.  Analiza frotiului trebuie să respecte următoarele condiţii: să nu fie făcută în grabă, superficial; să se aplice riguros criteriile de selecţie a nucleilor favorabili; să se examineze mai multe câmpuri pe fiecare lamă, numărându-se cel puţin 300 nuclei; să se repete examinarea dacă: frotiul este necorespunzător, frecvenţa celulelor cromatinX pozitive este mică (defect de tehnică, condiţii metabolice particulare, mozaic cromosomic) sau rezultatul obţinut diferă de normal (pentru certitudine). În acest ultim caz este utilă verificarea testului de un alt tehnician. 5. Formularea rezultatului Pe buletinul de analiză se va preciza: test Barr pozitiv sau negativ, evitându-se utilizarea termenului de cromatină sexuală (datorită ambiguităţii); nu se vor da procente decât în cazul unei frecvenţe mai mici de 10% (la 2 examene repetate). Medicul care a solicitat analiza va da explicaţiile necesare bolnavului, în contextul datelor clinice. La orice rezultat anormal se va indica efectuarea analizei cromosomice (cariotip).

B. TEHNICA DE STUDIU A CROMATINEI X ÎN POLIMORFONUCLEARELE NEUTROFILE 1. Pentru studiul cromatinei X se folosesc frotiuri obişnuite de sânge periferic, colorate cu soluţie May - Grűnwald - Giemsa. Analiza este efectuată cu obiectivul de imersie, la marginile frotiului, fiind analizate polimorfonuclearele neutrofile - PMN. În PMN se reperează prezenţa şi numărul apendicilor sexuali de tip A, pediculaţi (în "băţ de tobă") sau B (noduli sesili) care au dimensiuni de circa 1,5 microni şi sunt intens coloraţi. Se analizează atent morfologia apendicilor sexuali, pentru a-i deosebi - pe bază de mărime şi coloraţie - de nodulii mici (sub 1 micron) lobii mici ai nucleului (mai mari de 2 microni) apendicii în "rachetă de tenis" (au aceeaşi mărime ca apendicii A, dar prezintă un centru mai puţin colorat). Această analiză necesită "antrenament", datorită necesităţii comparării permanente a morfologiei unor apendici sexuali "standard" cu cea observată. Se analizează cel puţin 300-500 de PMN. În situaţia unui rezultat "anormal" se va cerceta un număr dublu de PMN, eventual pe lame diferite. O variantă tehnică mai bună este studiul unor frotiuri realizate cu concentrat leucocitar. Pentru aceasta se recoltează circa 5 ml sânge care se trece imediat într-o eprubetă cu anticoagulant (1 ml soluţie EDTA 5%) care se plasează vertical într-un stativ. După o oră se recoltează supernatantul, se centrifughează, iar sedimentul rămas după decantare se resuspendă. Se ia o picătură din suspensia leucocitară şi se pune pe o lamă de microscop; se acoperă cu o lamelă şi atunci când picătura s-a etalat aproape complet între lamă şi lamelă se trage lamela lateral, rapid şi orizontal pentru a realiza un frotiu. După uscare se colorează obişnuit cu soluţie May - Grünwald - Giemsa.

C. ANALIZA UNOR PREPARATE MICROSCOPICE Analiza se face pe preparate microscopice şi fotografii din colecţia disciplinei, studiindu-se aspectul cromatinei sexuale şi observându-se corelaţia dintre numărul şi mărimea corpusculilor de cromatina X şi anomaliile numerice sau structurale ce interesează cromosomii X.

D. DISCUTAREA INDICAŢIILOR PRACTICE ALE TESTULUI CROMATINEI SEXUALE 1. Indicaţiile practice ale testului cromatinei X în determinarea sexului genetic în stările intersexuale şi diagnosticul anomaliilor de număr şi structură ale cromosomilor sexuali la pacienţi cu disgenezii gonadice vor fi discutate pe baza unor fotografii şi diapozitive.

48

Cromatina sexuală

2. Analizaţi figura 3.6. şi stabiliţi care ar putea fi, în fiecare caz, numărul de cromosomi sexuali ai persoanelor care prezintă nuclei cu aspectul prezentat în figură.

a

b

c

d

Figura 3.6. Relaţia dintre numărul de cromosomi X şi numărul de corpusculi Barr (nuclei de celule epiteliale din mucoasa bucală)

III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR A. DEFINIŢI NOŢIUNILE URMĂTOARE: - Cromatină X - Corpuscul Barr - Cromatină Y

- Ipoteza Lyon - Corpuscul F - Sex genetic

-

- Apendice sexual tip B - Apendice sexual tip A - Heterocromatină sexuală

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. 2. 3. 4. 5.

Care sunt particularităţile cromatinei sexuale? Ce reprezintă sexul genetic? Formulaţi ipoteza Lyon. Care este rolul inactivării cromosomului X la femei? Ce este corpusculul Barr? În care celule poate fi analizată cromatina X? În care celule sanguine poate fi vizualizat un apendice sexual? Hematiile pot avea astfel de formaţiuni? Justificaţi răspunsul. 6. Care este formula de calcul în cazul testului cromatinei X? Câţi corpusculi Barr are o femeie normală? Dar un bărbat normal? 7. Există femei la care lipseşte corpusculul Barr? Dar bărbaţi la care acesta există? Justificaţi răspunsurile. 8. Ce este cromatina Y? Ce fel de coloraţie este necesară pentru vizualizarea cromatinei Y? 9. Care este formula de calcul în cazul testului cromatinei Y? Câţi corpusculi Barr are o femeie normală? Dar un bărbat normal? 10. Există bărbaţi la care lipseşte corpusculul F? 11. Care sunt indicaţiile studiului cromatinei sexuale? Care sunt limitele acestui test?

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun din cele enunţate. 1. Care dintre următoarele cifre indică în mod corect numărul de corpusculi Barr observaţi la: un băiat cu trisomie 21, o femeie cu trisomie X, o femeie cu sindrom Turner şi un bărbat cu sindrom Klinefelter (în această ordine)? A. 0, 1, 2, 1; D. 2, 0, 1, 1; B. 1, 1, 0, 1; E. 1, 1, 0, 2. C. 0, 2, 0, 1;

Cromatina sexuală

49

2. Numărul corpusculilor F dintr-o celulă este egal cu: A. Suma cromosomilor Y-1; B. Suma cromosomilor Y; C. Suma cromosomilor X şi Y; D. Suma cromosomilor Y+1; E. Suma corpusculilor Barr. II.

La următoarele întrebări răspundeţi astfel: A - dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2 şi 3 B - dacă sunt corecte răspunsurile 1 şi 3; C - dacă sunt corecte răspunsurile 2 şi 4; D - dacă este corect răspunsul 4; E - dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2, 3 şi 4. 3. Care dintre următoarele afirmaţii referitoare la corpusculul Barr sunt adevărate? 1. Reprezintă un corpuscul de heterocromatină din nucleul PMN; 2. În celulele mucoasei bucale este lipit de faţa internă a membranei nucleare; 3. Se colorează intens cu quinacrină; 4. Este un corpuscul intens colorat bazofil. III.

La următoarele întrebări răspundeţi astfel: A - dacă ambele propoziţii sunt adevărate şi între ele există relaţie cauză-efect; B - dacă ambele propoziţii sunt adevărate, dar între ele nu există relaţie cauză-efect; C - dacă prima propoziţie este adevărată, iar a doua falsă; D - dacă prima propoziţie este falsă, iar a doua este adevărată; E - dacă ambele propoziţii sunt false.

4. Studiul corpusculului Barr permite stabilirea sexului genetic, deoarece numărul corpusculilor Barr este corelat cu cel al cromosomilor X. 5. Persoanele în ale căror celule se evidenţiază un corpuscul Barr au întotdeauna fenotip feminin, deoarece prezenţa unui corpuscul Barr semnifică existenţa în celule a doi cromosomi X. IV. Asociaţi următoarelor cariotipuri din coloana din stânga numărul corespunzător de corpusculi Barr din coloana din dreapta: 1. 46,XX; A. Unul; 2. 45,X; B. Doi; 3. 48,XXXY; C. Nici unul; 4. 48,XXXX; D. Trei; 5. 49,XXXXX; E. Patru.

4. CROMOSOMII UMANI I. DATE TEORETICE A. GENERALITĂŢI Celulele somatice umane normale conţin un set diploid (2n) format din 46 cromosomi.15 Cei 46 cromosomi sunt grupaţi în 23 perechi de cromosomi omologi: 22 de perechi identice la cele două sexe − autosomi − şi una diferită − gonosomii − XX la femeie şi XY la bărbat16. În celulele sexuale mature (gameţi) există numai 23 de cromosomi (22 autosomi + X sau 22 autosomi + Y) reprezentând un set haploid (n) de cromosomi.

B. METODE DE STUDIU A CROMOSOMILOR UMANI Studiul cromosomilor umani se bazează pe trei principii fundamentale: obţinerea de celule în diviziune (mitoză sau meioză); blocarea diviziunii în metafază sau prometafază; obţinerea preparatelor cromosomice şi analiza lor la microscop.

1. OBŢINEREA DE CELULE ÎN DIVIZIUNE Se realizează: direct analizând ţesuturilor cu diviziuni active: măduvă hematogenă, gonade, tumori; indirect prin culturi de ţesuturi: de scurtă durată: sânge periferic (limfocite), măduvă osoasă hematogenă; de lungă durată: fibroblaşti din ţesutul conjunctiv (piele, fascii) celule din lichidul amniotic, din vilozităţile coriale sau tumori solide. Pentru studiul de rutină al cromosomilor umani, cel mai frecvent se utilizează culturile de limfocite T, deoarece sângele este uşor de prelevat, culturile durează numai 3 zile, pot fi stimulate pentru a obţine un indice mitotic crescut şi nu necesită dotări speciale. Stimularea diviziunilor celulare se face cu substanţe mitogene, precum fitohemaglutinina. Celelalte metode au indicaţii particulare, aplicarea lor fiind limitată datorită dificultăţilor de prelevare sau cultură. Totuşi, studiul cromosomilor în măduvă osoasă este abordabil chiar în condiţiile unui laborator cu dotare modestă.

2. BLOCAREA DIVIZIUNILOR Metafaza este stadiul mitotic optim pentru studiul cromosomilor, deoarece aceştia sunt bine individualizaţi şi dispuşi în acelaşi plan, la ecuatorul celulei. Diviziunea poate fi blocată într-un stadiu în care cromosomii sunt bicromatidieni (metafază, prometafază, 15 16

În 1956, Tijo şi Levan au stabilit că numărul de cromosomi ai speciei umane este de 46 La bărbat gonosomii nu sunt omologi

Cromosomii umani

51

profază) prin acţiunea unor substanţe statmokinetice, care inhibă formarea fusului de diviziune (polimerizarea tubulinei). Cele mai importante substanţe statmokinetice sunt colchicina şi derivaţii ei. Studiul cromosomilor în prometafază sau profază impune tehnici speciale, care asigură sincronizarea diviziunilor celulelor şi, prin obţinerea unor cromosomi mai puţin condensaţi, permite evidenţierea mai multor detalii de structură.

3. OBŢINEREA PREPARATELOR CROMOSOMICE Obţinerea unor preparate în care cromosomii sunt dispuşi în acelaşi plan, la mică distanţă unul de altul, fără alterări morfologice, se realizează prin: hipotonizare - trecerea celulelor într-un mediu ce reprezintă 1/5-1/6 din tonicitatea fiziologică duce la dilatarea celulelor şi dispersarea cromosomilor; se utilizează variate soluţii hipotone (KCl, ser bovin fetal diluat, citrat de sodiu); fixarea celulelor - întrerupe brusc activitatea vitală, păstrând structura morfologică prealabilă fixării; se realizează cu un amestec 3:1 alcool etilic (metilic): acid acetic glacial; de regulă, se fac mai multe fixări (2-3) pentru a obţine cromosomi de calitate; etalarea suspensiei celulare pe o lamă de microscopie asigură dispunerea cromosomilor în acelaşi plan şi accentuează dispersia produsă prin hipotonizare; astfel se obţin preparate definitive17; pentru obţinerea de cromosomi uniform coloraţi se face colorarea preparatelor cu coloranţi bazici (soluţie Giemsa); examinarea la microscop se face folosind un obiectiv cu imersie; se aleg metafazele cu cromosomi bine dispersaţi, contractaţi şi net conturaţi. Metoda analizei directe la microscop este procedeul obişnuit pentru aprecierea cantitativă (numerică) şi calitativă (morfologică) a cromosomilor. Ea permite depistarea unor anomalii ale cromosomilor (în special de număr). În cazurile în care nu există anomalii cromosomice, analiza a 16-20 de celule este suficientă. În cazul prezenţei unui mozaic, este necesară analiza a minimum 30 metafaze pentru a decela liniile celulare cu o incidenţă mai mică de 10%. Existenţa mai multor clone celulare impune analiza suplimentară a unui număr sporit de metafaze, pentru aprecierea cât mai corectă a procentajului fiecărei linii. În procedurile clasice, analiza cromosomică se încheie prin fotografierea metafazelor optime, decuparea cromosomilor fotografiaţi şi realizarea cariotipului. În momentul de faţă a căpătat amploare metodele bazate pe preluarea imaginilor cu o cameră video şi analiza cromosomilor pe computer, folosind un soft specializat. Pentru cazurile normale se cariotipează 2-3 metafaze. În cazul prezenţei unei anomalii cromosomice se analizează mai multe metafaze anormale. Dacă există mai multe clone, se recomandă cel puţin două cariotipuri pentru fiecare linie celulară. Prin cariotip se înţelege dispunerea sistematizată, în perechi de omologi, a cromosomilor fotografiaţi şi decupaţi ai unei singure celule, pe baza lungimii, poziţiei centromerului sau altor criterii morfologice (constricţii secundare, sateliţi, benzi), precis codificate prin standarde internaţionale. Studiul cromosomilor se bazează pe: obţinerea de celule în diviziune, blocarea diviziunii în metafază şi realizarea preparatelor cromosomice.

17

În cazul metodelor cu marcaj cromosomi după etalare sunt aplicate tratamente speciale care asigură apariţia benzilor.

52

Cromosomii umani

Celulele în diviziune se obţin, fie direct din ţesuturi care se divid activ, fie prin culturi celulare. Frecvent sunt folosite culturile de limfocite, stimulate cu fitohemaglutinină şi blocate în metafază, cu colchicină. Preparatele cromosomice se obţin prin: hipotonizare, fixare, etalarea suspensiei pe lame de microscopie şi colorare. Cromosomii sunt examinaţi la microscopul optic cu un obiectiv cu imersie. Cariotipul este obţinut prin decuparea cromosomilor fotografiaţi ai unei singure celule şi dispunerea sistematizată a acestora, în perechi de omologi, după criterii codificate prin standarde internaţionale.

C. IDENTIFICAREA CROMOSOMILOR UMANI Identificarea cromosomilor umani se face pe baza unor criterii morfologice cantitative (lungimea cromosomului, poziţia centromerului) şi calitative (constricţii secundare, sateliţi). La acestea se adaugă marcajul în benzi şi hibridarea fluorescentă in situ (FISH). Toate aceste criterii au fost codificate cu ocazia conferinţelor de standardizare într-un sistem internaţional de identificare şi nomenclatură (ISCN18).

1. CRITERII MORFOLOGICE DE IDENTIFICARE a. Criterii cantitative: 1. lungimea cromosomului - reprezentată de: lungimea absolută, exprimată în microni, variază în funcţie de stadiul diviziunii; lungimea relativă (Lr) exprimată în procente din lungimea unui set haploid normal (22 autosomi + X). lungime cromosom Lr   1000 22 autosomi  X Cromosomii umani sunt: mari, mijlocii şi mici. 2. poziţia centromerului se determină pe baza indicelui centromeric (Ic) - raportul procentual dintre lungimea braţului scurt şi lungimea totală a cromosomului: Ic = (p/p+q) x 100. Astfel, cromosomii se clasifică în: metacentrici (M) – Ic = 46-49; submetacentrici (SM) – Ic = 26-45; acrocentrici (A) – Ic = 17-25. raportul braţelor, reprezentat de raportul dintre lungimea braţului scurt şi a celui lung (p/q); are următoarele valori: cromosomi metacentrici  1, cromosomi submetacentrici = 1/3 – 1/4, cromosomi acrocentrici < 1/5. Folosind criteriile cantitative, se pot identifica perechile de cromosomi omologi, care se clasifică în 7 grupe notate cu majuscule de la A la G (tabelul 4.1.). Identificarea cromosomilor pe baza criteriilor cantitative este însă dificilă, cu excepţia cromosomilor din grupele A şi E. Determinarea parametrilor cantitativi prin măsurători este susceptibilă de erori, iar valorile obţinute sunt influenţate de gradul de condensare al cromosomilor omologi. b. Criterii calitative: 1. Sateliţii pot fi întâlniţi uneori pe braţele scurte ale cromosomilor acrocentrici din grupele D (13, 14, 15) şi G (21 şi 22) cu excepţia cromosomului Y. Numărul cromosomilor cu sateliţi şi mărimea sateliţilor variază de la o persoană la alta. Tabel 4.1. Clasificarea cromosomilor umani după lungime şi poziţia centromerului 18

Ultima Conferinţă de standardizare s-a desfăşurat în 1995

Cromosomii umani

53

LUNGIMEA CROMOSOMULUI MARI MIJLOCII MICI POZIŢIA CENTROMERULUI METACENTRICI A 1-3 E 16 F 19-20 SUBMETACENTRICI B 4-5 C 6-12, X E 17-18 ACROCENTRICI D 13-15 G 21-22, Y 2. Constricţiile secundare sunt segmente cromosomice despiralizate, slab colorate, formate din heterocromatină. Există două tipuri de constricţii secundare. Unele sunt prezente în regiunea juxtacentromerică a braţului lung al cromosomilor 1, 9 şi 1619. Un alt tip de constricţie secundară separă sateliţii de braţul scurt al cromosomilor acrocentrici. Constricţiile secundare nu sunt constante, iar atunci când sunt prezente pot avea lungimi diferite pe cromosomii omologi. 3. Situsurile fragile sunt regiuni cromosomice la nivelul cărora se produc mai frecvent rupturi cromosomice. Situsurile pot fi evidenţiate prin culturi celulare în mediu restrictiv sau prin adăugarea unor substanţe care cauzează rupturi cromosomice, precum aphidicilina sau agenţii antifolaţi. În majoritatea cazurilor situsul fragil nu este asociat cu manifestări clinice20. În practică, în cazul unei coloraţii uniforme, pentru identificarea cromosomilor pe baza criteriilor morfologice (figura 4.1.) se ţine cont de următoarea recomandare: alegerea omologilor se va face pe baza lungimii şi a raportului dintre braţul scurt şi cel lung (p/q); toţi autosomii şi gonosomii XX de la femeie formează perechi de omologi, în timp ce gonosomii XY de la bărbat nu sunt omologi. Caracteristicile morfologice ale fiecărei grupe de cromosomi sunt: Grupa A (1-3) - cromosomi mari, metacentrici; se identifică pe baza lungimii şi a poziţiei centromerului: cromosomul 1 este cel mai mare, prezintă centromerul median şi poate avea o constricţie secundară pe braţul lung, lângă centromer; cromosomul 2 este mai mic şi uşor submetacentric (p/q=1/2); cromosomul 3 este mai mic decât primii doi şi este metacentric. Grupa B (4-5) - cromosomi mari, submetacentrici; cromosomul 4 este uşor mai lung şi are braţul scurt mai mare decât cromosomul 5; Grupa C (6-12,X) - cromosomi mijlocii, submetacentrici; la femeie sunt 16, iar la bărbat 15; fără marcaj cromosomic sunt dificil de identificat şi se aranjează în ordinea mărimii; romosomii din perechile 6, 7, 11 şi X sunt mai puţin submetacentrici decât perechile 8, 9, 10, 12; cromosomul 9 poate avea o constricţie secundară juxtacenteromeric pe braţul lung; Grupa D (13-15) - cromosomi mijlocii, acrocentrici; toate cele trei perechi pot prezenta sateliţi; se aranjează în ordinea mărimii. Grupa E (16-18) - cromosomi mijlocii, mici; cromosomul 16 este metacentric, iar cromosomii 17 şi 18 sunt submetacentrici; cromosomul 17 are braţele scurte mai mari decât cele ale cromosomului 18.

19

Aceste regiuni se caracterizează prin prezenţa unor benzi C largi şi conţin ADN înalt repetitiv. Singura excepţie o reprezintă situsul fragil localizat Xq27.3, numit FRAXE, care se asociază cu retard mental 20

54

Cromosomii umani

Figura 4.1. Cariotip 46, XY - coloraţie uniformă (Giemsa), fără marcaj în benzi Grupa F (19-20) - cromosomi mici, metacentrici; cromosomul 19 este puţin mai mic decât cromosomul 20. Grupa G (21-22,Y) - cromosomi mici, acrocentrici; la femeie sunt 4, iar la bărbat 5; cromosomul 21 este mai mic decât cromosomul 22 şi ambii sunt mai mici decât Y, care are cromatidele mai puţin divergente şi mai puţin conturate în partea terminală; toţi cromosomii grupei G pot prezenta sateliţi, cu excepţia cromosomului Y. Identificarea cromosomilor umani se face pe baza unor criterii morfologice: lungimea relativă sau absolută, împarte cromosomii în: mari, mijlocii, mici; poziţia centromerului determinată prin indicele centromeric, împarte cromosomii în: metacentrici, submetacentrici, acrocentrici; sateliţii sunt prezenţi pe braţele scurte ale cromosomilor acrocentrici D şi G; constricţiile secundare sunt mai frecvente pe braţele lungi ale cromosomilor 1, 9, 16.

Cromosomii umani

55

Conform acestor criterii, cromosomii umani se clasifică în 7 grupe notate de la A-G. Fiecare grupă prezintă un anumit număr de perechi de cromosomi cu formă şi mărime caracteristică.

B. IDENTIFICAREA CROMOSOMILOR PRIN MARCAJ ÎN BENZI Ultimele trei decenii au revoluţionat înţelegerea genomului uman prin introducerea unor tehnici speciale de analiză a cromosomilor. Acestea au facilitat identificarea precisă a fiecărui cromosom, prin evidenţierea unor benzi caracteristice, dispuse transversal pe cromatide, benzi care reflectă structura internă a cromosomilor (figura 4.2.).

Figura 4.2. Aspectul cromosomilor din grupele D (13 – 15) şi G (21 –22, Y) în coloraţia uniformă (sus) şi cu marcaj R (jos) [permite identificarea precisă a fiecărui cromosom] Banda este un segment cromosomic distinct, ce se deosebeşte de benzile adiacente prin intensitatea coloraţiei. Denumirea benzilor se face în funcţie de metoda de marcaj folosită sau de localizarea lor: marcaj Q - benzi ce devin vizibile prin coloraţie cu quinacrină (sau alt fluorocrom) şi examinare la microscopul cu iluminare în ultraviolet; benzile Q pozitive sunt fluorescente, iar cele Q negative sunt întunecate; marcaj G - benzi colorate cu soluţie Giemsa, după un tratament prealabil cu baze, enzime proteolitice (tripsină) sau soluţii saline concentrate; benzile Q şi G au aceeaşi dispoziţie şi corespund regiunilor de heterocromatină (bogate în perechi de baze AT) (figura 4.3); marcaj R - benzi obţinute prin denaturarea termică a ADN (tratarea lamelor într-o soluţie salină complexă, la pH 6,5, la 87oC) şi colorare cu soluţie Giemsa sau cu acridin orange; benzile R au dispoziţie inversă ("reverse") benzilor Q şi G; benzile R intens colorate (pozitive) corespund benzilor mai slab colorate obţinute prin tehnicile Q şi G; benzile R pozitive corespund regiunilor de eucromatină (bogate în perechi de baze Figura 4.3. Comparaţie GC) (figura 4.3.); între marcajele G/Q şi R marcaj C - benzi ce corespund heterocromatinei centromerice;

56

Cromosomii umani

marcaj T - benzi localizate în regiunile telomerice; marcaj NOR – colorează sateliţii cromosomilor acrocentrici. Fiecare cromosom este alcătuit dintr-o alternanţă de benzi pozitive (colorate) şi negative (necolorate). Secvenţa acestor benzi constituie o caracteristică de specie, fiind aceeaşi în toate celulele unui organism şi la toţi indivizii normali ai speciei. Marcajul în benzi permite identificarea precisă a fiecărui cromosom (figurile 4.2., 4.5, 4.7 şi 4.8). Unele benzi sunt net conturate şi reprezintă, alături de centromer şi telomere, elemente importante pentru identificarea unui cromosom. Acestea con-stituie repere cromosomice şi delimitează de-a lungul cromosomului mai multe regiuni. Regiunile şi benzile sunt numerotate de la centromer spre telomere, începând cu numărul 1, separat de-a lungul fiecărui braţ. În celelalte regiuni, numărătoarea începe cu reperul proximal situat spre centromer. Nomenclatura regiunilor şi benzilor se face notând, în ordine: numărul cromosomului, simbolul braţului, numărul regiunii, numărul benzii, după care urmează un punct, ce delimitează subdiviziunile. De exemplu: 1q21.2 = cromosomul 1, braţul lung (q) regiunea 2, banda 1, subbanda 2 (figura 4.4.). Conferinţa de standardizare şi nomenclatură a cromosomilor umani de la Paris (1971) a stabilit o reprezentare diagramatică a tuturor cromosomilor metafazici pe baza tipurilor de marcaj Q, R, G şi C, care cuprinde 320 benzi per set haploid (figura 4.5.). Unele tehnici permit identificarea tuturor cromosomilor (benzile Q, R, G) în timp ce altele evidenţiază segmente cromosomice (benzi C, T, marcaj BrdU). În funcţie de scop şi de cromosomii analizaţi este aleasă tehnica adecvată. Pentru obţinerea detaliilor de Figura 4.4. Cromosomul 1: regiuni, benzi, subbenzi structură ale cromosomilor sunt utilizate tehnici speciale de înaltă rezoluţie, bazate pe sincronizarea ciclurilor celulare (prin

Cromosomii umani

57

tratamente combinate cu metotrexat şi timidină sau BrdU) şi scurtarea perioadei de colchicinizare. Avantajul constă în obţinerea de preparate cu cromosomi mai puţin condensaţi, aflaţi în stadiile de prometafază sau profază, caracterizaţi printr-un număr sporit de benzi (figura 4.4.). În acest caz o bandă metafazică, obţinută prin metoda standard, este separată în mai multe subbenzi, a căror evidenţiere devine mai uşoară odată cu alungirea cromosomului. În raport cu perioada în care se realizează blocarea diviziunii, rezoluţia marcajului este diferită, prin evidenţierea unui număr diferit de benzi (figura 4.4.). Dacă în metafază, când cromosomii sunt puternic condensaţi, se pot observa 300 - 450 benzi (tehnici clasice sau de generaţia a II-a), în prometafază numărul creşte până la 550 - 850, în timp ce analiza cromosomilor în profază poate evidenţia până la 1000 benzi (tehnici de înaltă rezoluţie sau de generaţia a III-a). Metodele de înaltă rezoluţie au aplicabilitate pentru identificarea unor anomalii de structură de mici dimensiuni (translocaţii, deleţii, duplicaţii, situsuri fragile). Ele permit corelaţii între modificările cromosomice minore şi unele aspecte clinice.

Figura 4.5. Reprezentarea diagramatică a benzilor cromosomice (marcaj G) [Conferinţa Paris, 1971] În practică, examenul citogenetic de rutină trebuie să utilizeze o metodă de marcaj a tuturor cromosomilor (G sau R) iar dacă se depistează o anomalie cromosomică se recurge la alte metode specifice, mai laborioase. Cromosomii pot fi identificaţi exact prin marcaj în benzi. Există mai multe tipuri de benzi (Q, G, R, C, T) obţinute prin diverse tehnici, care evidenţiază pe cromatide anumite repere (centromer, telomere, unele benzi), caracteristice fiecărui cromosom. Cu cât cromosomii sunt mai alungiţi, cu atât se observă mai multe benzi. Numerotarea benzilor se face pe fiecare braţ de la centromer spre telomere.

58

Cromosomii umani

C. TEHNICI DE CITOGENETICĂ MOLECULARĂ Definirea precisă a anomaliilor cromosomice structurale (deleţii, duplicaţii etc.) depinde de rezoluţia metodelor de analiză citogenetică. Tehnicile de marcaj metafazic (300450 benzi per genom haploid) permit obţinerea unei rezoluţii de 5-10 Mb/bandă. Analiza cromosomilor prometafazici (850 benzi per genom) are o rezoluţie de ordinul a 3-5 Mb/bandă şi permite diagnosticul unor microdeleţii sau microduplicaţii. Tehnicile de citogenetică moleculară depăşesc această limită, ajungând la o rezoluţie de 10 - 1000 de kilobaze, ce permite evidenţierea unor “deleţii submicroscopice”. Cea mai folosită tehnică de citogenetică moleculară este hibridarea fluorescentă in situ (FISH – Fluorescence In Situ Hybridization) a două secvenţe nucleotidice complementare: ADN cromosomic monocatenar (“ţintă”) obţinut prin denaturare termică şi o sondă specifică. Detecţia hibridării poate fi directă sau indirectă. Detecţia directă (cea mai folosită) se bazează pe utilzarea de sonde marcate cu fluorocromi. În cazul detecţiei indirecte sunt utilizate nucleotide modificate chimic (biotină, digoxigenină) ce sunt recunoscute în urma fixării unui ligand fluorescent, precum avidina (figura 4.6.).

Figura 4.6. Principiul hibridării in situ fluorescente (FISH) Sondele moleculare au specificităţi diferite (figura 4.7.): pentru un întreg cromosom sau un braţ cromosomic, care va apare colorat distinct de ceilalţi cromosomi (tehnica de “pictare” cromosomică – engl. “chromosome painting”); pentru secvenţele de ADN satelit localizate în regiunea centromerică sau pericentromerică a unui cromosom; ele pot semnala prezenţa cromosomului respectiv

Cromosomii umani

59

chiar în nuclei interfazici (de exemplu în trisomia 21, folosind sonde pentru centromerul cromosomului 21, vor fi evidenţiate trei semnale fluorescente); sonde specifice unui locus din structura unui cromosom; va fi vizualizat un semnal de hibridare unic, specific locusului studiat; deleţia locusului determină absenţa semnalului; sonde multi-locus care evidenţiază mai mulţi loci din structura unui cromosom.

A B C D E Figura 4.7. Tipuri de sonde folosite în tehnica FISH A - Sondă specifică unui cromosom; B - Sondă specifică unui braţ; C - Sondă specifică centromerului; D - Sondă specifică unui locus; E - Marcaj multilocus Trebuie menţionat că alegerea sondelor moleculare, precum şi a “ţintei” (cromosom metafazic, nucleu interfazic, fibră de cromatină decondensată) şi a celulelor utilizate (fetale, somatice adulte, tumorale, gameţi) depinde de scopul analizei, determinat de o situaţie clinică dată (fenotipul bolnavului). Multitudinea sondelor, ţintelor şi celulelor studiate asigură tehnicilor de citogenetică moleculară o largă aplicaţie practică, în diagnostic şi cercetare. În ultimii ani au fost introduse tehnici noi de citogenetică moleculară. Alte tehnici de citogenetică moleculară sunt SKY şi CGH. Cariotiparea spectrală (SKY – Spectral Karyotyping) foloseşte cinci sonde diferite, o cameră video pentru preluarea imaginilor şi programe de prelucrare a imaginilor recepţionate, astfel că în final fiecare cromosom apare colorat specific, permiţând recunoaşterea rapidă a unor remanieri cromosomice complexe. Tehnica are aplicabilitate în citogenetica tumorală, deoarece în celulele canceroase sunt deseori prezente translocaţii complexe, ce implică mai mulţi cromosomi. Hibridarea genomică comparată (CGH – Comparate Genomic Hybridization) foloseşte pentru marcarea ADN-ului cromosomilor pacientului o sondă colorată (de exemplu verde) iar pentru ADN-ul din celulele normale, folosite ca martor, o altă culoare (de exemplu roşu). Ambele tipuri de ADN se hibridează cu cromosomii unei metafaze normale. Dacă în ADN-ul pacientului există o duplicaţie (trisomie parţială) se va produce o hibridare în exces între ADN-ul pacientului şi ADN-ul normal, evidenţiată prin colorarea în verde. Dacă în ADN-ul pacientului există o deleţie (monosomie parţială) se va produce o hibridare preferenţială între ADN-ul martor şi ADN-ul normal, evidenţiată prin colorarea în roşu. Tehnica FISH – hibridare in situ fluorescentă - permite identificarea precisă a tuturor cromosomilor, folosind sonde de ADN specifice; are avantajul că poate fi folosită pentru celule în diviziune şi pentru celule interfazice. Alte tehnici, precum SKY (cariotipare spectrală) şi CHG (hibridare genomică comparată) permit identificarea rearanjamentelor cromosomice complexe sau a microdeleţiilor/microduplicaţiilor fără etalarea cromosomilor.

60

Cromosomii umani

D. NOMENCLATURA CROMOSOMILOR UMANI Nomenclatura cromosomilor umani este bazată pe Sistemul internaţional de standardizare şi nomenclatură – ISCN, elaborat la Paris, în 1970 şi ameliorat la următoarele Conferinţe internaţionale. Acest sistem stabileşte detaliat simbolurile utilizate pentru descrierea cromosomilor normali şi a anomaliilor cromosomice, precum şi modul practic de reprezentare sau formulare al cariotipului. Conţinutul informaţional al cariotipului se redă astfel: mai întâi se notează numărul total de cromosomi (autosomi + gonosomi) urmat, după o virgulă, de cromosomii sexuali. De exemplu: 46,XX - cariotip normal, sex genetic feminin (figura 4.8.);

Figura 4.8. Cariotip 46,XX cu marcaj R

46,XY - cariotip normal, sex genetic masculin (figura 4.9.); 45,X - cariotip anormal, caracterizat prin lipsa unuia dintre gonosomi, la o persoană de sex feminin (în absenţa cromosomului Y orice persoană este de sex feminin);

Cromosomii umani

61

Figura 4.9. Cariotip 46,XY cu marcaj R 47,XXY - cariotip anormal  cromosom X suplimentar, la o persoană de sex masculin. Autosomii sunt specificaţi numai în caz de anomalii. Astfel, absenţa unui autosom sau existenţa unuia suplimentar, se notează cu semnele – sau +, plasate înaintea numărului ce desemnează cromosomul respectiv şi după cromosomii sexuali. De exemplu: 47,XY,+21 - cariotip anormal prin prezenţa unui cromosom 21 suplimentar, la o persoană de sex masculin. În cazul unor mozaicuri cromosomice sunt notate toate liniile celulare, separate prin linii oblice, în ordinea descrescătoare a frecvenţei fiecărei clone. 45,X/46,XX/47,XXX – cariotip anormal caracterizat prin existenţa unei linii celulare cu monosomie X (45,X) a unei linii celulare normale (46,XX) şi a unei linii celulare trisomice (47,XXX) la o persoană de sex feminin, preponderentă fiind linia monosomică;

62

Cromosomii umani



46,XY/47,XY,+21 – cariotip anormal caracterizat prin coexistenţa unei linii celulare normale (46,XY) şi a uneia cu trisomie 21 (47,XY,+21) la o persoană de sex masculin, linia normală fiind mai frecventă. Braţul scurt al unui cromosom se notează cu "p", iar cel lung cu "q". Dacă semnele + sau ─ sunt plasate după aceste litere, ele semnifică o micşorare sau o mărire a lungimii braţului respectiv. De exemplu: 46,XY,1q+, cariotip anormal al unei persoane de sex masculin cu 46 cromosomi şi cu o creştere în lungime a braţului lung al cromosomului 1. 46,XX,5p-, cariotip anormal al unei persoane de sex feminin cu 46 cromosomi şi deleţie (pierdere de material) pe braţul scurt al cromosomului 5. Constricţia secundară se notează cu litera "h", plasată după simbolul braţului pe care se găseşte; creşterea ei în lungime se notează cu +. De exemplu: 46,XY,9qh+ - cariotip normal al unei persoane de sex masculin cu 46 cromosomi şi alungirea constricţiei secundare de pe braţul lung al cromosomului 9. Anomaliile de structură ale cromosomilor se marchează cu simboluri specifice care sunt descrise la capitolul “Anomalii cromosomice”. Nomenclatura cromosomilor umani are la bază un sistem internaţional de standardizare, care permite descrierea cariotipului normal şi anormal cu ajutorul unor simboluri şi semne, prin care se redă numărul de cromosomi şi eventualele anomalii de structură cromosomice.

E. VARIAŢIILE CARIOTIPULUI LA PERSOANE CU FENOTIP NORMAL - POLIMORFISMUL CROMOSOMIC Anumite persoane prezintă variante ale cariotipului, considerate modificări minore, a căror prezenţă nu poate fi asociată cu anomalii fenotipice şi care nu au semnificaţie clinică anormală, deoarece interesează regiuni cromosomice de heterocromatină, inactivă genetic. Aceste variante au fost denumite polimorfisme sau heteromorfisme. La 2% dintre adulţi au fost detectate prin marcaj cromosomic diferenţe mici de lungime. Alte forme de variabilitate cromosomică neasociată cu anomalii clinice, implică sateliţii, constricţiile secundare şi polimorfismele benzilor Q, G, C. Lungimea cromosomilor omologi nu este întotdeauna aceeaşi, fiind modificată, în special, lungimea braţelor lungi ale cromosomilor D şi G. Printre bărbaţii normali există variaţii marcate ale cromosomului Y pe seama părţii sale heterocromatiniene (Yq). Sateliţii prezintă o mare variabilitate, fie de număr (foarte rar sunt prezenţi pe toţi cei 10 acrocentrici ai grupelor D şi G dintr-o celulă) fie de formă sau mărime. Pot fi întâlniţi sateliţi giganţi, alungiţi, multipli, divizaţi, dubli sau în tandem. În mod excepţional, ei pot apărea şi pe alţi cromosomi (17, Y). Constricţiile secundare sunt depistate constant în regiunile proximale ale braţelor lungi ale cromosomilor 1, 9 şi 16. Uneori apare o alungire a constricţiei secundare21 sau apar constricţii neobişnuite pe cromosomii 6 sau 19. Polimorfismele benzilor Q, G şi C se caracterizează prin diferenţe în ceea ce priveşte mărimea şi aspectul zonelor cromosomice colorate prin variate tehnici de marcaj. Aceste diferenţe variază de la o celulă la alta şi implică, în mod obişnuit, numai unul din cromosomii omologi. Cel mai frecvent, polimorfismele benzilor C implică regiunile 21

Prezenţa unei constricţii secundare mari determină o alungire totală a cromosomului, fără a avea însă efecte clinice.

Cromosomii umani

63

centromerice, braţele scurte şi regiunile satelit ale cromosomilor D şi G, precum şi zona de constricţie secundară de pe braţul lung al cromosomului Y. Semnificaţia exactă a acestor variante nu este cunoscută. Se cunoaşte că ele se transmit dominant, conform legilor lui Mendel, şi că nu modifică expresia fenotipică, deoarece polimorfismul pare limitat numai la regiunile heterocromatice, inactive genetic. Importanţa practică a polimorfismelor cromosomice constă în utilizarea lor pentru determinarea originii cromosomilor suplimentari în trisomii, pentru identificarea cromosomilor ce conţin gene marker, în medicina legală etc.

II. APLICAŢII PRACTICE 1.

Examinaţi pe planşă şi fotografii etapele de obţinere ale cromosomilor la om; corelaţi observaţiile făcute cu ceea ce aţi observat în cadrul vizitei de prezentare a laboratorului de citogenetică (culturi celulare) al disciplinei de Genetică umană. 2. Examinaţi la microscop un preparat cu cromosomi; apreciaţi calitatea culturii prin numărul de metafaze, dispersia şi claritatea cromosomilor. 3. Reprezentaţi grafic (desen) după fotografii, cromosomii unei metafaze; recunoaşteţi pe desen tipurile de cromosomi după mărime (mari, mijlocii, mici) şi poziţia centromerului (metacentrici, submetacentrici, acrocentrici); observaţi dacă există sateliţi pe cromosomii acrocentrici şi constricţii secundare pe cromosomii 1, 9, 16. 4. Recunoaşteţi după lungime şi poziţia centromerului şi notaţi pe metafaza desenată cromosomii care aparţin fiecărei grupe; identificaţi cromosomii 1, 2, 3, 16, 17, 18 şi eventual, Y. 5. Pe idiograma cromosomilor umani cu marcaj G (figura 4.5.), recunoaşteţi reperele cromosomice = benzi, centromer, telomere. Observaţi particularităţile de marcaj ale fiecărui cromosom. 6. Pe o metafază cu marcaj în benzi (figura 4.10.) recunoaşteţi cu ajutorul ideogramei din figura 4.5. fiecare cromosom, identificaţi perechile de omologi şi stabiliţi sexul genetic şi dacă numărul total de cromosomi este 46. 7. Dacă pe o metafază cu marcaj există o anomalie de număr, identificaţi cromosomii suplimentari sau pe cei absenţi. Dacă la stabilirea perechilor de omologi constataţi o anomalie de structură, înregistraţi-o pentru a fi discutată. 8. Având ca model o idiogramă cu marcaj în benzi, realizaţi un cariotip prin aranjarea cromosomilor decupaţi de pe o fotografie, folosind criteriile caracteristice pentru separarea pe grupe, iar în cadrul grupelor, utilizaţi marcajul în benzi (ex. B 4-5, C 6-12, D 13-15, G 21-22). 9. Analizaţi pe diapozitive şi fotografii exemple de metafaze cu variaţii normale ale cromosomilor (numărul cromosomilor cu sateliţi, constricţie secundară 9qh+ sau Yq+). 10. Analizaţi diferite cariotipuri, identificaţi anomalia prezentă în fiecare caz şi stabiliţi formula cromosomică, conform nomenclaturii internaţionale.

III. ÎNTREBĂRI ŞI TESTE PENTRU VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR A. DEFINIŢI NOŢIUNILE Cariotip Satelit Cromosom submetacentric Reper Marcaj G

Criteriu cantitativ Constricţie secundară Cromosom acrocentric Marcaj Q FISH

Criteriu calitativ Cromosom metacentric Bandă cromosomică Marcaj R Polimorfism cromosomic

64

Cromosomii umani

Figura 4.10. Metafază cu marcaj G

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.

Ce etape sunt necesare pentru analiza cromosomilor ? Care este cea mai folosită metodă de obţinere a unor celule în diviziune? Care este substanţa care stimulează diviziunea limfocitelor cultivate? Care sunt substanţele care asigură blocarea diviziunii într-o anumită etapă şi care este mecanismul lor de acţiune? Care este rolul hipotonizării? Dar al fixării? Ce reprezintă cariotipul? Care sunt criteriile morfologice cantitative? Dar cele calitative? În ce categorii sunt împărţiţi cromosomii pe baza lungimii? Dar pe baza poziţiei centromerului? Enumeraţi care sunt caracteristicile cromosomilor din grupele: A, B, C, D, E, F şi G? Care sunt cromosomii ce pot prezenta sateliţi? Care sunt cromosomii ce pot prezenta frecvent constricţii secundare? Care este singurul cromosom acrocentric care nu poate avea sateliţi? Câţi cromosomi din grupa C au bărbaţii? Dar din grupa G? Câţi cromosomi din grupa C au femeile? Dar din grupa G? Ce sunt benzile cromosomice? Cum se obţin benzile Q? Dar cele G, respectiv R?

Cromosomii umani

65

16. Care este relaţia între benzile Q, G şi R? 17. Care este principiul tehnicii FISH? 18. Care este limita de rezoluţie a tehnicii FISH comparativ cu cele ale marcajului cromosomic metafazic şi profazic? 19. Care sunt tipurile de sonde folosite în FISH? 20. Scrieţi formula cromosomică pentru: o femeie normală, un bărbat normal, un bărbat cu constricţie secundară pe braţul lung al cromosomului 16, o femeie cu trisomie 21, o femeie cu monosomie X, 21. Ce sunt polimorfismele cromosomice? 22. Care sunt principalele polimorfisme?

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ La următoarele întrebări, răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun din cele enunţate. 1. Care dintre următoarele tipuri de coloraţii dau acelaşi aspect al benzilor? A. Coloraţia T şi C; B. Coloraţia Q şi R; C. Coloraţia Q şi C; D. Coloraţia Q şi T; E. Nici unul din răspunsuri nu este corect. 2. Ce se înţelege prin cariotip? A. Informaţia genetică conţinută în nucleu; B. Informaţia genetică dintr-un set haploid de cromosomi; C. Tipurile de cromosomi din celule; D. Dispunerea sistematizată a cromosomilor unei celule; E. Nici unul din răspunsuri nu este corect. La următoarele întrebări răspundeţi astfel: A - dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2 şi 3; B - dacă sunt corecte răspunsurile 1 şi 3; C - dacă sunt corecte răspunsurile 2 şi 4; D - dacă este corect răspunsul 4; E - dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2, 3 şi 4. 3. Cromosomul X: 1. Este un cromosom metacentric; 2. Este un cromosom mijlociu; 3. Se găseşte în triplu exemplar la copiii cu sindrom Down; 4. Este prezent în dublu exemplar la femei. La următoarele întrebări răspundeţi astfel: A - dacă ambele propoziţii sunt adevărate şi între ele există relaţie cauză-efect; B - dacă ambele propoziţii sunt adevărate, dar între ele nu există relaţie cauză-efect; C - dacă prima propoziţie este adevărată, iar a doua este falsă; D - dacă prima propoziţie este falsă, iar a doua este adevărată; E - dacă ambele propoziţii sunt false. 5. Colchicina este frecvent folosită în studiile de citogenetică, deoarece blochează clivarea longitudinală a centromerului cromosomilor metafazici. 6. Variaţiile cariotipului la persoane normale includ prezenţa sateliţilor pe braţele scurte ale cromosomului Y, deoarece sateliţii sunt constituiţi din eucromatină, al cărei exces nu induce modificări ale fenotipului Asociaţi următoarelor tipuri de cromosomi, din coloana din stânga, grupa corespunzătoare, din care fac parte, menţionată în coloana din dreapta. 1.Cromosomi mari, metacentrici; A. Grupa A; 2.Cromosomi mici, metacentrici; B. Grupa C, 3.Cromosomi mijlocii, acrocentrici; C. Grupa D 4.Cromosomi mijlocii, submetacentrici. E. Grupa G; 5.Cromosomi mici, acrocentrici; D. Grupa F;

5. ANOMALIILE {I BOLILE CROMOSOMICE I. DATE TEORETICE A. CLASIFICARE Anomaliile cromosomice sunt modificări ale numărului sau structurii cromosomilor. Ele reprezintă o importantă componentă a patologiei genetice umane, atât datorită frecvenţei globale, cât mai ales datorită consecinţelor fenotipice şi reproductive. Până în prezent au fost identificate peste 100 de sindroame cromosomice. Anomaliile cromosomice afectează aproximativ: 0,7% din nou-născuţi, 2% din sarcinile femeilor cu vârsta peste 35 de ani în momentul concepţiei şi se regăsesc la peste 50% din produşii avorturilor spontane din primul trimestru. Anomaliile cromosomice pot fi clasificate pe baza mai multor criterii (tabelul 5.1.). Tabelul 5.1. Clasificarea anomaliilor cromosomice Criteriu Momentul apariţiei Numărul de celule afectate Tipul de ţesut afectat Tipul de cromosom afectat Modul de afectare al materialului genetic

Tip de anomalie constituţionale dobândite omogene în mozaic somatice germinale autosomale gonosomale mixte numerice - poliploidii - aneuploidii structurale - echilibrate - neechilibrate disomii uniparentale

După momentul producerii lor, anomaliile cromosomice pot fi: anomalii constituţionale şi anomalii dobândite. Anomaliile constituţionale sunt prezente la naştere şi au originea în cursul gametogenezei unuia dintre părinţi sau în primele etape ale embriogenezei. Anomaliile dobândite apar ulterior în cursul vieţii şi interesează o populaţie de celule (clone celulare anormale). În raport cu numărul de celule afectate, anomaliile cromosomice pot fi împărţite în: omogene şi în mozaic. Anomaliile omogene se caracterizează prin prezenţa anomaliei în

Anomaliile şi bolile cromosomice

67

toate celulele individului afectat. Anomaliile în mozaic sunt caracterizate de prezenţa a două sau mai multe linii (clone) celulare, care diferă prin numărul de cromosomi. În raport cu tipul celulei afectate, anomaliile cromosomice în mozaic se clasifică în: anomalii somatice (pot modifica fenotipul individului afectat) şi anomalii germinale (anomalia nu modifică fenotipul pacientului, dar se poate transmite prin gameţi la descendenţi). În funcţie de tipul de cromosom afectat, anomaliile cromosomice se clasifică în: anomalii autosomale (sunt interesaţi unul sau mai mulţi autosomi) anomalii gonosomale (anomalia implică cromosomii X sau Y) şi anomalii mixte (anomalia interesează cel puţin un autosom şi un gonosom). În raport cu modul de afectare a materialului cromosomic, anomaliile pot fi împărţite în: numerice şi structurale. Prin anomalie cromosomică numerică se înţelege orice modificare a numărului de cromosomi în raport cu numărul normal de cromosomi (diploid – 2n = 46 cromosomi, în celule somatice, respectiv haploid – n = 23 cromosomi, în gameţi). Anomaliile numerice se clasifică în: poliploidii şi aneuploidii. Poliploidiile sunt caracterizate prin prezenţa în plus a unuia sau mai multor seturi haploide complete de cromosomi. Aneuploidiile se caracterizează prin absenţa (monosomie) sau prezenţa în plus a unuia sau mai multor cromosomi (trisomie, tetrasomie, pentasomie) din aceeaşi pereche sau din perechi diferite. Anomaliile cromosomice structurale se caracterizează prin modificarea structurii normale a cromosomilor. Ele se împart, în raport cu efectul fenotipic, în: anomalii echilibrate şi anomalii neechilibrate. Anomaliile cromosomice structurale echilibrate – translocaţii şi inversii – nu afectează cantitatea totală de material genetic celular şi nici fenotipul22. Anomaliile cromosomice structurale neechilibrate − deleţii, duplicaţii, cromosomi inelari, cromosomi dicentrici şi isocromosomi − sunt caracterizate prin prezenţa suplimentară, absenţa sau asocierea dintre surplusul şi lipsa unuia sau mai multor segmente cromosomice (trisomii sau monosomii parţiale), ceea ce determină o modificare a cantităţii totale de material genetic celular şi un fenotip anormal. Un tip particular de anomalie cromosomică este disomia uniparentală, determinată de prezenţa în celulele unui individ a unei perechi de cromosomi ce provine de la acelaşi genitor. Ele se clasifică în: isodisomii (cei doi cromosomi sunt identici) şi heterodisomii (cei doi cromosomi sunt diferiţi). Aceste anomalii determină un fenotip anormal, doar când se realizează o stare homozigotă pentru gene recesive anormale (în isodisomii) sau când unele segmente cromosomice prezintă amprentare genetică (parentală) fenomen ce produce o neechivalenţă funcţională între cromosomii proveniţi de la cei doi genitori. Anomaliile cromosomice se caracterizează prin modificarea numărului sau structurii cromosomilor Principalul criteriu de clasificare este tipul anomaliei, care permite împărţirea anomaliilor cromosomice în: numerice, structurale şi disomii uniparentale.

B. ANOMALII NUMERICE Anomaliile numărului de cromosomi produc modificări importante ale cantităţii de material genetic dintr-o celulă, determinând un fenotip anormal. Ele se împart în două categorii: poliploidii şi aneuploidii. 22

Uneori translocaţiile sau inversiile pot produce modificări fenotipice datorită producerii unei rupturi în interiorul unor gene de structură sau a formării unor gene himeră (gene fuzionate cu funcţii noi, diferite de cele normale).

68

Anomaliile şi bolile cromosomice

1. POLIPLOIDIILE Poliploidia se caracterizează prin prezenţa în plus a unuia sau mai multor seturi haploide de cromosomi (n=23 cromosomi) faţă de numărul diploid normal (2n=46 cromosomi). La specia umană cele mai frecvente poliploidii sunt: triploidia (3n=69 cromosomi) şi tetraploidia (4n=92 cromosomi). Poliploidiile se caracterizează prin modificări importante ale cantităţii de material genetic celular, determinând modificări majore ale fenotipului, cu efect letal, astfel că majoritatea embrionilor poliploizi sunt eliminaţi precoce prin avort spontan. Poliploidiile pot rezulta prin erori: meiotice, mitotice sau de fecundare. Triploidiile pot rezulta prin erori meiotice sau erori de fecundare. Eroarea meiotică constă în nesepararea citelor de ordin II şi poate afecta, atât meioza feminină, cât şi cea masculină. Neexpulzia celui de-al doilea globul polar, în timpul meiozei II feminine, conduce la formarea unui ovul diploid anormal, fenomen denumit diginie. Afectarea meiozei masculine duce la formarea unui spermatozoid diploid anormal, fenomen numit diandrie. Prin fecundarea unui gamet diploid cu un gamet normal rezultă un zigot triploid. Eroarea de fecundare ce poate conduce la apariţia unui zigot triploid se numeşte dispermie şi constă în fecundarea concomitentă a unui ovul normal (n=23 cromosomi) de către doi spermatozoizi normali (n=23 cromosomi)23. Tetraploidiile sunt, de obicei, consecinţa unei erori mitotice, numită endoreduplicare. Eroarea se caracterizează prin blocarea mitozei zigotului, după terminarea replicării ADNului nuclear. Celula trece direct în faza G1 a unui nou ciclu celular, perioadă în care cromosomii se despiralizează, producându-se separarea cromatidelor surori. Astfel, numărul de cromosomi din celulă se dublează de la 2n la 4n. O posibilitate, extrem de rară, este fecundarea unui ovul diploid de către un spermatozoid diploid.

2. ANEUPLOIDIILE Aneuploidia se caracterizează prin modificarea numărului diploid de cromosomi (2n = 46 cromosomi) datorită pierderii unui cromosom (monosomie) sau prezenţei în exces a 1, 2 sau 3 cromosomi (trisomie, tetrasomie, pentasomie). Trisomiile se caracterizează prin prezenţa într-o celulă somatică a trei exemplare ale aceluiaşi cromosom, în locul perechii normale de cromosomi omologi (2n+1). La specia umană majoritatea trisomiilor complete sunt letale, ducând la avorturi spontane precoce. Singurele excepţii sunt trisomiile autosomale: 21, 18, 13, 8, şi cele gonosomale (XXX, XXY şi XYY). Monosomiile sunt anomalii caracterizate prin prezenţa într-o celulă somatică a unui singur cromosom, în locul unei perechi de cromosomi (2n-1). Efectele fenotipice ale monosomiilor sunt mult mai grave decât cele ale trisomiilor, astfel încât la om singura monosomie viabilă este monosomia X, celălalte monosomii conducând la avorturi spontane. În cazul gonosomilor sunt posibile şi tetrasomii (48,XXXX, 48,XXYY, 48,XXXY) sau chiar pentasomii (49,XXXXX, 49,XXXXY). a. ETIOLOGIA ANEUPLOIDIILOR

23

La om fecundarea este în mod normal monospermică, astfel ca prin fuziunea unui ovul haploid cu un spermatozoid haploid rezultă zigotul la care se reface numărul diploid de cromosomi, caracteristic speciei.

Anomaliile şi bolile cromosomice

69

Cauzele aneuploidiilor sunt încă incomplet elucidate. În majoritatea cazurilor, aneuploidiile rezultă prin nedisjuncţie meiotică şi de aceea cele două fenomene au cauze identice. Un fapt cunoscut de mult timp este concordanţa dintre creşterea vârstei materne în momentul concepţiei şi creşterea incidenţei trisomiilor la nou-născuţi. Cel mai clar efect al vârstei materne asupra incidenţei trisomiilor a fost dovedit în cazul sindromului Down (trisomia 21) dar efecte similare au fost identificate şi în cazul trisomiilor 13 şi 18. Se presupune că efectul vârstei materne asupra incidenţei trisomiilor are la bază două fenomene: o reducere a ratei recombinărilor intracromosomice (crossing-over) în meioza I şi formarea unui fus de diviziune anormal. În schimb, factorii externi (nivel hormonal, alcool, fumat, diferite medicamente, radiaţii ionizante, boli autoimune etc.) nu cresc frecvenţa nedisjuncţiilor. b. MECANISMELE DE APARIŢIE ALE ANEUPLOIDIILOR Aneuploidiile omogene sunt consecinţa unor erori produse în cursul meiozei (nedisjuncţie cromosomică, nedisjuncţie cromatidiană, întârziere anafazică) dar şi a unor erori mitotice (nedisjuncţie cromatidiană) (vezi capitolul 2). Nedisjuncţia meiotică se produce cel mai frecvent în meioza I (3/4 din cazurile de sindrom Down) originea fiind, de obicei, maternă (90-95% din cazurile de trisomie 21, 18 sau 13). Singurele excepţii sunt monosomia X (80% de origine paternă) şi trisomia XYY (exclusiv de origine paternă). Nedisjuncţia cromosomică survine uneori în meioza I, fiind caracterizată prin migrarea celor doi cromosomi omologi la acelaşi pol al fusului de diviziune. Consecinţa acestei erori este formarea a doi gameţi anormali: unul disomic (n+1 = 24 cromosomi) iar celălalt nulisomic (n−1 = 22 cromosomi) (figura 2.10.). Fecundarea acestor gameţi de către gameţi normali (n=23 cromosomi) conduce la formarea de zigoţi aneuploizi trisomici, respectiv monosomici. Nedisjuncţia cromatidiană poate apărea în meioza II şi se caracterizează prin migrarea celor două cromatide surori ale unui cromosom la acelaşi pol al fusului de diviziune. Consecinţa acestei erori este apariţia a doi gameţi anormali: unul disomic, iar celălalt nulisomic (figura 2.10.). Fecundarea acestor gameţi de către gameţi normali conduce, de asemenea, la formarea de zigoţi trisomici, respectiv monosomici. Întârzierea anafazică este un accident care se poate produce în anafazele ambelor meioze (mai frecvent în anafaza II) şi constă în blocarea migrării sau reducerea vitezei de migrare a unor cromosomi/ cromatide normal segregate. Cromosomul sau cromatidele “întârziate” nu vor mai putea fi integrate într-unul din nucleii celulelor fiice şi vor rămâne în citoplasmă şi se vor pierde în cursul diferenţierii sau diviziunilor ulterioare. Efectul întârzierii anafazice este apariţia unor gameţi nulisomici, care prin fecundare cu gameţi normali vor conduce la zigoţi cu monosomie. Aneuploidiile în mozaic sunt consecinţa unor erori de mitoză: nedisjuncţia cromatidiană şi întârzierea anafazică. Efectul nedisjuncţiei cromatidiene este diferit în funcţie de celula afectată şi de cromosomul implicat. Afectarea diviziunii zigotului poate produce un mozaic de tip 47,XXX/45,X, doar dacă cromosomul implicat este cel X. Nedisjuncţia cromatidiană a altui cromosom va induce o trisomie omogenă, deoarece celulele monosomice vor fi eliminate. Afectarea diviziunii unei celule într-o etapă ulterioară de dezvoltare conduce la un mozaic de tip 47/46 (când este implicat un alt cromosom decât cromosomul X) sau la un mozaic de tip 47,XXX/46,XX/45,X sau 47,XXY/46,XY/45,X (când este implicat cromosomul X). Întârzierea anafazică determină mozaicuri cromosomice de tip 46,XX/45,X sau 46,XY/45,X, deoarece implicarea unui autosom duce la celule monosomice neviabile.

70

Anomaliile şi bolile cromosomice Anomaliile numerice se împart în: poliploidii (prezenţa în plus a unuia sau mai multor seturi haploide de cromosomi) şi aneuploidii (prezenţa în plus sau absenţa unuia sau mai multor cromosomi). Principalele aneuploidii sunt: trisomia (prezenţa unui cromosom suplimentar) şi monosomia (absenţa unuia dintre cromosomi). Cauzele anomaliilor cromosomice numerice sunt puţin cunoscute, fiind semnalată însă asocierea cu vârsta maternă înaintată. Mecanismul de producere al anomaliilor cromosomice numerice implică erori de meioză (poliploidii, aneuploidii) erori de fecundare (poliploidii) erori de mitoză (aneuploidii în mozaic).

C. ANOMALIILE DE STRUCTURĂ ALE CROMOSOMILOR Anomaliile cromosomice structurale se caracterizează prin modificarea morfologiei şi a conţinutului genic normal al unuia sau mai multor cromosomi. Ele pot fi echilibrate (translocaţii, inversii) sau neechilibrate (deleţii, duplicaţii, cromosomi inelari, cromosomi dicentrici, isocromosomi). Anomaliile cromosomice structurale sunt descrise folosind abrevierile din tabelul 5.2. Abrevierile se plasează înaintea cromosomului sau cromosomilor anormali, menţionaţi între paranteze. Dacă într-o anomalie de structură mai complexă (rearanjament cromosomic) sunt implicaţi mai mulţi cromosomi, ei vor fi înscrişi în paranteză în ordinea mărimii (exceptând cromosomii sexuali, care se vor scrie primii) şi se separă prin punct şi virgulă. Tabelul 5.2. Simboluri utilizate pentru descrierea anomaliilor cromosomice (ISCN 1995) SIMBOL  : :: del dic dup i ins inv r rob t ter der

DEFINIŢIE de la ... până la ... ruptură cromosomică ruptură urmată de reunirea segmentelor deleţie cromosom dicentric duplicaţie isocromosom inserţie inversie cromosom inelar translocaţie Robertsoniană ("fuziune centrică") translocaţie terminal, p ter = capătul braţului scurt; q ter = capătul braţului lung. Cromosom derivativ

Există două sisteme pentru descrierea anomaliilor structurale: prescurtat, în care natura rearanjamentului şi punctele de ruptură sunt identificate prin banda sau regiunea în care se produc; detaliat, care, pe lângă identificarea tipului de rearanjament, defineşte fiecare cromosom anormal după compoziţia sa în benzi.

Anomaliile şi bolile cromosomice

71

1. CAUZELE ŞI MECANISMELE DE PRODUCERE ALE ANOMALIILOR CROMOSOMICE STRUCTURALE Anomaliile cromosomice structurale sunt produse prin ruperea a unuia/doi cromosomi în unu/două puncte, urmată de reunirea captelor rupte (“adezive”) într-o nouă configuraţie, care generează un rearanjament cromosomic sau de pierderea unuia sau mai multor fragmente cromosomice. Ruperea se poate produce spontan (în anumite puncte “fragile” ale cromosomilor) sau poate rezulta sub acţiunea a diverşi agenţi mutageni din mediu (radiaţii ionizante, substanţe chimice, virusuri) numiţi şi clastogeni. Un alt mecanism este crossing-over-ul inegal determinat de împerecherea greşită a cromosomilor omologi în pahiten.

2. ANOMALII CROMOSOMICE STRUCTURALE ECHILIBRATE Anomaliile cromosomice structurale echilibrate se caracterizează prin modificarea poziţiei unor segmente cromosomice, fără modificarea cantităţii totale de material genetic celular. Ele sunt de două tipuri: inversii şi translocaţii. a. INVERSIILE Inversiile, abreviate inv, sunt rearanjamente care afectează un singur cromosom şi se caracterizează prin modificarea (inversarea) poziţiei normale a unui segment cromosomic. Inversiile rezultă prin ruperea cromosomului în două puncte, urmată de rotirea fragmentului intermediar cu 1800 şi reunirea fragmentelor. În funcţie de localizarea punctelor de ruptură, inversiile se clasifică în: paracentrice – dacă cele două puncte de ruptură sunt situate pe acelaşi braţ, iar fragmentul rotit nu conţine centromerul (figura 5.2.a); pericentrice – dacă cele două puncte de ruptură sunt situate pe braţe diferite, iar fragmentul rotit conţine centromerul (figura 5.2.b). Inversiile sunt greu de identificat în absenţa marcajului cromosomic, deoarece, în general, nu modifică morfologia cromosomului implicat. Inversiile pericentrice de dimensiuni mai mari duc însă la schimbarea morfologiei şi la pierderea similitudinii între omologi.

a

b Figura 5.2. Mecanismul inversiilor a: inversie paracentrică; b: inversie pericentrică (după Emery, 1998)

În figura 5.3. este prezentat un exemplu de inversie (inversie paracentrică a cromosomului 7 – inv 7) vizualizată datorită marcajului în benzi.

72

Anomaliile şi bolile cromosomice

Inversiile nu produc, de regulă, modificări fenotipice deoarece nu determină modificări ale cantităţii de material genetic, ci doar repoziţionarea unor gene în cromosom. Excepţiile apar când unul din punctele de ruptură este localizat în interiorul unei gene, ducând la modificarea distanţei dintre porţiunea centrală şi cea reglatoare a unei gene sau la disrupţia secvenţei codante. Inversiile pot produce grave probleme reproductive (sterilitate, avorturi spontane, naşterea unor copii plurimalformaţi) determinate de recombinarea intracromosomică în regiunea cu inversie. Datorită faptului că genele nu mai sunt poziţionate normal, sinapsa între cromosomii omologi nu se face corect (“genă la genă”) decât dacă Figura 5.3. Inversie cromosomul cu inversie formează o buclă la nivelul inversiei (figura paracentrică a 5.4.). Producerea unui crossing-over la acest nivel are consecinţe cromosomului 7 diferite în raport cu tipul de inversie. În cazul inversiilor paracentrice, (după Connor & Ferguson Smith, 1998) prin crossing-over la nivelul zonei inversate rezultă doi cromosomi recombinanţi anormali: unul dicentric şi altul acentric (figura 5.4.a). Fragmentul acentric se pierde la următoare diviziune, deoarece este lipsit de centromer şi nu se poate ataşa la fusul de diviziune. Cromosomii dicentrici sunt instabili, iar supravieţuirea unui embrion cu un cromosom dicentric este improbabilă.

a

b

Figura 5.4. Mecanismul de formare a unor cromosomi recombinanţi neechilibraţi în cazul inversiei paracentrice (a) şi al celei pericentrice (b) (după Emery, 1998) Prin apariţia unui crossing-over la nivelul buclei de inversie, purtătorii de inversii pericentrice pot avea descendenţi anormali, cu anomalii cromosomice neechilibrate, ce

Anomaliile şi bolile cromosomice

73

asociază duplicaţia unui segment (trisomie parţială) şi deleţia unui alt fragment cromosomic (monosomie parţială) (figura 5.4.b). Studiile efectuate au arătat că riscul unui purtător de inversie pericentrică de a avea un descendent afectat este de 1-10%, în funcţie de mărimea şi poziţia inversiei. b. TRANSLOCAŢIILE Prin translocaţie se înţelege transferul de segmente cromosomice între doi cromosomi. Există trei tipuri de translocaţii echilibrate: translocaţii reciproce, inserţii şi translocaţii prin fuziune centrică (Robertsoniene).

TRANSLOCAŢII RECIPROCE Translocaţiile reciproce, abreviate t, implică schimbul reciproc de fragmente cromosomice între doi cromosomi neomologi, cu formarea a doi cromosomi derivativi. De exemplu, translocaţia reciprocă dintre cromosomii 3 şi 11 din figura 5.5. poate fi descrisă ca 46, XX, t(3q11qter;11p15pter). Mecanismul de formare al unei translocaţii reciproce implică ruperea (în cursul interfazei) a doi cromosomi neomologi, fiecare în câte un punct, urmată de schimbul reciproc al fragmentelor acentrice şi realipirea fragmentelor rupte cu formarea cromosomilor derivativi (der). În cazul în care fragmentele schimbate au dimensiuni aproximativ egale, anomalia este imposibil de depistat prin colorarea uniformă a cromosomilor. Depistarea translocaţiilor reciproce se face însă cu mare acurateţe utilizând marcajul cromosomic de înaltă rezoluţie, cariotiparea spectrală sau tehnica FISH pentru translocaţii minime. Incidenţa translocaţiilor reciproce în populaţia generală este de aproximativ 1:200 - 1:500 de indivizi. De regulă, translocaţiile reciproce sunt specifice unei anumite familii. O translocaţie relativ frecventă este cea dintre braţele lungi ale cromosomilor 11 şi 22. Deoarece anomalia nu modifică cantitatea totală de material genetic, fenotipul purtătorilor de translocaţii reciproce nu este modificat24. În schimb, pot apărea tulburări de reproducere, determinate de segregarea cromosomilor derivativi în cursul meiozei I (figura 5.6. şi tabelul 5.3.) şi formarea de gameţi anormali. 3 der(3) der(11) 11 Translocaţiile reciproce pot produce A B C D uneori blocarea spermatogenezei, astfel că Figura 5.5. Translocaţie reciprocă bărbaţii purtători sunt sterili. Femeile purtătoare între cromosomii 3 şi 11 pot avea o fertilitate redusă, determinată de (după Thompson, 2001) alterarea împerecherii cromosomilor omologi în zigoten. 24

Cu excepţia cazurilor când produc disrupţia unei gene sau duc la formarea unor gene - himeră

74

Anomaliile şi bolile cromosomice

În cursul meiozei I, datorită translocaţiei, cromosomii omologi formează o sinapsă specială, numită cvadrivalent, cu aspect de cruce. În cadrul acestei structuri se produce alinierea regiunilor omologe ale cromosomilor implicaţi în translocaţie. În cursul anafazei I, când se produce segregarea cromosomilor omologi, cromosomii angajaţi în cvadrivalent pot urma trei căi de segregare: 2:2; 3:1; 4:0 (vezi tabelul 5.3.). Ultimele două căi, complet dezechilibrate, sunt foarte rare şi conduc la gameţi cu anomalii genetice majore. Segregarea 2:2 se poate face în trei moduri: alternativ, adiacent-1 şi adiacent-2. În cazul segregării alternative, cromosomii normali migrează la un pol al fusului de diviziune, la celălalt pol deplasându-se cromosomii cu translocaţie. Astfel, prin fecundarea acestor gameţi rezultă, fie zigoţi normali, fie zigoţi purtători ai translocaţiei echilibrate. În segregarea adiacentă-1 centromerii neomologi segregă împreună, în timp ce în segregarea adiacentă-2 se produce segregarea împreună a centromerilor omologi. În ambele tipuri de segregare rezultă gameţi anormali, care prin fecundare vor conduce la zigoţi ce asociază trisomia parţială a unuia dintre cromosomi cu monosomia parţială a celuilalt cromosom. În translocaţiile reciproce este foarte importantă calcularea riscului de apariţie a unor anomalii cromosomice la descendenţi. Deşi riscul teoretic este ridicat (50%) se consideră că riscul practic de apariţie a unor copii cu anomalii cromosomice neechilibrate este de 1-10%, dependent de tipul translocaţiei, deoarece majoritatea zigoţilor neechilibraţi sunt neviabili.

A

C

B

D

A C D B A D B C C D A B neechilibrat neechilibrat normal echilibrat neechilibrat neechilibrat ADIACENT-1 ALTERNATIV ADIACENT-2 Figura 5.6. Segregarea 2:2 a cromosomilor 3 şi 11 în cazul existenţei unei translocaţii t(3;11)(q12;p15.5) (după Thompson, 2001) Tabelul 5.3. Tipuri de segregare a cromosomilor implicaţi în translocaţii reciproce

Anomaliile şi bolile cromosomice Tip de segregare Alternativ Adiacent-1 Adiacent-2

Cromosomi segregaţi 2:2 A+D B+C A+C B+D A+B

75 Embrion

normal translocaţie echilibrată asociere de monosomie parţială şi trisomie parţială asociere de monosomie parţială şi trisomie parţială

C+D 3:1 A+B+C A+B+D A+C+D B+C+D D sau C sau B sau A

Trisomie completă

Monosomie completă

INSERŢII Inserţiile, abreviate ins, sunt translocaţii nereciproce, care implică transferul unui fragment cromosomic de pe un cromosom pe un cromosom neomolog. În figura 5.7. este prezentată inserţia ins(1;5)(q32;q11q22) în care un fragment din cromosomul 5 este translocat pe cromosomul 1.

1

ins(1) del(5)

5

1

ins(1) del(5) 5

Figura 5.7. Inserţie ins(1;5)(q32;q11q22) Mecanismul de apariţie al anomaliei constă în ruperea a doi cromosomi neomologi, în trei puncte de ruptură, două situate pe un cromosom şi unul pe celălalt cromosom. Fragmentul liber al cromosomului cu două rupturi este transferat la nivelul punctului de ruptură al celui de-al doilea cromosom. Inserarea fragmentului translocat se poate realiza, fie în poziţie normală, fie inversat. Anomalia nu modifică fenotipul purtătorului, dar poate conduce la tulburări de reproducere datorite segregării cromosomilor derivativi în cursul meiozei I. Astfel, un individ cu inserţie poate avea copii normali, copii purtători ai anomaliei echilibrate, copii cu monosomie parţială şi copii cu trisomie parţială.

TRANSLOCAŢII ROBERTSONIENE Translocaţiile Robertsoniene, abreviate rob, reprezintă un tip special de anomalii echilibrate, deoarece afectează doar cromosomii acrocentrici. Ele sunt numite şi fuziuni centrice, deoarece se caracterizează prin “fuziunea” a doi cromosomi acrocentrici, omologi

76

Anomaliile şi bolile cromosomice

sau neomologi, la nivelul centromerelor (figura 5.8.)25. La translocaţiile Robertsoniene pot participa toţi cromosomi acrocentrici, exceptând cromosomul Y.

Figura 5.8. Translocaţie Robertsoniană între un cromosom G şi un cromosom D (după Emery, 1998) Mecanismul de producere al anomaliei este reprezentat de ruperea a doi cromosomi acrocentrici la nivelul centromerelor sau foarte aproape de acestea pe braţele scurte, urmată de pierderea braţelor scurte şi unirea braţelor lungi într-un cromosom derivativ. Ca urmare se produce o modificare a numărului de cromosomi, care se reduce de la 46 la 45. În translocaţiile Robertsoniene echilibrate pierderea braţelor scurte ale cromosomilor implicaţi nu duce la modificarea fenotipului pacienţilor, deoarece braţele scurte ale tuturor acrocentricilor, cu excepţia cromosomului Y, conţin multiple copii ale genelor pentru ARNul ribosomal, gene care rămân într-un număr suficient de copii pe cromosomii acrocentrici normali. Incidenţa globală a translocaţiilor Robertsoniene în populaţie este de aproximativ 1/1000 de indivizi. Cea mai frecventă translocaţie de acest tip este cea dintre cromosomii 13 şi 14 - rob(13q14q). Translocaţiile Robertsoniene, deşi nu afectează fenotipul, pot produce grave probleme de reproducere, datorită segregării cromosomilor în cursul meiozei. Riscul de apariţie a unor descendenţi anormali este diferit în funcţie de tipul translocaţiei: între cromosomi omologi sau cromosomi neomologi. În cazul unei translocaţii între cromosomi neomologi, de exemplu între cromosomii 14 şi 21 pot rezulta 6 tipuri de gameţi (figura 5.9.): trei viabili (normal, sănătos cu translocaţie Robertsoniană echilibrată sau disomie 21) şi trei neviabili (cu nulisomie 14, nulisomie 21 sau disomie 14). Fecundarea acestor gameţi cu un gamet normal va conduce la produşi de concepţie normali, cu translocaţie Robertsoniană echilibrată, cu sindrom Down, respectiv embrioni neviabili ce vor fi avortaţi (cu monosomie 14, monosomie 21 sau trisomie 14). În cazul unei translocaţii Robertsoniene echilibrată (21q;21q) există un singur tip de segregare − 1:0 − care asigură formarea de gameţi cu disomie 21 sau nulisomie 21. Prin fecundare cu un gamet normal se pot forma doar două tipuri de zigoţi: cu trisomie 21 sau cu monosomie 21. Produşii de concepţie cu monosomie 21 nu sunt viabili şi sunt eliminaţi prin avort spontan, astfel încât un purtător de translocaţie Robertsoniană între cromosomii 21 poate avea doar copii anormali cu trisomie 21. Acest caz constituie una din puţinele situaţii în care riscul de recurenţă al unei afecţiuni genetice este de 100%.

25

În translocaţiile între cromosomi neomologi rezultă un cromosom dicentric cu centromere apropiate, iar în translocaţiile între cromosomi omologi apare un isocromosom de braţ lung.

Anomaliile şi bolile cromosomice

77

Figura 5.9. Mecanismul de producere şi efectele reproductive ale unei translocaţii Robertsoniene, rob(14q21q) (după Emery, 1998) În funcţie de consecinţele fenotipice, anomaliile structurale sunt: echilibrate (fenotip normal) sau neechilibrate (fenotip anormal) Mecanismul de producere implică rupturi cromosomice cu sau fără rearanjamente ale fragmentelor rupte. Anomaliile structurale echilibrate se clasifică în: inversii şi translocaţii Inversiile, caracterizate prin modificarea poziţiei unui segment cromosomic, care rămâne pe cromosomul de origine, se împart în inversii pericentrice şi paracentrice. Translocaţiile, caracterizate prin modificarea poziţiei unor segmente cromosomice, ca urmare a transferului lor pe alţi cromosomi, se clasifică în: translocaţii reciproce, inserţii şi translocaţii Robertsoniene. Anomaliile cromosomice echilibrate nu modifică fenotipul purtătorilor, dar produc tulburări de reproducere manifestate prin: sterilitate, infertilitate (avorturi spontane, nou-născuţi malformaţi morţi), naşterea de copii malformaţi vii. Inversiile determină tulburări de reproducere datorită apariţiei unui crossing-over la nivelul buclei de inversie. Translocaţiile se asociază cu tulburări de reproducere, datorită formării unor gameţi neechilibraţi prin segregarea cromosomilor cu translocaţie în cursul meiozei I.

3. ANOMALII CROMOSOMICE STRUCTURALE NEECHILIBRATE

78

Anomaliile şi bolile cromosomice

Anomaliile cromosomice structurale neechilibrate se caracterizează printr-o modificare a cantităţii totale de material genetic, ceea ce induce o modificare a fenotipului persoanelor purtătoare ale anomaliei. Anomaliile structurale neechilibrate se împart în: deleţii, duplicaţii, cromosomi inelari, cromosomi dicentrici şi isocromosomi. a. DELEŢIILE Deleţiile, abreviate del, sunt anomalii cromosomice structurale neechilibrate caracterizate prin pierderea unui fragment cromosomic. Rezultatul acestei pierderi este apariţia unei monosomii parţiale. Deleţiile ce depăşesc 2% din cantitatea de material genetic al unui set haploid de cromosomi sunt letale. Deoarece deleţiile care permit supravieţuirea sunt reduse ca dimensiuni, ele sunt greu de identificat prin analiza clasică, fără marcaj, a cromosomilor. Pentru evidenţierea deleţiilor este necesară, fie aplicarea marcajului cromosomic, de preferinţă de înaltă rezoluţie, fie folosirea unor sonde FISH pentru regiunea presupusă a fi absentă din cariotipul individului. Din punct de vedere al localizării segmentului absent, deleţiile se clasifică în: deleţii terminale şi deleţii interstiţiale (figura 5.10.). Deleţiile terminale rezultă prin ruperea unui cromosom într-un punct, urmată de pierderea fragmentului acentric. Deleţiile interstiţiale sunt produse prin ruperea unui cromosom în două puncte situate pe acelaşi braţ, urmată de pierderea fragmentului interstiţial şi reunirea fragmentelor restante. O deleţie interstiţială localizată pe braţul scurt al cromosomului 3 este prezentată în figura 5.11. – del(3p22-p25). Un alt mecanism de apariţie al deleţiilor îl constituie segregarea cromosomilor cu translocaţii echilibrate (figura 5.6.) sau inserţii în cursul meiozei I sau apariţia unei recombinări intracromosomice la nivelul unei inversii (crossing-over în bucla de inversie – figura 5.4.).

a

b Figura 5.10. Tipuri de deleţii Figura 5.11. Deleţie interstiţială pe a: deleţie terminală; b deleţie interstiţială braţul scurt al cromosomului 3 (după Thompson 2001) Din punct de vedere al dimensiunilor, deleţiile se împart în deleţii microscopice şi deleţii submicroscopice. Deleţiile microscopice pot fi observate prin tehnici de citogenetică cu marcaj cromosomic. În practică cele mai frecvente deleţii sunt cele localizate pe braţele scurte ale cromosomilor 4 (sindromul Wolf Hirschhorn) şi 5 (sindromul cri du chat) şi cele de pe braţul lung al cromosomului 18.

Anomaliile şi bolile cromosomice

79

Deleţiile submicroscopice sau microdeleţiile nu pot fi vizualizate decât prin tehnici de marcaj de înaltă rezoluţie sau prin tehnica FISH. Datorită perfecţionării tehnicilor de citogenetică a devenit posibilă stabilirea etiologiei cromosomice a numeroase sindroame malformative produse prin microdeleţii. Aceste sindroame au fost denumite şi sindroame ale genelor contigue, deoarece microdeleţia produce pierderea mai multor gene învecinate. Principalele sindroame cu microdeleţii sunt prezentate în tabelul 5.4. Tabelul 5.4. Principalele sindroame produse prin microdeleţii Sindrom Sindrom Langer-Giedion (triho-rino-falangian) Sindrom “WAGR”

Deleţie del (8q24.1)

Manifestări clinice multiple exostoze, aspect particular al nasului, păr subţire, anomalii falangiene del (11p13) tumoră Wilms, aniridie, displazie genitourinară, retard mental Sindrom Prader-Willi del(15q11-q13) hipotonie neonatală, retard mental, obezitate, dismorfie facială, acromicrie Sindrom Angelman del (15q11-q13) retard mental, hipostatură, ataxie, crize de râs Sindrom Rubinstein-Taybi del (16p13.3) retard mental, hipostatură, police şi haluce late Sindrom Smith-Magenis del (17p11.2) retard mental, dismorfie, hiperactivitate, automutilare Sindrom Miller-Dieker del (17p13.3) lisencefalie, retard mental, dismorfie facială Sindrom Alagille del (20p11-p12) colestază cronică, dismorfie facială, anomalii vertebrale Sindrom DiGeorge şi del (22q11.2) hipoplazia timusului şi paratiroidelor, Sindrom velo-cardio-facial malformaţii cardiace, dismorfie facială, retard mental, despicătură palatină

După Ch. Ledbetter, în Scriver’s “The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease”, 1996

b. DUPLICAŢIILE Duplicaţiile, abreviate dup, sunt anomalii cromosomice structurale neechilibrate, caracterizate prin prezenţa pe unul dintre cromosomi a unui segment în dublu exemplar. Consecinţa genotipică o reprezintă apariţia unei trisomii parţiale pentru segmentul cromosomic duplicat. Majoritatea duplicaţiilor sunt rezultatul unui crossing-over inegal între cromosomii omologi în cursul pahitenului, favorizat de prezenţa unor secvenţe similare de ADN repetitiv (figura 5.12.). Alte surse de trisomii parţiale sunt recombinarea intracromosomică la nivelul unei inversii şi segregarea cromosomilor în cazul unor translocaţii echilibrate. Cele mai frecvente duplicaţii sunt cele: dup12q, care produce sindromul Pallister şi 17q care determină boala Charcot – Marie - Tooth. c. CROMOSOMII INELARI Figura 5.12. Mecanismul de formare a unei duplicaţii prin crossing-over inegal (după Thompson, 2001)

Cromosomii inelari, notaţi cu r, sunt cromosomi caracterizaţi printr-o conformaţie circulară. Mecanismul de producere al acestei anomalii constă în ruperea unui cromosom în două puncte localizate pe braţe diferite, urmată de pierderea fragmentelor acentrice (terminale) şi

80

Anomaliile şi bolile cromosomice

unirea capetelor fragmentului centric (figura 5.13.). Cromosomii inelari prezintă dificultăţi de segregare în cursul mitozei fiind astfel instabili. Datorită acestei particularităţi, frecvenţa cromosomilor inelari este redusă. Principalii cromosomi inelari întâlniţi în practica medicală sunt: r(X), r(21), r(18), r(22) şi r(15). d. CROMOSOMII DICENTRICI Cromosomii dicentrici, notaţi dic, sunt caracterizaţi prin prezenţa a două centromere. Mecanismul de formare implică o translocaţie neechilibrată, cu ruperea a doi cromosomi, fiecare în câte un punct, urmată de pierderea fragmentelor acentrice şi unirea fragmentelor centrice într-un cromosom derivativ. Consecinţa acestui proces este reducerea numărului de cromosomi din celulă de la 46 la 45. Cromosomii dicentrici prezintă anomalii de ataşare la fibrele fusului de diviziune şi dificultăţi de segregare în cursul diviziunii, ceea ce induce pierderea lor. De regulă, unul din cei doi centromeri este inactivat, fiind posibilă transmiterea anomaliei în succesiunea generaţiilor celulare. Când ambele centromere rămân active, cromosomul este instabil şi dispare în timpul diviziunii datorită tracţiunii fibrelor fusului de diviziune. e. ISOCROMOSOMII Isocromosomii, notaţi cu i, sunt cromosomi anormali caracterizaţi prin prezenţa în dublu exemplar a unuia dintre braţe şi absenţa celuilalt braţ. Astfel, în cazul isocromosomilor există o asociere între duplicaţia unuia dintre braţe (trisomie parţială) şi deleţia celuilalt braţ (monosomie parţială) (figura 5.14.). Isocromosomii rezultă prin clivarea transversală a centromerului, o eroare a mitozei. Astfel, rezultă un mozaic celular, o clonă având isocromosom de braţ scurt, iar cealaltă isocromosom de braţ lung. Deoarece monosomia unuia dintre braţe se caracterizează printrun deficit major de material genetic, cei mai frecvenţi isocromosomi sunt i(Xq) şi i(Xp).

Figura 5.13. Mecanismul de formare al unui cromosom inelar (după Thompson, 2001)

isocromosom de braţ lung Figura 5.14. Formarea unui isocromosom de braţ lung (după Thompson, 2001)

Anomaliile structurale neechilibrate se caracterizează prin modificări cantitative ale materialului genetic, fiind clasificate în: deleţii (pierderea de fragmente cromosomice) duplicaţii (prezenţa în dublu exemplar a unui segment cromosomic) isocromosomi (cromosomi anormali formaţi din două braţe identice) cromosomi inelari (cromosomi anormali cu configuraţie circulară) şi cromosomi dicentrici (cromosomi anormali ce prezintă două centromere).

Anomaliile şi bolile cromosomice

81

4. CONSECINŢELE ANOMALIILOR CROMOSOMICE NEECHILIBRATE Anomaliile cromosomice, caracterizate prin modificări cantitative ale materialului genetic (anomalii numerice şi anomalii structurale neechilibrate) sunt anomalii de dozaj genic, deoarece efectele fenotipice ale acestora sunt consecinţa excesului sau absenţei uneia sau mai multor gene. Indiferent de cromosomul afectat, toate anomaliile cromosomice neechilibrate viabile prezintă o serie de trăsături comune: tulburări de creştere şi dezvoltare pre- şi postnatală; retard psiho-motor; tulburări de reproducere, manifestate prin: sterilitate şi/sau infertilitate (avorturi repetate sau naştere de copii plurimalformaţi morţi sau vii); sindrom plurimalformativ specific fiecărei anomalii în parte şi dermatoglife anormale; Consecinţele anomaliilor cromosomice neechilibrate numerice şi structurale depind de mai mulţi factori: tipul anomaliei şi mărimea dezechilibrului genic; tipul cromosomului afectat (autosom sau gonosom) cantitatea de eucromatină şi heterocromatină a cromosomului; numărul de celule afectate. Poliploidiile, producând o modificare majoră a cantităţii de material genetic, sunt incompatibile cu viaţa la specia umană, sarcinile cu făt poliploid încheindu-se prin avort spontan, de obicei în primul trimestru de sarcină26. În cazul aneuploidiilor consecinţele fenotipice depind de tipul anomaliei. Pierderea de material genetic (monosomia) este mai gravă decât surplusul de material genetic (trisomia). Monosomiile, exceptând o mică parte din cazurile cu monosomie X, sunt letale la specia umană, conducând la avort spontan. În cazul trisomiilor, consecinţele fenotipice depind de tipul cromosomului implicat. Astfel, trisomiile cromosomilor mari sau a celor bogaţi în eucromatină sunt letale, în timp ce trisomiile cromosomilor mici sau a celor bogaţi în heterocromatină permit supravieţuirea produsului de concepţie, dar acesta va prezenta multiple malformaţii, ca urmare a alterării dozajului genic. Studiile produşilor de avort spontan au relevat prezenţa tuturor trisomiilor, exceptând trisomia 1. Singurele trisomii autosomale complete viabile sunt trisomiile: 21, 18, 13 şi 8 (în cazul ultimei de cele mai multe ori fiind prezentă o anomalie în mozaic). Pe de altă parte, aneuploidiile autosomale sunt mai grave decât cele gonosomale. Acest fapt este determinat de două particularităţi ale gonosomilor: cromosomul Y conţine puţine gene şi multă heterocromatină, inactivă genetic, iar prezenţa a doi cromosomi Y nu modifică major fenotipul persoanei afectate; cromosomii X suplimentari se inactivează aproape în întregime, astfel încât prezenţa lor suplimentară nu modifică fenotipul în aceeaşi măsură ca şi trisomiile autosomale; această caracteristică a cromosomului X ar putea explica şi viabilitatea monosomiei X. Un alt factor care influenţează fenotipul clinic al aneuploidiilor este numărul de celule afectate. Astfel, anomaliile omogene sunt mult mai grave decât anomaliile în mozaic, ultimele producând modificări cu atât mai mici, cu cât numărul de celule afectate este mai redus. 26

Rareori sarcinile triploide ajung la termen (de obicei când placenta este diploidă) şi se soldează cu naşterea de copii plurimalformaţi, care decedează în perioada neonatală.

82

Anomaliile şi bolile cromosomice

Mozaicurile cromosomice produse în primele etape ale embriogenezei (prin erori mitotice sau prin “corecţia” unei trisomii iniţiale) au efecte fenotipice grave, deoarece numărul de celule anormale este mare, iar fenotipul nu este mult diferit de cel al anomaliei omogene. De exemplu, în sindromul Down fenotipul în trisomia 21 omogenă nu se deosebeşte semnificativ de cel identificat în trisomia 21 în mozaic. În schimb, mozaicurile cromosomice produse târziu în cursul ontogenezei sau cele postnatale au efecte fenotipice reduse sau chiar absente, de cele mai multe ori mozaicul fiind limitat la un singur ţesut. Mozaicurile cromosomice somatice se asociază uneori cu diverse forme de cancer sau cu o degenerescenţă precoce a ţesutului afectat, în timp ce mozaicurile germinale pot cauza diverse tulburări de reproducere, datorită transmiterii anomaliei la descendenţi. Mozaicurile cromosomice aneuploide sunt rare, deoarece atât monosomia cât şi polisomiile autosomale sunt letale. În schimb, mozaicurile ce implică anomalii structurale (monosomii parţiale sau trisomii parţiale) pot fi detectate în condiţiile în care dezechilibrul genic nu este foarte important. Consecinţele fenotipice ale anomaliilor cromosomice, produse prin erori ale dozajului genic (anomalii numerice şi anomalii structurale neechilibrate) depind de tipul anomaliei, tipul cromosomului implicat, numărul de celule modificate şi localizarea lor tisulară. Prezenţa unui dezechilibru genic important este incompatibilă cu supravieţuirea, determinând pierderea produsului de concepţie (avort spontan precoce sau naştere de copii morţi plurimalformaţi). Aneuploidiile şi anomaliile structurale neechilibrate viabile prezintă aspecte comune: retard de creştere şi dezvoltare, sindrom malformativ caracteristic fiecărei anomalii în parte, debilitate mintală, tulburări de reproducere.

5. DISOMIILE UNIPARENTALE Disomiile uniparentale sunt anomalii cromosomice caracterizate prin prezenţa unei perechi de cromosomi moştenite de la acelaşi genitor. Mecanismul de producere al disomiilor uniparentale implică procese de corecţie (“salvare”) a unor aneuploidii omogene în primele etape ale embriogenezei. În cazul monosomiei, aceasta poate fi salvată prin duplicarea cromosomului implicat, rezultând obligatoriu o disomie uniparentală. În cazul trisomiei, corecţia constă în eliminarea unuia dintre cei trei cromosomi omologi, existând o probabilitate de 1/3 de apariţie a unei disomii uniparentale prin eliminarea cromosomului provenit de la unul din genitori. Un exemplu de corecţie a unei trisomii 15 este prezentat în figura 5.15. În trisomia 15 de origine paternă pierderea cromosomului 15 de origine maternă determină sindrom Angelman. În trisomia 15 de origine maternă pierderea cromosomului 15 de origine paternă determină sindrom Prader-Willi. Teoretic, pot exista disomii uniparentale pentru toţi cromosomii umani. Până la ora actuală au fost identificate 23 de disomii uniparentale, dintre care următoarele au implicaţii patologice: 15q paternă (sindrom Angelman) 15q maternă (sindrom Prader-Willi) 11p paternă (sindrom Beckwith-Wiedemann) 6 maternă (diabetul zaharat tranzitoriu al nounăscutului) şi 7 maternă (sindrom Silver – Russell). Implicaţiile patologice ale disomiilor uniparentale sunt consecinţa unui fenomen recent identificat, numit amprentare genetică (gametică sau parentală).

Meioza maternă

Anomaliile şi bolile cromosomice

83

Figura 5.15. Mecanismul de producere al disomiei uniparentale 15 a – disomie uniparentală maternă 15 – sindrom Prader Willi; b – disomie uniparentală paternă 15 – sindrom Angelman Genomurile parentale nu sunt echivalente funcţional. La nivelul anumitor loci se exprimă fenotipic, fie alela de origine maternă, fie cea de origine paternă (cea de a doua alelă fiind inactivă). Amprentarea gametică se produce în spermatogeneză sau ovogeneză şi constă

84

Anomaliile şi bolile cromosomice

în marcarea specifică a anumitor gene localizate pe unii cromosomi. Procesul are două etape: ştergerea amprentării moştenite de la părinţi şi introducerea noii amprentări caracteristice sexului individului respectiv. Zigotul rezultat în urma fecundării gameţilor va moşteni două genomuri parentale marcate specific şi diferite funcţional. Marcarea acestor gene (de regulă implicate în embriogeneză) constă fie în inactivarea prin metilare a uneia dintre alele, fie în modificarea regiunii reglatoare a uneia dintre alele. Amprentarea genetică este responsabilă de imposibilitatea partenogenezei la mamifere (obţinerea de organisme diploide prin duplicarea informaţiei genetice a unui singur gamet). Principalele regiuni cromosomice amprentate la om sunt: 15q11-13 şi 11p15.5. La nivelul regiunii 15q11-13 există un centru de control al amprentării, gene amprentate matern şi gene amprentate patern, anomaliile cromosomice ale acestei regiuni fiind implicate în sindroamele Angelman şi Prader-Willi (tabelul 5.5.). La nivelul regiunii 11p15.5, implicată în sindromul Beckwith-Wiedemann, au fost identificate un centru de control al amprentării, gene amprentate matern (H19 şi p57KIP2) şi gene amprentate patern (IGF2). Tabelul 5.5. Caracteristicile sindroamelor Prader-Willi şi Angelman Anomalie cromosomică Gene implicate Particularităţi clinice

Sindrom Prader Willi deleţie paternă 15q11-13 (70%); disomie uniparentală maternă (25%); anomalie a centrului de amprentare (5%) SNRPN hipotonie neonatală; hipogonadism; bulimie; obezitate; retard mental mediu; hipopigmentare; tulburări de comportament

Sindrom Angelman deleţie maternă 15q11-13 (95%); disomie uniparentală paternă (2%); anomalie a centrului de amprentare (3%) Ligaza ubiquitinei retard mental sever; crize comiţiale; crize incontrolabile de râs; mişcări ataxice

Disomiile uniparentale sunt anomalii cromosomice determinate de prezenţa unei perechi de cromosomi moştenite de la acelaşi genitor, iar consecinţele lor fenotipice sunt rezultatul amprentării genomice.

D. SINDROAME CROMOSOMICE 1. SINDROMUL DOWN Sindromul Down este consecinţa fenotipică a trisomiei 21. El a fost descris de John Langdon Down în 1866, iar substratul genetic al bolii a fost stabilit de Lejeune, care a asociat sindromul Down cu prezenţa în celule a trei cromosomi 21. Incidenţa trisomiei 21 este estimată la 1:650 nou-născuţi vii (1,5‰). Boala este mai frecventă la copiii de sex masculin, raportul sexelor fiind de 3 băieţi : 2 fete. Factorii etiologici care determină trisomia 21 nu sunt cunoscuţi, dar există numeroase date care incriminează: vârsta maternă avansată în momentul concepţiei pentru trisomiile libere şi prezenţa la unul dintre părinţi a unei translocaţiii Robertsoniene echilibrate ce implică un cromosom 21, pentru trisomia 21 prin translocaţie.

Anomaliile şi bolile cromosomice

85

Simptomatologia clinică diferă în funcţie de vârsta la care este examinat pacientul. La nou-născut, trisomia 21 trebuie suspectată în prezenţa următoarelor semne clinice: lungime şi greutate mică, hipotonie musculară, dismorfie facială - fante palpebrale oblice în sus şi în afară (mongoloide), nas mic cu narine anteversate, protruzie linguală (datorită gurii mici) gât scurt, cu exces de piele pe ceafă, mâini scurte şi late, cu brahidactilie, clinodactilie a degetului V pliu palmar transvers unic (pliu simian) şi malformaţii viscerale (atrezie duodenală, imperforaţie anală, defecte cardiace) (figura 5.16.). La sugar şi copilul mic fenotipul de sindrom Down este caracterizat prin: talie şi greutate sub media vârstei, hipotonie musculară, hiporeflexie nervoasă, hiperlaxitate articulară, brahicefalie, dismorfie facială, anomalii ale membrelor şi malformaţii viscerale. Dismorfia facială se caracterizează prin fante palpebrale mongoloide, iris pestriţ (pete Brushfield) epicantus (pliu cutanat ce acoperă unghiul intern al ochiului) nas turtit, hipoplazia etajului mijlociu al feţei, limbă protruzionată.

Figura 5.16. Fenotip de sindrom Down la sugar La nivelul membrelor se remarcă brahidactilie, clinodactilia auricularului, dermatoglife anormale (pliu simian, exces de bucle cubitale, triradius axial situat distal) spaţiul interdigital I larg la picior. Malformaţiile cardiace cu şunt dreapta  stânga (defect septal ventricular sau atrial) produc cianoză (coloraţie violacee a tegumentelor şi mucoaselor indusă de deficitul de oxigenare a ţesuturilor) (tabelul 5.6., figura 5.17.). Nici unul din aceste semne nu este relevant luat separat, ci doar în asociere cu celelalte semne. La sugar diagnosticul clinic de sindrom Down este certificat de prezenţa a cel puţin 6 din semnele din tabelul 5.6. La adult semnele clinice relevante pentru diagnosticul sindromului Down sunt: retard mental sever, hipostatură, obezitate, fante palpebrale mongoloide, pete Brushfield (pete de culoare maronie localizate pe iris) buze groase şi eversate, limbă plicaturată, brahicefalie, microtie, gât scurt (figurile 5.18., 5.19.). Tabelul 5.6. Semnele cardinale pentru diagnosticul de sindrom Down în perioada neonatală şi de sugar (după Hall, 1966) Semne Reflex Moro redus Hipotonie musculară

Frecvenţă (%) 85 80

86

Anomaliile şi bolile cromosomice Profil facial plat Fante palpebrale oblice în sus şi în afară Urechi mici, rotunde, jos situate Exces de piele pe ceafă Pliu simian Hiperlaxitate articulară Modificări morfologice pelvine la examenul radiografic Hipoplazia falangei mijlocii a auricularului

90 80 60 80 45 80 70 60

Bucle cubitale

Pliu simian Triradius axial în poziţie distală Figura 5.17. Aspectul dermatoglifelor în sindromul Down (după Thompson 2001)

Figura 5.18. Aspectul regiunii oculare în sindromul Down

Figura 5.19. Fenotip de sindrom Down la adult în vârstă

În sindromul Down ritmul de creştere este redus, ceea ce induce hipostatură, caracterizată prin prezenţa unei deviaţii de minimum –2 DS faţă de media normală a vârstei. Talia maximă a pacienţilor cu sindrom Down este de 140 – 160 cm. Trisomia 21 determină un retard mental sever şi tulburări de limbaj. Coeficientul de inteligenţă (QI) al persoanelor afectate variază între 20 şi 85. Un bolnav cu sindrom Down poate acumula un nivel maxim de cunoştinţe comparabil cu cel al unui copil normal cu vârsta

Anomaliile şi bolile cromosomice

87

între 6 şi 8 ani. După vârsta de 30-35 de ani există o descreştere marcată a funcţiilor cognitive, similară cu cea din boala Alzheimer. Pacienţii cu sindrom Down prezintă tulburări senzoriale, în special auditive şi vizuale. Reducerea bilaterală a acuităţii auditive până la surditate afectează 50-75% din pacienţi. Anomaliile oculare sunt împărţite în două categorii: minore (epicantus, fante palpebrale mongoloide sau pete Brushfield) şi majore (cataractă congenitală sau strabism). Analiza citogenetică este esenţială pentru diagnosticul etiologic şi poate releva unul din următoarele cariotipuri: trisomie 21 liberă omogenă (47,XX,+21 sau 47,XY,+21) prezentă la 92% dintre pacienţi, cromosomul suplimentar fiind de origine maternă în 80% din cazuri; translocaţie Robertsoniană neechilibrată între cromosomi omologi, de exemplu între cromosomii 21 [46,XY,-21,rob(21q21q)] sau neomologi, de exemplu între cromosomii 14 şi 21 [46,XX,14,rob(14q21q)]; acest tip de anomalie poate fi observat în 5% din cazuri; mozaic cromosomic de tip 47/46 (47,XY,+21 /46,XY) prezent la 3% din pacienţi trisomie 21 parţială 0 H>h Relaţia genotip – fenotip pentru sistemul AB0 este prezentată în tabelul 6.3. Tabelul 6.3. Relaţia genotip-fenotip în sistemul sanguin ABO 28

Antigenele A şi B au fost depistate şi la o serie de bacterii

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic FENOTIP A1 A2 B A1B A2B O

109

GENOTIP homozigot A1A1 A2A2 BB 00

heterozigot A1A2, A10 A20 B0 A1B A2B -

Antigenele din sistemul AB0 sunt complexe glicosfingolipidice fixate pe membrana eritrocitelor, antigenicitatea fiind dependentă de restul glucidic. Sinteza acestor antigene este catalizată de două sisteme enzimatice ce intervin succesiv asupra unui precursor sfingolipidic. Genele care codifică cele două sisteme enzimatice – H (localizată 19q13) şi AB0 (loclaizată 9q34) – se află în relaţie de epistazie. Gena H codifică o fucozil transferază care asigură ataşarea unei molecule de fucoză la precursorul sfingolipidic, determinând formarea antigenului H. Asupra antigenului H acţionează genele A, B şi 0. Gena A codifică o transferază ce asigură ataşarea la antigenul H a unui rest de N-acetilglucozamină, în timp ce gena B codifică o altă transferază care asigură fixarea unei molecule de D-galactoză. Gena 0 nu produce nici o enzimă ectivă, astfel că antigenul H rămâne nemodificat. Un număr foarte mic de persoane, purtători homozigoţi ai unei mutaţii inactivatoare a genei H (genotip hh) nu au pe hematii nici un fel de antigene, deoarece în absenţa genei H precursorul sfingolipidic rămâne nemodificat, iar enzimele codificate de genele A şi B nu pot acţiona pentru că lipseşte restul de fucoză. Aceşti indivizi sunt consideraţi a avea fenotip Bombay. Ei prezintă similitudini serologice cu persoanele cu grup sanguin 0, dar pe hematii nu există nici un antigen. b. SISTEMUL DE GRUP SANGUIN Rh Grupul sanguin Rh se caracterizează prin prezenţa pe suprafaţa eritrocitelor a trei tipuri de antigene (aglutinogene) denumite C, D şi E. Antigenele Rh sunt de tip polipeptidic, reprezentând porţiuni dintr-o proteină transmembranară cu rol de canal ionic. Antigenul D este cel mai imunogenic şi defineşte în practică fenotipurile Rh29: persoane Rh pozitive care au antigen D pe hematii (85% dintre indivizi); persoane Rh negative care nu au antigen D pe hematii (15% dintre indivizi). Determinismul genetic al antigenelor Rh este complex, fiind implicaţi 2 loci genetici, D şi C/E, situaţi foarte apropiat pe acelaşi cromosom, astfel că genele se transmit înlănţuit. Fiecare locus poate fi ocupat alternativ de mai multe alele, astfel că se pot constitui haplotipuri distincte, ce determină antigene specifice (tabelul 6.4.) 30. Locusul D poate fi ocupat fie de alela D dominantă, care codifică antigenul D, fie de alela d recesivă, care este amorfă. Determinanţii antigenici C/c şi E/e constituie domenii distincte ale aceluiaşi polipeptid, codificat de genele din locusul C/E31. Tabelul 6.4. Frecvenţa haplotipurilor Rh comune în populaţia caucaziană Haplotip 29

Frecvenţă

Antigene produse

Fenotipurile Rh sunt definite în raport cu reacţia hematiilor la acţiunea anticorpilor anti D Locusul Rh este localizat 1p34 31 Antigenele C şi c, respectiv E şi e diferă prin 1-4 aminoacizi 30

110

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic CDe cde cDE cDe cdE Cde CDE CdE

0,40 0,38 0,14 0,025 0,013 0,009 Rar Foarte rar

C, D, e c, e c, D, E c, D, e c, E C, e C, D, E C, E

Fiecare individ posedă 2 haplotipuri (cele mai frecvente fiind CDe/cde şi CDe/CDe), pe autosomii omologi. Prin urmare antigenele prezente pe hematii şi fenotipul individului sunt determinate de ambele haplotipuri, pe baza interrelaţiei alelice la nivelul fiecărui locus (dominanţă-recesivitate pentru locusul D, codominanţă pentru locusul C/E). Ţinând cont de antigenicitatea redusă a antigenelor C/E, pentru simplificare se poate considera că doar locusul D este implicat în determinismul Rh. În acest caz, persoanele Rh pozitive sunt fie homozigoţi DD, fie heterozigoţi Dd, în timp ce persoanele Rh negative sunt obligatoriu homozigoţi dd. Deşi în mod natural persoanele Rh negative nu au în ser anticorpi împotriva antigenelor D, ele pot forma aceşti anticorpi în urma imunizării cu hematii D. Această imunizare se poate produce într-una din următoarele situaţii: transfuzie de sânge sau transplant de organ de la un individ Rh+, respectiv la prima sarcină Rh+ la o femeie Rh. Incompatibilitatea feto-maternă în sistemul Rh poate cauza la copil boala hemolitică a nou-născutului32. Aceasta este consecinţa trecerii transplacentare a anticorpilor anti-D de la mamă la făt pe parcursul sarcinii. Mecanismul patogenic este prezentat în figura 6.1. La prima sarcină Rh+, în circulaţia maternă trec un număr mic de hematii fetale, purtătoare de antigen D. Cantitatea de antigen D, conţinută de aceste eritrocite, este însă insuficientă pentru declanşarea unei reacţii imune din partea organismului matern, astfel încât, în absenţa imunizării prealabile, la prima sarcină Rh+ copilul nu va fi afectat de boala hemolitică a nou-născutului. În cursul naşterii (avortului) în circulaţia maternă pătrunde o cantitate însemnată de antigen D, suficientă pentru declanşarea sintezei de anticorpi anti-D. Aceştia se vor fixa pe hematiile fetale şi le vor distruge. În schimb, nu vor afecta fătul deoarece acesta a fost deja expulzat.

32

Gameţi

Mama Rhdd

Tata Rh+ Dd Gameţi d d

D Dd Dd

d dd dd

Boala hemolitică a nou-născutului poate apare mai rar şi datorită unei incompatibilităţi maternofetale în sistemul AB0 (femei cu grup sanguin 0 şi feţi cu grup sanguin A, B sau AB). Hematiile fetale ce trec în circulaţia maternă produc anticorpi anti-A sau anti-B, dar aceştia sunt de tip IgM, care au dimensiuni mari şi de obicei nu pot trece prin bariera feto-placentară. De aceea, în majoritatea cazurilor acets tip de incompatibilitate determină la făt doar forme uşoare de anemie

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic

Mama Rh-

Anticorpi anti-D Primul făt Placentă Rh+ Copil normal

111

Mama Rh-

Antigen D

Antigen D

Anticorpi anti-D Următorii feţi Rh+ Copii cu boală hemolitică

Figura 6.2. Mecanismul imunizării unei femei Rh- în cursul sarcinilor Rh+ Informaţia despre existenţa antigenelor D va fi stocată în memoria limfocitelor B şi la următoarea sarcină Rh+, numărul redus de eritrocite fetale pătrunse în circulaţia maternă va fi suficient pentru declanşarea răspunsului imun. Anticorpii anti-D sunt de tip IgG, au dimensiuni reduse şi pot trece de la mamă la făt prin bariera placentară. Ajunşi în circulaţia fetală ei se fixează pe antigenul D de pe hematii şi determină o reacţie antigen-anticorp finalizată prin hemoliză. Distrugerea hematiilor fetale are trei efecte: apariţia unei stări de anemie; stimularea eritropoiezei fetale, ceea ce va produce o hiperplazie a organelor eritropoietice, concretizată prin apariţia hepato-splenomegaliei; eliberarea unei cantităţi crescute de bilirubină. Bilirubina este toxică pentru făt şi nou-născut, deoarece sistemele enzimatice hepatice de conjugare cu glicocolul şi taurina sunt nedezvoltate. Până la naştere, bilirubina nu produce efecte toxice, deoarece este metabolizată de ficatul matern. În schimb, postnatal bilirubina restantă, nefiind conjugată, nu poate fi eliminată din organism şi se depune la nivelul pielii şi mucoaselor, determinând icter (coloraţia galben-brun-verzuie a pielii şi mucoaselor) respectiv la nivelul nucleilor bazali ai encefalului, producând fenomene neurologice. Asocierea de icter şi fenomene neurologice constituie icterul nuclear. În concluzie, existenţa bolii hemolitice a nou-născutului poate fi suspicionată în prezenţa următoarelor semne clinice: icter nuclear (icter intens, persistent mai mult de 3-4 zile postnatal asociat cu fenomene neurologice) anemie şi hepato-splenomegalie. Boala hemolitică a nou-născutului constituie o urgenţă neonatologică, deoarece fenomenele neurologice se pot croniciza şi determină sechele pentru toată viaţa. Tratamentul vizează pe de o parte eliminarea bilirubinei şi a anticorpilor anti-D din sângele fetal, iar pe de altă parte stimularea maturării sistemelor enzimatice hepatice. Pentru aceasta se face pe de o parte o exsanguinotransfuzie completă cu sânge izogrup ABO şi Rh, iar pe de altă parte se administreaza timp de 10-14 zile fenobarbital care acţionează ca inductor enzimatic.

112

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic

Profilaxia bolii hemolitice a nou-născutului poate fi primară sau secundară. Profilaxia primară se face la femeile Rh- neimunizate33 şi constă în administrarea de anticorpi anti-D cu 2-3 zile înaintea naşterii. Astfel, în momentul naşterii antigenele fetale pătrunse în circulaţia maternă vor fi distruse de anticorpii administraţi, fiind blocată reacţia imună maternă. În acest mod, la următoarea sarcină Rh+, femeia Rh- va fi practic neimunizată. Profilaxia secundară se adresează femeilor Rh- imunizate cu antigen D şi constă în administrarea periodică, de–a lungul perioadei gestaţionale, de antigene D, care vor fixa anticorpii anti-D produşi de mamă, reducând astfel titrul anticoprilor ce ajung în circulaţia fetală. Totuşi, accidentele de incompatibilitate materno-fetală în sistemul Rh se produc rar datorită reducerii imunizării materne în situaţia în care mama şi fătul sunt incompatibili şi în sistemul ABO (hematiile fetale trecute în circulaţia maternă sunt distruse în acest caz imediat de aglutininele AB0). c. SISTEMUL DE GRUP SANGUIN MNSs Grupul sanguin MNSs este caracterizat prin prezenţa pe hematii a antigenelor M şi/sau N, S sau s. Aceşti determinanţi antigenici polipeptidici sunt reprezentaţi de porţiuni din două sialoglicoproteine transmembranare eritrocitare numite glicoforine. Antigenele M şi N fac parte din glicoforina A, în timp ce antigenele S şi s fac parte din glicoforina B. Cele două glicoforine sunt codificate de două gene situate adiacent pe acelaşi autosom34 şi care se transmit înlănţuit, constituind un haplotip. În populaţia europeană cele mai frecvente haplotipuri sunt: Ns (38%) Ms (30%) MS (24%) şi NS (7%). Relaţiile între genele celor doi loci sunt de codominanţă pentru alelele M şi N, respectiv dominanţă/recesivitate pentru alelele S şi s (tabelul 6.5.). Tabel 6.5. Relaţiile genotip-fenotip pentru haplotipurile MNSs GENOTIP MM/SS, MM/Ss MM/ss NN/SS, NN/Ss NN/ss MN/SS, MN/Ss MN/ss

FENOTIP MS Ms NS Ns MNS MNs

Semnificaţia clinică a sistemului MNSs este minoră. Anticorpii anti-M sau anti-N pot apare “natural” şi reprezintă de obicei un amestec de molecule de tip IgM şi IgG. Anticorpii anti-S sau anti-s sunt de tip IgG şi se produc numai prin reacţii de imunizare la persoane negative ca urmare a unei transfuzii sau sarcini. Totuşi, datorită actvităţii imunologice reduse, aceşti anticorpi sunt rareori implicaţi în reacţii transfuzionale sau producerea unei anemii hemolitice la noul născut. d. SISTEMUL DE GRUP SANGUIN Xg Fenotipurile posibile sunt Xg(a+) şi Xg(a-) determinate de prezenţa, respectiv absenţa de pe hematii a antigenului Xga. Variaţia fenotipică este determinată de existenţa a două gene alele: Xga şi Xg, care pot ocupa alternativ locusul Xg situat pe cromosomul X. 33

Este important ca la o persoană de sex feminin, în cazul administrării de transfuzii de sânge, să se determine şi grupul sanguin Rh, nu numai cel AB0 34 Locii sistemului MNSs sunt localizaţi 4q28

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic

113

Acest locus nu este supus inactivării la femei, el fiind situat în porţiunea pseudoautosomală a cromosomului X (Xp22). Gena Xga este dominantă faţă de Xg şi produce antigenul Xga, în timp ce gena Xg este recesivă (tabelul 6.6.). Tabelul 6.6. Relaţiile genotip-fenotip în sistemul Xg

BĂRBAŢI FEMEI

GENOTIP XgaY Xg Y XgaXga, XgaXg Xg Xg

FENOTIP Xg (a+) Xg (a-) Xg (a+) Xg (a-)

Datorită situării locusului Xg pe cromosomul X, bărbaţii şi femeile sunt diferiţi genotipic. Bărbaţii sunt hemizigoţi, deoarece nu au decât un singur cromosom X, în timp ce femeile pot fi homozigote sau heterozigote. Transmiterea grupului Xg la descendenţi se face respectând legile transmiterii dominante gonosomale.

2. GRUPE DIN SECREŢII Genotipurile care determină fenotipurile secretor şi nesecretor sunt formate prin împerecherea alelelor Se (dominantă) şi se (recesivă, amorfă). Indivizii SeSe sau Sese sunt secretori şi au capacitatea de a sintetiza antigenele AB0 într-o formă hidrosolubilă, în timp ce persoanele nesecretoare sunt numai homozigoţii sese, la care antigenele AB0 rămân în formă liposolubilă, fiind absente din secreţii. Genele secretoare acţionează independent de genele sistemului sanguin AB0, dar condiţionează exprimarea acestor gene în secreţii, deoarece se găsesc în relaţie de epistazie cu acestea (tabelul 6.7.). Tabelul 6.7. Relaţia genotip-fenotip în sistemul secretor. Fenotip sistemul secretor

Genotip sistemul secretor

Antigene AB0 sanguine

Antigene AB0 în secreţii

Secretor (Se)

SeSe sau Sese





Nesecretor (se)

SeSe sau Sese SeSe sau Sese SeSe sau Sese sese

A B A, B oricare

A B A, B 

Fenotipurile sunt caracterizate de prezenţa sau absenţa în diversele secreţii ale organismului ale antigenelor grupului sanguin AB0. Persoanele care prezintă antigenele ABO în umori sunt consideraţi secretori [Se] (78%) iar cei care nu le prezintă sunt consideraţi nesecretori [se] (22%). Gena Se modifică solubilitatea antigenelor ABO, transformându-le din liposolubile în hidrosolubile. Astfel, antigenele ABO trec în secreţiile organismului (salivă, lapte, urină, spermă, sudoare etc.)35. La indivizii nesecretori, în absenţa genei Se (genotip sese) antigenele sunt liposolubile şi vor lipsi din secreţiile apoase.

3. GRUPELE SERICE

35

Statusul secretor este asociat cu o predispoziţie la ulcer duodenal

114

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic

Polimorfismul structural al diferitelor proteine serice (structurale sau enzimatice) este determinat genetic monogenic, numărul de variante depinzând de numărul de alele diferite pentru locusul genetic ce codifică o anumită proteină. Polimorfismul proteic, baza individualităţii biologice, poate fi demonstrat prin electroforeză în gel (variantele haptoglobinelor, transferinelor, alfa-2 globulinelor şi fosfatazelor) sau prin imunelecroforeză (sistemul gamma globulinelor şi beta lipoproteinelor), separarea lor făcându-se în funcţie de încărcătura electrică, mărimea şi forma moleculelor. a. HAPTOGLOBINELE Haptoglobinele sunt α2-globuline care au rolul de a fixa hemoglobina din eritrocitele distruse prin hemoliză intravasculară. Există trei tipuri de haptoglobine: Hp 1-1, Hp 1-2 şi Hp 2-2, diferenţiate pe baza vitezei de migrare electroforetică în gel. Cele 3 variante polipeptidice sunt determinate de prezenţa în genotipul individului, în stare homozigotă sau în stare heterozigotă, a două gene alele codominante Hp1 şi Hp2 (tabelul 6.8.). Tabelul 6.8. Relaţia genotip-fenotip pentru haptoglobine Fenotip Hp 1-1 Hp 2-2 Hp 1-2

Genotip Hp1 Hp1 Hp2 Hp2 Hp1 Hp2

b. TRANSFERINELE Transferinele sunt β1-globuline care au capacitatea de a fixa şi transporta fierul şi alţi ioni metalicic. Se cunosc 14 tipuri, determinate probabil de o serie de alele codominante. Cele mai importante sunt Tf C, Tf B, Tf D. c. GRUPUL COMPONENT SPECIFIC Proteinele grupului component specific sunt α2-globuline. Ele se notează cu GC, existând trei fenotipuri Gc1-1, Gc1-2, Gc2-2. Fenotipul Gc2-2 este asociat frecvent cu psoriazisul.

4. GRUPELE ENZIMATICE Grupele enzimatice pot fi serice sau eritrocitare. Enzimele serice polimorfe sunt reprezentate de pseudocolinesterază, acetil-transferază, lacticdehidrogenază, creatinfosfokinază, etc în timp ce enzimele eritrocitare polimorfe sunt reprezentate de fosfataza acidă, fosfoglucomutază, adenilatkinază, glucozo-6-fosfat dehidrogenază etc. Grupele enzimatice prezintă importanţă practică, fiind folosite în studii populaţionale. Un exemplu de polimorfism enzimatic este reprezentat alfa1-antitripsină. α1antitripsina este o proteină serică care inhibă activitatea unor enzime proteolitice (tripsina, chemotripsina etc.). Totuşi principala enzimă inhibată de α1-antitripsină este elastaza leucocitară, enzimă care distruge elastina din ţesutul alveolelor pulmonare, determinând o formă severă de emfizem pulmonar (cu debut precoce). Gena pentru α1-antitripsină este situată în locusul PI (proteaz-inhibitor) de pe cromosomul 14. La nivelul acestui locus cel mai frecvent pot fi detectate alelele M1, M2 şi M3, iar mai rar pot fi idnetificate alelele S şi Z. Aceste alele codifică proteine cu activitate antiproteazică diferită. Unele dintre aceste proteine au activitate foarte redusă, în timp ce alte enzime nu pot fi eliberate din hepatocite (se produce o acumulare intrahepatică de α1-antitripsină). Din punct de vedere patologic cele mai importante alele sunt alelele Z şi S. Persoanele cu genotipuri ZZ, MZ, MS şi ZS au o activitate antiproteazică redusă şi un risc crescut de boli pulmonare obstructive, artrită

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic

115

reumatoidă sau hepatită cronică. Bolile pulmonare sunt mai frecvente la fumători, deoarece substanţele chimice din fumul de ţigară alterează situsul activ al enzimei.

5. GRUPELE TISULARE Grupele tisulare sunt reprezentate de proteine cu rol structural, incluse în membrana celulară, dar care prezintă şi antigenitate specifică. Cel mai important sistem tisular este cel denumit HLA ("Human Leucocyte Antigen"). Este un sistem multigenic şi multifuncţional cu rol major în supravegherea şi apărarea imună a organismului, alcătuind complexul major de histocompatibilitate. Genele care determină proteinele sistemului HLA sunt localizate pe cromosmul 6p21.3 şi sunt foarte strâns înlănţuite determinând haplotipuri. Există mai mulţi loci, corespunzători unor gene care codifică proteine cu roluri diferite, genele fiind grupate în 3 clase distincte (datele referitoare la aceste gene sunt discutate pe larg la curs). Genele de clasă I ocupă locii HLA-A, HLA-B şi HLA-C şi prezintă fiecare un polialelism marcat (59 variante alelice pentru locusul A; 118 pentru locusul B şi 36 pentru locusul C). Ele determină glicoproteine antigenice exprimate pe suprafaţa tuturor celulelor nucleate (cu excepţia celulelor SNC, trofoblastice şi embrionare) şi sunt implicate în diferenţierea antigenelor self de cele nonself de către limfocitele T citotoxice. Au rol major în stabilirea compatibilităţii donor - acceptor în transplantele tisulare şi grefele de organe. Genele de clasă II ocupă locii D (HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR) existând 12 variante alelice. Aceste gene produc proteine existente pe membrana celulelor cu rol în prezentarea antigenelor către limfocitele T helper, având rol în recunoaşterea antigenelor străine şi declanşarea răspunsului imun umoral. Genele de clasă III codifică unele componente ale ale sistemului complement. Alelele genelor HLA sunt codominante şi formează un haplotip, care se transmite “în bloc” de la părinţi la descendenţi. Fiecare individ are are două haplotipuri HLA moştenite de la cei doi genitori, fiind semiidentic cu fiecare dintre aceştia. În cazul unei fratrii, un individ are o probabilitate de 25% de a fi idnetic cu unul dintre fraţi, de 50% de a fi semiidentic cu aceştia şi de 25% de a fi diferit de fraţii săi (figura 6.2.). Sistemul HLA este cel mai polimorfic sistem genetic datorită numărului foarte mare de alele existente în populaţie pentru fiecare locus al sistemului. Fiecare persoană are câte o singură alelă pentru fiecare locus, rezultând un număr de aproximativ 300 milioane de haplotipuri şi 40 miliarde de genotipuri posibile în populaţie. Majoritatea antigenelor HLA pot fi determinate prin metode serologice sau imunologice, contribuind la realizarea profilului biologic al individului. Acesta este util atât pentru identificarea persoanei (haplotipurile HLA pot fi considerate ca devărate “buletine de identitate moleculară”) şi filiaţiei, cât şi în stabilirea predispoziţiei pentru anumite afecţiuni.

A3 C8 B9

A1 C11 B12

I

1

A1

2

DR3

DR4

II

1

DR8

DR1

2

A6

A22 C19 B47

A6 C5 B3

A1

3

A22

A3

4

A6

A3

A22

116

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic

a

b

c

d

Figura 6.2. Modul de transmitere al haplotipurilor HLA Persoana a (II.1.) este semiidentică cu părinţii săi (I.1. şi I.2) sora b (II.2.) şi fratele c (II.3.) şi diferită complet de sora d (II.4)

6. SENSIBILITATEA GUSTATIVĂ Sensibilitatea gustativă este un caracter fiziologic determinat monogenic, caracterizat prin existenţa unor praguri gustative diferite pentru cele 4 gusturi fundamentale. Testele efectuate cu zaharină, chinină, sare de bucătărie etc. au arătat că gustul acestor substanţe este perceput în mod diferit de persoane diferite. Unele dintre acestea simţeau gustul substanţelor la concentraţii mici, în timp ce altele percepeau aceste substanţe ca insipide. Sensibilitatea gustativă prezintă variaţii în funcţie de sex, vârstă, rasă şi chiar în cazul aceluiaşi individ, la testări succesive. Similar sensibilităţii gustative şi în cazul sensibilităţii olfactive, indivizi diferiţi prezintă praguri olfactive distincte. Practic, variabilitatea sensibilităţii gustative este testată folosind fenil tiocarbamidă (PTC) substanţă care este percepută ca amară de către o parte din populaţie şi insipidă de ceillalţi indivizi. Genotipurile sunt determinate de asocierea a 2 alele: G dominantă şi g recesivă. În tabelul 6.9. sunt prezentate genotipurile posibile şi relaţia lor cu fenotipul, la părinţi şi la descendenţi. Tabelul 6.9. Relaţia genotip – fenotip pentru caracterul gustător Fenotip Gustător Negustător

Genotip GG, Gg gg

Fenotipurile prezente în populaţie sunt gustător (2/3 din populaţie) – percep gustul amar al PTC- şi negustător (1/3 din persoane) - cei care o percep substanţa ca insipidă. Principalele caractere monogenice sunt: sistemele de grup sanguin AB0, Rh, MN, Xg, caracterele secretor şi gustător, grupele din secreţii, grupele enzimatice şi grupele tisulare HLA; Sistemul de grup sanguin AB0 se caracterizează prin prezenţa pe hematii a unui antigen specific (A, B sau H) şi prezenţa în ser a tuturor anticorpilor (α, β şi anti-H) cu excepţia celuia (celor) împotriva antigenului de pe eritrocite; antigenele AB0 sunt determinate de genele AB0 (A1, A2, B şi 0); Datorită antigenicităţii crescute a antigenelor AB0, sistemul AB0 este principalul sistem de grup sanguin cercetat pentru stabilirea compatibilităţii transfuzionale; Sistemul de grup sanguin Rh este determinat în principal de asocierea a două gene D şi d, existând două fenotipuri caracteristice Rh+ (antigen D prezent) şi Rh- (antigen D absent);

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic

117

În mod natural anticorpii anti-D lipsesc atât la indivizii Rh+, cât şi la cei Rh-, ultimii începând producerea de astfel de anticorpi în urma contactului cu hematii Rh+; o situaţie cu implicaţii patologice este aceea prezentă la femeile Rh-, care au sarcini Rh+, când fătul poate fi afectat datorită trecerii transplacentare a anticorpilor anti-D produşi de mamă; în această situaţie după naştere poate apărea boala hemolitică a nou-născutului, caracterizată prin anemie, hepatosplenomegalie şi icter nuclear Sistemul MN este determinat în principal de două gene codominante M şi N, fiind caracterizat prin trei fneotipuri: M, N sau MN Sistemul Xg este caracterizat prin prezenţa sau absenţa de pe hematii a antigenului Xga, determinat de o pereche de gene alele Xga (dominantă) şi Xg (recesivă) care ocupă un locus situat pe cromosomul X; datorită acestei particularităţi femeile pot fi homo- sau heterozigote, în timp ce bărbaţii vor fi obligatoriu hemizigoţi; Caracterul secretor este determinat de o pereche de gene alele (Se şi se) aflate în relaţie de epistazie cu genele sistemului AB0; în prezenţa genei Se, antigenele AB0 de pe hematii devin hidrosolubile, trecând în secreţiile apoase ale organismului (fenotip secretor); persoanele cu genotip sese sunt considerate nesecretoare, antigenele AB0 fiind absente în secreţiile apoase; Caracterul gustător este determinat de o pereche de gene alele G şi g, implicate în existenţa unor praguri gustative diferite la persoane diferite;

C. VALOAREA TEORETICĂ ŞI PRACTICĂ A STUDIULUI CARACTERELOR EREDITARE NORMALE Studiul caracterelor ereditare normale are numeroase aplicaţii teoretice şi practice. Principalele puncte de interes teoretic, legate de studiul caracterelor ereditare normale, sunt: demonstrarea la om a valabilităţii legilor lui Mendel: “legea purităţii gameţilor” şi “legea segregării independente a genelor”; studiul funcţiei genice - analiza produşilor genei (proteine sau enzime) permite identificare pe de o parte a funcţiei genei analizate, iar pe de altă parte poate decela efectele existenţei unei mutaţii genice noi; evidenţierea la om a unor fenomene genetice, descoperite la alte specii, precum himerele, dubla fecundare, recombinarea genică, nedisjuncţia meiotică, ceea ce atestă universalitatea proceselor genetice, valabile atât cele mai simple organisme, cât şi la mamiferul cel mai evoluat – omul; studiile de înlănţuire genică între locusul unui caracter fenotipic normal (utilizat ca marker) şi locusul unui caracter morbid permit identificarea unor mutaţii noi şi sunt folosite pentru determinarea indirectă a poziţiei genelor necunoscute pe cromosomi şi implicit pentru realizarea hărţilor cromosomice Aplicaţiile practice ale studiului caracterelor ereditare normale sunt: Identificarea persoanelor – datorită existenţei a numeroase caractere monogenice normale şi a polimorfismului fenotipic al acestora probabilitatea ca doi indivizi (cu excepţia gemenilor monozigoţi, care provenind din aceeaşi celulă au aceleaşi gene) să fie identici din punct de vedere genetic minimă. Astfel, se poate spune că fiecare individ este un unicat biologic. Cu cât numărul de caractere monogenice investigate este mai mare, cu atât identificarea unei persoane este mai certă. Totuşi, datorită testării unui număr limitat

118

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic

de sisteme monogenice, stabilirea cu certitudine a identităţii unei persoane este de obicei imposibilă. În condiţiile determinării şi a polimorfismului HLA, probabilitatea de eroare se reduce foarte mult; Expertiza filiaţiei şi paternităţii – testele de filiaţie şi paternitate nu pot atesta că un copil aparţine unui anumit cuplu sau că un bărbat este tatăl unui anumit copil, datorită folosirii unui număr limitat ssiteme monogenice, aceste teste fiind doar teste de excludere; - astfel dacă un copil are grupa sanguină 0, iar unul dintre membrii cuplului parental are grupa sanguină A1B se poate declara că acel copil nu aparţine cuplului analizat; - de asemenea, dacă un bărbat are grupa sanguină A1B, iar copilul a cărui paternitate este contestată are grupul sanguin A2 se poate concluziona că acel bărbat nu poate fi tataăl copilului diagnosticul tipului de gemelaritate – utilizarea analizei mai multor sisteme monogenice permite să stabilim dacă doi gemeni sunt monozigoţi sau dizigoţi - în condiţiile în care un anumit caracter monogenic nu concordă la doi gemeni de acelaşi sex, în mod cert cuplul gemelar este dizigot; - în schimb, dacă toate determinările sunt concordante nu se poate stabili cu exactitate tipul de gemelaritate, dar cu cât numărul de sisteme analizate este mai mare, cu atât probabilitatea gemenilor de a fi monozigoţi este mai mare; stabilirea compatibilităţii între donator şi primitor în cazul transfuziilor sanguine şi a transplantelor de organe: - determinarea tipului d egrup sanguin AB0 şi Rh este obligatorie înaintea oricărei transfuzii de sânge, atât la donator, cât şi la primitor, pentru a preveni apariţia unor accidente posttransfuzionale, care pot determina chiar şi decesul persoanei transfuzate; - în cazul transplantelor de organe, pentru a preveni rejetul grefei, este obligatorie existenţa unei compatibilităţi în sistemul HLA între donator şi primitor (în special pentru genele A, B şi C); asocierea dintre anumite caracetre monogenice şi unele boli: - incompatibilitatea feto-maternă în sistemul Rh este implicată în patogenia bolii hemolitice a nou-născutului –determinarea fenotipului Rh, atât la femeia însărcinată cât şi la presupusul tată permite aplicarea unor măsuri de profilaxie primară; cunaşterea existenţei unei imunizări prealabile cu antigen D a femeii Rh- permite în schimb aplicarea unor măsuri de profilaxie secundară, cu scopul împiedicării apariţiei bolii hemolitice a nou-născutului; - în condiţiile în care este cunoscută existenţa unei înlănţuiri genice între locusul genei unui caracter monogenic normal şi cel al genei implicate într-o boală monogenică, se poate stabili, în mod indirect, prin studii de înlănţuire genică, prezenţa sau absenţa genei mutante la descendenţii unui cuplu cu risc; exemple de astfel de înlănţuiri sunt: - locusul pentru sistemul de grup sanguin Rh şi locusul genei elipsocitozei36; - locusul genelor HLA de clasă III şi locusul 21 hidroxilazei37;

36

Eliptocitoza este o formă de anemie hemolitică intravasculară, determinată de prezenţa unor hematii de formă ovalară, ceea ce favorizează distrugerea prematură a hematiilor şi formarea trombilor capilari; afecţiunea are o transmitere dominant autosomală şi este determinată de mutaţia genei α sau β spectrinei, gene localizate 1p36.2-p34, la fel ca şi genele sistemului de grup snaguin Rh

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic -

-

119

persoanele negustătoare au un risc crescut de a face hipotiroidie – unii compuşi naturali, similari feniltiocarbamidei, au acţiune antitiroidiană – persoanele negustătoare deoarece nu percep gustul amar al acestor compuşi pot dezvolta un mixedem ca urmare a consumului exagerat de produse vegetale ce conţin aceşti produşi38; persoanele cu genotip ZZ, MZ, SZ sau MS pentru α1-antitripsină au un risc crescut de a face emfizem pulmonar, poliartrită reumatoidă sau hepatică cronică; unele haplotipuri HLA sunt asociate cu anumite afecţiuni – explicaţia acestei asocieri nu este încă posibilă, dar depistarea unui anumit haplotip HLA la o persoană creşte riscul individului respectiv de a face boala; exemple de astfel de asocieri sunt: - diabet zaharat tip I - haplotipul HLA DR3 sau DR4; - spondilita ankilopoetică - haplotipul HLA B27; - hemocromatoză- haplotipul HLA A3.

II. APLICAŢII PRACTICE A. STABILIREA PATERNITĂŢII ŞI FILIAŢIEI Stabilirea paternităţii şi filiaţiei prin folosirea grupelor ABO se face ţinând cont de următoarele 4 reguli: Antigenele A1, A2 sau B nu pot fi prezente în sângele unui copil, dacă nu se găsesc în sângele unuia sau ambilor părinţi; un părinte AB trebuie să transmită copiilor gena A sau B şi nu poate avea copii cu grupa 0; persoană cu grupa 0 nu poate fi părintele unui copil cu grupa AB; dacă ambii părinţi sunt cu grupa 0, atunci toţi copii vor avea grupa 0. De la aceste reguli fac excepţie persoanele homozigote hh (fenotip Bombay) Ţinând cont de relaţiile genotip - fenotip şi de relaţiile dintre genele existente în sistemele de grup sanguin, precum şi de legile lui Mendel, se pot stabili raţionamentele necesare pentru rezolvarea următoarelor tipuri de probleme:

1. DETERMINAREA GRUPELOR SANGUINE POSIBILE LA COPII Exemplu: determinaţi care sunt grupele posibile şi imposibile la copiii unor părinţi cu grupele A1, respectiv B. Rezolvare: ştiind că grupul sanguin A1 al unui părinte poate fi determinat de unul din următoarele genotipuri: A1A1, A1A2 sau A10, iar grupul sanguin B al celuilalt părinte poate fi determinat de genotipurile BB sau B0, prin încrucişarea gameţilor posibili (purtători ai unei singure gene) la copil pot rezulta genotipurile sau fenotipurile prezentate în tabelul 6.10.:

Tabelul 6.10. Genotipurile şi fenotipurile copiilor unor părinţi cu grupe sanguin A1 şi B 37

21-hidroxilaza este o enzimă cheie în metabolizarea colesterolului la nivelul cortico-suprarenalei şi transformarea acestuia în gluco- sau mineralocorticoizi; deficitul enzimatic produce o afecţiune gravă caracterizată prin: nivel scăzut al glucocorticoizilor (hipoglicemie şi răspuns inadecvat la stres şi infecţii) nivel scăzut al mineralocorticoizilor (pierdere crescută de apă şi Na prin urină şi hipotensiune arterială) nivel crescut al androgenilor (masculinizarea prenatală atât a feţilor de sex masculin, cât şi a celor de sex feminin) şi nivel crescut al ACTH-ului prin feed-back negativ (hiperplazie congenitală a corticosuprarenalelor) 38 tiocarbamida este folosită în tratamentul hipertiroidiilor datorită limitării sintezei de hormoni tiroidieni

120

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic

Încrucişări parentale A1A1 x BB A1A1 x B0 A1A2 x BB A1A2 x B0 A10 x BB A10 x B0

Fenotip copii

Gameţi

Genotip copii

A1 + B A1 + B sau 0 A1 sau A2+ B A1 sau A2+ B sau 0 A1 sau 0+ B A1 sau 0+ B sau 0

A1B A10 sau B0 A1B sau A2B A10, A20, A1B sau A2B A1B sau B0 A10, A1B, B0 sau 00

A1B A1 sau B A1B sau A2B A1, A2, A1B sau A2B A1B sau B A1, A1B, B sau 0

Teoretic, se poate remarca faptul că din încrucişarea acestor părinţi se pot obţine copii având oricare din cele 6 grupe – A1, A2, B, 0, A1B, A2B, deşi unele genotipuri sunt imposibile: A1A1, A1A2, A2A2, BB. Este evident că problema de mai sus este o problemă teoretică, în care au fost luate în considerare toate variantele genotipice parentale posibile. În realitate, un individ nu poate avea în acelaşi timp mai multe genotipuri.

2 DETERMINAREA GRUPELOR SANGUINE POSIBILE LA PĂRINŢI Exemplu: determinaţi grupele posibile ale părinţilor unui copil cu grupa A2. Rezolvare: un copil cu grupa A2 poate avea teoretic genotipuril A2A2 sau A2O. Ţinând cont de legelile lui Mendel, este clar că una dintre gene vine de la mamă, iar cealaltă de la tată, asocierile parentale posibile fiind prezentate în tabelul 6.11.

Tabelul 6.11. Genotipuri şi fenotipuri posibile la părinţii unui copil cu grup sanguin A2 Genotip copil A2A2 Gameţi parentali A2

A2 Genotipuri părinţi A2A2, A20, A1A2, A2B A2A2, A20, A1A2, A2B

A20 Gameţi parentali A2

0 Genotipuri părinţi 00, A10, A20, B0 A2A2, A20, A1A2, A2B Fenotipuri părinţi Fenotipuri părinţi A2, A1, A2B A2, A1, A2B A2, A1, A2B 0, A1, A2, B Din tabelul 6.11. se observă că pot exista două tipuri de asocieri parentale: fiecare dintre părinţi poate avea grupele sanguine A2, A1, sau A2B; unul dintre părinţi poate avea grupele sanguine A2, A1, sau A2B, în timp ce celălalt părinte poate avea grupele sanguine 0, A1, A2, sau B.

3. DETERMINAREA FILIAŢIEI ŞI PATERNITĂŢII 

Stabilirea fenotipurilor posibile ale tatălui, când sunt cunoscute fenotipurile mamei şi copilului. Exemplu: o mamă A1 are un copil cu grupa B; stabiliţi grupele posibile ale tatălui. Rezolvare: în condiţiile în care mama are grupa sanguină A1, genotipurile posibile materne sunt A1A1, A1A2, A10; deoarece copilul are grupa sanguină B, genotipurile posibile ale acestuia sunt BB sau B0; ştiind că orice copil moşteneşte o genă de la mamă şi una de la tată, este clar că de la mamă acest copil a primit gena 0, genotipul său fiind B0, iar cel al mamei A10; în aceste condiţii, copilul moşteneşte obligatoriu de la tată gena B, genotipurile posibile ale tatălui fiind BB, B0, A1B sau A2B, fenotipurile corespunzătoare fiind: B A1B şi A2B (figura 6.3.). BB, B0 A1A1 B, A1B, A1 A1B A1A2 A2B A2B A10

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic

121

Figura 6.3. Identificarea genotipurilor şi fenotipurilor paterne în sistemul de grup sanguin AB0, când sunt cunoscute fenotipurile mamei şi copilului 

Stabilirea legitimităţii unui copil când se cunoaşte fenotipul acestuia, al părinţilor săi şi al unui frate mai mare considerat legitim. Noţiunea de “legitim” se referă întotdeauna la tatăl copilului, deoarece mama copilului este în general cunoscută, una dintre genele ei regăsindu-se obligatoriu în genotipul copilului; în rarele cazuri în care mama poate fi nelegitimă (genotipul copilului nu are gene materne), este vorba întotdeauna despre un copil adoptat voluntar sau involuntar (schimbat la maternitate). Exemplu: tatăl este A1, mama este B, ei au 6 copii în ordinea următoare: A1, A2, B, O, A1B, A2B. Considerând primul copil sigur legitim, care dintre ceilalţi copii sunt legitimi. Rezolvare:  teoretic tatăl poate avea genotipurile: A1A1, A1A2, A10, iar mama poae avea genotipurile BB sau B0  dacă primul copil este sigur legitim şi are grupul sanguin A1, ţinând cont de fenotipul mamei înseamnă că genotipul său este A1O, iar cel al mamei sale BO  tatăl poate avea oricare din genotipurile grupei A1;  dacă al doilea copil, grup sanguin A2, este legitim, tatăl are obligatoriu genotipul A1A2;  în aceste condiţii, copiii cu grupa sanguină B şi O nu pot fi legitimi, deoarece ar trebui să moştenească de la tată gena 0, în timp ce copiii cu grupe sanguine A1B şi A2B sunt legitimi (figura 6.4.). În cazul familiei de mai sus dacă se consideră ca sigur legitim copilul 4, grup sanguin O, părinţii săi vor fi A1O şi BO, nelegitimi fiind copiii 2 (A2 ) şi 6 (A2B).

B. DETERMINAREA COMPATIBILITĂŢII TRANSFUZIONALE Determinarea compatibilităţii transfuzionale se realizează în funcţie de proporţia de antigene pe care donatorul şi primitorul le au în comun. Acelaşi principiu este valabil şi pentru antigenele sistemului HLA în cazul transplantelor de ţesuturi sau organe. Pentru stabilirea compatibilităţii transfuzionale esenţiale sunt determinarea antigenelor AB0 şi Rh, celălalte sisteme nefiind importante, datorită antigenicităţii reduse. Determinarea grupelor sanguine în sistemele AB0 şi Rh: principiul metodei – determinarea prezenţei unor antigene specifice pe hematiile indivizilor investigaţi se face pe baza reacţiei antigen-anticorp, produse la contactul dintre eritrocitele testate şi diverse tipuri de ser

BB B0

A1

B

A2

A1

B

0

A1A1 A1A2 A10

A1B

A2B

122

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic

Figura 6.4. Stabilirea legitimităţii copiilor unui cuplu metodologie se recoltează câteva picături de sânge prin puncţie capilară, respectându-se principiile asepsiei; sângele recoltat este pus în contact cu ser ce conţine anticorpi α, β şi anti-D interpretarea rezultatelor dacă se produce aglutinare numai la contact cu ser α, înseamnă că persoana are grupa A1 sau A2, având pe hematii antigen A39; dacă se produce aglutinare numai la contact cu ser β, înseamnă că persoana are grupa B, având pe hematii antigen B; dacă se produce aglutinare la contact cu ser α şi β, înseamnă că persoana are grupa A1B sau A2B, având pe hematii atât antigen A, cât şi antigen B; dacă nu se produce aglutinare la contact cu ser α şi β, înseamnă că persoana are grupa 0, neavând pe hematii nici antigen A, nici antigen B; dacă se produce aglutinare la contact cu ser anti-D, înseamnă că persoana are grupa Rh+, având pe hematii antigen D. O problemă esenţială în cazul transfuziilor de sânge este legată de obligativitatea determinării grupei sanguine, atât a donatorului, cât şi a primitorului, înainte de efectuarea transfuziei. În cazul efectuării transfuziei de sânge este preferabilă administrarea de sânge izogrup AB0 şi Rh. În condiţii de urgenţă şi când volumul de sânge transfuzat nu depăşeşte 500 mL, este acceptabilă administrarea de sânge 0, fără a se ţine cont de grupa Rh. Totuşi, dacă persoana este Rh- şi a fost imunizată în prealabil cu antigen D, atunci obligatoriu trebuie să primească sânge Rh-.

C. DETERMINAREA STATUSULUI SECRETOR Principiul metodei constă în evidenţierea aglutinării antigenelor A, B, H de către aglutininele corespunzătoare, prezente în serul test. Evidenţierea se realizează prin adăugarea de hematii corespunzătoare grupului sanguin al probantului. Materialul necesar este reprezentat de rondele de hârtie de filtru (Ø = 5 mm) sterile, pense, lame de microscopie curate, ser test A, B, 0; concentrat de hematii de grup A, B, AB şi 0 în diluţie 3-5% ; micropipete. Modul de lucru este următorul se stabileşte grupul sanguin al probantului; se îmbibă bine cu salivă o rondelă de hârtie, manevrându-se cu pensa, după care se pune pe o lamă de microscopie; peste rondelă se adaugă 1 ml de ser test ce conţine aglutinine care reacţionează cu antigenele specifice grupului sanguin al probantului: pentru o persoană cu grup sanguin A se foloseşte ser B, care conţine aglutinine α; pentru o persoană cu grup sanguin B se foloseşte ser A, care conţine aglutinine β; pentru o persoană cu grup sanguin AB se foloseşte ser 0, care conţine aglutinine α şi β; pentru o persoană cu grup sanguin 0 se foloseşte ser anti-H, recoltat de la un individ cu grup sanguin AB; lama de microscopie se ţine 10 minute la temperatura camerei, pentru a permite desfăşurarea eventualei reacţii de aglutinare; reacţia de aglutinarea se evidenţiază indirect: peste rondele se pune 1 ml de suspensie de hematii izogrup cu probantul;

39

Determinarea prezenţei antigenului A1 sau A2 este posibilă doar în condiţii speciale de dotare

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic

123

se aşteaptă 10 minute, pentru realizarea posibilei reacţii Ag-Ac; interpretarea rezultatelor se face în modul următor: prezenţa aglutinării indică statusul nesecretor - în salivă nu există antigene AB0, astfel încât anticorpii din serul test rămân activi şi reacţionează cu antigenele din suspensia eritrocitară; absenţa aglutinării indică statusul secretor – în salivă există antigene AB0, care aglutinează în prezenţa anticorpilor din serul test, iar la adăugarea suspensiei eritrocitare antigenele nu sunt aglutinate, deoarece nu mai există anticorpi liberi.

D. DETERMINAREA SENSIBILITĂŢII GUSTATIVE LA FENILTIOCARBAMIDĂ Principiul metodei constă în aplicarea pe limbă, în mod seriat, a unor soluţii cu concentraţie crescândă de feniltiocarbamidă - PTC (phenylthiocarbamide) pentru a evidenţia pragul percepţiei gustative amare. Materialul necesar: 7 soluţii de PTC (soluţia 1 - 1300 mg%; soluţia 2 - 325 mg%; soluţia 3 81,25 mg%; soluţia 4 - 20,32 mg%; soluţia 5 - 5,08 mg%; soluţia 6 - 1,27 mg%; soluţia 7 - 0,32 mg%) obţinute prin diluări succesive de ¼ ale unei soluţii de bază cu o concentraţie de 1,3 g%, şapte pipete, două pahare cu apă distilată. Modul de lucru: se aplică cu pipeta, pe limba persoanei testate, 1-2 picături din soluţia cea mai diluată de PTC (soluţia 7); dacă persoana nu percepe un gust amar distinct, se trece la soluţiile următoare din ce în ce mai concentrate, până ce individul identifică gustul specific al feniltiocarbamidei; soluţia cea mai diluată, percepută amar în comparaţie cu apa, este soluţia prag probabilă. Pentru stabilirea riguroasă a pragului real subiectul trebuie să guste din cele două soluţii cu concentraţii adiacente soluţiei la care a perceput gustul amar, fiecare probă fiind urmată de clătirea gurii cu apă.

III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR A. DEFINIŢI NOŢIUNILE URMĂTOARE: Genă alelă Haplotip Recesivitate Codominanţă Aglutinogen Aglutinină Negustător Gustător Nesecretor Grup seric Boala hemolitică a nou-născutului

Dominanţă Epistazie Sistem hla Secretor Fenotip Bombay

B. INTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. 2. 3. 4. 5.

De ce caracterele ereditare monogenice se transmit conform legilor lui Mendel? Ce reprezintă termenul de locus? Dar cel de gene alele? Care sunt diferenţele dintre termenii: polialelie şi poligenie? Ce antigene AB0 prezintă un individ cu grup sanguin A1? Dar unul cu grup sanguin B? În cazul sistemului de grup sanguin AB0, un anumit antigen şi anticorpul corespunzător se exclud reciproc. Este valabil acest lucru şi în cazul sistemului de grup sanguin Rh? 6. De ce o persoană cu grup sanguin 0 este considerată donator universal? 7. De ce o persoană cu grup sanguin AB este considerată primitor universal? 8. Care sunt particularităţile fenotipului Bombay? 9. Care sunt semnele şi simptomele bolii hemolitice a nou-născutului? 10. Poate fi prevenită boala heolitică a nou-născutului? Explicaţi opţiunea Dv.

124

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic

11. De ce genele sistemului HLA se transmit în bloc de la părinţi la copii? 12. Care este cel mai polimorf sistem monogenic prezent la specia umană? 13. Este adevărată afirmaţia: “genele pentru caracterul gustător se află în relaţie de epistazie cu genele sistemului de grup sanguin ABO”? Cu care gene se află în relaţie de epistazie genele AB0? 14. Ce relaţie există între genele haptoglobinelor?

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPL| I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun din cele enunţate ("complement simplu"): 1. O femeie are un copil care a avut boala hemolitică a nou-născutului, iar soţul său a prezentat şi el boala în copilărie. Ce risc are cuplul de a avea un alt copil afectat? A. 100%; B. 75%; C. 50%; D. 25%; E. 0% 2. O femeie cu grupele sanguine A1, MN a născut doi copii gemeni: unul cu grupele A1, M, iar celălalt cu grupele AB, MN. Care dintre următorii bărbaţi poate fi tatăl copiilor? A. A1, N; B. O,MN C. A1B, M; D. A1,N; E. A2B, N. 3. Ce grupe sanguine în sistemul Xg vor avea copiii următorului cuplu: mama: Xg(a+); tata: Xg(a-) ? A.Toţi copiii Xg(a+); B.Fetele Xg(a-) şi băieţii Xg(a+); C.Fetele Xg(a+) şi băieţii Xg(a-); D. Copii Xg(a+) sau Xg(a-) în funcţie de genotipul mamei; E. Fetele Xg(a+) sau Xg(a-) în funcţie de genotipul mamei şi băieţii numai Xg(a-). 4. Un copil gustător homozigot are ambele bunici negustătoare. Care sunt genotipurile parinţilor? A. GG şi GG; B. gg şi gg; C. Gg şi GG D. Gg şi gg; E. Gg şi Gg. 5. O pacientă are cariotipul 47,XXX; ea are grupa sanguină Xg(a-). Tatăl ei are grupa sanguină Xg(a-), iar mama ei este Xg(a+); bunica maternă a pacientei a avut grupa sanguină Xg(a-). Stabiliţi când a avut loc nedisjuncţia meiotică ce a determinat anomalia cromosomică existentă în cariotipul pacientei, A. În cursul primei diviziuni în meioza paternă; B. În cursul primei diviziuni în meioza maternă; C. În cursul diviziunii ecvaţionale a meiozei paterne; D. În cursul celei de-a doua diviziuni meiotice materne; E. În cursul primei sau al celei de-a doua diviziuni meiotice materne. II. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("complement grupat"): A - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3; B - dacă sunt corecte răspunsurile 1,3; C - dacă sunt corecte răspunsurile 2,4; D - dacă este corect răspunsul 4; E - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3,4. 6. În cadrul unei familii, tatăl are grupa A2 şi este Rh+, mama este O, Rh-, iar cei patru copii au, în ordine, următoarele fenotipuri: - primul - O, Rh+; al doilea - O, Rh-; al treilea - A2, Rh+ - ; al patrulea A2, Rh- . Care dintre propoziţiile următoare sunt corecte? 1. genotipul tatălui este A2O, Dd; 2. genotipul tatălui este A2A2, Dd; 3. proporţia teoretică pentru fiecare fenotip dintre cele ale descendenţilor este de 25%; 4. la cea de a doua sarcină este posibilă apariţia unui accident de incompatibilitate feto-maternă. 7. Analizaţi familia de mai jos şi stabiliţi care copii sunt nelegitimi; mama este A2, M, se, iar tatăl este B, MN, Se (mama sa a fost se). Copiii au următoarele fenotipuri: 1. A2B, MN, Se; 3. A2, M, se; 2. B, N, Se; 4. A1B, MN, se. 8. In situaţia de mai jos care dintre copiii cuplului sunt nelegitimi ştiind ca bunica lor materna a avut grupa O şi a fost nesecretoare?

Caractere ereditare normale cu determinism monogenic

125

Mama: A1, Rh+, N, Se, Hp 2-2; Tata: B, Rh-, MN, se, Hp 1-2 (părinţii au fost A1B şi A2B); Copii: 1. A1B, Rh-, MN, se, Hp 1-2; 2. O, Rh-, MN, se, Hp 2-2; 3. B, Rh+, N, Se, Hp 2-2; 4. B, Rh+, M, Se, Hp 1-1. 9. Care dintre următoarele propoziţii referitoare la transmiterea grupelor sanguine sunt corecte? 1. transmiterea în sistemul sanguin ABO se face după legile monohibridării; 2. dacă o femeie cu grupa A1B naşte un copil cu cu grupa A1, nu se poate face excluderea de la paternitate folosind numai sistemul ABO; 3. doi părinţi Rh+ pot avea copii Rh-; 4. doi părinţi având grupele A1, respectiv B nu pot avea copii cu grupa sanguină A2B. 10.

În următoarea situaţie precizaţi care femeie poate fi mama copilului: tata: B, M , Rh+, Xg(a+) copilul (băiat): A1B, MN, Rh-, Xg(a-) femei: 1. B, MN, Rh-, Xg(a+) 2. A2B, N, Rh-, Xg(a+) 3. A1B, M, Rh-, Xg(a+) 4. A1 , MN, Rh+, Xg(a+) .

III. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("teste tip cauză-efect"): A - dacă ambele propoziţii sunt adevărate şi între ele există relaţie cauză-efect; B - dacă ambele propoziţii sunt adevărate, dar între ele nu există relaţie cauză-efect; C - dacă prima propoziţie este adevărată, iar a doua falsă; D - dacă prima propoziţie este falsă, iar a doua este adevărată; E - dacă ambele propoziţii sunt false. 10. O persoană cu fenotip Bombay nu prezintă în salivă antigenele sistemului ABO deoarece în absenţa genei H, antigenele sistemului ABO nu pot fi transformate din stare liposolubilă în stare hidrosolubilă. 11. Antigenele sistemului ABO se găsesc la unele persoane şi în salivă deoarece antigenele ABO de pe suprafaţa hematiilor sunt liposolubile. IV. Asociaţi enunţurilor din coloana din stânga, notate cu cifre, enunţurile corespunzătoare din coloana din dreapta, notate cu litere: 12. Într-o maternitate s-au încurcat brasardele care identificau nou-născuţii. Identificaţi cărui cuplu aparţin fiecare dintre următorii copii? COPII: PĂRINŢI A. A1, M, Hp1-1, Se / B, MN, Hp1-2, Se. 1. O, MN, Hp1-1, Se. B. B, N, Hp1-2, Se / A1B, N, Hp2-2, se. 2 A1B, N, Hp1-2, Se. 3. A2, MN, Hp1-1, Se. C. O, M, Hp1-2, se /A2, N, Hp2-2, Se. D. A2, M, Hp2-2, se / B, MN, Hp2-2, se. 4. O, N, Hp1-2, se. E. B, N, Hp1-2, se / B, MN, Hp1-2, se. 5. A2B, M, Hp2-2, se. 13. La o maternitate s-au încurcat brasardele care identificau nou-născuţii. Determinaţi cărei familii aparţine fiecare dintre următorii copii: COPII: PARINŢI: 1. 0, M, Rh+, G; A. 0, MN, Rh-, g / A1, MN, Rh-, g; 2. A1, MN, Rh-, g; B. A1, M, Rh-, G / A2B, M, Rh-, G; 3. 0, N, Rh-, G; C. A2, MN, Rh+, G / B, N, Rh-, g; 4. A1B, M, Rh-, G; D. A1B, M, Rh+, g / A1, M, Rh+, g; 5. A1B, M, Rh+, g; E. B, MN, Rh+, g / A2, M, Rh-, G.

7. TRANSMITEREA EREDITARÃ A CARACTERELOR MONOGENICE ANORMALE. BOLI MONOGENICE. I. DATE TEORETICE A. GENERALITĂŢI Factorii mutageni externi fizici, chimici, biologici, pot modifica accidental structura materialului genetic (secvenţa deoxiribonucleotidelor dintr-o moleculă de ADN). Modificările permanente ale genelor, care se pot propaga (transmite) de la o generaţie de organisme la alta, sunt denumite mutaţii. Mutaţiile determină modificarea caracterului produs de o anumită genă. De multe ori, mutaţia unei gene poate modifica atât de mult expresia unui caracter (absenţa unei enzime, producerea unei proteine toxice, etc.) încât se ajunge la un fenotip anormal - boală genetică. Bolile monogenice sunt produse prin mutaţii care afectează o singură pereche de gene alele. Bolile monogenice sunt caracterizate prin fenotipuri anormale, determinate exclusiv de factorii ereditari. Ele reprezintă o parte importantă a patologiei genetice, deoarece sunt numeroase - peste 4.500 de entităţi clinice distincte, per ansamblu sunt relativ frecvente – afectând 1-2% dintre nou-născuţii vii - şi au un impact deosebit asupra individului şi familiei sale, fiind boli cronice, cu risc ridicat de recurenţă la descendenţi. Transmiterea ereditară a caracterelor determinate de perechi de factori ereditari a fost studiată şi descrisă de Gregor Mendel. Bolile monogenice prezintă toate particularităţile caracterelor ereditare descrise de Mendel. Identificarea unuia dintre tipurile mendeliene de transmitere genealogică pentru o anumită boală ereditară permite, de obicei, evaluarea corectă a riscului de recurenţă (de reapariţie) al afecţiunii la alţi membri ai familiei. De aceea, dacă o boală ereditară este prezentă într-o anumită familie, investigaţia genetică presupune în primul rând efectuarea anamnezei familiale şi a arborelui genealogic (vezi capitolul „Consultul genetic”). Pe baza arborelui genealogic, folosind criterii specifice fiecărui tip, se poate stabili modul de transmitere monogenic al afecţiunii: dominant sau recesiv, autosomal sau legat de cromosomul X. Cel mai frecvent însă, transmiterea mendeliană este stabilită pe baza asocierii unui anumit diagnostic clinic cu un tip de transmitere compatibil (care corespunde datelor din literatur de specialitate). Evaluarea tipului de transmitere ereditară a unei boli genetice poate fi extrem de dificilă, datorită manifestărilor variabile ale mutaţiilor şi fenomenului de heterogenitate genetică40. Bolile care se transmit genealogic după criterii mendeliene sunt prezentate într-un 40

Heterogenitatea genetică – fenomenul genetic prin care genotipuri diferite determină fenotipuri identice sau asemănătoare

134

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

vast catalog – „Mendelian Inheritance in Man” (ed. 12, 1998), realizat de un colectiv de cercetători condus de Victor McKusick, de la Johns Hopkins University, fapt care uşurează mult efortul geneticianului de a stabili un diagnostic corect (tabelul 7.1.). Tabelul 7.1. Exemple de boli monogenice. TIP DE TRANSMITERE Dominant Autosomal

Dominant legat cromosomul X (rare)

Recesiv Autosomal

de

EXEMPLE DE BOLI MONOGENICE Boli cu afectare neurologică sau musculară Coreea Huntington Boala Steinert (distrofia miotonică) Boli cu afectare scheletică Acondroplazia Osteogenesis imperfecta Brahidactilia Boli cu afectare cardiovasculară Hipercolesterolemia familială Sindromul Marfan Boli cu afectare oculară Hemeralopia Aniridia Boli cu afectare renală Boala polichistică renală cu transmitere dominant autosomală (ADPKD) Sindromul Alport Boli cu afectare cutanată Epidermoliza buloasă Ihtioza vulgară Hipercheratoza palmo-plantară Boli hematologice Boala von Willebrand Microsferocitoza ereditară Minkowski-Chauffard Cancere ereditare Cancerul de sân Cancerul de colon nonpolipozic Polipoza colică familială Retinoblastomul Boli cu afectare neurologică Sindromul Rett Boli cu afectare scheletică Rahitismul hipofosfatemic (rezistent la vitamina D) Boli cu afectare cutanată Incontinentia pigmenti Sindromul Goltz Boli metabolice Glicogenozele, Galactozemia Sindromul Morquio, Sindromul Hurler Boala Niemann-Pick, Boala Gaucher Aminoacidopatii: Fenilcetonuria, Homocistinuria Boli hematologice Hemoglobinopatii: Drepanocitoza, Beta-talasemia Boli cu afectare cutanată Albinismul oculo-cutanat Xeroderma pigmentosum Boli cu afectare pulmonară

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale TIP DE TRANSMITERE

Recesiv legat cromosomul X

de

135

EXEMPLE DE BOLI MONOGENICE Mucoviscidoza Boli cu afectarea organelor de simţ Retinopatia pigmentară Surditatea congenitală Boli cu afectare musculară Distrofia musculară Duchenne / Becker Boli cu afectare hematologică Hemofilia A şi B Deficitul de G6PD Boli cu afectare oculară Albinismul ocular Discromatopsiile (daltonismul) Boli metabolice Boala Lesch-Nyhan Boala Hunter Diabetul insipid nefrogen

În acest capitol genele mutante anormale vor fi notate simbolic cu „A”, dacă sunt dominante, respectiv cu „a” dacă sunt recesive. În raport cu gena mutantă A, respectiv a, variantele alelice normale corespunzătoare vor fi notate cu „n” (genă normală recesivă) respectiv „N” (genă normală dominantă).

B. TRANSMITEREA DOMINANTĂ O boală genetică este considerată dominantă în situaţia în care se manifestă atât la homozigoţi, cât şi la heterozigoţi. Alterarea unei singure alele duce la apariţia fenotipului anormal la heterozigoţi prin diferite mecanisme: haploinsuficienţă – când singura genă normală nu produce o cantitate de proteină suficientă pentru realizarea funcţiilor celulare; câştig de funcţie – când proteina mutantă este produsă în cantităţi prea mari, uneori ectopic sau are o activitate funcţională crescută; sinteză de proteine toxice sau cu alte funcţii fiziologice decât cea normală; efecte dominante negative – când proteina anormală face parte din complexe multimerice şi interferă chiar cu funcţia proteinei normale. Bolile dominante sunt boli rare (cele mai frecvente au o incidenţă de 1:1.000 indivizi), iar căsătoriile între bolnavi sunt foarte rare, exceptând căsătoriile asortative, precum cele dintre doi bolnavi de acondroplazie sau doi surzi. Astfel, homozigoţii afectaţi sunt extrem de rari. În plus, deseori homozigoţii pentru alela mutantă sunt mai grav afectaţi decât heterozigoţii dominanţă incompletă (ex. hipercolesterolemia familială) sau sunt neviabili (ex. acondroplazia). În consecinţă, în majoritatea cazurilor, bolnavii cu afecţiuni dominante sunt heterozigoţi (cu o singură alelă mutantă) sau hemizigoţi (tabelul 7.2.). Tabel 7.2. Corelaţia între genotip şi fenotip în cazul bolilor dominante Transmiterea dominantă autosomală AA nn An Genotipuri Fenotipuri

Bolnavi

Sănătoşi

Transmiterea dominant legată de cromosomul X X AX A XnXn A n X X XnY A X Y Bolnavi Sănătoşi

136

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

Au fost identificate boli dominante determinate de mutaţii la nivelul unor loci genetici de pe autosomi (boli dominante autosomale) sau de mutaţii la nivelul unor loci de pe cromosomul X (boli dominante legate de cromosomul X, gonosomale). Bolile dominante pot fi recunoscute cu uşurinţă prin examinarea arborelui genealogic al unei familii întrucât prezintă următoarele caracteristici: a. Număr mare de bolnavi în familie. Frecvenţa bolii se apreciază comparând numărul bolnavilor cu numărul indivizilor sănătoşi. În familiile cu boli dominante, frecvenţa bolnavilor este mare deoarece toţi indivizii care au gena anormală (AA, An sau XAXA, XAXn, XAY) sunt bolnavi. b. Continuitatea transmiterii bolii din generaţie în generaţie - transmitere genealogică verticală. Continuitatea transmiterii se apreciază urmărind pe verticală, în arborele genealogic, apariţia indivizilor bolnavi. De obicei, bolile dominante au o transmitere continuă deoarece toţi indivizii bolnavi pot transmite gena anormală unora dintre descendenţi, iar orice bolnav moşteneşte afecţiunea de la unul dintre părinţi. c. Doi părinţi sănătoşi nu pot avea copii bolnavi. În bolile dominante cu penetranţă completă, doi părinţi sănătoşi (nn sau XnXn, XnY) nu pot avea copii bolnavi deoarece, neavând genele anormale, nu le pot transmite copiilor lor. Interacţiunile între gene nealele şi factorii de mediu determină uneori o expresivitate variabilă a mutaţiilor sau o penetranţă incompletă (vezi subcapitolul D) şi pot duce aparent la „salturi” peste o generaţie şi naşterea unui copil bolnav (cu o boală dominantă) din părinţi sănătoşi. d. Doi părinţi bolnavi pot avea copii sănătoşi. În familiile cu boli dominante, dacă ambii părinţi bolnavi sunt heterozigoţi (An boli autosomale) sau mama este heterozigotă (XAXn boli legate de cromosomul X), ei pot transmite genele normale unora dintre descendenţi şi pot avea copii sănătoşi (vezi tabelele 7.3. şi 7.4.). Această situaţie este rară, fiind întâlnită doar în asocierile preferenţiale în care partenerii au acelaşi handicap. e. Consanguinitate absentă sau redusă. Consanguinitatea (căsătoria între persoane cu fond genetic comun – înrudite) nu are importanţă în bolile dominante deoarece un individ bolnav poate avea copii bolnavi, indiferent dacă se căsătoreşte cu o persoană sănătoasă neînrudită sau cu o persoană din aceeaşi familie.

1. TRANSMITEREA DOMINANTĂ AUTOSOMALĂ Bolile dominante autosomale sunt consecinţa mutaţiilor dominante produse la nivelul unor loci de pe autosomi (perechile de cromosomi 1-22). Există numeroase afecţiuni de acest tip, iar unele boli dominante autosomale sunt frecvente (de exemplu, hipercolesterolemia familială afectează 1:500 indivizi, iar boala polichistică renală transmisă dominant autosomal afectează 1:1.000 indivizi în populaţia caucaziană). Ambele sexe sunt afectate în proporţii relativ egale, bolnavii fiind în mare majoritate heterozigoţi. Analiza transmiterii bolilor dominante autosomale în diferite familii (vezi arborele genealogic din figura 7.1.) şi a tuturor combinaţiilor parentale posibile (tabelul 7.3.) a permis identificarea caracteristicilor acestui tip de afecţiuni.

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

137

Figura 7.1. Arbore genealogic sugestiv pentru o boală ereditară dominantă autosomală Tabelul 7.3. Bolile dominante autosomale: cupluri parentale şi descendenţii lor Încrucişări parentale

Genotipuri parentale

Gameţi

Genotipuri copii (proporţii)

Fenotipuri copii (proporţii)

Ambii părinţi sunt sănătoşi Un părinte bolnav (heterozigot) şi un părinte sănătos Un părinte bolnav (homozigot) şi un părinte sănătos Ambii părinţi sunt bolnavi (heterozigoţi)

nn + nn

nxn

An + nn

(A + n) x n Axn

nn (toţi) An (1/2) nn (1/2)

sănătoşi (toţi) bolnavi (1/2) sănătoşi (1/2)

An (toţi)

bolnavi (toţi)

AA (1/4) An (1/2) nn (1/4) AA (1/2) An (1/2) AA (toţi)

bolnavi (3/4)

AA + nn An + An

Ambii părinţi sunt bolnavi AA + An (homozigot + heterozigot) Ambii părinţi sunt bolnavi AA + AA (homozigoţi) a.

b. c. d. e. f.

g.

(A + n) x (A + n) A x (A + n) AxA

sănătoşi (1/4) bolnavi (toţi) bolnavi (toţi)

Bolile dominant autosomale se particularizează prin: Orice bolnav moşteneşte afecţiunea de la unul dintre părinţi. Transmiterea genealogică a afecţiunii este verticală, continuă. Doi părinţi sănătoşi nu pot avea copii bolnavi deoarece nu posedă gena anormală. Excepţii de la această regulă apar în afecţiunile dominante autosomale caracterizate prin penetranţă incompletă sau când mutaţia s-a produs în celulele liniei germinale ale unuia dintre părinţi. Bărbaţii şi femeile sunt afectaţi în proporţii egale. Atât bărbaţii, cât şi femeile pot transmite afecţiunea la descendenţii lor. Doi părinţi cu aceeaşi boală dominantă pot avea copii sănătoşi şi băieţi şi fete. Bărbaţii bolnavi pot transmite boala fiilor lor (transmitere tată – fiu posibilă) dovadă că gena mutantă nu se găseşte pe cromosomul X, pe care băieţii îl moştenesc de la mame. Bărbaţii bolnavi (heterozigoţi) pot avea fiice sănătoase (indiferent dacă mama este sănătoasă sau bolnavă – heterozigotă). Naşterea unei fete perfect sănătoase, când tatăl este afectat, este o dovadă a faptului că gena mutantă se găseşte pe alt cromosom decât cromosomul X. Riscul de recurenţă a bolii la descendenţii unui pacient (indiferent de sex) cu o boală dominantă autosomală este în general de 50%. Deoarece pacienţii cu boli dominante

138

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale autosomale sunt în majoritate heterozigoţi (cu o alelă normală şi una mutantă) probabilitatea ca un gamet să conţină la nivelul locusului respectiv gena mutantă este de 1/2 (50%). Dacă partenerul de cuplu este sănătos, el are gameţi doar cu alela normală, existând o probabilitate (risc) de 1/2 (50%) ca orice sarcină să ducă la naşterea unui copil afectat (heterozigot) (tabelul 7.4.), indiferent de sexul acestuia.

Tabelul 7.4. Tabelul Punett pentru calculul riscului de recurenţă pentru boli dominante autosomale (un părinte afectat)

Tată

Mama A

n An

n An

n

nn

nn

2. TRANSMITEREA DOMINANTĂ LEGATĂ DE CROMOSOMUL X Bolile numite gonosomale sunt consecinţa mutaţiilor genelor situate pe cromosomul X (genele situate pe cromosomul Y sunt în majoritate implicate în procesul de sexualizare şi până în prezent nu au fost identificate mutaţii care să determine boli ereditare). Sunt cunoscute puţine boli legate de cromosomul X care să fie consecinţa unor mutaţii dominante (un exemplu fiind rahitismul hipofosfatemic, rezistent la vitamina D). În cazul bolilor dominante gonosomale, atât femeile, cât şi bărbaţii pot fi afectaţi, dar, în timp ce femeile bolnave sunt de obicei heterozigote (au o alelă normală şi una mutantă) bărbaţii bolnavi sunt hemizigoţi (au numai alela mutantă, deoarece au un singur cromosom X). Datorită procesului de inactivare întâmplătoare a unuia dintre cromosomii X, femeile heterozigote pentru o anumită mutaţie dominantă a unei gene de pe cromosomul X vor avea un tablou clinic extrem de variat. Unele boli dominante gonosomale se manifestă doar la femei (de exemplu incontinentia pigmenti), fiind letale pentru embrionii de sex masculin fapt evidenţiat de excesul de avorturi spontane (figurile 7.2. şi 7.3., tabelul 7.5.). Analiza transmiterii bolilor dominante gonosomale în diferite familii (vezi arborele genealogic din figura 7.2.) şi a tuturor combinaţiilor parentale posibile (tabelul 7.5.) a permis identificarea caracteristicilor acestui tip de afecţiuni. Particularităţile bolilor cu transmitere dominantă legată de cromosomul X sunt : a. Orice bolnav moşteneşte afecţiunea de la unul dintre părinţi. Transmiterea genealogică a afecţiunii este verticală, continuă, specifică bolilor dominante. Doi părinţi sănătoşi nu pot avea copii bolnavi deoarece nu posedă gena anormală. b. Atât femeile, cât şi bărbaţii pot fi afectaţi, dar există o predominanţă a femeilor bolnave (aproximativ 2:1 faţă de bărbaţii bolnavi). c. Atât femeile, cât şi bărbaţii pot transmite afecţiunea la descendenţi, dar riscul de recurenţă depinde de sexul acestora. d. Doi părinţi bolnavi pot avea copii sănătoşi exclusiv băieţi. e. Bărbaţii bolnavi nu pot transmite boala fiilor lor, dovadă că gena mutantă se găseşte pe cromosomul X, pe care băieţii îl moştenesc de la mamele lor.

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

139

Figura 7.2. Arbore genealogic sugestiv pentru o boală ereditară dominantă legată de cromosomul X

Figura 7.3. Arbore genealogic al unei familii cu o boală ereditară dominantă legată de cromosomul X, letală la bărbaţi Tabelul 7.5. Cuplurile parentale şi descendenţii lor în bolile dominante legate de cromosomul X Încrucişări parentale

Genotipuri parentale

Gameţi

Ambii părinţi sunt sănătoşi XnXn + XnY (Xn) Mama (heterozigotă) sănătos

şi

bolnavă XAXn + XnY tatăl

Mama bolnavă XAXA + XnY (homozigotă) şi tatăl sănătos Mama sănătoasă şi tatăl XnXn + XAY bolnav Mama bolnavă XAXn + XAY (heterozigotă) şi tatăl bolnav Mama (homozigotă) bolnav

bolnavă XAXA + XAY şi tatăl

Genotipuri Fenotipuri copii copii (proporţii) (proporţii) XnXn (1/2) toţi sănătoşi XnY (1/2) (ambele sexe)

x (Xn + Y) (XA + Xn) XAXn (1/4) x XAY (1/4) (Xn + Y) XnXn (1/4) XnY (1/4) A (X ) XAXn (1/2) x XAY (1/2) n (X + Y) (Xn) x XAXn (1/2) A (X + Y) XnY (1/2) (XA + Xn) XAXA (1/4) x XAXn (1/4) A (X + Y) XAY (1/4) XnY (1/4) A (X ) XAXA (1/2) x XAY (1/2) (XA + Y)

-bolnavi (1/2) (ambele sexe) -sănătoşi (1/2) (ambele sexe) toţi bolnavi (ambele sexe) - fete bolnave (1/2) - băieţi sănătoşi (1/2) - fete bolnave (1/2) - băieţi bolnavi (1/4) - băieţi sănătoşi (1/4) toţi bolnavi (ambele sexe)

140

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale Bărbaţii bolnavi nu pot avea fiice sănătoase (indiferent dacă mama este sănătoasă sau bolnavă). Fetele moştenesc un cromosom X de la tatăl lor şi dacă mutaţia dominantă se găseşte pe cromosomul X respectiv, ele vor manifesta aceeaşi boală ca şi tatăl lor. Riscul de recurenţă a bolii la descendenţii unui pacient cu o boală dominantă legată de cromosomul X este de 50%. Un bărbat bolnav (căsătorit cu o femeie sănătoasă) va avea toate fiicele bolnave şi toţi fiii sănătoşi, în timp ce riscul de recurenţă a bolii la descendenţii unui femei cu o boală dominantă gonosomală va fi de 50%, indiferent de sexul copiilor. Deoarece pacientele cu boli dominante legate de cromosomul X sunt în majoritate heterozigote, probabilitatea ca un gamet să conţină un cromosom X purtând gena mutantă este de 1/2 (50%). Dacă partenerul de cuplu este sănătos (XnY) există o probabilitate (risc) de 1/2 (50%) ca sarcina să ducă la naşterea unei fete afectate (heterozigote) (figura 7.2.) şi o probabilitate (risc) de 1/2 (50%) ca sarcina să ducă la naşterea unei băiat afectat (hemizigot) (tabelul 7.6.).

f.

g.

Tabelul 7.6. Tabelul Punett pentru calculul riscului de recurenţă pentru boli dominante legate de cromosomul X (tată afectat şi mamă sănătoasă)

Tatăl

Mama X

A

Y

Xn X AX n

Xn X AX n

XnY

XnY

Transmiterea dominantă poate fi recunoscută pe baza următoarelor criterii: frecvenţă mare a bolii în familie, transmiterea continuă a bolii în succesiunea generaţiilor, absenţa consanguinităţii, doi părinţi bolnavi pot avea copii sănătoşi sau bolnavi, doi părinţi sănătoşi au întotdeauna copii sănătoşi; Transmiterea dominant autosomală poate fi identificată ţinând cont de următoarele reguli: doi părinţi bolnavi pot avea copii sănătoşi de ambele sexe, un cuplu în care tatăl este bolnav, iar mama este sănătoasă poate avea băieţi bolnavi, tatăl bolnav poate avea fete bolnave sau sănătoase, mama sănătoasă poate avea băieţi bolnavi sau sănătoşi; Transmiterea dominantă legată de cromosomul X poate fi identificată ţinând cont de următoarele reguli: doi părinţi bolnavi pot avea copii sănătoşi exclusiv băieţi, un cuplu în care tatăl este bolnav, iar mama este sănătoasă nu poate avea băieţi bolnavi, tatăl bolnav are toate fetele bolnave, mama sănătoasă are toţi băieţii sănătoşi;

C. TRANSMITEREA RECESIVĂ O boală genetică este considerată recesivă în situaţia în care se manifestă doar la indivizii homozigoţi (care prezintă aceeaşi mutaţie la nivelul locilor omologi) sau la heterozigoţii compuşi (care au în locii omologi, gene mutante anormale diferite). Mutaţiile genice pot duce la apariţia fenotipului anormal recesiv prin diferite mecanisme: producerea unei proteine anormale instabile care nu îşi poate îndeplini funcţia celulară; absenţa unei enzime şi devierea căii metabolice corespunzătoare cu producerea de metaboliţi toxici. Bolile recesive sunt boli rare (cele mai frecvente pot afecta 1:2.500 indivizi), iar căsătoriile între bolnavi sunt excepţionale, survenind mai frecvent în comunităţi de persoane

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

141

cu un handicap comun (de exemplu surditate). Cel mai adesea, numărul de persoane bolnave dintr-o familie este redus (uneori există un singur caz), iar părinţii indivizilor afectaţi sunt sănătoşi (purtători heterozigoţi ai mutaţiei). Este de subliniat faptul că orice persoană sănătoasă poate fi purtătoarea unei mutaţii recesive nemanifeste, pe care însă o poate transmite descendenţilor săi (tabelul 7.7.). Tabelul 7.7. Corelaţii între genotip şi fenotip pentru bolile recesive

GENOTIPURI FENOTIPURI

TRANSMITEREA RECESIVĂ AUTOSOMALĂ aa NN Na Bolnavi

Sănătoşi

TRANSMITEREA RECESIVĂ GONOSOMALĂ X aX a X NX N a XY X NX a X NY Bolnavi Sănătoşi

Au fost identificate, atât boli recesive determinate de mutaţii la nivelul unor loci de pe autosomi (boli recesive autosomale) cât şi afecţiuni determinate de mutaţii la nivelul unor loci de pe cromosomul X (boli recesive legate de cromosomul X, gonosomale). Bolile recesive pot fi recunoscute cu uşurinţă prin examinarea arborelui genealogic al unei familii, întrucât prezintă următoarele caracteristici: a. Număr redus de bolnavi în familie. Aceasta se datorează faptului că boala recesivă se manifestă numai la indivizi homozigoţi (aa sau XaXa) sau hemizigoţi (XaY) numărul acestora fiind mai mic decât cel al persoanelor sănătoase homozigote sau heterozigote. Cel mai frecvent bolnavii se găsesc în cadrul aceleiaşi generaţii sau chiar în aceeaşi fratrie, de obicei părinţii fiind sănătoşi – transmitere orizontală. În familie există în schimb numeroşi purtători sănătoşi ai genelor anormale (heterozigoţi Na, XNXa). b. Boala se transmite discontinuu, cu salturi peste una sau mai multe generaţii. În familiile cu boli recesive, un individ afectat (aa sau XaXa, XaY) poate avea numai copii sănătoşi dacă se căsătoreşte cu o persoană sănătoasă, nepurtătoare a genei anormale (NN sau XNXN, XNY). Copiii vor fi sănătoşi, dar purtători ai genei anormale (Na sau XNXa). Dacă aceştia la rândul lor se căsătoresc cu persoane care nu posedă mutaţia, boala poate fi absentă pe parcursul mai multor generaţii, deşi gena anormală se transmite prin indivizii purtători (heterozigoţi) din generaţie în generaţie. Apariţia unor alţi indivizi bolnavi în familie este condiţionată de căsătoria întâmplătoare, dar mai ales de căsătoria consanguină, a doi heterozigoţi. c. Numărul bolnavilor cu afecţiuni recesive este mai ridicat în familiile în care există căsătorii consanguine (între persoane înrudite, care au un fond comun de gene). Mutaţiile recesive sunt numeroase, astfel încât mulţi dintre indivizii sănătoşi din populaţie sunt, de fapt, purtători ai mai multor gene recesive anormale. În familiile lor apar însă rareori copii bolnavi, deoarece există o probabilitate mică de a se căsători cu un heterozigot cu o mutaţie la nivelul aceluiaşi locus genetic. Consanguinitatea creşte riscul asocierii într-un cuplu a doi heterozigoţi pentru aceeaşi mutaţie, pe care au moştenit-o de la ascendentul (strămoşul) comun şi pe care o pot transmite concomitent la unii dintre descendenţii lor (aceştia fiind homozigoţi). Consecinţele negative ale consanguinităţii au fost observate din cele mai vechi timpuri şi de aceea majoritatea religiilor sau legislaţiilor interzic formal căsătoriile consanguine. În România nu este permisă căsătoria între persoane înrudite până la gradul IV. d. Doi părinţi sănătoşi pot avea copii bolnavi. În cazul bolilor recesive, dacă părinţii sunt sănătoşi, dar heterozigoţi (Na, XNXa) ei pot transmite concomitent genele anormale

142

e.

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale unora dintre descendenţii lor, care vor fi astfel homozigoţi şi vor manifesta fenotipul anormal (vezi tabelele 7.8. şi 7.10.). Doi părinţi bolnavi nu pot avea copii sănătoşi (au numai copii bolnavi). Dacă ambii părinţi au aceeaşi boală recesivă, fiind homozigoţi pentru gena mutantă (aa) sau unul este homozigot, iar celălalt hemizigot (XaXa, respectiv XaY) ei nu pot avea copii sănătoşi, deoarece nici unul dintre ei nu posedă gene normale pe care să le transmită descendenţilor.

1. TRANSMITEREA RECESIVĂ AUTOSOMALĂ Bolile recesive autosomale sunt determinate de mutaţii ale unor gene situate pe autosomi (afectând în proporţii egale femeile şi bărbaţii) dar manifeste doar la homozigoţi sau la heterozigoţii compuşi, genele mutante fiind recesive faţă de alelele normale dominante (figura 7.4., tabelul 7.8.).

Figura 7.4. Arbore genealogic sugestiv pentru o afecţiune cu transmitere recesivă autosomală Tabelul 7.8. Cuplurile parentale şi descendenţii lor în boli recesive autosomale: Încrucişări parentale

Genotipuri parentale

Gameţi

Ambii părinţi sunt bolnavi Un părinte bolnav şi un părinte sănătos (homozigot) Un părinte bolnav şi un părinte sănătos (heterozigot) Ambii părinţi sănătoşi (heterozigoţi)

aa + aa aa + NN

axa axN

aa + Na

a x (a + N) (a + N) x (a + N) N x (a + N) NxN

Ambii părinţi sunt sănătoşi (homozigot + heterozigot)

Na + Na NN + Na

Ambii părinţi sunt sănătoşi - NN + NN homozigoţi

Genotipuri Fenotipuri copii copii (proporţii) (proporţii) aa (toţi) bolnavi (toţi) Na (toţi) sănătoşi (toţi) purtători aa (1/2) bolnavi (1/2) Na (1/2) sănătoşi (1/2) aa (1/4) bolnavi (1/4) Na (1/2) sănătoşi (3/4) NN (1/4) Na (1/2) sănătoşi (toţi) NN (1/2) purtători (1/2) NN (toţi)

sănătoşi (toţi)

Bolile recesive autosomale sunt numeroase şi, deseori, au consecinţe grave asupra calităţii vieţii şi prognosticului vital al pacientului (ex. mucoviscidoza, erorile înnăscute de metabolism - mucopolizaharidoze, aminoacidopatii, albinismul oculocutanat, etc).

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

143

Analiza transmiterii bolilor recesive autosomale în diferite familii (vezi arborele genealogic din figura 7.4.) şi a tuturor combinaţiilor parentale posibile (tabelul 7.8.) a permis identificarea caracteristicilor acestui tip de afecţiuni: a. Bolnavii sunt în general descendenţii unor indivizi sănătoşi şi sunt frecvent membrii aceleiaşi fratrii. Transmiterea genealogică a afecţiunii este aparent orizontală. Cei doi părinţi sănătoşi sunt heterozigoţi pentru mutaţii produse la nivelul aceluiaşi locus genetic şi pot fi înrudiţi. b. Cu cât o boală recesivă autosomală este mai rară în populaţie, cu atât este mai frecventă consanguinitatea în familiile bolnavilor. c. Bărbaţii şi femeile sunt afectaţi în proporţii egale. d. Doi părinţi sănătoşi (heterozigoţi) pot avea copii bolnavi şi băieţi şi fete. e. Bărbaţii sănătoşi (Na) pot avea fiice bolnave, indiferent dacă mama este sănătoasă (Na) sau bolnavă (aa), dovadă că locusul genetic implicat nu se găseşte pe cromosomul X. Dacă gena respectivă s-ar găsi pe cromosomul X, fiicele oricărui bărbat sănătos ar fi sănătoase, întrucât ar moşteni o alelă normală dominantă de la tatăl lor. f. Femeile bolnave (homozigote) pot avea fii sănătoşi, dacă soţul lor este sănătos (Na sau NN). Naşterea unui băiat sănătos, când mama este afectată, este o dovadă a faptului că gena mutantă se găseşte pe alt cromosom decât cromosomul X. g. Riscul de recurenţă a bolii în fratria unui bolnav (indiferent de sex) cu o maladie recesivă autosomală este de 25% (presupunând că părinţii sunt sănătoşi). Deoarece pacienţii cu boli recesive autosomale sunt homozigoţi şi au moştenit câte o alelă mutantă de la fiecare dintre părinţi, rezultă că părinţii bolnavilor sunt heterozigoţi pentru aceeaşi mutaţie. Probabilitatea ca un gamet provenit de la oricare dintre părinţi să conţină la nivelul locusului respectiv gena mutantă este de 1/2 (50%). Probabilitatea fecundării, a doi gameţi conţinând aceeaşi alelă mutantă, este produsul probabilităţilor fiecărui gamet de a conţine mutaţia respectivă (1/2 x 1/2 = 1/4) adică 25%. Membrii sănătoşi ai fratriei unui bolnav cu o boală recesivă autosomală au o probabilitate de 2/3 de a fi purtători asimptomatici ai mutaţiei (Na) (tabelul 7.9.). Tabelul 7.9. Tabelul Punett pentru calculul riscului de recurenţă în fratria unui bolnav cu o boală recesivă autosomală

Tata

Mama N

N NN

a Na

a

Na

aa

Naşterea unui copil bolnav când un părinte este afectat (aa) iar celălalt este sănătos (Na) mimează o transmitere dominantă şi este denumită pseudodominanţă. În această situaţie riscul de recurenţă a afecţiunii la ceilalţi descendenţi ai cuplului este de 50%.

2. TRANSMITEREA RECESIVĂ LEGATĂ DE CROMOSOMUL X Bolile recesive gonosomale sunt consecinţa unor mutaţii produse la nivelul locilor situaţi pe cromosomul X, alelele mutante având un comportament de tip recesiv în prezenţa genei normale. În absenţa genei normale, la bărbaţii hemizigoţi care posedă gena mutantă, mutaţia se exprimă fenotipic, determinând un fenotip anormal. Prin urmare, numărul bărbaţilor afectaţi este mai mare decât cel al femeilor, care vor avea un fenotip anormal doar în prezenţa unei duble mutaţii (pe cei doi cromosomi X) (figura 7.5., tabelul 7.10.).

144

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

Figura 7.5. Arbore genealogic sugestiv pentru o boală transmisă recesiv legat de cromosomul X Tabelul 7.10. Cuplurile parentale şi descendenţii lor în boli recesive legate de X: Încrucişări parentale

Genotipuri parentale Ambii părinţi sunt bolnavi XaXa + XaY Mama bolnavă şi tatăl XaXa + XNY sănătos Mama sănătoasă XNXa + XNY (purtătoare) şi tatăl sănătos Mama sănătoasă XNXa + XaY (purtătoare) şi tatăl bolnav Mama sanătoasă XNXN+ XaY (homozigotă) şi tatăl bolnav Ambii părinţi sănătoşi X NX N+ X NY

Gameţi Genotipuri copii (proporţii) (Xa) x XaXa (1/2) (Xa + Y) XaY (1/2) (Xa) x XNXa (1/2) (XN + Y) XaY (1/2) a N (X +X ) XNXa (1/4) x XNXN (1/4) N (X + Y) XaY (1/4) XNY (1/4) a N (X +X ) XaXa (1/4) x XNXa (1/4) a (X + Y) XaY (1/4) XNY (1/4) N (X ) XNXa (1/2) x (Xa + Y) XNY (1/2) (XN) x XNXN 1/2) (XN+ Y) XNY (1/2)

Fenotipuri copii (proporţii) toţi bolnavi (ambele sexe) fete sănătoase (1/2) băieţi bolnavi (1/2) fete sănătoase (1/2 purtătoare) băieţi bolnavi (1/2) băieţi sănatoşi (1/2) fete bolnave (1/2) fete sănătoase (1/2) băieţi bolnavi (1/2) băieţi sănătoşi (1/2) fete sănatoase (purtătoare) băieţi sănătoşi fete sănătoase băieţi sănătoşi

Apariţia la o femeie a unei boli recesive legate de cromosomul X poate fi consecinţa: procesului de inactivare în proporţie mai mare (sau exclusivă, aşa cum se întâmplă în cazul translocaţiilor X-autosom) a cromosomului X, care conţine alela normală (femeia fiind în acest caz heterozigotă);  a unor anomalii ale cromosomului X (monosomie X, deleţii ale cromosomului X) prin care se pierde alela normală - femeia este hemizigotă, având doar gena mutantă;  prezenţei mutaţiei în stare homozigotă, mai ales când aceasta are o frecvenţă mare în populaţia respectivă (ex. discromatopsiile – incapacitatea de a distinge culoarea roşie sau verde – se întâlnesc la 8% dintre bărbaţi, dar şi la 1:150 dintre femei). Femeile heterozigote sunt de obicei asimptomatice (sănătoase) dar pot fi uneori depistate prin identificarea de semne minore de boală (pigmentarea „în mozaic” a retinei la femeile heterozigote pentru mutaţia ce produce albinismul ocular, creşterea activităţii creatin-kinazei serice la purtătoarele mutaţiei pentru distrofia musculară Duchenne etc.). 

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

145

Analiza transmiterii bolilor recesive autosomale în diferite familii (vezi arborele genealogic din figura 7.5.) şi a tuturor combinaţiilor parentale posibile (tabelul 7.10.) a permis identificarea caracteristicilor acestui tip de afecţiuni: a. Bolnavii sunt în general descendenţii unor indivizi sănătoşi. b. Boala este prezentă aproape în exclusivitate la bărbaţi. c. Transmiterea se face de obicei prin femei sănătoase, dar purtătoare de mutaţie, la fiii lor – transmitere genealogică oblică. d. Doi părinţi sănătoşi pot avea copii bolnavi, exclusiv băieţi. e. Bărbaţii sănătoşi (XNY) au toate fiicele sănătoase, indiferent dacă mama este sănătoasă (XNXa sau XNXN) sau bolnavă (XaXa) dovadă că locusul genetic implicat se găseşte pe cromosomul X. Fiicele oricărui bărbat sănătos sunt sănătoase, întrucât moştenesc (odată cu cromosomul X patern) o alelă normală dominantă de la tatăl lor. f. Femeile bolnave (homozigote XaXa) nu pot avea fii sănătoşi, chiar dacă soţul lor este sănătos. Băieţii moştenesc unicul cromosom X de la mama lor şi de aceea, ei vor manifesta aceeaşi boală ca şi mama lor. Naşterea unui băiat sănătos când mama este afectată, exclude o mutaţie recesivă legată de cromosomul X. g. Riscul de recurenţă a bolii în fratria unui băiat bolnav cu o boală recesivă legată de X este de 25% (când părinţii sunt sănătoşi). Dacă mama este heterozigotă (XNXa), probabilitatea ca un gamet provenit de la mamă să conţină un cromosom X cu gena mutantă este de 1/2 (50%). Dacă tatăl bolnavului este hemizigot sănătos (XNY), el va genera atât gameţi care conţin cromosomul X cu alela normală (1/2 = 50%), cât şi gameţi care conţin cromosomul Y. Prin urmare toate fiicele cuplului vor fi sănătoase (1/2 homozigote, 1/2 heterozigote) iar fiii vor fi fie sănătoşi (1/2), fie bolnavi (1/2) (tabelul 7.11.). Tabelul 7.11. Tabelul Punett pentru calculul riscului de recurenţă în fratria unui bolnav cu o boală recesivă legată de cromosomul X

Tatăl

Mama N

X Y

XN X NX N X NY

Xa X NX a X aY

Particularităţile diferitelor tipuri de transmitere mendeliană sunt prezentate comparativ în tabelul 7.12. Transmiterea recesivă poate fi recunoscută pe baza următoarelor criterii: frecvenţă mică a bolii în familie, transmiterea discontinuă a bolii în succesiunea generaţiilor, consanguinitate prezentă, doi părinţi bolnavi au toţi copiii bolnavi, doi părinţi sănătoşi au copii sănătoşi sau bolnavi Transmiterea recesiv autosomală are următoarele criterii: doi părinţi sănătoşi pot avea copii bolnavi de ambele sexe, un cuplu în care tatăl este sănătos iar mama este bolnavă poate avea fete bolnave, tatăl sănătos poate avea fete bolnave sau sănătoase, mama bolnavă poate avea băieţi bolnavi sau sănătoşi Transmiterea recesivă legată de cromosomul X poate fi identificată ţinând cont de următoarele reguli: doi părinţi sănătoşi pot avea copii bolnavi exclusiv băieţi, un cuplu în care tatăl este sănătos iar mama este bolnavă nu poate avea fete bolnave, tatăl sănătos are toate fetele sănătoase, mama bolnavă are toţi băieţii bolnavi

146

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale Tabelul 7.12. Caracteristicile transmiterii mendeliene.

Caracteristici Transmiterea Transmiterea Transmitere Transmiterea dominantă dominantă legată a recesivă recesivă legată de X autosomală de X autosomală Tip de Verticală Verticală (oblică Orizontală Oblică transmitere pentru bolile letale la bărbaţi) Persoane Femei şi Femei şi bărbaţi Femei şi Aproape exclusiv afectate bărbaţi în (raport 2:1) sau bărbaţi în bărbaţi proporţii egale numai femei (boli proporţii letale la bărbaţi) egale Transmitere Persoane Persoane afectate Purtători Femei purtătoare sau prin afectate (femei (femei sau bărbaţi) sănătoşi bărbaţi afectaţi sau bărbaţi) (femei sau bărbaţi) Risc de 50% pentru 50% pentru 25% dacă 0% pentru fiice şi recurenţă bolnavi (orice descendenţii părinţii sunt 50% pentru fiii sex) femeilor bolnave purtători femeilor purtătoare 0% pentru 0% pentru fii şi (indiferent 0% pentru sănătoşi 100% pentru fiicele de sexul descendenţii bărbaţilor afectaţi copilului) bărbaţilor afectaţi Fenomene Transmitere Transmitere tată-fiu Consanguinit Mutaţii noi asociate tată-fiu imposibilă ate prezentă, Femei heterozigote posibilă Afectare mai puţin mai ales în afectate (inactivare Mutaţii noi severă la femeile cazul bolilor neîntâmplătoare a Penetranţă heterozigote decât rare cromosomului X) incompletă la bărbaţi Expresivitate variabilă

D. MANIFESTĂRI VARIABILE ALE MUTAŢIILOR GENICE Deşi teoretic transmiterea monogenică (mendeliană) este cel mai simplu mod de transmitere şi poate fi recunoscută cu uşurinţă într-un arbore genealogic, în realitate bolile de acest tip ridică probleme care fac dificile diagnosticul şi evaluarea riscului de recurenţă. Problemele derivă din variabilitatea care caracterizează expresia fenotipică a mutaţiilor, fenomen incomplet cunoscut şi înţeles până în prezent. Variaţiile în expresia genelor pot fi explicate prin faptul că genele acţionează corelat, sub influenţa unor factori din mediul intern şi extern. Manifestările variabile ale mutaţiilor genice pot avea diferite aspecte, concretizate în termeni ca penetranţă, expresivitate şi specificitate.

1. PENETRANŢA Penetranţa este o noţiune cantitativă aplicabilă bolilor dominante, noţiune care defineşte frecvenţa manifestării genei mutante (numărul bolnavilor), în raport cu numărul total de purtători ai genei anormale (AA, An). În cazul unor familii prezentând boli dominante cunoscute, s-a observat că unii heterozigoţi (An) sunt aparent sănătoşi, gena „A” fiind în acest caz „mută” din punct de

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

147

vedere al expresiei fenotipice (se comportă asemănător unei gene recesive - este lipsită de penetranţă). Totuşi, în multe situaţii, aceşti indivizi heterozigoţi sănătoşi, pot avea descendenţi (An) la care boala se manifestă complet (figura 7.6.).

Figura 7.6. Arbore genealogic al unei familii cu retinoblastom ereditar (transmis autosomal dominant, cu penetranţă incompletă) Se realizează în acest mod o transmitere dominantă neregulată, în care, spre deosebire de transmiterea dominantă clasică:  Doi părinţi sănătoşi pot avea copii bolnavi.  Transmiterea genealogică a afecţiunii este discontinuă, cu salturi peste o generaţie. Riscurile de recurenţă pentru afecţiunile cu penetranţă incompletă sunt dificil de evaluat, deoarece, pe de o parte, un individ aparent sănătos poate fi heterozigot şi se va confrunta cu un risc de 50 % de a transmite mutaţia la descendenţi, iar pe de altă parte, un individ heterozigot nu manifestă semne de boală în 100% din cazuri, ci se confruntă cu un risc care depinde de penetranţa mutaţiei (vezi capitolul „Sfatul genetic”). De remarcat că penetranţa este un fenomen dependent de vârsta individului, fapt care trebuie luat în consideraţie în special pentru bolile genetice cu debut tardiv (ex. coreea Huntington, pentru care penetranţa este de 50% la vârsta de 40 de ani, dar atinge 100% la vârsta de 70 de ani).

2. EXPRESIVITATEA Expresivitatea este o noţiune cantitativă, care defineşte manifestarea clinică a anomaliei genetice cu diferite grade de intensitate, în aceeaşi familie sau în familii diferite. Deşi există şi boli dominante care au o expresie clinică aproape constantă (ex. acondroplazia) expresivitatea variabilă este aproape o regulă, îmbrăcând o diversitate de aspecte: a. Afecţiunile dominante, caracterizate prin anomalii unice, pot prezenta grade diferite de severitate la membrii aceleiaşi familii sau în familii diferite (de exemplu polidactilia poate fi prezentă la indivizi afectaţi unilateral, bilateral, numai la mâini, numai la picioare sau la toate membrele). b. În unele boli dominante, persoanele afectate pot avea fie forme tipice ale bolii, fie forme incomplete, variabile, care pot fi chiar fruste, cu manifestări reduse, subclinice. Acest aspect este întâlnit în bolile dominante determinate de gene anormale cu efect multiplu (pleiotrope) (de exemplu în familiile cu sindrom Marfan, există indivizi care prezintă afectare oculară, scheletică şi cardiovasculară caracteristică, dar şi indivizi cu forme fruste de boală, care prezintă doar talie înaltă, aspect astenic şi arahnodactilie sau miopie) (figura 7.7.). Recunoaşterea cazurilor cu manifestări reduse, monosimptomatice, nu este întotdeauna uşor de realizat, dar este esenţială pentru managementul afecţiunii şi acordarea sfatului genetic. c. Expresivitatea variabilă poate fi corelată şi cu vârsta la care boala devine manifestă clinic. Un fenomen particular legat de manifestarea bolii la vârste diferite, la membrii aceleiaşi familii, este fenomenul de anticipaţie. Anticipaţia se referă la manifestarea

148

d.

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale bolii (cu severitate crescută) la vârste din ce în ce mai tinere în generaţii succesive (ex. coreea Huntington). În cazul coreei Huntington, substratul anticipaţiei este reprezentat de o mutaţie „dinamică”, care constă în amplificarea, în cursul meiozei, a unei secvenţe trinucleotidice repetitive, localizată în interiorul genei. Amplificarea produce o proteină cu efecte toxice celulare prin alterarea transcripţiei. Creşterea numărului de repetiţii, în succesiunea generaţiilor, duce la efecte celulare din ce în ce mai grave, care se manifestă clinic precoce. Predominanţa sau limitarea la unul dintre sexe este un fenomen remarcat în unele boli determinate de mutaţii autosomale. Un exemplu este hemocromatoza, transmisă dominant autosomal, care are o frecvenţă de zece ori mai mare la bărbaţi decât la femei. O explicaţie a acestui fenomen ar putea fi aportul alimentar mai redus în fier şi pierderile menstruale prezente la femei. Alte exemple de boli predominante la bărbaţi sunt: guta, calviţia frontală (boli în care este incriminat rolul hormonilor androgeni) în timp ce aplazia emailului dentar sau căderea precoce a dinţilor sunt întâlnite mai frecvent la femei. Limitarea la un sex survine atunci când organul ţintă este prezent doar la unul dintre cele două sexe (de exemplu, sindromul Morris se manifestă clinic doar la subiecţii de sex masculin).

Absent Mediu Sever Cardiac Anevrism arterial

Cardiac

Moarte prin disecţie aortică

Scheletic

Ocular

Ocular Ectopie de cristalin

Scheletic Talie înaltă, aspect astenic Scolioză Prolaps de valvă mitrală Miopie Hiperlaxitate articulară Arahnodactilie Figura 7.7. Arbore genealogic al unei familii cu sindrom Marfan (boală autosomal dominantă cu expresivitate variabilă)

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

149

3. SPECIFICITATEA DE ORGAN Specificitatea de organ este o noţiune calitativă introdusă pentru a caracteriza tipul şi localizarea efectelor fenotipice ale genei mutante. Specificitatea de organ se întâlneşte în unele familii cu boli dominante, care afectează de obicei multiple organe sau ţesuturi. De exemplu, boala Rendu-Osler (angiomatoza hemoragică ereditară) se caracterizează prin hemoragii determinate de dezvoltarea unor hemangioame în diferite ţesuturi sau organe, cu toate că mutaţia este prezentă în toate celulele organismului. În unele familii, indivizii afectaţi au numai epistaxis sau numai hematurie.

E. PLEIOTROPIA ŞI HETEROGENITATEA GENETICĂ Analiza familiilor cu boli genetice arată că mutaţia unei gene poate avea un efect limitat la nivelul unui singur ţesut sau organ. Mai frecvent, însă, o singură mutaţie poate avea consecinţe asupra mai multor ţesuturi sau organe, fenomen denumit pleiotropie. Un exemplu în acest sens este sindromul Marfan, în care o mutaţie dominantă la nivelul genei fibrilinei (componentă a ţesutului conjunctiv) produce anomalii scheletice (talie înaltă, aspect astenic, arahnodactilie, hiperlaxitate articulară) oculare (subluxaţie de cristalin, miopie) şi cardiovasculare (prolaps de valvă mitrală, anevrism aortic). Dezvoltarea geneticii moleculare a permis explicarea efectelor pleiotrope ale mutaţiilor genice, pe baza localizării expresiei proteinei codificate de gena respectivă. La nivel molecular a fost demonstrat faptul că mutaţii diferite, la nivelul aceluiaşi locus sau la nivelul unor loci distincţi, pot avea consecinţe fenotipice identice sau similare, determinând aceeaşi boală genetică - heterogenitate genetică. Situaţia în care mutaţii distincte, survenite în aceeaşi genă, determină acelaşi tablou clinic – heterogenitate alelică - este amplu ilustrată de mucoviscidoză, boală recesivă autosomală pentru care au fost identificate până în prezent peste 700 de mutaţii, care alterează o proteină membranară, cu rol de canal ionic pentru ionul de clor (CFTR). Există afecţiuni, care au ca substrat mutaţii la nivelul unor loci genetici distincţi – heterogenitate de locus - şi care pot avea chiar moduri diferite de transmitere genealogică. Un exemplu clasic este retinopatia pigmentară, care se poate transmite autosomal dominant sau recesiv, sau chiar legat de cromosomul X. Datorită fenomenului de heterogenitate genetică, diagnostic clinic al unei afecţiuni ereditare nu este suficient pentru evaluarea riscului de recurenţă la alţi membri ai familiei, aceasta realizându-se pe baza identificării unui anumit tip mendelian de transmitere în arborele genealogic al familiei. De asemenea, trebuie menţionată existenţa unor fenotipuri anormale care pot fi determinate, atât monogenic, cât şi de factori de mediu (fenocopii). Un exemplu clasic este microcefalia, care poate fi consecinţa unei mutaţii genice autosomale recesive sau poate face parte din tabloul clinic al unui sindrom teratogenic – sindromul alcool fetal. Riscul de recurenţă este mult diferit în cele două situaţii, fiind de 25% în primul caz şi practic nul în cel de-al doilea, dacă se evită factorul teratogen.

F. CONSANGUINITATEA ŞI ROLUL EI ÎN BOLILE RECESIVE AUTOSOMALE Căsătoriile consanguine (între persoane înrudite, care au un fond comun de gene, moştenite de la strămoşul comun) au drept rezultat creşterea probabilităţii ca descendenţii să moştenească de la ambii părinţi aceeaşi mutaţie genică, cu efecte recesive şi să fie homozigoţi afectaţi. Acest risc este prezent, chiar şi atunci când nu există o anamneză

150

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

familială pozitivă pentru membrii cuplului consanguin, deoarece fiecare individ sănătos posedă 3-4 gene mutante recesive. Dintre acestea 2-3 sunt letale şi vor duce la moartea embrionilor homozigoţi, iar una este o genă recesivă care în stare homozigotă determină o boală gravă. Astfel, probabilitatea ca primul copil al unui cuplu consanguin să aibă o boală recesivă gravă se calculează pornind de la premisa că fiecare dintre genitorii comuni posedă o genă autosomală recesivă cu efecte morbide majore. De exemplu, probabilitatea ca primul născut al unui cuplu de veri primari se calculează, pornind de la ipoteza că fiecare dintre bunicii comuni ai consultanţilor (I1 şi I2) este purtătorul unei mutaţii recesive (figura 7.8.). În acest caz, probabilitatea ca ambii părinţi ai copilului să fie heterozigoţi pentru aceeaşi mutaţie recesivă moştenită de la bunicul comun este de 1/4 x 1/4, iar probabilitatea ca primul lor copil să fie homozigot pentru această mutaţie este de 1/4 x 1/4 x 1/4 = 1/64. Aceleaşi probabilităţi (riscuri) se aplică şi pentru situaţia în care mutaţia recesivă se moşteneşte de la bunica comună. Astfel, probabilitatea totală ca primul copil (IV1) să fie homozigot pentru o mutaţie recesivă cu efecte severe este de 1/64 + 1/64 = 1/32. * I 1 2 II

½

½ 1

III IV

2

3

4 ¼

¼ 1

2

1 Figura 7.8. Riscul genetic pentru o căsătorie consanguină între veri primari Probabilitatea copilului provenit dintr-un cuplu consanguin de a fi homozigot (afectat) pentru o genă la nivelul unui locus specific, moştenită de la genitorul comun al cuplului parental, este denumită coeficient de consanguinitate (F). Coeficientul de consanguinitate este diferit de coeficientul de înrudire (R) care se referă la membrii cuplului consanguin, indicând proporţia medie de gene pe care aceştia le au în comun, ca urmare a faptului că au un strămoş comun (tabelul 7.13.). Coeficientul de înrudire se calculează folosind formula:

n  n

1

1 1 2 R  2 unde: R – coeficient de înrudire; n1 – numărul de generaţii existente între unul din membrii cuplului consanguin şi strămoşul comun; n2 – numărul de generaţii existente între celălalt din membrii cuplului consanguin şi strămoşul comun. Coeficientul de consanguinitate se calculează cu formula: 1 F  2 R 4 unde: F – coeficient de consanguinitate, iar R – coeficient de înrudire. Pentru exemplul de mai sus coeficientul de consanguinitate este de 1/16 pentru copilul cuplului de veri primari, pornind de la calcularea probabilităţii copilului de a fi homozigot pentru alela 1 sau pentru alela 2 de la bunicul comun al părinţilor săi şi respectiv a probabilităţii copilului de a fi homozigot pentru alela 1 sau pentru alela 2 de la bunica comună a părinţilor

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

151

săi. Fiecare dintre aceste probabilităţi este de 1/64, deci suma lor va fi 1/16. Alternativ, valoarea de 1/16 pentru coeficientul de consanguinitate poate fi dedusă, pornind de la faptul că, dacă unul dintre părinţi transmite copilului o anumită alelă, probabilitatea partenerului (văr primar) de a transmite aceeaşi genă este R x 1/2 = 1/8 x 1/2 = 1/16. Tabelul 7.13. Coeficienţii de înrudire, consanguinitate şi riscul descendenţilor de a avea o boală recesivă autosomală pentru unele uniuni consanguine Cuplul consanguin

Coeficientul de înrudire (R) Fraţi 1/2 Fraţi vitregi 1/4 Unchi – nepoată de frate 1/4 Mătuşă – nepot de frate Veri primari 1/8 Unchi – nepoată de văr 1/16 Mătuşă – nepot de văr Veri de gradul II 1/32 Veri primari dubli 1/4 Veri de gradul II dubli 1/16

Coeficientul de Riscul de apariţie a unei consanguinitate boli recesiv autosomale la (F) descendenţi 1/4 1/8 1/8 1/16 1/8 1/16 1/16 1/32

1/32 1/64

1/64 1/8 1/16

1/128 1/16 1/64

În perspectiva sfatului genetic, conceptul de coeficient de consanguinitate poate duce la confuzii, întrucât se referă la probabilitatea copilului cuplului consanguin de a fi homozigot, atât pentru alela mutantă cât şi pentru cele normale. Probabilitatea de interes pentru cuplul consultant este cea care reflectă riscul genetic – probabilitatea copilului de a fi homozigot pentru o mutaţie care determină o boală genetică, în situaţia de mai sus aceasta fiind de 1/32. La modul general, probabilitatea ca un copil născut din părinţi consanguini să aibă o boală recesivă autosomală este (F/2) x n, unde n reprezintă numărul de alele recesive ale fiecărui genitor (strămoş) comun. Manifestările variabile ale genelor dominante sunt reprezentate de penetranţa incompletă (absenţa manifestărilor de boală la unii dintre heterozigoţii An) expresivitatea variabilă (simptomatologie diferită la indivizii afectaţi din aceeaşi familie sau din familii diferite) şi specificitate de organ (prezenţa aceleiaşi modificări dar în ţesuturi diferite la indivizi din familii diferite sau chiar din aceeaşi familie); Pleiotropia reprezintă asocierea de efecte fenotipice diferite induse de aceeaşi mutaţie; Heterogenitatea genetică reprezintă fenomenul prin care mutaţii diferite, ale aceleiaşi gene sau a unor gene diferite, induc un fenotip anormal, identic sau similar; Căsătoriile consanguine cresc riscul de apariţie a unor copii afectaţi de o boală recesivă, deoarece descendenţii unui astfel de cuplu au o probabilitate crescută de a moşteni de la ambii părinţi aceeaşi mutaţie, moştenită de aceştia de la un strămoş comun.

152

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

II. APLICAŢII PRACTICE A. IDENTIFICAREA MODULUI DE TRANSMITERE ÎN BOLI EREDITARE ŞI EVALUAREA RISCULUI DE RECURENŢĂ 1. CAZUL CLINIC 1 Un copil, în vârstă de 5 ani, este adus pentru consult genetic de către părinţi. Copilul prezintă o constituţie gracilă, stern înfundat, suflu cardiac, iar un examen oftalmologic, efectuat anterior a depistat o subluxaţie a cristalinului. Pe baza semnelor clinice, medicul genetician stabileşte diagnosticul de sindrom Marfan. Anamneza familială relevă că, probantul are două surori: o soră în vârstă de 8 ani (IV-1) fără manifestări clinice şi alta în vârstă de 3 ani (IV-3) care are o constituţie gracilă, hiperlaxitate articulară şi prolaps de valvă mitrală. Mama probandului este sănătoasă şi are o anamneză familială negativă pentru sindromul Marfan, în timp ce tatăl probandului are numeroase rude cu boli cardiace, talie înaltă şi aspect gracil. Tatăl probandului (III-2) nu este deosebit de înalt (talie 175 cm) şi nu prezintă afectare oculară sau cardiacă. În schimb, fratele său (III-1) în vârstă de 39 de ani, are o talie de 190 cm, constituţie astenică, platfus şi hernii inghinale bilaterale, fiind diagnosticat cu anevrism şi insuficienţă aortică. Atât bunicul patern al probandului, cât şi străbunicul au avut talie peste medie şi au decedat în decada a 4-a de viaţă în urma unor „atacuri de cord”. Bunicul patern al probandului a avut un frate mai mic sănătos (încă în viaţă, dar necăsătorit) şi o soră cu talie înaltă şi miopie; aceasta e căsătorită şi a avut 3 copii: un băiat sănătos, o fată cu talie înaltă care a decedat în urma unui anevrism disecant de aortă şi un alt băiat cu talie înaltă, arahnodactilie, hernii inghinale şi suflu cardiac. Vara primară a tatălui probandului are la rândul ei trei copii: o fată cu talie înaltă, arahnodactilie şi miopie, precum şi un băiat şi o fată fără manifestări clinice sugestive de sindrom Marfan (figura 7.9.).

Figura 7.9. Arborele genealogic al familiei (cazul clinic 1) Sindromul Marfan (MIM 154700) este o boală monogenică, dominant autosomală, după cum se poate observa şi în arborele genealogic al acestei familii: există numeroase persoane afectate în familie; fiecare bolnav moşteneşte afecţiunea de la unul dintre părinţi – transmitere verticală; excepţie face probandul al cărui tată nu are semne clinice evidente, reprezentând un caz de lipsă de penetranţă;

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

153

bărbaţii şi femeile sunt afectaţi în egală măsură şi pot transmite boala descendenţilor lor; boala se poate transmite de la tată la fiu, dovadă certă a transmiterii autosomale. După cum se remarcă din anamneza familială, sindromul Marfan se caracterizează printr-o expresivitate clinică extrem de variabilă. Deşi toate persoanele afectate prezintă aceeaşi mutaţie genică (sunt heterozigoţi An) semnele clinice sunt diverse, de la talie înaltă şi miopie (formă frustă, II-4) la talie înaltă, constituţie gracilă, platfus, hernii inghinale bilaterale, anevrism şi insuficienţă aortică (formă completă, III-1). Persoanele sănătoase din familie, cu excepţia tatălui probandului (purtător sănătos, An) sunt toate homozigote pentru alela normală, nn, şi ca urmare nu transmit alele mutante descendenţilor lor. Riscul de recurenţă a bolii în fratria probandului (în cazul unor sarcini ulterioare) este teoretic de 50% (tabelul 7.14.) deoarece tatăl probandului este cert heterozigot, An, iar mama este sănătoasă şi nu posedă mutaţia. Practic, datorită faptului că un individ purtător de mutaţie poate fi lipsit de manifestări clinice (penetranţă incompletă) riscul de recurenţă este sub 50%, în funcţie de gradul de penetranţă a mutaţiei (pentru o evaluare mai precisă vezi capitolul „Sfatul genetic”). Tabelul 7.14. Tabelul Punett ilustrând riscul de recurenţă a afecţiunii în fratria probantului

Tatăl

Mama A n

n An nn

n An nn

2. CAZUL CLINIC 2 Un bărbat are doi fraţi cu microcefalie (craniu de dimensiuni reduse) şi retard mintal. El este căsătorit cu vara sa primară şi este preocupat de riscul de recurenţă a microcefaliei la descendenţii săi. Anamneza familială (figura 7.10.) relevă următoarele: bărbatul este al patrulea născut, după un băiat afectat, o fată sănătoasă şi o altă fată cu microcefalie; părinţii săi sunt sănătoşi, dar mama sa şi mama soţiei sale sunt surori; mama soţiei sale mai are o soră geamănă, sănătoasă dar necăsătorită; soţia consultantului mai are un frate şi o soră, ambii sănătoşi; bunicii comuni ai consultanţilor sunt sănătoşi.

Figura 7.10. Arborele genealogic al familiei (cazul clinic 2)

154

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

Microcefalia este o afecţiune caracterizată prin heterogenitate genetică. În plus, ea poate fi şi consecinţa unor expuneri teratogene. În situaţia de faţă, în prezenţa a doi copii grav afectaţi în aceeaşi fratrie, provenind din părinţi sănătoşi, există date care pledează pentru o boală recesivă autosomală (MIM 251200), fapt relevat şi de arborele genealogic al familiei: numărul de bolnavi în familie este redus; bolnavii sunt membri ai aceleiaşi fratrii, iar părinţii lor sunt sănătoşi – transmitere orizontală; bolnavii sunt de ambele sexe; un cuplu de părinţi sănătoşi au o fată bolnavă. În cazul bolilor recesive autosomale, bolnavii sunt homozigoţi pentru gena mutantă, iar părinţii lor, sănătoşi, sunt heterozigoţi. Riscul de recurenţă a microcefaliei în descendenţa cuplului consultant depinde de probabilitatea membrilor cuplului de a transmite gena mutantă, deci de a fi heterozigoţi. Consultantul este sănătos şi provine dintr-un cuplu de părinţi sănătoşi dar heterozigoţi, ceea ce face ca probabilitatea sa de a fi heterozigot să fie 2/3 (tabelul 7.15.). Tabelul 7.15. Tabelul Punett ilustrând probabilitatea unui copil sănătos provenind dintr-un cuplu de heterozigoţi de a fi la rândul său heterozigot

Tatăl

Mama N

N NN

a Na

a

Na

aa41

În ceea ce priveşte consultanta, ea poate moşteni gena mutantă de la oricare dintre părinţii săi; întrucât tatăl ei este sănătos şi neînrudit cu familia mamei, riscul major provine de la mamă. Mama consultantei are o soră (mama consultantului) care este cert heterozigotă şi deci va avea o probabilitate de 1/2 de a fi moştenit şi ea mutaţia de la unul dintre părinţi (de a fi heterozigotă). Ca urmare, probabilitatea consultantei de a fi heterozigotă este de 1/4 (jumătate din probabilitatea mamei sale). Naşterea unui copil afectat (aa) în familia consultanţilor presupune deci 2 evenimente independente: consultantul trebuie să transmită o genă mutantă (1/2 din probabilitatea sa de a fi heterozigot) şi, concomitent, consultanta trebuie să transmită cea de a doua mutaţie (1/2 din probabilitatea sa de a fi heterozigot). Riscul de recurenţă a microcefaliei în descendenţa probanţilor va fi deci: (1/2 x 2/3) x (1/2 x 1/4) = 1/24.

3. CAZUL CLINIC 3 Un bărbat în vârstă de 20 de ani se prezintă la medicul neurolog pentru scăderea forţei musculare la membrele inferioare (în principal la muşchii gambei). Anamneza familială (figura 7.11.) relevă următoarele: părinţii probandului sunt sănătoşi, ca şi fratele său mai tânăr, dar bunicul matern a suferit de „slăbiciune musculară” şi a decedat la vârsta de 40 de ani în urma unei boli cardiace; mama probandului are două surori şi un frate, toţi sănătoşi; fiecare soră are câte 3 copii; sora mijlocie are doi băieţi (veri primari cu probandul) care au fost diagnosticaţi cu „distrofie musculară” în decada a doua de viaţă, şi o fată sănătoasă; 41

Din arborele genealogic se observă că persoana este sănătoasă, genotipul aa fiind exclus

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

155

sora mai mică are o fată şi doi băieţi, toţi sub vârsta de 20 de ani şi aparent sănătoşi. Atât probandul cât şi cei doi veri ai săi ar dori să afle riscul de recurenţă a afecţiunii la viitorii lor descendenţi.

Figura 7.11. Arborele genealogic al familiei (cazul clinic 3) Forma de distrofie musculară prezentă în această familie, cu debut în a doua decadă de viaţă şi deces în cea de a 4-a, sugerează diagnosticul de distrofie musculară Becker (forma clinică mai puţin severă, determinată de o mutaţie în gena pentru distrofină – MIM 310200). În acelaşi sens pledează şi transmiterea recesivă legată de X, sugerată de arborele genealogic: număr redus de bolnavi în familie; toţi bolnavii sunt de sex masculin; bolnavii sunt descendenţii unor părinţi sănătoşi; transmiterea se face discontinuu, de la un bărbat afectat, prin fiicele sale purtătoare, la băieţii acestora – transmitere oblică. Atât mama probandului (II-2) cât şi surorile ei (II-3, II-5) sunt heterozigote, deoarece au moştenit mutaţia odată cu cromosomul X patern. Fiicele lor sănătoase au fiecare o probabilitate de 1/2 de a fi moştenit mutaţia de la mamele lor şi deci un risc de 1/8 de a avea la rândul lor fii cu distrofie Becker (probabilitatea unei heterozigote de a avea un copil cu distrofie Becker este de 1/4, vezi tabelul 7.16.). Bărbaţii afectaţi nu transmit boala la descendenţi dacă se căsătoresc cu femei sănătoase neînrudite (care nu au această mutaţie) dar fiicele lor vor fi obligatoriu heterozigote şi vor avea un risc de 1/4 de a avea copii afectaţi (1/2 dintre băieţi). Întrucât gena care determină această boală este cunoscută, diagnosticul molecular poate fi aplicat prenatal pentru a preveni naşterea copiilor afectaţi. Tabelul 7.16. Tabelul Punett ilustrând riscul de recurenţă a afecţiunii în descendenţa purtătoarelor de mutaţie (sănătoase)

Tatăl

Mama X

N

Y

XN X NX N

Xa X NX a

X NY

X aY

B. EVALUAREA UNUI CAZ SPORADIC Naşterea unui copil bolnav într-o familie de oameni sănătoşi reprezintă de cele mai multe ori o adevărată dramă familială. În practica medicală, situaţia este destul de frecventă, constituind o bună parte din cazurile pentru care se solicită sfat genetic cu scopul de a se

156

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

calcula riscul de reapariţie a afecţiunii la viitorii copii ai familiei respective. Calcularea riscului de recurenţă nu este întotdeauna simplă, deoarece naşterea unui copil afectat din părinţi sănătoşi poate avea cauze diverse, care trebuie analizate cu atenţie. a. Naşterea unui copil bolnav din părinţi sănătoşi este cel mai adesea datorată bolilor recesive, fie autosomale, când ambii părinţi sunt purtători sănătoşi (heterozigoţi Na) ai unor mutaţii care afectează acelaşi locus genetic, fie gonosomale, dacă este vorba de un băiat bolnav (în acestă situaţie doar mama este purtătoare, XNXa). b. Naşterea unui copil bolnav din părinţi sănătoşi poate fi rezultatul unei boli dominante cu penetranţă incompletă, unul dintre părinţi fiind în acest caz purtător asimptomatic de mutaţie. c. Părinţii sănătoşi pot da naştere unui copil cu o boală monogenică, în situaţia apariţiei unei mutaţii noi (dominantă autosomală sau recesivă legată de X) care survine în celulele sexuale ale unuia dintre părinţi. Vârsta paternă avansată ca şi expunerea la agenţi mutageni favorizează producerea mutaţiilor genice. Agentul mutagen nu este totdeauna decelabil, dar cazurile spontane, nou apărute, pot constitui cazuri primare, care vor transmite afecţiunea generaţiei următoare. d. Copii bolnavi proveniţi din părinţi sănătoşi pot avea boli genetice cu determinism poligenic (multifactorial), atunci când copilul moşteneşte de la ambii părinţi un număr de gene anormale ce depăşeşte pragul de risc (vezi capitolul „Ereditatea multifactorială”). Evenimentul se produce cu atât mai frecvent, cu cât există şi alţi membri afectaţi în familie sau condiţii favorizante ale mediului extern. e. Copilul bolnav poate avea o boală cromosomică, produsă de agenţi mutageni de mediu sau apărută în urma existenţei unei anomalii cromosomice echilibrate la unul dintre părinţi. f. O ultimă posibilitate este reprezentată de existenţa unei fenocopii, anomalii datorite factorilor de mediu, dar care se manifestă congenital, mimând o afecţiune ereditară. Există trei posibilităţi de estimare a riscului în prezenţa unei anamneze familiale negative. Prima este legată de dobândirea de informaţii noi, care ar putea orienta către un anumit tip de transmitere, de exemplu prezenţa consanguinităţii în familie (boală monogenică recesivă autosomală) vârsta maternă avansată (boală cromosomică) sau vârsta paternă avansată (boală dominantă autosomală determinată de o mutaţie genică nouă). Dacă nu există date sugestive, atunci boala însăşi poate fi relevantă asupra modului de transmitere; catalogul bolilor monogenice „Mendelian Inheritance in Man” furnizează informaţii asupra bolilor genetice cunoscute. Astfel, identificarea unui copil cu acondroplazie (MIM 100800) semnifică un risc mic de recurenţă în fratrie, boala fiind consecinţa unei mutaţii noi care se transmite dominant autosomal, în timp ce diagnosticul de mucoviscidoză (MIM 219700, boală recesivă autosomală) sau de distrofie musculară Duchenne (MIM 310200, boală recesivă legată de X) este asociat unui risc de recurenţă de 25%. Dacă nu există nici factori familiali şi nici un mecanism cunoscut, riscul maxim va fi apreciat la 25%, luându-se astfel în consideraţie posibilitatea unei boli recesive (autosomale sau legate de X). În această situaţie se trece cu vederea posibilitatea extrem de rară a unei boli dominante cu penetranţă incompletă. Estimarea riscului de recurenţă la 25% este foarte importantă pentru familiile care au o percepţie greşită asupra bolilor genetice: „nu există alţi bolnavi în familie, deci boala nu poate fi transmisă ereditar”. Un exemplu în acest sens îl constituie cazul clinic 4 (figura 7.12.). Un băiat de 14 ani este trimis pentru consult genetic deoarece a fost diagnosticat cu retinopatie pigmentară

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

157

(retinitis pigmentosa). El a remarcat scăderea treptată a acuităţii vizuale, începând de la vârsta de 10 ani şi este în prezent practic orb. Probandul are un frate mai mic, în vârstă de 7 ani, care a remarcat şi el o scădere a acuităţii vizuale pe parcursul ultimului an. Două surori mai mici, în vârstă de 8 şi respectiv 3 ani, sunt sănătoase, ca şi părinţii şi rudele lor. Părinţii copiilor sunt preocupaţi de posibilitatea copiilor aparent sănătoşi de a manifesta boala în viitor, precum şi de riscul recurenţei afecţiunii la descendenţii băiatului orb.

Figura 7.12. Arborele genealogic al familiei (cazul clinic 4) Catalogul McKusick relevă faptul că retinopatia pigmentară este o boală heterogenă din punct de vedere genetic, putând prezenta orice mod de transmitere mendeliană: autosomal recesivă – MIM 268000, autosomal dominantă – MIM 180100 sau recesivă legată de X – MIM 312650. În situaţia de faţă băiatul afectat ar putea avea o formă recesivă legată de X sau o formă dominantă autosomală, consecinţa unei mutaţii noi. Simptomele prezente la fratele său sugerează că ambii băieţi pot fi afectaţi, fapt care a fost confirmat de examenul oftalmologic. Acest lucru indică o transmitere recesivă (pe orizontală). Transmiterea autosomală recesivă este sugerată de gravitatea şi manifestarea precoce a afecţiunii. Riscul de recurenţă a bolii în fratria bolnavilor este de 25% (părinţii sunt cert heterozigoţi, Na) în timp ce riscul de recurenţă la descendenţii bolnavilor este redus dacă ei evită căsătoriile consanguine cu femei care ar putea fi purtătoare sănătoase de mutaţie. Modalitatea concretă de calcul a riscului de recurenţă este prezentată în capitolele „Genetica populaţiilor” şi „Sfatul genetic”.

III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR A. DEFINIŢI TERMENII URMĂTORI: - homozigot - heterozigot - hemizigot

- heterozigot compus - genă recesivă - arbore genealogic

- genă dominantă - fenotip - mutaţie

B. RĂSPUNDEŢI LA URMĂTOARELE ÎNTREBĂRI: 1. 2. 3. 4. 5.

Care sunt criteriile de recunoaştere a transmiterii dominante? Care sunt criteriile de recunoaştere a transmiterii recesive? Cum recunoaşteţi că un caracter anormal este determinat de mutaţia unei gene autosomale? Cum recunoaşteţi că un caracter anormal este determinat de mutaţia unei gene situate pe cromosomul X? Ce caracter normal studiat anterior se transmite dominant legat de cromosomul X?

158 6. 7.

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale Un cuplu de părinti, afectaţi de o boală genetică cu transmitere verticală în arborele genealogic, are următorii copii: o fată (2 ani) cu o formă gravă de boală (homozigotă); un băiat (4 ani) bolnav, heterozigot şi o fată (6 ani) sănătoasă. Ce probabilitate are cuplul de a avea un alt copil afectat? Determinaţi tipul transmiterii caracterelor anormale prezente în familiile reprezentate în arborii genealogici din figurile 7.13.7.15. Estimaţi riscul de recurenţă a afecţiunii la descendenţii probandului (II.1 - figura 7.13.; III.1 – figura 7.14.; III.4 – figura 7.15.).

1

I

2 2

1

II

1

III

3

2

4

3 4

5

3

7

6

4

8

6

5

Figura 7.13. Arbore genealogic 1

I

2

1

II

1

III

5

4

3

6

4

5

2

3

Figura 7.14. Arbore genealogic 3 1 2

I

2

1

II

IV

3

2

1

IV

III

2

1

2

1

3

3

2

5

4 4

3

4 6

5

7

6

7

4

Figura 7.15. Arbore genealogic

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun din cele enunţate ("complement simplu"):

Transmiterea ereditară a caracterelor monogenice anormale

159

1. Prin căsătoria a doi indivizi afectaţi de aceeaşi boală dominantă autosomală vor rezulta copii homozigoţi în proporţie de: A. 0%, B. 25% C. 50%, D. 75%, E. 100% 2. Care este probabilitatea unui cuplu heterozigot pentru o aceeaşi genă mutantă recesivă de a avea copii sănătoşi? A. 0%, B. 25% C. 50%, D. 75%, E. 100% II. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("complement grupat"): A - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3; B - dacă sunt corecte răspunsurile 1,3; C - dacă sunt corecte răspunsurile 2,4; D - dacă este corect răspunsul 4; E - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3,4. 3.

În cazul unei femei cu albinism oculo-cutanat: 1. afecţiunea se regăseşte obligatoriu la unul dintre părinţii săi; 2. dintre copii săi, băieţii vor moşteni afecţiunea, iar fetele vor fi sănătoase; 3. genotipul său este heterozigot; 4. nici unul dintre copii săi nu va fi afectat, dacă se căsătoreşte cu o persoană homozigotă normală. 4. Un cuplu format dintr-un bărbat sănătos şi o femeie purtătoare a unei gene mutante pentru hemofilia A, are o fată ce prezintă semnele clinice ale acestei afecţiuni. Care dintre următoarele mecanisme pot explica apariţia bolii la fetiţă? 1. fetiţa are şi sindrom Turner; 2. existenţa unui mozaic germinal patern (o mutaţie a genei corespunzătoare de pe cromosomul X în unele celule sexuale paterne); 3. s-a produs inactivarea preferenţială a cromosomului X provenit de la tată, în condiţiile în care fata a moştenit cromosomul cu genă mutantă al mamei; 4. fetiţa prezintă simultan sindromul Down.

III. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("teste tip cauză-efect"): A - dacă ambele propoziţii sunt adevărate şi între ele există relaţie cauză-efect; B - dacă ambele propoziţii sunt adevărate, dar între ele nu există relaţie cauză-efect; C - dacă prima propoziţie este adevărată, iar a doua falsă; D - dacă prima propoziţie este falsă, iar a doua este adevărată; E - dacă ambele propoziţii sunt false. 5. O femeie care are tatăl afectat de hemofilie va avea toţi băieţii afectaţi, deoarece ea a moştenit obligatoriu gena mutantă de la tatăl său 6. Un individ afectat de hipercolesterolemie familială are un risc de 50% de a avea descendenţi anormali, deoarece el prezintă obligatoriu un genotip An. IV. Asociaţi enunţurilor din coloana din stânga notate cu cifre, enunţurile corespunzătoare din coloana din dreapta, notate cu litere: 1. Două fete bolnave născute din părinţi sănătoşi; 2. Tată şi fiu cu aceeaşi afecţiune; 3. Veri primari (băieţi) cu aceeaşi boală; 4. Tatăl şi 3 fete cu aceeaşi boală, 2 băieţi sănătoşi; 5. Gemeni monozigoţi cu aceeaşi boală;

A. Dominantă autosomală; B. Dominantă legată de X; C. Recesivă autosomală; D. Recesivă legată de X; E. Date neconcludente.

8. EREDITATEA MULTIFACTORIAL\ I. DATE TEORETICE Numeroase caractere normale şi anormale sunt determinate de interacţiunea, în proporţii variate, între factorii ereditari şi cei de mediu (tabelul 8.1.), fiind considerate a avea o ereditate multifactorială. Ele prezintă o agregare familială evidentă, dar transmiterea lor în succesiunea generaţiilor nu respectă legile lui Mendel. Riscul de recurenţă se calculează, în consecinţă, empiric şi este mai redus decât în cazul caracterelor cu determinism monogenic. Tabelul 8.1. Caractere ereditare normale şi anormale determinate multifactorial Caractere normale

Caractere anormale Anomalii congenitale (unice, izolate) Boli comune ale adultului Tensiunea arterială Despicătura labio-palatină Diabetul zaharat Dermatoglifele Stenoza hipertrofică de pilor Epilepsia Talia Spina bifida Glaucomul Greutatea Piciorul strâmb congenital Hipertensiunea arterială Inteligenţa Luxaţia congenitală de şold Boala coronariană Culoarea pielii Malformaţii congenitale cardiace Schizofrenia Componenta genetică a caracterelor multifactoriale este reprezentată de mai multe gene, fiecare cu o pondere mică în determinismul caracterului respectiv, dar al căror efecte sunt cumulate (teoria poligenică a caracterelor multifactoriale) respectiv de un număr redus de gene, unele având o pondere mai importantă în etiologia caracterului (teoria oligogenică). Pentru evaluarea factorilor genetici în determinismul unui caracter multifactorial este utilizat un indice, numit heritabilitate (h2), egal cu raportul dintre variaţia factorilor genetici implicaţi în formarea acelui caracter şi variaţia fenotipurilor pe care le determină: h2 = VG/VF unde VG este variaţia factorilor genetici, iar VF variaţia fenotipurilor. În tabelul 8.2. este prezentată heritabilitatea pentru unele boli multifactoriale.

A. TIPURI DE EREDITATE MULTIFACTORIALĂ 1. EREDITATEA MULTIFACTORIALĂ A CARACTERELOR CANTITATIVE (MODELUL DISTRIBUŢIEI CONTINUE) Modelul distribuţiei continue explică modul de transmitere a numeroase caractere cantitative, precum: tensiunea arterială, talia, greutatea, inteligenţa etc. Aceste caractere sunt rezultatul intervenţiei mai multor gene şi a factorilor de mediu. Efectele acestor gene, care ocupă loci diferiţi, sunt mici şi aditive, fără a exista relaţii de dominanţă – recesivitate sau codominanţă.

162

Ereditatea multifactorială Tabelul 8.2. Estimări ale heritabilităţii pentru diverse boli multifactoriale Boala

Incidenţa în populaţie (%) Schizofrenia 1 Astmul 4 Despicătura labială / palatină 0,1 Stenoza pilorică 0,3 Spondilita anchilopoietică 0,2 Piciorul strâmb congenital 0,1 Boala coronariană 3 Hipertensiunea arterială esenţială 5 Subluxaţia congenitală de şold 0,1 Anencefalia şi spina bifida 0,3 Ulcerul peptic 4 Malformaţii congenitale cardiace 0,5

Heritabilitatea 85 80 76 75 70 68 65 62 60 60 37 35

Caracterele cantitative prezintă următoarele particularităţi: distribuţia continuă în populaţie (sunt prezente la toate persoanele, dar se manifestă cu grade diferite de intensitate) - reprezentarea grafică a distribuţiei este o curbă Gauss. Cu cât numărul genelor implicate este mai mare, cu atât reprezentarea grafică este mai apropiată de o curbă Gauss. De exemplu, prin acţiunea unei perechi de gene alele codominante rezultă 3 fenotipuri distincte, două perechi determină 5 variante fenotipice, trei perechi 7 variante fenotipice etc. (figura 8.1.). ca urmare a distribuţiei de tip gaussian, majoritatea indivizilor manifestă caracterul respectiv cu o intensitate medie, în timp ce valorile extreme ale acelui caracter, foarte mici sau foarte mari, se regăsesc în populaţie la un număr minim de persoane. Astfel, nu există o distincţie clară între normal şi patologic. Diferenţierea se realizează prin calculul deviaţiei standard (DS) şi/sau al percentililor Figura 8.1. Distribuţia fenotipurilor în (P). Deviaţia standard este egală cu radicalul cazul înălţimii, dacă se consideră variaţiei fenotipice. Percentilii arată procentul existenţa a 1, 2 sau 3 loci, fiecare cu câte indivizilor din populaţie ce manifestă două alele cu frecvenţă egală caracterul cu o anumită intensitate. Se consideră că 68% din indivizii populaţiei au intensitatea manifestării fenotipice corespunzătoare unei valori ce se înscrie intervalul ± 1 DS, iar 95% în intervalul ± 2 DS (figura 8.2.). Pentru majoritatea caracterelor multifactoriale cantitative se consideră patologice manifestările fenotipice care nu se încadrează în intervalul – 2DS → + 2DS. tendinţa de “regresie spre medie” a caracterului în succesiunea generaţiilor. În cazul în care un cuplu parental prezintă un caracter cantitativ, precum talia sau inteligenţa, a cărui

Ereditatea multifactorială

163

valoare este situată spre unul din capatele scalei de valori, la descendenţi valoarea caracterului respectiv va fi apropiată de media manifestării.

Figura 8.2. Distribuţia gaussiană a caracterelor multifactoriale cantitative

2. EREDITATEA MULTIFACTORIALĂ CU PRAG (CARACTERE CU DISTRIBUŢIE DISCONTINUĂ) Un număr important de caractere multifactoriale anormale nu au o distribuţie de tip continuu în populaţia generală, ci o distribuţie bimodală, unele persoane prezentând acel caracter anormal, altele nu. În această categorie de afecţiuni intră anomaliile congenitale izolate şi unele boli comune ale adultului (tabelul 8.1.). Totuşi, aceste boli nu pot fi încadrate în categoria bolilor monogenice, întrucât transmiterea lor nu respectă legile lui Mendel. Pentru acest gen de caractere anormale Falconer (1981) a propus aşa-numitul model al eredităţii multifactoriale cu prag. Conform acestui model: predispoziţia genetică la boală (determinată de factorii genetici) prezintă o distribuţie continuă în populaţie (după un model gaussian). Orice persoană dintr-o anumită populaţie prezintă o predispoziţie la boală, mai mare sau mai mică. există însă un aşa-numit prag al acestei predispoziţii, care odată depăşit determină apariţia bolii. Aşa se explică distribuţia bimodală a acestor boli, o persoană putând fi sau sănătoasă, sau bolnavă. Modelul eredităţii multifactoriale cu prag explică tendinţa de agregare a acestor boli în familie. În cazul rudelor unei persoane bolnave, acestea au un număr mai mare de gene de susceptibilitate şi, de aceea, curba de distribuţie a predispoziţiei este deplasată către dreapta, în timp ce pragul rămâne acelaşi (figura 8.3.).

164

Ereditatea multifactorială

Figura 8.3. Curbele de distribuţie ale predispoziţiei în populaţia generală şi la rude în cazul unei afecţiuni transmise după modelul eredităţii multifactoriale cu prag

B. RISCUL DE RECURENŢĂ ÎN AFECŢIUNILE MULTIFACTORIALE În timp ce riscul de recurenţă poate fi calculat cu exactitate în cazul bolilor monogenice, în bolile multifactoriale riscul se calculează empiric. Aceasta deoarece nu sunt cunoscute cu exactitate numărul genelor ce contribuie la determinismul acelei boli, constituţia alelică a părinţilor şi gradul de implicare al factorilor de mediu. Pentru aprecierea riscului de recurenţă în bolile multifactoriale, sunt necesare studii populaţionale ample, urmărindu-se recurenţa unei anumite boli în familiile în care există deja un individ cu acea boală. Însă, riscul de recurenţă în bolile multifactoriale variază de la o populaţie la alta, deoarece frecvenţa alelelor mutante şi factorii de mediu prezintă variaţii importante de la o regiune la alta. În condiţiile absenţei cazurilor de boală multifactorială într-o familie, riscul apariţiei unei astfel de afecţiuni este de aproximativ 3%. În cazul existenţei unor persoane afectate riscul de recurenţă este influenţat de mai mulţi factori: Riscul de recurenţă este mai mare atunci când în familie sunt mai mulţi indivizi afectaţi. De exemplu, riscul de recurenţă pentru un defect de sept ventricular (DSV) este de 3% atunci când există un singur descendent afectat, dar creşte la aproximativ 10% dacă malformaţia este prezentă la doi descendenţi. Existenţa mai multor descendenţi bolnavi într-o familie înseamnă o plasare mai spre dreapta pe curba de distribuţie a predispoziţiei, deci, implicit, un risc mai mare de apariţie a unor noi descendenţi bolnavi. Riscul de recurenţă este mai mare dacă probandul are o formă mai severă de boală. Existenţa unei forme mai severe de boală presupune existenţa în familie a unui număr mai mare de factori de risc genetici sau ambientali, deci o plasare spre dreapta a curbei predispoziţiei. De exemplu, în cazul despicăturii labio-palatine, riscul de recurenţă creşte de la 2% (pentru formele unilaterale) la peste 6% (pentru formele bilaterale).

Ereditatea multifactorială

165

În cazul bolilor ce prezintă o frecvenţă mai mare la un anumit sex, riscul de recurenţă este crescut dacă probandul aparţine sexului mai rar afectat. De exemplu în stenoza hipertrofică de pilor, afecţiune mai frecventă la sexul masculin (1/200 băieţi faţă de 1/1.000 fete), riscul de recurenţă este mult mai mare când probandul este de sex feminin. Apariţia bolii la sexul feminin presupune acumularea mai multor factori de risc în familie, deci o amplasare spre dreapta a curbei de distribuţie a predispoziţiei. Riscul de recurenţă scade rapid odată cu creşterea gradului de rudenie cu persoana afectată. În timp ce riscul de recurenţă pentru bolile monogenice scade cu 50% pentru fiecare generaţie, reducerea se face mult mai rapid în cazul bolilor multifactoriale (tabelul 8.3.). Aceasta se datorează faptului că pentru apariţia bolii este nevoie de combinarea mai multor factori genetici şi de mediu, condiţii care pot fi greu îndeplinite pentru rudele mai îndepărtate. Tabelul 8.3. Riscul de recurenţă corelat cu gradul de rudenie în boli multifactoriale BOALA

RISCUL (%) Rude de gradul 1

Rude de gradul 2

Rude de gradul 3

Populaţia generală

Despicătura labio/palatină

4,0

0,7

0,3

0,1

Piciorul strâmb congenital Luxaţie congenitală de şold Autismul infantil

2,5 5,0 4,5

0,5 0,6 0,1

0,2 0,4 0,05

0,1 0,2 0,04

Conceptul eredităţii multifactoriale a fost propus pentru a explica agregarea familială a unor malformaţii congenitale unice şi a bolilor comune ale adultului care nu respectă modelul de transmitere mendelian. Aceste afecţiuni sunt considerate a fi rezultatul interacţiunii mai mulor factori genetici şi de mediu. Multe caractere normale precum talia, inteligenţa etc. prezintă în populaţia generală o distribuţie de tip continuu, gaussian. În cazul malformaţiilor congenitale şi a bolilor comune ale adultului distribuţia în populaţie este discontinuă, afecţiunea fiind prezentă doar la unii indivizi. În aceste boli, susceptibilitatea la boală are o distribuţie gaussiană, dar apariţia afecţiunii este condiţionată de depăşirea unui prag de susceptibilitate (modelul eredităţii multifactoriale cu prag). Riscul de recurenţă în cazul afecţiunilor multifactoriale este influenţat de severitatea bolii, gradul de rudenie cu probandul, numărul rudelor afectate şi de sexul persoanei afectate, în bolile cu incidenţă mai mare la un anumit sex.

C. EREDITATEA OLIGOGENICĂ În unele afecţiuni multifactoriale a fost identificată influenţa crescută a câtorva gene cu efect major şi în asociere cu alte gene şi factori de mediu care au efecte mici suplimentare. Astfel, a fost elaborat modelul oligogenic care permite identificarea mai uşoară a genelor de risc şi un calcul mai exact al riscului de recurenţă. Genele care au rolul cel mai important în determinismul unor asemenea caractere se numesc gene majore, iar restul factorilor alcătuiesc componenta multifactorială.

166

Ereditatea multifactorială

Un model oligogenic a fost propus pentru determinismul taliei. Modelul presupune existenţa a două gene majore notate cu A şi a. Indivizii cu genotip AA tind să fie mai înalţi, în timp ce indivizii cu genotip aa tind să fie mai scunzi, iar cei cu genotip Aa vor avea o talie intermediară. La componenta genetică se asociază componenta multifactorială care generează variaţii suplimentare. Ca urmare, cei cu genotip aa vor avea înălţimi cuprinse între 130 şi 170 cm, cei cu genotip Aa vor avea talii de 150 până la 190 cm, iar cei cu genotip AA între 170 şi 210 cm (figura 8.4.). Suprapunerile dintre cele trei genotipuri sunt generate de “fondul” multifactorial. Pe ansamblu, distribuţia după înălţime a populaţiei urmează o curbă de tip gaussian prin suprapunerea celor trei distribuţii ale fiecărui genotip.

Figura 8.4. Distribuţia gaussiană a unui caracter precum talia în determinismul căruia intervin două gene majore (A şi a) şi un “fond” multifactorial (după Jorde et al, 1999) Multe din aşa-numitele “boli comune ale adultului” par a fi rezultatul unui determinism oligogenic, ca urmare a intervenţiei unor gene majore. Astfel, sunt cazuri de cancer de colon, cancer de sân sau boală coronariană în care afecţiunea este moştenită similar bolilor monogenice (cu variaţii suplimentare în susceptibilitatea la boală induse de intervenţia altor factori genetici sau de mediu). Identificarea acestor cazuri este importantă deoarece: studiul lor permite identificarea genelor majore care ar putea reprezenta chei importante în înţelegerea fiziopatologiei şi în descoperirea unor noi metode terapeutice; riscul de recurenţă în aceste cazuri este semnificativ mai crescut faţă de situaţia bolilor multifactoriale în general, datorită distribuţiei de tip mendelian a genelor majore; determinismul oligogenic uşurează identificarea persoanelor cu risc crescut într-o familie, premisă importantă în profilaxia acestor boli. Unele caractere au un determinism oligogenic: sunt determinate de câteva gene majore ce interacţionează cu un “fond” multifactorial, reprezentat de o serie de gene cu acţiune minoră şi de factorii ambientali. Riscul de recurenţă al acestor afecţiuni este semnificativ crescut comparativ cu alte boli multifactoriale.

D. METODE DE APRECIERE A DETERMINISMULUI GENETIC AL UNUI CARACTER MULTIFACTORIAL Există două strategii importante pentru estimarea influenţei relative a eredităţii şi mediului în determinismul caracterelor multifactoriale: studiul gemenilor şi studiile de adopţie.

Ereditatea multifactorială

167

1. STUDIUL GEMENILOR În populaţia caucaziană sarcinile gemelare au o incidenţă de 1%. Există două tipuri de gemeni: monozigoţi (MZ) – 1/3 din cazuri şi dizigoţi (DZ) – 2/3 din cazuri. Gemenii monozigoţi rezultă dintr-un singur zigot, ca urmare a separării embrionului în două mase distincte în cursul primelor 14 zile post-fecundare. Ei reprezintă clone naturale şi au un aspect fizic asemănător. Gemenii dizigoţi sunt rezultatul unei ovulaţii duble urmate de fertilizarea fiecărui ovul de câte un spermatozoid. Ei au acelaşi grad de asemănare genetică precum doi fraţi. Deoarece gemenii MZ sunt identici genetic, orice diferenţă între ei este determinată de intervenţia factorilor de mediu. Studiul gemenilor constă în compararea a diferite caractere între gemenii MZ şi DZ. Dacă ambii membri ai unei perechi de gemeni prezintă un anumit caracter (de exemplu, despicătură palatină), ei sunt consideraţi a fi concordanţi. Dacă nu prezintă acelaşi caracter, ei sunt consideraţi discordanţi. Pentru caracterele determinate exclusiv genetic, concordanţa la gemenii MZ este întotdeauna completă, în timp ce gemenii dizigoţi au o concordanţă mai redusă, deoarece ei au în comun doar 50% din gene. În cazul caracterelor cantitative, precum talia sau tensiunea arterială, testul gemenilor nu este potrivit pentru estimarea concordanţei. În aceste cazuri este utilizat coeficientul de corelaţie intraclasă, care are valori în intervalul –1,0 şi +1,0 şi măsoară gradul de asemănare al acelor cantităţi într-o populaţie. Un caracter determinat în întregime genetic va avea un coeficient de corelaţie de 1,0 la gemenii MZ şi 0,5 la gemenii DZ. Compararea ratelor de concordanţă sau a coeficienţilor de corelaţie între gemenii MZ şi DZ permite aprecierea ponderii factorilor genetici în determinismul caracterelor multifactoriale. Studiul gemenilor prezintă însă unele dezavantaje: dificultatea realizării de studii pe loturi mari care ar da rezultate semnificative statistic; existenţa unor diferenţe genetice între gemenii MZ în ceea ce priveşte: tipul anticorpilor şi cel al receptorilor limfocitelor T prin rearanjamente epigenetice; mutaţiile somatice; numărul moleculelor de ADN mitocondrial (deoarece împărţirea lor are loc prin fenomene epigenetice); modelul inactivării unuia din cei doi cromosomi X la gemenii MZ de sex feminin. posibilitatea ca gemenii DZ să aibă taţi diferiţi; în situaţia caracterelor ce prezintă frecvenţe diferite la cele două sexe, ratele de concordanţă pot diferi în cazul perechilor de gemeni DZ de acelaşi sex şi cele de sex opus. În aceste situaţii, pentru compararea ratelor de concordanţă faţă de gemenii MZ trebuie utilizate numai perechi de gemeni DZ de acelaşi sex; gemenii MZ care cresc împreună sunt supuşi acţiunii aceloraşi factori de mediu, fapt care poate influenţa rata de concordanţă pentru unele caractere. Pentru a evita acest factor de eroare, o metodă utilă este studiul gemenilor MZ crescuţi în medii diferite.

2. STUDIILE DE ADOPŢIE Studiile de adopţie reprezintă metodele cele mai bune pentru discriminarea între factorii genetici şi cei de mediu în determinismul unui caracter. În situaţia în care copiii proveniţi dintr-o familie în care apare o anumită boală cu caracter familial dezvoltă acea boală mai frecvent decât copiii adoptaţi din familii sănătoase, rezultă că există un factor genetic care intervine în determinismul acelei boli. De exemplu, circa 8 - 10% din copiii unor

168

Ereditatea multifactorială

părinţi schizofrenici adoptaţi de familii sănătoase dezvoltă această boală, faţă de doar 1% în cazul copiilor adoptaţi care au părinţi sănătoşi. Ca şi în cazul studiului gemenilor, există câţiva factori ce pot influenţa rezultatele, exagerând aparent importanţa factorilor genetici: factorii de mediu ce acţionează prenatal pot avea consecinţe de lungă durată; copiii sunt adoptaţi deseori după ce au fost crescuţi un număr de ani în cadrul familiei; de multe ori agenţiile de adopţie caută părinţi adoptivi din medii asemănătoare socioeconomic cu cele de origine. Aprecierea componentei ereditare în determinismul unui caracter multifactorial se realizează prin studii comparative pe perechi de gemeni MZ şi DZ sau prin studii de adopţie.

E. IDENTIFICAREA GENELOR IMPLICATE ÎN DETERMINISMUL CARACTERELOR MULTIFACTORIALE Metode precum studiul gemenilor sau studiile de adopţie nu sunt capabile să identifice genele specifice implicate în determinismul caracterelor multifactoriale. Acest lucru este însă important pentru înţelegerea corectă a patogeniei şi pentru tratamentul corect al acestor boli. Există mai mulţi factori ce fac dificilă identificarea genelor implicate în determinismul caracterelor multifactoriale: heterogenitatea de locus, intervenţia a numeroase gene cu penetranţă scăzută, debutul tardiv al multor boli multifactoriale sau existenţa fenocopiilor (indivizi afectaţi fără a fi purtători ai unei mutaţii genice). În prezent sunt utilizate mai multe strategii pentru identificarea locilor genetici implicaţi în determinismul caracterelor multifactoriale: Analizele de înlănţuire sunt utile în special pentru bolile cu transmitere monogenică, dar şi pentru unele afecţiuni în care intervin gene majore de susceptibilitate (determinism oligogenic). Metoda perechilor de descendenţi afectaţi se bazează pe identificarea familiilor în care există doi sau mai mulţi fraţi afectaţi. La aceştia se realizează o scanare a întregului genom cu markeri polimorfici. Se identifică markerii cu concordanţă de peste 50% la fraţii afectaţi, aceştia putând fi înlănţuiţi cu loci de susceptibilitate la boală. Această metodă a fost utilizată de exemplu pentru evidenţierea regiunilor HLA ce contribuie la susceptibilitatea pentru diabetul zaharat tip I. Dezavantajele metodei sunt reprezentate de necesitatea unor loturi mari şi rezoluţia redusă (regiunea genomică incriminată este adeseori mare, de peste 10 cM). Studiile de dezechilibru al înlănţuirii utilizează scanarea întregului genom cu ajutorul unor seturi de markeri polimorfici, precum microsateliţi şi, mai recent, polimorfisme mononucleotidice (single nucleotide polymorphisms – SNPs). Studii de înlănţuire pe modele animale. Această metodă a fost utilizată pentru studiul unor boli precum hipertensiunea arterială sau diabetul zaharat tip I. Metoda permite identificarea unor gene individuale ce intervin în determinismul unor boli multifactoriale. Identificarea locilor care contribuie la susceptibilitatea pentru afecţiunile multifactoriale se realizează prin: analize de înlănţuire clasice, analize de înlănţuire pe perechi de descendenţi afectaţi, studii de dezechilibru al înlănţuirii sau analize de înlănţuire pe modele animale.

Ereditatea multifactorială

169

F. DERMATOGLIFELE – EXEMPLU DE CARACTER NORMAL CU DETERMINISM MULTIFACTORIAL Dermatoglifele (gr.: derma = piele şi glyphein = a grava) reprezintă dispoziţia crestelor papilare (dermice) şi a pliurilor de flexie pe suprafaţa degetelor, palmelor şi plantelor. Pielea din celelalte regiuni ale corpului nu prezintă creste dermice. Caractere generale: Formarea în viaţa intrauterină: dermatoglifele încep să apară din săptămâna a 17-a de viaţă intrauterină prin cudarea ectodermului, ca urmare a creşterii sale mai rapide faţă de mezenchimul subiacent; pliurile de flexie se dezvoltă din luna a III-a, ca urmare a aderenţei epidermului la structurile subiacente şi a mişcării de flexie a degetelor pe palmă. Fixitatea: odată formate, crestele papilare îşi păstrează forma şi particularităţile în tot cursul vieţii, ulterior producându-se numai modificări ale dimensiunilor, prin creştere. Unicitatea: dispoziţia crestelor dermice precum şi modelele realizate de ansamblul lor sunt specifice fiecărei persoane, au un caracter individual, unic şi irepetabil. Există totuşi diferenţe chiar şi între cele două palme ale aceleiaşi persoane sau între gemenii monozigoţi, datorită factorilor de mediu diferiţi. Încadrarea în tipuri de model: deşi variate, dermatoglifele se pot încadra în anumite tipuri de model, ceea ce facilitează clasificarea şi studiul lor. Determinismul genetic: ponderea factorilor genetici (poligenie) în realizarea dermatoglifelor este de peste 95%. Pentru aceasta pledează: distribuţia continuă (gaussiană) în populaţie a numărului total de creste papilare de pe degete (suma crestelor digitale); aspectul concordant la gemenii monozigoţi în proporţie de 95% (teoretic, în lipsa unei varianţe a mediului, concordanţa poate fi de 100%); transmiterea modelelor de la părinţi la descendenţi; modificarea relativ specifică a configuraţiei dermatoglifelor în diferite boli genetice.

1. DERMATOGLIFELE DIGITALE Falanga distală. Modelele determinate de crestele dermice pe falanga terminală a degetelor pot fi clasificate în funcţie de numărul triradiilor. Triradiusul (figură deltică) este figura formată prin intersectarea a trei creste papilare, cu direcţii divergente. Se disting trei tipuri principale de modele (figura 8.5.): arcuri (engl.: arch) – notate cu A, sunt simple, fără triradius (figuri adeltice) şi piniforme, care prezintă un triradius situat în centrul figurii (monodeltice); bucle (engl.: loop) – notate cu L, prezintă un triradius (figuri monodeltice) ce se prelungeşte cu o buclă deschisă spre cubitus (bucle cubitale - UL) sau spre radius (bucle radiale - RL); vârtejuri (engl.: whorl) – notate cu W, au două sau trei triradii (bi- sau trideltice), şi pot fi de trei subtipuri: concentrice, spiralate şi bucle duble. Falanga medie şi proximală. Crestele papilare de pe aceste falange sunt paralele şi nu formează figuri, dar orientarea lor poate fi oblică, arcuată sau ondulată. La nivelul fiecărui deget pot fi identificate o serie de pliuri de flexie, corespunzătoare articulaţiilor interfalangiene şi metacarpo-falangiană. Fiecare deget, exceptând policele, are câte trei pliuri de flexie digitale. Policele, având doar două falange, are implicit numai două pliuri.

170

Ereditatea multifactorială

Figura 8.5. Modele ale dermatoglifelor de la nivelul falangei terminale a degetelor

Modelele dermatoglifelor digitale diferă şi prin dimensiuni şi amplasare, putându-se calcula doi parametri principali: Suma crestelor digitale (SCD) reprezintă numărul crestelor digitale ce participă la realizarea figurilor de pe cele 10 degete. Se calculează prin numărarea crestelor intersectate de o linie trasată între centrul şi triradiusul figurii respective. Pentru figurile adeltice SCD este 0. În cazul figurilor bi- şi trideltice se ia în considerare numărul cel mai mare de creste ce corespunde numai unuia dintre triradii. Valorile medii ale SCD sunt de 135 ± 47 la sexul masculin_şi 127 ± 45 la sexul feminin. Distribuţia figurilor digitale. Frecvenţa figurilor digitale diferă în funcţie de apartenenţa etnică, sex, lateralitate şi pentru fiecare deget în parte. În ansamblu, la ambele mâini predomină buclele (63,4%), urmate de vârtejuri (29,6%) şi arcuri (7%). Arcurile şi buclele radiale predomină pe index (II), buclele cubitale sunt mai frecvente pe degetul mic (V), iar vârtejurile predomină pe police (I). Variaţiile legate de sex sunt nete pentru arcuri care predomină la femei şi vârtejuri care sunt mai frecvente la bărbaţi. Aceasta explică valorile SCD mai mari la bărbaţi. Variaţiile de lateralitate sunt evidente pentru arcuri şi bucle, care predomină la mâna dreaptă.

2. DERMATOGLIFELE PALMARE Palma prezintă în mod normal trei şanţuri mai adânci decât cele determinate de crestele papilare, numite pliuri de flexie: Pliul longitudinal (pliul de flexie al policelui), determinat de mişcările de opoziţie ale policelui, porneşte din primul spaţiu interdigital, înconjură eminenţa tenară şi ajunge în pliul de flexie al articulaţiei pumnului (baza palmei). Pliul tranvers proximal (pliul de flexie al degetelor II-IV), porneşte din primul spaţiu interdigital, putând avea aceeaşi origine cu pliul de flexie al policelui şi ajunge în proximitatea marginii cubitale a palmei. Atunci când se prelungeşte până la marginea cubitală, este numit pliu Sydney, situaţie întâlnită la aproximativ 11% din populaţie, dar poate avea şi semnificaţie diagnostică în unele sindroame cromosomice. Pliul transvers distal (pliul de flexie al degetelor III-V), porneşte din dreptul celui de-al II-lea spaţiu interdigital şi se termină la marginea ulnară a mâinii. Uneori cele două pliuri transverse sunt fuzionate într-un pliu palmar transvers unic (engl.: single transversal crease, STC) numit şi pliu simian. Acesta se întâlneşte şi în populaţia generală, la o singură mână (aproximativ 4%) sau bilateral (aproximativ 1%), dar frecvenţa este mult mai mare în unele anomalii cromosomice (95% în trisomia 21 sindromul Down). Fuziunea celor două pliuri transverse poate fi incompletă, unirea lor făcându-se printr-un pliu intermediar, ce realizează un echivalent de STC. Cele trei pliuri de flexie palmare delimitează trei regiuni:

Ereditatea multifactorială

171

Eminenţa tenară delimitată de pliul de flexie al policelui prezintă creste papilare paralele şi uşor arcuate şi mult mai rar alte modele (bucle). Eminenţa hipotenară poate prezenta o varietate de modele ce se pot înscrie în tipurile de bază (arcuri, bucle vârtejuri). Regiunea subdigitală (superioară) cuprinde ariile interdigitale 2, 3, 4, delimitate de triradiile subdigitale (aflate la baza fiecărui deget) care se notează cu: a - pentru index (II); b - pentru medius (III); c - pentru inelar (IV); d - pentru auricular (V) (figura 8.6.). Uneori pot fi prezente bucle cu deschidere distală, vârtejuri sau se constată absenţa unui triradius. Două din crestele care formează triradiusul subdigital delimitează baza degetului, iar cea de-a treia: linia principală (notată cu A, B, C, D, după numele triradiusului subdigital corespunzător) - se prelungeşte spre unul dintre cele 13 sectoare ale palmei fără să se întretaie niciodată între ele. Linia principala A merge spre marginea ulnară a palmei, proiectându-se în câmpul 4 sau 5. Orientarea celorlalte linii principale depinde de orientarea liniei D care se orientează cel mai frecvent către spaţiul interdigital 2 sau 3. Suma numerelor corespunzătoare câmpurilor unde se termină liniile principale constituie indicele de Figura 8.6. Aspectul dermatoglifelor digitale şi transversalitate (IT). Valorile normale palmare la un individ normal ale IT sunt cuprinse între 24 şi 29 (de exempu: IT = A4 + B5 + C7 + D9 = 25). Acest indice apreciază gradul de tranversalitate al crestelor palmare (IT > 27 indică o tendinţă la orizontalizare a crestelor, iar IT < 24 indică verticalizarea acestora). La baza policelui, între eminenţa tenară şi hipotenară, se află triradiusul axial - t (figura 8.6.) care se prelungeşte cu linia principală T, ce se termină de obicei în câmpul 13. Poziţia t se apreciază pe baza unghiului atd (unghiul format de liniile imaginare care unesc triradiusurile a, t şi d). În funcţie de valoarea unghiului atd, poziţia triradiusului se notează cu: t - pentru atd < 45; t' - pentru 45 < atd < 56; t" - pentru atd >56.

3. ASPECTUL DERMATOGLIFELOR ÎN UNELE SINDROAME CROMOSOMICE Sindromul Down se caracterizează prin următoarele modificări ale dermatoglifelor: pliu palmar transvers unic (uni sau bilateral), preponderenţa buclelor cubitale sau radiale pe degetele IV-V, triradius axial situat distal (t' sau t") (figura 8.7.) şi buclă halucală.

172

Ereditatea multifactorială

Figura 8.7. Modificări ale dermatoglifelor care pot fi întâlnite la pacienţi cu sindrom Down Sindromul Edwards determinat de trisomia 18 se caracterizează prin: exces de arcuri (610), triradius axial situat distal şi, uneori, un singur pliu de flexie pe degetul V. Sindromul Patau determinat de trisomia 13 se caracterizează prin: pliu simian, triradius axial situat distal şi buclă, arc sau arc în formă de “S” pe haluce. Sindromul Turner determinat de monosomia X se caracterizează prin: triradius axial situat distal şi SCD peste medie. Dermatoglifele reprezintă totalitatea modelelor determinate de aşezarea crestelor papilare şi a pliurilor de flexie pe suprafaţa degetelor, palmelor şi plantelor. Dermatoglifele se formează în viaţa intrauterină, au un caracter fix, unic şi un determinism multifactorial în cadrul căruia factorii genetici reprezintă 95%.

II. APLICAŢII PRACTICE A. CALCULUL COEFICIENTULUI EREDITAR PENTRU UNELE CARACTERE MULTIFACTORIALE În tabelul 8.4. sunt specificate ratele de concordanţă la gemenii monozigoţi şi dizigoţi pentru unele caractere multifactoriale normale şi anormale. Aceste date pot fi utilizate pentru aprecierea ponderii factorilor ereditari în determinismul lor. Pentru aceasta se poate calcula un parametru numit coeficient ereditar (CE), după următoarea formulă:

concordanţa la MZ – concordanţa DZ CE = --------------------------------------------100 – concordanţa DZ În cazul unui CE = 1, caracterul este determinat exclusiv de factori genetici.

Ereditatea multifactorială

173

Tabelul 8.4. Ratele de concordanţă la gemenii monozigoţi şi dizigoţi pentru anumite caractere multifactoriale Caracterul normal sau afecţiunea Rata concordanţei la Rata concordanţei la multifactorială gemenii monozigoţi gemenii dizigoţi Talia 0,94 0,44 Coeficientul de inteligenţă 0,76 0,51 Dermatoglifele 0,95 0,49 Indexul de masă corporală 0,95 0,53 Tensiunea arterială sistolică 0,55 0,25 Tensiunea arterială diastolică 0,58 0,27 Alcoolismul 0,60 0,30 Autismul 0,92 0,0 Despicătura labio-palatină 0,38 0,08 Diabetul zaharat tip I 0,35 – 0,50 0,05 – 0,10 Diabetul zaharat tip II 0,70 – 0,90 0,25 – 0,40 Epilepsia 0,69 0,14 Scleroza multiplă 0,28 0,03 Schizofrenia 0,47 0,12 Spina bifida 0,72 0,33 Calculaţi coeficientul ereditar pentru caracterele normale şi anormale multifactoriale din tabelul 8.4. aplicând formula de mai sus. Care din acestea au coeficientul ereditar cel mai crescut? Interpretaţi aceste rezultate şi specificaţi importanţa lor în practica medicală.

B. METODE DE STUDIU AL DERMATOGLIFELOR Dermatoglifele pot fi observate direct cu ajutorul unei lupe, având grijă ca lumina să cadă oblic pe suprafaţa de examinare, sau cu ajutorul unui otoscop cu sursă de lumină încorporată. 1. Înregistrarea dermatoglifelor se poate realiza în mai multe moduri: Aplicarea unui rulou cu tuş pe suprafaţa palmei şi apoi aplicarea palmei pe o foaie de hârtie; se procedează similar pentru înregistrarea dermatoglifelor plantare. umezirea palmelor şi plantelor cu o soluţie de sulfit de sodiu, hidroxid de sodiu şi amidon şi aplicarea lor pe o hârtie fotografică, urmată apoi de fixarea hârtiei; colorarea palmelor şi plantelor cu un creion de grafit moale şi recoltarea dermatoglifelor cu ajutorul unor benzi adezive transparente (tip Scotch) care se lipesc apoi pe o foaie de hârtie pentru contrast. În laboratorul nostru se foloseşte următoarea tehnică: Pe o placă metalică sau o sticlă groasă se pune o mică cantitate de tuş tipografic; se întinde într-un strat subţire cu un rulou de cauciuc; scopul acestei manevre este de a depune uniform pe suprafaţa ruloului o peliculă de tuş (dacă ruloul este prea "încărcat" se îndepărtează surplusul de tuş deplasând ruloul pe suprafaţa unei hârtii); Se trece ruloul pe suprafaţa palmei, începând de la bază spre degete, având grijă să se "înnegrească" uniform toată suprafaţa digito-palmară; mâinile vor fi în prealabil spălate cu săpun sau şterse de transpiraţie cu un tifon curat (folosirea oricărui solvent, în special eter, este contraindicată); Palma înnegrită se aplică pe o coală de hârtie albă cu baza pumnului şi apoi, progresiv, cu restul compartimentelor. Se va urmări cu atenţie ca mâna să nu se mişte în cursul acestei acţiuni, pentru a nu şterge desenele digito-palmare recoltate. Pentru o imprimare mai bună se apasă uşor pe dosul mâinii, apoi degetelor li se dă o uşoară mişcare spre dreapta şi spre stânga, pentru a surprinde eventualele triradii situate pe marginea falangelor. Palma se ridică de pe coala de hârtie începând cu marginea radială şi se răstoarnă spre marginea cubitală, care va fi ultima regiune ce va păstra contact cu hârtia; în felul acesta se imprimă desenul marginii cubitale, putându-se evidenţia un eventual triradius în partea externă a regiunii hipotenare.

174

Ereditatea multifactorială

La sfârşit se înregistrează din nou figurile digitale, prin rularea fiecărui deget în parte. 2. Analiza dermatoglifelor se realizează în modul următor: la nivelul degetelor: cu ajutorul unui creion bine ascuţit localizaţi poziţia şi numărul triradiilor digitale şi trasaţi conturul figurilor digitale; trasaţi o linie între mijlocul figurii digitale şi triradiusul acesteia; stabiliţi numărul de creste papilare intersectate şi calculaţi suma pentru cele 10 degete. la nivelul palmei: localizaţi triradiile subdigitale şi cel axial; măsuraţi unghiul atd; trasaţi liniile principale A, B, C, D şi T, stabilind în ce câmp al palmei îşi termină parcursul; calculaţi indicele de transversalitate însumând valorile câmpurilor respective; examinaţi cu atenţie regiunile tenară, hipotenară şi interdigitale, pentru a stabili eventuala prezenţă a unei figuri în aceste regiuni; stabiliţi dispoziţia pliurilor de flexie de la nivelul degetelor şi palmelor şi recunoaşteţi eventualele tipuri particulare; comparaţi valorile obţinute pentru SCD şi IT cu valorile medii corespunzătoare pentru ţara noastră; corelaţi frecvenţele modelelor digitale cu frecvenţele menţionate în lucrarea practică; stabiliţi variaţiile de lateralitate şi diferenţele ce ţin de sex (calculaţi raportul A/V). 3. Calculaţi parametrii dermatoglifelor digito-palmare pentru lotul reprezentat de grupele ce fac lucrarea practică; comparaţi rezultatele obţinute cu valorile medii obţinute pentru ţara noastră.

III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR A. DEFINIŢI URMĂTOARELE NOŢIUNI: poligenie gemeni monozigoţi dermatoglife triradius

multifactorial gemeni dizigoţi bucle arcuri

heritabilitate coeficient ereditar vârtejuri radiant

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. 2. 3.

În cazul bolilor multifactoriale riscul de recurenţă este mai crescut decât pentru bolile cu determinism monogenic? (adevărat / fals) Hipertensiunea arterială este o afecţiune cu determinism multifactorial? (adevărat / fals) Doi părinţi cu valori mici ale taliei au copii a căror talie este egală cu media taliilor lor? (adevărat /fals)

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun dintre cele enunţate ("complement simplu"): 1. Numărul de creste digitale are o distribuţie: A. discontinuă; B. gaussiană; C. logaritmică; D. liniară; E. nici un răspuns nu este corect. 2. Figurile adeltice sunt: A. arcul; B. arcul piniform; C. vârtejul.

D. bucla cubitală; E. bucla radială;

3. Care este riscul de recurenţă aproximativ la descendenţii unei persoane afectate pentru o afecţiune multifactorială cu incidenţa în populaţia generală de 1/1.000? 5%; B. 1% C. 10% D. nu poate fi calculat E. 3%.

Ereditatea multifactorială

175

4. Se consideră o afecţiune multifactorială care este de două ori mai frecventă la femei faţă de bărbaţi. Indicaţi care este situaţia cu risc maxim de recurenţă la descendenţii unei persoane afectate: A. la descendenţii de sex feminin ai bărbaţilor afectaţi; B. la descendenţii de sex masculin ai bărbaţilor afectaţi; C. la descendenţii de sex feminin ai femeilor afectate; D. la descendenţii de sex masculin ai femeilor afectate; E. la descendenţii bărbaţilor afectaţi, indiferent de sexul acestora. II.

La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("complement grupat"): A - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3; B - dacă sunt corecte răspunsurile 1,3; C - dacă sunt corecte răspunsurile 2,4; D - dacă este corect răspunsul 4; E - dacă sunt corecte răspunsurile 1,2,3,4.

5.

Modelele teoretice privind ereditatea poligenică presupun că: 1. toate genele au efecte aditive; 3. genele acţionează independent una de alta; 2. există relaţii de epistazie; 4. expresia fenotipică prezintă o variaţie liniară.

6.

Care sunt caracterele generale ale dermatoglifelor ?: 1. formare în viaţa intrauterină; 2. modificare postnatală; 3. diversitate; 4. determinate de mediu.

7.

Între doi gemeni MZ pot exista diferenţe genetice în ceea ce priveşte: 1. tipul anticorpilor şi cel al receptorilor limfocitelor T; 2. mutaţiile somatice; 3. numărul moleculelor de ADN mitocondrial; 4. modelul inactivării unuia din cei doi cromosomi X la gemenii MZ de sex feminin.

III.

La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("teste tip cauză-efect"): A - dacă ambele propoziţii sunt adevărate şi între ele există relaţie cauză-efect; B - dacă ambele propoziţii sunt adevărate, dar între ele nu există relaţie cauză-efect; C - dacă prima propoziţie este adevărată, iar a doua falsă; D - dacă prima propoziţie este falsă, iar a doua este adevărată; E - dacă ambele propoziţii sunt false.

8. Concordanţa dermatoglifelor la gemenii monozigoţi este de 100%, deoarece dermatoglifele au determinism genetic. 9. În cazul afecţiunilor multifactoriale ce prezintă incidenţă mai mare la un anumit sex, riscul de recurenţă este mai crescut dacă probandul aparţine sexului mai rar afectat deoarece aceasta presupune acumularea mai multor factori de risc în acea familie. IV. Asociaţi enunţurilor din coloana din stânga notate cu cifre, enunţurile corespunzătoare din coloana din dreapta, notate cu litere: 10. Asociaţi tipul de figură digitală cu numărul de triradii corespunzător: 1. arc A. 0 2. arc piniform B. 1 3. buclă cubitală C. 2 4. vârtej D. 3 5. buclă radială E. 4

9. GENETICA POPULA]IILOR I. DATE TEORETICE În Genetică, mai mult ca în orice altă specialitate medicală, pacientul este reflectarea familiei şi a populaţiei căreia îi aparţine. Genetica Medicală nu se ocupă numai cu stabilirea unui diagnostic corect la un anumit pacient, ci şi cu determinarea genotipurilor altor membri ai familiei şi estimarea riscului de recurenţă atât pentru părinţii unui copil afectat, cât şi pentru rudele lor mai apropiate sau mai îndepărtate. Cunoaşterea frecvenţei diferitelor boli genetice în diferite populaţii este foarte utilă pentru diagnosticul clinic şi sfatul genetic. Genetica populaţiilor este studiul distribuţiei genelor în populaţie şi a modului în care frecvenţele genelor şi genotipurilor sunt menţinute sau modificate. Genetica populaţiilor se referă atât la factori genetici, cu sunt mutaţiile, cât şi la factori de mediu şi sociali (selecţia şi migraţia), factori care împreună determină frecvenţa şi distribuţia bolilor genetice în familii şi comunităţi. Studiile antropologice actuale sugerează că strămoşii oamenilor au apărut în urmă cu aproximativ 1,5 milioane de ani în Africa şi s-au răspândit în restul lumii în valuri succesive de migraţie. Au rezultat astfel comunităţi umane izolate geografic şi genetic unele de altele, comunităţi care au format grupuri etnice cu frecvenţe genice specifice. Selecţia mutaţiilor favorabile ca răspuns la factorii de mediu sau supravieţuirea mutaţiilor neutre sau nefavorabile, împreună cu un anumit grad de izolare reproductivă între grupuri au dus la stabilirea de diferenţe genetice între grupurile populaţionale. Frecvent există diferenţe mari între grupurile populaţionale în ceea ce priveşte frecvenţa diferitelor gene (normale şi anormale).

A. OBIECTIVELE GENETICII POPULAŢIILOR Populaţia reprezintă un grup (comunitate) de indivizi care au un fond comun de gene, trăiesc în acelaşi habitat şi se împerechează la întâmplare (panmictic), fără selecţia partenerilor de sex opus. Fiecare organism primeşte de la părinţii săi, prin genele gameţilor, informaţiile necesare pentru formarea şi dezvoltarea sa. În acest mod, membrii unei populaţii umane moştenesc şi transmit gene asemănătoare. Totalitatea genelor existente la un moment dat în populaţie alcătuiesc fondul comun de gene. Astfel, se poate considera că indivizii reprezintă "asocieri temporare unice" ale unor gene din fondul de gene caracteristic populaţiei, iar populaţia biologică reprezintă "o populaţie de gene". Populaţiile pot fi deci descrise în termeni de frecvenţă a diferitelor fenotipuri/genotipuri sau a diferitelor alele ale unui locus dat. În populaţie, genele formează combinaţii care interacţionează şi se influenţează reciproc, stabilindu-se relaţii alelice şi nonalelice care fac ca ansamblul lor să fie integrat. Acest fapt conferă fondului genic al populaţiei o puternică coeziune.

Genetica populaţiilor

179

Împerecherea întâmplătoare a indivizilor din populaţie produce un schimb permanent de gene, care printr-o continuă recombinare şi segregare meiotică generează la descendenţi o heterozigoţie perpetuă, iar în populaţie o intensă variabilitate genetică. Astfel, se poate explica unicitatea genetică a fiecărei persoane şi adaptabilitatea populaţiei. Exceptând parţial omul, la celelalte specii individul are un rol neînsemnat în evoluţie, rolul decisiv revenind populaţiei. Populaţia biologică constituie o unitate de reproducere panmictică şi o unitate de evoluţie. Specia umană poate fi divizată în trei grupe populaţionale, denumite rase: albi (caucazieni), negri şi asiatici. Fiecare grup se subdivide în numeroase subpopulaţii distincte, numite grupuri etnice. Grupele şi subgrupele populaţionale se deosebesc unele de altele prin fondul specific de gene, determinat de frecvenţele diferite ale alelelor multor loci. De exemplu: în sistemul polialelic al grupului sanguin AB0, alela B predomină în populaţia asiatică, frecvenţa ei scăzând de la est spre vest, alela A predomină în vestul Europei, iar alela O în populaţia africană. Genetica populaţiilor umane studiază frecvenţa genelor şi proporţiile relative ale diferitelor genotipuri în populaţie, dar şi factorii care menţin sau modifică frecvenţa acestora de la o generaţie la alta. Evaluarea acestor parametri este utilă pentru: definirea structurii genetice a populaţiei respective pe baza frecvenţelor specifice a unor gene mutante şi boli genetice; sfatul genetic, deoarece prin cunoaşterea frecvenţei diferitelor genotipuri în populaţie se poate stabili incidenţa heterozigoţilor (Na) sănătoşi şi calcularea riscului de apariţie în descendenţă a unor copii afectaţi (aa); aprecierea rentabilităţii programelor de screening genetic într-o anumită populaţie.

B. LEGEA HARDY - WEINBERG Frecvenţele genotipice şi alelice depind de factori cum ar fi tipul de căsătorie (consanguină sau nu), mărimea şi distribuţia populaţiei, mutaţii, migraţii şi selecţie. Calcularea frecvenţelor genotipice pe baza frecvenţelor alelice, într-o populaţie în echilibru, în care încrucişările sunt întâmplătoare, se poate face folosind legea Hardy – Weinberg, elaborată în 1908 independent de matematicianul englez Goeffrey Hardy şi medicul german Wilhelm Weinberg. Enunţul legii Hardy – Weinberg este următorul: într-o populaţie panmictică în echilibru (în care căsătoriile se fac la întâmplare), neinfluenţată de migraţii, selecţie sau mutaţii, în cazul unui locus ce poate fi ocupat de două alele A1 şi A2, frecvenţele alelelor (p şi q) şi frecvenţele genotipurilor A1A1, A1A2 şi A2A2, (p2, 2pq respectiv q2) se menţin constante în succesiunea generaţiilor. Demonstrarea legii Hardy – Weinberg se face în modul următor: În cazul unui locus ce poate fi ocupat doar de două alele A1 şi A2, genotipurile posibile sunt: A1A1, A1A2 şi A2A2. În condiţiile în care frecvenţa în populaţie a genei A1 = p, iar a genei A2 = q, atunci p + q = 1 (100%), deoarece locusul A poate fi ocupat fie de A1, fie de A2, eventualităţi care se exclud reciproc; în cazul în care una dintre gene este dominantă, iar cealaltă recesivă, pentru gena dominantă se foloseşte litera p, iar pentru cea recesivă litera q. Ţinând cont de cele de mai sus frecvenţa genotipurilor A1A1, A1A2 şi A2A2, în funcţie de frecvenţele p şi q ale genelor A1 şi A2, este: A1A1 = p2; A1A2 = 2pq; A2A2= q2. (vezi tabelul 9.1). Frecvenţa de apariţie a tuturor încrucişărilor posibile în populaţia respectivă este prezentată în tabelul 9.2.

180

Genetica populaţiilor Tabelul 9.1 Frecvenţa genotipurilor realizate de prin asocierea alelelor A1 şi A2

Gameţi feminini

A1 (p) A2 (q)

Gameţi masculini A1 (p) A1A1 (p2) A1A2 (pq)

A2 (q) A1A2 (pq) A2A2 (q2)

Tabelul 9.2 Frecvenţa diferitelor tipuri de încrucişări parentale

Frecvenţa genotipurilor la mamă

A1A1 (p2) A1A2 (2 pq) A2A2 (q2)

Frecvenţa genotipurilor la tată A1A1 (p2) A1A2 (2 pq) A2A2 (q2) p4 2p3q p2q2 3 2 2 2p q 4p q 2 pq3 2 2 3 pq 2 pq q4

Analiza detaliată a fiecărui tip de încrucişare, cu frecvenţele diferitelor genotipuri rezultate la descendenţi este prezentată în tabelul 9.3 Tabelul 9.3 Frecvenţa genotipurilor la descendenţi în diferite încrucişări parentale Incrucişări parentale Frecvenţa genotipurilor la urmaşi Tipuri Frecvenţă A1A1 A1A2 A2A2 A1A1 x A1A1 p4 p4 A1A1 x A1A2 4p3q 2p3q 2p3q A1A2 x A1A2 4 p2q2 p2q2 2 p2q2 p2q2 2 2 2 2 A1A1 x A2A2 2p q 2p q A1A2 x A2A2 4 pq3 2 pq3 2 pq3 4 A2A2 x A2A2 q q4 4 3 2 2 3 2 2 2 2 Total genotipuri = (p +2p q+p q ) + (2p q+2p q +2p q +2 pq3) + ( p2q2+2 pq3+ q4) = la urmaşi = p2 (p2 + 2pq + q2) + 2pq (p2 + 2pq + q2) + q2 (p2 + 2pq + q2) = = p2 (p+q)2 + 2pq (p+q)2 + q2 (p+q)2 = p2 + 2pq + q2 = 1 Genotipurile care apar la copii prin combinarea gameţilor parentali vor fi: A1A1, A1A2 şi A2A2 cu frecvenţele: A1A1: p4 + 2p3q + p2q2 = p2 (p2 + 2pq + q2) = p2; A1A2: 2p3q + 2 p2q2 + 2 p2q2 + 2pq3 = 2pq (p2 + 2pq + q2) = 2pq; A2A2: p2q2 + 2pq3 + q4 = q2 (p2 + 2pq + q2) = q2. Rezultă că frecvenţele celor trei genotipuri în generaţia descendenţilor sunt identice cu cele ale părinţilor: A1A1 = p2; A1A2 = 2pq; A2A2= q2. Frecvenţele genelor A1 şi A2 în generaţia a doua sunt identice cu cele din prima generaţie: frecvenţa genei A1 = p2 + 1/2 x 2pq = p ( p + q ) = p; frecvenţa genei A2= q2 + 1/2 x 2pq = q ( p + q ) = q; Acelaşi lucru va fi valabil pentru toate generaţiile următoare şi astfel se poate formula o concluzie cu caracter general. Pentru genele situate într-un locus de pe cromosomul X aplicarea legii Hardy Weinberg este diferită deoarece echilibrul nu se realizează după prima generaţie de încrucişări întâmplătoare, ci este obţinut, într-o manieră oscilatorie, după un număr de

Genetica populaţiilor

181

generaţii, întrucât transmiterea ereditară diferă la bărbaţi şi femei. Bărbaţii au un singur cromosom X pe care îl moştenesc obligatoriu de la mamele lor şi îl transmit obligatoriu la toate fiicele, în timp ce femeile moştenesc câte un cromosom X de la ambii părinţi. Când se realizează echilibrul genic el este menţinut în generaţiile următoare (Tabel 9.4.). Tabel 9.4. Tipuri de încrucişări în cazul a două alele (A şi a) situate pe cromosomul X Genotip Genotip patern matern

Frecvenţa Frecvenţa genotipurilor la descendenţi încrucişării Genotipuri la băieţi Genotipuri la fete

A a AA Aa aa p3 p3 p 2q p2q p 2q p2q 2 pq pq2 p 2q p2q 2 2 pq pq pq2 pq2 q3 q3 p(p2 + 2pq q(p2 + 2pq p2(p + q) = 2pq(p + q) q2(p + q) + q2) = p + q2) = q p2 = q2 = 2pq În aceste condiţii, frecvenţa genică este aceeaşi la ambele sexe, dar frecvenţa bărbaţilor afectaţi (hemizigoţi XaY) este egală cu aceea a genei alele mutante (Xa) în timp ce frecvenţele genotipice la femei (XX) sunt la fel ca şi în cazul unui locus autosomal. În cazul unor alele multiple frecvenţele genice şi genotipice pot fi calculate prin adăugarea unui/unor noi termen(i) la ecuaţia binomială (p + q)2. De exemplu, frecvenţele genice şi genotipice în cazul existenţei a trei alele pentru un anumit locus se vor calcula pe baza formulei (p + q + r)2, unde p, q şi r reprezintă frecvenţele celor trei alele. Presupunerile pe care se bazează legea Hardy - Weinberg sunt următoarele: legea se aplică populaţiilor mari; rata mutaţiilor este constantă; nu există selecţie în favoarea sau defavoarea unui genotip (indivizii cu diverse genotipuri au aceeaşi capacitate de a transmite genele la descendenţi); căsătoriile se fac complet la întâmplare, fără căsătorii preferenţiale sau consangvine; nu există migraţie spre sau dinspre populaţia respectivă; genele alele nu diferă în efectul lor asupra fertilităţii. A (p) A (p) A (p) a (q) a (q) a (q) Total

AA (p2) Aa (2pq) aa (q2) AA (p2) Aa (2pq) aa (q2)

p3 2p2q pq2 p2q 2pq2 q3

Legea Hardy - Weinberg: într-o populaţie panmictică (în care încrucişările se fac la întâmplare), fără migraţii, selecţie şi mutaţii, frecvenţele la origine p şi q ale alelelor A1 şi A2 se menţin constante din generaţie în generaţie; la fel se păstrează constante şi frecvenţele genotipurilor A1A1, A1A2 şi A2A2, ele fiind p2, 2pq şi q2. O astfel de populaţie cu frecvenţe genice stabile este în echilibru. Presupunerile pe care se bazează legea Hardy - Weinberg sunt următoarele: legea se aplică populaţiilor mari, rata mutaţiilor este constantă, nu există selecţie în favoarea sau defavoarea unui genotip, căsătoriile se fac complet la întâmplare, nu există migraţie spre sau dinspre populaţia respectivă, iar genele alele nu diferă în efectul lor asupra fertilităţii.

182

Genetica populaţiilor

C. FACTORII CARE MODIFICĂ ECHILIBRUL HARDY WEINBERG Echilibrul genic postulat de legea Hardy - Weinberg se realizează în anumite condiţii speciale (vezi paragraful anterior). Legea nu este valabilă decât în populaţiile panmictice (mari) în care încrucişările sunt aleatorii şi nu există selecţie, mutaţii sau migraţii. Aceste condiţii sunt rar îndeplinite în populaţiile umane, totuşi evoluţia spre un echilibru genetic stabil este posibilă şi principiile ce decurg din legea Hardy - Weinberg rămân valabile în genetica clinică, permiţând aprecierea frecvenţei genelor alele. Factorii care modifică echilibrul Hardy - Weinberg sunt următorii: căsătoriile neîntâmplătoare (stratificare, căsătorii asortative şi consangvinitate), mutaţiile, selecţia şi migraţiile.

1. CĂSĂTORIILE NEÎNTÂMPLĂTOARE Termenul de căsătorii neîntâmplătoare se referă la fenomenul de stratificare, căsătoriile asortative şi căsătoriile consangvine. În majoritatea populaţiilor umane, căsătoriile sunt rareori aleatorii. Ele sunt de obicei orientate, în sensul că membrii unei subpopulaţii, definită pe criterii rasiale, etnice, religioase, se unesc mai frecvent cu alţi membri ai aceleiaşi populaţii. Acest lucru este firesc deoarece multe populaţii sunt stratificate, fiind alcătuite din mai multe subgrupe cu un "profil genic" caracteristic. Uneori ele formează adevărate "izolate", populaţii mici în care membrii lor nu se vor încrucişa înafara grupului (de exemplu populaţia Statelor Unite formată din caucazieni, afro-americani, indieni, asiatici şi hispanici). Datorită stratificării, în fiecare subgrup unele afecţiuni sunt mai frecvente, iar altele mai rare. Exemple de afecţiuni frecvente în anumite subgrupuri populaţionale sunt: boala Tay- Sachs la evreii Ashkenazi, talasemia în jurul bazinului Mediteraneean, siclemia la negrii americani, fibroza chistică şi fenilcetonuria la caucazieni. Informaţiile legate de stratificare au importanţă deosebită pentru sfatul genetic şi diagnosticul prenatal. La acest fenomen de stratificare a populaţiei se adaugă încrucişarea asortativă sau preferenţială, care constă în alegerea partenerului pe baza anumitor criterii (limbaj, inteligenţă, statură, culoarea pielii, talent muzical, abilităţi sportive etc). Ea este de obicei pozitivă, adică indivizii tind să-şi aleagă un partener care să le semene. O astfel de încrucişare influenţează echilibrul Hardy- Weinberg deoarece creşte frecvenţa homozigoţilor în defavoarea heterozigoţilor. Încrucişarea asortativă negativă se referă la alegerea unui partener cu caracteristici opuse, este mai rar întâlnită şi nu influenţează semnificativ echilibrul Hardy- Weinberg. Un aspect important din punct de vedere clinic se referă la tendinţa indivizilor de a se căsători cu parteneri cu probleme medicale similare (de exemplu surditate, cecitate, nanism). Atunci când partenerii sunt purtători ai aceloraşi gene anormale (ceea ce se întâmplă rar), frecvenţa genică se modifică prin creşterea frecvenţei copiilor anormali. De obicei, deşi partenerii au aceeaşi problemă medicală, substratul este reprezentat de mutaţii diferite (heterogenitate genetică); astfel de cupluri au un risc mai mic de copii anormali, dar mai mare faţă de populaţia generală. Un aspect particular al uniunilor nonaleatorii îl reprezintă încrucişările consangvine. Frecvenţa lor a scăzut în ultimele decenii, căsătoriile consanguine rămânând frecvente doar în anumite subgrupe populaţionale. O căsătorie este considerată consanguină când cei doi membri au cel puţin un strămoş comun până la a treia generaţie de ascendenţi (stră-străbunic). Ei vor avea mai multe gene în comun decât indivizii neînrudiţi, ceea ce duce la o creştere a posibilităţilor de întâlnire a doi

Genetica populaţiilor

183

heterozigoţi pentru aceiaşi genă şi la o amplificare la descendenţi a proporţiei homozigoţilor bolnavi cu afecţiuni recesive severe, a bolilor poligenice/multifactoriale sau a malformaţiilor congenitale. Riscul naşterii unui copil homozigot pentru o alelă recesivă rară este proporţional cu gradul de înrudire. De exemplu, pentru verii primari riscul unui urmaş anormal fizic sau mintal este aproape dublu faţă de riscul unui cuplu neînrudit din populaţia generală: 1/30 faţă de 1/50. La verii de gradul II riscul se reduce, pentru ca la grade de înrudire mai îndepărtate acesta să devină neglijabil, cu excepţia situaţiilor când în fiecare din familiile înrudite există cel puţin un bolnav cu o afecţiune identică. În cazul căsătoriilor consanguine este importantă stabilirea coeficientului de înrudire (R) şi a coeficientului de consangvinitate (F). Coeficientul de înrudire se calculează folosind formula:

n  n

1

1 1 2 R  2 unde: R este coeficientul de înrudire, n1 numărul de generaţii existente între unul din membrii cuplului consanguin şi strămoşul comun, iar n2 – numărul de generaţii existente între celălalt din membrii cuplului consanguin şi strămoşul comun.

Coeficientul de consanguinitate se calculează cu formula: 1 F  2 R 4 unde: F este coeficientul de consangvinitate iar R coeficientul de înrudire. Coeficientul de consanguinitate al unui copil rezultat dintr-o căsătorie consanguină reprezintă probabilitatea acestuia de a moşteni aceeaşi alelă de la ambii genitori, genă pe care aceştia au moştenit-o de la un strămoş comun. În tabelul 9.5 sunt prezentaţi coeficienţii de consangvinitate pentru diferite tipuri de căsătorii consangvine. Aprecierea înrudirii dintr-o populaţie poate fi realizată prin măsurarea scăderii heterozigozităţii fată de populaţiile unde încrucişările se fac la întâmplare. Spre deosebire de afecţiunile din populaţiile stratificate, în care fiecare subgrup are o frecvenţă crescută a câtorva alele, tipurile de boli recesive care apar la descendenţii căsătoriilor consangvine sunt reprezentate de boli foarte rare, care de obicei apar numai în acea familie, nu şi la alţi membri ai comunităţii. Tabelul 9.5 Coeficienţii de înrudire şi de consanguinitate în diferite tipuri de căsătorii Tip de căsătorie Părinte - copil Frate - soră Fraţi vitregi Unchi – nepoată Mătuşă - nepot Veri gradul I Veri gradul II Veri gradul III

Proporţia de alele în comun (coeficient de înrudire) 1/2 1/2 1/4 1/4

F (coeficient de consangvinitate) 1/4 1/4 1/8 1/8

1/8 1/32 1/128

1/16 1/64 1/256

Stratificarea se referă la formarea de izolate în cadrul unei populaţii, fiecare grup având anumite afecţiuni mai frecvente;

184

Genetica populaţiilor

Căsătoriile asortative sunt căsătorii între indivizi cu caracteristici similare (tip pozitiv) sau total opuse (tip negativ); cele de tip pozitiv modifică frecvenţa genelor în populaţie; Căsătoriile consangvine sunt căsătorii între persoane înrudite şi duc la apariţia de afecţiuni recesive rare (neîntâlnite la alţi indivizi din acea populaţie); Înrudirea între 2 indivizi se măsoară prin coeficientul de consangvinitate şi coeficientul de înrudire.

2. POPULAŢIILE REDUSE Pentru motive diferite (geografice, religioase, politice) un subgrup restrâns dintr-o populaţie se poate izola fizic şi/sau social de restul populaţiei formând un izolat genetic. În populaţiile mici se poate produce un fenomen care modifică echilibrul Hardy - Weinberg, numit deriva genetică întâmplătoare. Spre deosebire de populaţiile mari, în care variaţiile numărului copiilor indivizilor cu genotipuri diferite nu influenţează semnificativ frecvenţa genelor, în populaţiile mici asemenea variaţii pot modifica, uneori considerabil, această frecvenţă. Dacă într-o astfel de populaţie, gena "A" este mai frecventă decât alela "a" şi indivizii cu gena "a" nu au copii sau nu o transmit la descendenţi, atunci după câteva generaţii, gena "a" va dispare iar gena "A" se va fixa mai puternic. Astfel se poate explica frecvenţa crescută a unor grupe sanguine sau boli genetice în anumite populaţii mici, dar este greu de acceptat că deriva genetică este unica cauză a fenomenului. O altă explicaţie a incidenţei mari a unor afecţiuni genetice în anumite populaţii este efectul de fondator. Dacă membrii fondatori ai unui subgrup au o genă mutantă recesivă rară, prin încrucişările ulterioare în cadrul subgrupei populaţionale respective se produce o homozigotare frecventă şi o creştere a incidenţei bolii produsă de gena mutantă. Se cunosc mai multe exemple: frecvenţa crescută a bolii Huntington în regiunea lacului Maracaibo din Venezuela, a tirozinemiei în regiunea franceză a Canadei sau a porfiriei variegata în Africa de Sud. Ultimul exemplu este sugestiv pentru efectul de fondator. În Africa de Sud există la ora actuală circa un milion de persoane de origine afrikaans. Aceştia reprezintă urmaşii unui mic grup de origine olandeză care au emigrat în colonia Cape Town în secolul XVII. Unul dintre membrii fondatori a prezentat porfiria variegata, o boală dominant autosomală, caracterizată prin fotosensibilitate şi fenomene neuroviscerale. Prin încrucişare preferenţială, frecvenţa bolnavilor este astăzi de 3/1.000, mult mai mare decât cea din Olanda sau alte ţări ale lumii. O acţiune combinată a derivei genetice şi efectului de fondator s-a înregistrat în Finlanda, unde populaţia a fost mult timp izolată genetic, geografic, lingvistic şi cultural. La acest fenomen s-a adăugat explozia demografică din ultimele secole. Aceşti factori au determinat o frecvenţă crescută în Finlanda a circa 20 de boli genetice, rare în alte zone ale lumii (sindromul nefrotic congenital, aspartilglicosaminuria, coroideremia etc.). Deriva genetică se referă la populaţiile mici, în care creşterea sau scăderea numărului de descendenţi ai unei persoane afectate duce la modificarea semnificativă a frecvenţelor genice şi genotipice. Efectul de fondator apare atunci când unul dintre indivizii care iniţiază o comunitate prezintă o afecţiune ce va fi transmisă la descendenţii săi; boala devine mai frecventă decât în alte comunităţi.

3. MUTAŢIILE

Genetica populaţiilor

185

Mutaţiile sunt modificări accidentale, permanente şi ereditare, care determină o modificare a functiei unei gene, ducând la apariţia unor caracteristici noi utile, neutre sau defavorabile. Mutaţiile favorabile au jucat un rol important în evoluţia biologică, culminând cu apariţia omului şi evoluţia acestuia. Majoritatea mutaţiilor noi sunt însă defavorabile şi tind să rupă echilibrul genic din populaţie. Amploarea efectului defavorabil al unei mutaţii poate fi apreciat prin consecinţele acesteia asupra capacităţii biologice de supravieţuire şi reproducere a individului (fitness). Ea reprezintă principalul factor care determină dacă o genă mutantă dispare imediat, supravieţuieste câteva generaţii sau devine o alelă predominantă. O mutaţie poate fi letală atunci când nu se transmite la generaţia următoare deoarece afectează supravieţuirea sau reproducerea (produce moarte sau sterilitate). De exemplu, osteogenesis imperfecta tip 2, sindromul Apert sau displazia tanatoforică sunt determinate de mutaţii care nu se pot transmite la descendenţi, iar aceste boli au caracter sporadic. Mutaţiile pot fi subletale când reduc rata de reproducere, cum este cazul în acondroplazie, unde indicele de fertilitate al bolnavilor este 0,20. Mutaţiile se produc continuu, iar efectele lor defavorabile realizează în ansamblu povara genetică a populaţiei, reprezentată de reducerea capacităţii reproductive indusă global de toate mutaţiile existente la indivizii unei populaţii. Mutaţiile dominante autosomale sau situate pe cromosomul X şi cele recesive localizate pe cromosomul X se exprimă la heterozigoţi, respectiv hemizigoţi. În schimb, mutaţiile recesive, destul de frecvente, nu se manifestă la heterozigoţi. Analiza statistică a populaţiilor panmictice a arătat că fiecare persoană normală are în stare heterozigotă 3-5 gene recesive, letale la homozigoţi, dar acestea diferă de la o persoană la alta. Efectul negativ al unor mutaţii este influenţat şi contrabalansat de selecţie, păstrânduse astfel un echilibru genic. Menţinerea constantă a unei frecvenţe genice se realizează prin înlocuirea genelor anormale pierdute prin deces sau sterilitate prin mutaţii noi în generaţia următoare. Pentru majoritatea genelor umane rata de mutaţie este relativ mică, de ordinul a 10-6-5 per locus/gamet/generaţie. Dintre excepţiile de la această regulă pot fi citate neurofibromatoza tip 1 şi miopatia Duchenne în care rata mutaţiilor este de ordinul 10-4. Fenomenul poate fi explicat în distrofia Duchenne prin dimensiunea foarte mare a genei (>2.000Kb) care o face mai vulnerabilă la acţiunea agenţilor mutageni. Factorii de mediu care produc mutaţii la om sunt reprezentaţi de radiaţiile ionizante şi diferiţi agenţi chimici. La aceşti factori se adaugă efectul vârstei paterne, caracterizat prin creşterea frecvenţei mutaţiilor dominante noi odată cu creşterea vârstei bărbatului, riscul pentru astfel de mutaţii fiind de 0.5 - 1% la copiii bărbaţilor peste 40 de ani. Mutaţiile letale apar în majoritatea cazurilor sub formă de cazuri sporadice; rareori apar în fratrii (mozaicism gonadic); Mutaţiile subletale reduc rata de reproducere, frecvenţa fiind menţinută prin apariţia de mutaţii noi.

4. SELECŢIA Selecţia reprezintă acţiunea factorilor de mediu asupra unui anumit genotip. Genotipurile dezavantajoase sunt selectate negativ (eliminate) şi contribuie cu puţine gene la fondul generaţiei următoare. În schimb, genotipurile avantajoase sunt selectate pozitiv (menţinute) şi contribuie cu un număr mare de gene la generaţia următoare. Astfel, selecţia

186

Genetica populaţiilor

stabileşte cota de gene prin care indivizii cu genotipuri diferite contribuie la fondul comun de gene al populaţiei în funcţie de viabilitatea şi fertilitatea lor. Teoria darwinistă consideră că selecţia naturală a constituit un factor crucial al evoluţiei. Indivizii cei mai apţi într-un anumit mediu supravieţuiesc şi se reproduc. În concepţia actuală selecţia este consecinţa unui indice de fertilitate diferit al anumitor fenotipuri produse de genotipuri ce rezultă prin mutaţii. Selecţia acţionează prin diminuarea sau creşterea aptitudinii biologice de supravieţuire şi reproducere a indivizilor. Selecţia favorizează indivizii cu cea mai ridicată capacitate de reproducere şi elimină variaţiile care slăbesc potenţialul reproductiv. Indicele de fertilitate măsoară aptitudinea reproductivă a unui individ şi contribuţia acestuia la fondul genetic al generaţiei următoare. Valoarea acestui indice variază între 0 (alelă letală sau care produce sterilitate) şi 1 (alelă normală ). Indicele de fertilitate este parametrul cel mai util în compararea diferitelor genotipuri într-o populaţie, dar el este valabil în contextul unui mediu particular în care există o diferenţă de adaptare la mediu. Mutaţiile produse în regiunile necodante ale genelor sau în segmentele intergenice sunt neutre din punct de vedere al efectului lor fenotipic. În aceste cazuri variaţia lor în populaţie este determinată de întâmplare şi nu de selecţie. În schimb, mutaţiile cu efecte negative, defavorabile, sunt cu certitudine supuse selecţiei, care uneori este foarte eficientă. Alelele mutante dominante sunt supuse direct selecţiei, care acţionează rapid în sensul eliminării mutaţiei. În schimb, genele mutante recesive sunt nemanifeste la heterozigoţi, iar efectul selecţiei este foarte lent. Selecţia naturală şi mutaţiile intervin concomitent pentru a crea în populaţie un echilibru genetic stabil. Acesta poate fi realizat prin două mecanisme: presiunea de selecţie = presiunea de mutaţie - rata de eliminarea a caracterului anormal este echilibrată de apariţia unor mutaţii noi; presiunea de selecţie = presiunea de mutaţie + avantajul selectiv al heterozigoţilor - rata mutaţiilor este mică, dar frecvenţa genei mutante este crescută, datorită avantajului selectiv al heterozigoţilor. Teoretic există patru moduri de acţiune a selecţiei naturale: contra mutaţiilor dominante autosomale, contra homozigoţilor (sau hemizigoţilor) recesivi, contra heterozigoţilor şi în favoarea heterozigoţilor. Primele trei tipuri duc la o incapacitate în transmiterea genei, prin reducerea duratei de supravieţuire şi/sau sterilitate (infertilitate), indicele de fertilitate scăzând spre zero. Frecvenţele actuale ale alelelor mutante sunt rezultatul echilibrului între "pierdere" prin selecţie şi "câştig" prin mutaţii noi. Al patrulea tip de acţiune al selecţiei naturale favorizează heterozigoţii comparativ cu ambele tipuri de homozigoţi. Selecţia contra mutaţiilor dominante autosomale acţionează astfel încât gena defavorabilă este supusă direct selecţiei, deoarece ea se manifestă fenotipic atât la heterozigoţi, cât şi la homozigoţi. Selecţia acţionează rapid, iar transmiterea mutaţiei la generaţiile următoare depinde de aptitudinile de supravieţuire şi reproducere ale indivizilor ce au mutaţia. În bolile dominant autosomale cu indice de fertilitate 0 cazurile noi rezultă doar prin mutaţii de novo. În bolile dominante subletale, cu rată de reproducere redusă, numai o parte din genele anormale trec de la o generaţie la alta. Restul cazurilor de boală sunt consecinţa unor mutaţii noi. Selecţia contra mutaţiilor recesive defavorabile este mai puţin eficientă şi foarte lentă, deoarece numai o mică proporţie a acestor gene sunt manifeste (la homozigoţi) În majoritatea cazurilor, gena este nemanifestă, fiind prezentă la heterozigoţi, care au un indice de fertilitate normal.

Genetica populaţiilor

187

În mutaţiile recesive ale genelor situate pe cromosomul X selecţia se face contra bărbaţilor hemizigoţi. În unele boli recesive letale, precum în distrofia musculară Duchenne, bărbaţii afectaţi nu se reproduc, iar gena mutantă este transmisă exclusiv de femeile purtătoare. În aceste boli, 1/3 din genele mutante dispar în fiecare generaţie, fiind înlocuite prin mutaţii noi. În bolile recesive cu transmitere legată de cromosomul X mai puţin severe, precum hemofilia, o parte dintre bărbaţii afectaţi se pot reproduce, transmiţând gena anormală la toate fiicele, iar proporţia de bolnavi rezultaţi prin mutaţii noi este de aproximativ 15 %. Selecţia contra heterozigoţilor este rareori prezentă. De exemplu, în cazul sistemului de grup sanguin Rh a existat o astfel de selecţie la femeile Rh negative (dd) o selecţie contra feţilor Rh pozitivi, heterozigoţi (Dd) care dezvoltă boala hemolitică a nou-născutului. La ora actuală, în condiţiile în care incompatibilitatea materno-fetală poate fi prezentă, selecţia contra heterozigoţilor nu va mai avea loc şi, în timp, va creşte incidenţa alelei recesive. Selecţia în favoarea heterozigoţilor apare în anumite boli în care aceste persoane au un avantaj selectiv faţă de ambele tipuri de genotipuri homozigote. În aceste condiţii apare o creştere a frecvenţei genei anormale, chiar dacă mutaţia reduce sever supravieţuirea şi reproducerea la homozigoţii recesivi (aa). Exemplul clasic de astfel de avantaj este cele al heterozigoţilor pentru sicklemie (dreponocitoză) care sunt rezistenţi la malarie. În regiunile în care malaria este endemică (bazinul Mediteranean, Asia de Sud-Est) homozigoţii normali (NN) sunt vulnerabili la infecţie şi vor avea o fertilitate mai redusă comparativ cu heterozigoţii, în eritrocitele cărora nu se pot dezvolta paraziţii din specia Plasmodium. În consecinţă, în aceste regiuni, frecvenţa genei mutante pentru HbS a crescut în timp. Protecţia heterozigoţilor contra malariei reprezintă o explicaţie plauzbilă şi pentru frecvenţele crescute ale altor gene mutante cu efect asupra hematiilor: hemoblobina C, talasemie, deficit de glucozo-6-fosfatdehidrogenază (G6PD). Selecţia reprezintă acţiunea factorilor de mediu asupra unui anumit genotip; Există patru moduri de acţiune a selecţiei naturale: contra mutaţiilor dominante autosomale, contra homozigoţilor (sau hemizigoţilor) recesivi, contra heterozigoţilor şi în favoarea heterozigoţilor.

5. MIGRAŢIILE ŞI FLUXUL GENIC Migraţiile unui grup etnic dintr-o zonă geografică în alta şi căsătoriile mixte cu populaţia indigenă (cu o structură genetică diferită) pot modifica frecvenţele alelice în cele două populaţii. Se produce fenomenul de flux genic, definit ca o difuziune lentă a genelor dincolo de barierele rasiale. Procesul implică populaţii mari şi o modificare gradată a frecvenţelor genice. În urma imigrării, fondul genic al populaţiei gazdă se îmbogăţeşte. O dovadă a fluxului genic este scăderea gradată a frecvenţei grupului sanguin B de la 25-30 % în Estul Asiei la 6-8 % în populaţiile Europei de Vest, datorită în mare măsură migraţiilor grupurilor asiatice de la Est la Vest şi amestecului acestora cu populaţiile europene. În general, se apreciază că 70-80 % din totalul genelor noi dintr-o populaţie sunt gene "imigrate", migraţia fiind considerată o sursă importantă de variaţii ereditare. Migraţiile modifică frecvenţele genice prin introducerea de alele noi într-o populaţie; Distribuţia frecvenţelor alelice frecvent reflectă evenimente istorice, bariere geografice şi diferenţe lingvistice.

188

Genetica populaţiilor

D. MODUL DE APLICARE A LEGII HARDY WEINBERG ÎN BOLILE MONOGENICE 1. BOLI DOMINANT AUTOSOMALE În cazul bolilor dominant autosomale, legea Hardy - Weinberg se aplică ţinând cont de următoarele particularităţi: frecvenţa p a genei mutante A, este foarte mică faţă de frecvenţa q a genei normale n; frecvenţa heterozigoţilor An (2pq) este mult mai mare decât frecvenţa homozigoţilor anormali AA (p2). În condiţiile în care p2 q2). În aceste condiţii, majoritatea genelor mutante din populaţie se găsesc la heterozigoţii Na.

3. BOLI RECESIVE CU TRANSMITERE LEGATĂ DE CROMOSOMUL X În bolile recesive legate de X, legea Hardy - Weinberg se poate aplica numai la femei, deoarece acestea au 2 alele pentru fiecare locus de pe cromosomul X. Bărbaţii au numai o copie a fiecărei gene de pe cromosomul X, iar frecvenţa genotipurilor XNY şi XaY este dată de termenii p şi q. Astfel la bărbaţi, frecvenţa genei anormale (q) este egală cu frecvenţa bolii. Numărul de femei afectate (XaXa) este mult mai mic decât cel al bărbaţilor afectaţi (XaY) deoarece q>q2, aspect accentuat în bolile recesive rare. În schimb numărul de heterozigote XNXa, sănătoase (2q) este dublu comparativ cu bărbaţii afectaţi (q). În populaţia generală aproximativ 2/3 din genele mutante recesive de pe cromosomul X se găsesc la femeile purtătoare, iar 1/3 la bărbaţii afectaţi.

II. APLICAŢIILE PRACTICE 1. Estimarea frecvenţei purtătorilor sănătoşi (Na) ai unei gene recesive autosomale se face uşor când se cunoaşte frecvenţa bolii. De exemplu, când frecvenţa bolii este 1/ 10.000, frecvenţa heterozigoţilor Na este de aproximativ 1/50. q2 = 1/ 10.000 → q = 1/ 100 p + q = 1 → p = 1 – q = 99/100 → p≈1 Ţinând cont de relaţiile de mai sus: 2pq = 2 x 1 x 1/100 = 1/ 50. 2. Estimarea ratei mutaţiilor se poate face folosind două metode: directă sau indirectă. Metoda directă se poate aplica în bolile dominant autosomale cu penetranţă completă, când afecţiunea este întotdeauna prezentă la heterozigoţi. În aceste cazuri aprecierea ratei mutaţiilor se poate face prin raportarea numărului de cazuri noi la numărul total de naşteri. Metoda se aplică, de asemenea,

Genetica populaţiilor

189

în bolile dominant autosomale în care capacitatea reproductivă este complet compromisă (indice de fertilitate 0) în care toate cazurile noi sunt rezultatul unor mutaţii de novo. Metoda indirectă se aplică în bolile dominant autosomale în care capacitatea reproductivă nu este complet compromisă, iar boala se află în echilibru Hardy - Weinberg. În această situaţie, genele pierdute datorită reproducerii scăzute a indivizilor afectaţi sunt înlocuite de mutaţiile noi. Frecvenţa mutaţiilor noi se poate calcula folosind diferite formule matematice. 3. Determinarea potenţialului mutagen este necesară pentru aprecierea efectelor mutagenice ale radiaţiilor ionizante sau ale unor agenţi chimici. În acest caz, trebuie estimată rata mutaţiilor şi modul în care acestea modifică incidenţa bolii în populaţie.

III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR A. DEFINIŢI URMĂTOARELE NOŢIUNI: Populaţie Încrucişare asortativă Deriva genetică Mutaţii subletale Migraţiile

Legea Hardy-Weinberg Coeficient de înrudire Efect de fondator Selecţia

Căsătorie panmictică Coeficient de consanguinitate Mutaţii letale Indicele de fertilitate

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. 2. 3. 4. 5.

Enunţaţi legea Hardy- Weinberg. Care sunt condiţiile în care se aplică legea Hardy- Weinberg? Care sunt factorii care pot modifica echilibrul Hardy- Weinberg? Enunţaţi şi comentaţi câteva aplicaţii ale legii Hardy- Weinberg. Care sunt particularităţile legii Hardy- Weinberg pentru boli autosomal dominante, autosomal recesive şi recesive legate de X? 6. Ce nu se întâmplă într-o populaţie aflată în echilibru Hardy- Weinberg? 7. Cum este folosită ecuaţia Hardy- Weinberg pentru a prezice recurenţa trăsăturilor recesive legate de X? 8. Exemplificaţi cum modifică frecvenţele genice din echilibrul Hardy- Weinberg fiecare din următorii factori: căsătoriile neîntâmplătoare; migraţia; căsătoriile asortative; deriva genetică; mutaţiile. 9. De ce persistă în populaţie o alelă mutantă atunci când este în stare homozigotă? 10. Daţi un exemplu de alelă mutantă care protejează împotriva bolilor infecţioase.

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun dintre cele enunţate ("complement simplu"): 1. Fibroza chistică este cea mai comună boală recesiv autosomală la populaţia albă, având o frecvenţă de 1/ 2.500 nou-născuţi. Care este frecvenţa purtătorilor heterozigoţi de fibroză chistică în această populaţie? A. 1/ 25; B. 2/ 25; C. 1/ 50; D. 1/ 2.500; E. 2/ 2.500. 2. Pentru o boală recesiv autosomală cu frecvenţa heterozigoţilor 1/ 500, care este frecvenţa bolii în populaţie? A. 1/ 100; B. 1/ 1.000.000; C. 1/ 1.000; D. 1/ 10.000; E. Oricare răspuns.

190

Genetica populaţiilor

3. Incidenţa genei pentru mucoviscidoză este 1/ 50. Care este incidenţa heterozigoţilor în populaţie: A. 1/ 1.250; B. 1/ 625; C. 1/ 50; D. 1/ 25; E. 1/ 10. 4. În cazul unei boli recesive legate de cromosomul X frecvenţa în populaţie a bărbaţilor afectaţi este 1/200. Care este frecvenţa femeilor purtătoare în populaţie? A. 1/40.000; B. 1/100; C. 1/10.000; D. 1/200; E. 1/50. 5. Frecvenţa genei anormale pentru o boală autosomal dominantă este 1/500. Care este frecvenţa indivizilor afectaţi în acea populaţie? A. 1/100; B. 1/1.000; C. 1/250; D. 1/250.000; E. 1/50. 6. Într-o populaţie pentru un anumit locus există două alele: A şi a. Cunoscând că frecvenţa genei A este 0,7 calculaţi care este frecvenţa persoanelor homozigote aa? A. 5/100 B. 3/100 C. 9/100 D 1/1000 E. 1/50 6. Într-o populaţie în echilibru există trei genotipuri în următoarele proporţii: A/A, 0,81; A/a, 0,18; a/a. 0,01. a. Care sunt frecvenţele genelor A şi a? A. 50%/50% B.60%/40% C. 70%/30% D. 80%/20% E. 90%/10% b. Care vor fi frecvenţele lor generaţia următoare? A. 50%/50% B.60%/40% C. 70%/30% D. 80%/20% E. 90%/10% 7.

Frecvenţa beta talasemiei în populaţia italiană este de 4%. Care este : a. Frecvenţa genei mutante pentru beta talasemie (presupunând că există numai o mutaţie în această populaţie); A. 50% B.40% C. 30% D. 20% E.10% b. Incidenţa feţilor sau nou născuţilor afectaţi din această populaţie; A. 50% B.4% C. 15% D. 20% E.10% c. Incidenţa beta talasemiei printre urmaşii cuplurilor în care ambii membri sunt heterozigoţi. A. 50% B.100% C. 75% D. 25% E.10% 8. La consult genetic se prezintă cuplul Popescu Ion (sănătos, în vârstă de 35 de ani) şi Popescu Maria (sănătoasă, în vârstă de 30 de ani) care doreşte să afle riscul de a avea un descendent afectat, deoarece în familia lor există cazuri de mucoviscidoză. Anamneza reproductivă a cuplului relevă: un băiat sănătos, o fată sănătoasă, un avort spontan cu făt sănătos, iar în prezent Maria este însărcinată, sarcină în vârstă de 20 de săptămâni cu făt de sex masculin. Ion şi Maria sunt veri de gradul II (bunicul patern a lui Ion şi bunica maternă a Mariei au fost fraţi). Părinţii lui Ion şi părinţii Mariei sunt toţi sănătoşi. Ion are o soră mai mare Elena, sănătoasă, măritată cu un bărbat sănătos neînrudit, care momentan este însărcinată, sarcină în vârstă de 10 săptămâni. Maria este cea mai mare dintr-o fratrie de 3 persoane. Ea are un frate mai mic, Emil, sănătos, căsătorit cu o femeie sănătoasă neînrudită. Cei doi au două fete gemene monozigote sănătoase, iar momentan soţia lui Emil este însărcinată, sarcină în vârstă de 16 săptămâni, cu făt de sex feminin. Maria are şi o soră mai mică Rodica, afectată, care este măritată cu un bărbat sănătos, neînrudit. Rodica are un băiat sănătos şi două fete sănătoase. Bunicul patern a lui Ion şi bunica maternă a Mariei au mai avut o soră mai mică afectată, care a murit datorită unei infecţii respiratorii grave. Ştiind că frecvenţa bolii în populaţia caucaziană este de 1/2500 de nounăscuţi, răspundeţi la următoarele întrebări: a. Care este tipul de transmitere al afecţiunii prezente în familie ? Justificaţi opţiunea. A. Recesiv autosomal. B. Recesiv legat de cromosomul X C Dominant autosomal. B. Dominant legat de cromosomul X b. Care este riscul cuplului consultant de a avea un copil afectat ? A. 1/4 B. 1/8 C. 1/24 D. 1/50 E. 1/100 c. Care ar fi riscul lui Ion de a avea o fată bolnavă, dacă s-ar fi căsătorit cu o femeie neînrudită ? A. 1/4 B. 1/200 C. 1/24 D. 1/400 E. 1/100

Genetica populaţiilor

191

d. Care este riscul Elenei de a avea un copil afectat ? B. 1/200 C. 1/24 D. 1/400 E. 1/100 e. Care este riscul soţiei lui Emil de a avea un copil bolnav la sarcina în curs ? A. 1/150 B. 1/200 C. 1/24 D. 1/400 E. 1/100 f. Care este riscul Rodicăi de a avea un copil bolnav ? A. 1/4 B. 1/200 C. 1/24 D. 1/50 E. 1/100 A. 1/4

9. Cuplul Vasile şi Ana se prezintă la consultaţie, deoarece sora Anei, Maria, are o formă de mucopolizaharidoză (sindrom Hurler) şi ei vor să ştie dacă au risc să aibă un copil cu această afecţiune. Sindromul Hurler este o afecţiune cu transmitere autosomal recesivă, cu o frecvenţă în populaţie de 1/90.000. a. Dacă Vasile şi Ana nu sunt consangvini, care este riscul pentru ca primul lor copil să aibă sindromul Hurler? A. 1/200 B. 1/400 C. 1/24 D. 1/900 E. 1/100 A. 1/4

b.Dacă ei sunt veri de gradul întâi, care este riscul? B. 1/200 C. 1/24 D. 1/400

E. 1/100

10. Tirozinemia de tip autosomal recesiv are o incidenţă de 1/625 într-o populaţie din Moldova şi 1/10.000 în altă populaţie. Care este frecvenţa alelei mutante în cele 2 grupuri? A. 1/25 şi 1/50; B. 1/50 şi 1/5 C. 1/50 şi 1/100 D.1/2 şi 1/4 E. 1/8 şi 1/64 11. În Finlanda, frecvena purtătorilor genei anormale pentru epilepsia de tip mioclonic (boală cu transmitere recesiv autosomală) este de 1%. Două persoane neînrudite, care nu au cazuri de boală în familie doresc să afle riscul de a avea un copil afectat. Care este valoarea acestui risc? A. 1/400 B. 1/2.000 C. 1/24.000 D. 1/40.000 E. 1/100.000 12. Hemofilia prin deficit al factorului IX al coagulării afectează 1/190 evrei din Israel şi 1/1.000.000 de bărbaţi din alte grupe populaţionale (japonezi, chinezi, germani, italieni, afro-americani, englezi, indieni şi arabi). a. Care este frecvenţa genei mutante în populaţia din Israel? A. 1/400 B. 1/2.000 C. 1/24 D. 1/40 E. 1/190 b. Care este frecvenţa alelei normale în această populaţie? A. 399/400 B. 1.999/2.000 C. 23/24

D. 39/40

c. Calculaţi proporţia de femei heterozigote în populaţia din Israel. A. 1/400 B. 1/1.000 C. 1/12 D. 1/40

E. 189/190 E. 1/95

10. CONSULTUL GENETIC I. DATE TEORETICE Consultul genetic este un act medical specializat şi complex, care vizează stabilirea unui diagnostic de certitudine a bolii, precizarea implicării factorilor genetici în patogenia afecţiunii şi care, obligatoriu, trebuie finalizat prin acordarea sfatului genetic atât bolnavului, cât şi familiei acestuia. Consultul genetic este realizat de un medic specialist în Genetică medicală şi, de obicei, este consecutiv unui consult clinic efectuat de un medic cu o altă specialitate.

A. PARTICULARITĂŢILE CARACTERELOR EREDITARE Caracterele ereditare – caractere care pot fi “moştenite” – pot fi normale sau anormale (boli ereditare). În cazul caracterelor ereditare, există întotdeauna o componentă genetică, uneori extrem de importantă, alteori abia detectabilă. Identificarea prezenţei componentei ereditare este esenţială în cazul consultului genetic, dar deseori este dificilă. Prezenţa acestei componente poate fi sugerată de existenţa unora dintre următoarele particularităţi: distribuţia familială, transmiterea genealogică, manifestarea congenitală, identitatea caracterului la gemenii monozogoţi, asocierea cu un marker genetic, prezenţa de proteine anormale, prezenţa unor anomalii cromosomice sau frecvenţa diferită în populaţii diferite. Totuşi este important de reţinut că nici unul dintre criteriile prezentate mai jos, luat separat, nu are valoare absolută şi nu permite stabilirea naturii ereditare a unui caracter, acest lucru fiind posibil numai în condiţiile în care mai multe particularităţi sunt prezente concomitent.

1. DISTRIBUŢIA FAMILIALĂ Distribuţia familială a unui caracter ereditar este reprezentată de frecvenţa mai mare a anomaliei la membrii unei familii comparativ cu populaţia generală. Acest criteriu nu este absolut şi nici suficient pentru a stabili natura ereditară a unei boli, deoarece: uneori o boală ereditară poate apare sporadic, fiind consecinţa unei mutaţii de novo; există boli neereditare care au concentrare familială crescută, cum ar fi: guşa endemică, tuberculoza, intoxicaţiile etc. Pentru aprecierea distribuţiei familiale a unui caracter se foloseşte testul concentrării familiale, care reprezintă raportul dintre incidenţa afecţiunii la rudele probanzilor, faţă de incidenţa afecţiunii/ caracterului în populaţia generală. O valoare mai mare de 2 indică o participare importantă a factorilor genetici.

2. TRANSMITEREA GENEALOGICĂ Transmiterea genealogică se caracterizează prin moştenirea unui caracter de la părinţi şi transmiterea lui la descendenţi. Nu este un criteriu absolut, deoarece:

Consultul genetic

193

pot exista caractere ereditare care nu se transmit la descendenţi – de exemplu disgeneziile gonadice de tipul 45,X (sindrom Turner) şi 47,XXY (sindrom Klinefelter) deşi sunt afecţiuni genetice, datorită sterilităţii primare pe care o induc nu se pot transmit la descendenţi, o situaţie similară fiind întâlnită în bolile genetice care determină decesul persoanelor afectate în timpul copilăriei, înainte de a atinge vârsta reproductivă, când ar fi posibilă transmiterea mutaţiei la descendenţi; unele caractere neereditare pot fi transmise transplacentar de la mamă la copii, mimând o transmitere genealogică – de exemplu, o femeie cu sifilis va naşte un copil cu sifilis congenital, datorită trecerii parazitului Treponema pallidum prin bariera placentară;

3. MANIFESTAREA CONGENITALĂ Manifestarea congenitală, caracterizată prin prezenţa unei anumite afecţiuni încă de la naştere, nu este valabilă pentru toate bolile ereditare, deoarece unele boli de natură ereditară nu se manifestă la naştere – de exemplu hipodonţia sau anomaliile aparatului reproductiv. Pe de altă parte, nu orice caracter congenital este şi ereditar, deoarece există numeroase malformaţii congenitale datorite acţiunii factorilor de mediu asupra fătului – de exemplu focomelia42 indusă de tratamentul simptomatic cu talidomidă a greţurilor din timpul sarcinii.

4. IDENTITATEA CARACTERULUI LA GEMENII MONOZIGOŢI Gemenii monozigoţi sunt genetic identici, deoarece provin din aceeaşi celulă, în timp ce gemenii dizigoţi diferă genetic, fiind doi fraţi obişnuiţi care însă s-au dezvoltat în acelaşi timp. Datorită acestor particularităţi, în cazul prezenţei unei afecţiuni provocate exclusiv de modificări genetice, concordanţa afectării este de 100% la gemenii monozigoţi. Dacă afecţiunea sau caracterul normal este multifactorial, concordanţa la gemenii monozigoţi scade, dar valoarea acesteia este mai mare decât cea observată la gemenii dizigoţi. Prin compararea concordanţelor la gemenii monozigoţi şi dizigoţi se poate identifica valoarea participării componentei genetice (vezi capitolul Ereditatea multifactorială).

5. ASOCIEREA CU UN MARKER GENETIC În unele cazuri, prin studii statistice, a fost identificată asocierea unei boli genetice cu un caracter fenotipic normal, considerat marker genetic, asociere care este mai frecventă decât cea presupusă pe baza analizei frecvenţei separate a celor două caractere. Asocierea poate fi explicată astfel: genele pentru cele două caractere sunt înlănţuite, ocupând loci învecinaţi; una dintre gene favorizează apariţia unei tulburări independente – astfel poate fi frecvenţa crescută a ulcerului duodenal la persoanele cu grup sanguin 0; o genă are efecte multiple (pleiotrope).

6. APARIŢIA SPONTANĂ În multe boli genetice există în diverse familii cazuri izolate, a căror apariţie poate fi explicată de prezenţa unor mutaţii noi. Această particularitate trebuie obligatoriu analizată asociat cu alte particularităţi.

7. PREZENŢA ANOMALIILOR CROMOSOMICE 42

Focomelie – anomalie congenitală caracterizată prin ataşarea mâinilor şi plantelor direct la centura scapulară, respectiv pelvină, celălalte segmente ale membrelor fiind absente

194

Consultul genetic

Orice anomalie cromosomică este şi genetică, deoarece implică afectarea unor segmente mai mari sau mai mici de material genetic. Totuşi, analiza cromosomică nu este obligatorie în toate afecţiunile presupuse genetice, deoarece metoda este incapabilă să detecteze mutaţii genice. De aceea, un cariotip normal nu exclude prezenţa unui caracter anormal la subiectul cercetat.

8. FRECVENŢA DIFERITĂ ÎN POPULAŢII DIFERITE Frecvenţa diferită a genelor în diverse populaţii este rezultatul unei selecţii naturale, al cărei efect a fost concentrarea anumitor gene într-o anumită regiune geografică. De exemplu, unele mutaţii genice, precum cele care determină deficienţa în glucozo-6-fosfatdehidrogenază sau unele hemoglobinopatii sunt mai frecvente în zonele în care malaria este o maladie endemică, deoarece heterozigoţii pentru aceste afecţiuni sunt imuni la acţiunea parazitului (Plasmodium falciparum) care determină paludismul. În condiţiile în care mult timp malaria a fost o boală incurabilă, heterozigoţii pentru bolile citate mai sus aveau o speranţă de viaţă mai mare decât cea a indivizilor normali, iar prin căsătoria lor cu indivizi de asemenea heterozigoţi a fost favorizată perpetuarea şi creşterea frecvenţei mutaţiei în populaţia respectivă. O altfel de situaţie există în cazul izolatelor umane din punct de vedere geografic, etnic sau religios, în care prin căsătoriile consanguine s-a realizat un fond comun de gene mutante.

B. OBIECTIVELE CONSULTULUI GENETIC Consultul genetic vizează trei obiective principale: stabilirea diagnosticului bolii, stabilirea implicării factorilor genetici în patogenia bolii şi acordarea sfatului genetic. Este obligatoriu ca diagnosticul bolii să fie corect şi complet. Pentru realizarea unui diagnostic corect trebuie stabilită o asociere corectă a semnelor şi simptomelor, punând accent pe semnele esenţiale ale afecţiunii. În caz contrar se poate ajunge la ipoteze eronate de diagnostic. Diagnosticul complet implică verificarea tuturor aparatelor şi sistemelor, astfel încât să nu fie ignorate o serie de localizări mai puţin obişnuite. Pentru realizarea acestor deziderate sunt necesare colaborări interdisciplinare cu alţi clinicieni sau specialişti în explorări, geneticianul fiind cel care stabileşte diagnosticul final. Stabilirea naturii sau a componentei genetice a bolii este o activitate specifică medicului genetician, care trebuie să diferenţieze bolile genetice de cele condiţionat genetice sau negenetice. Aceasta se realizează prin două categorii de acţiuni: anamneza familială şi explorările genetice. Anamneza familială este o activitate ce poate fi realizată de orice medic specialist, dar trebuie realizată impecabil; orice evaluare superficială a unor membri ai familiei poate duce la concluzii greşite cu stabilirea unui diagnostic etiologic incorect; o anamneză familială bună presupune nu numai contorizarea datelor furnizate de consultant, ci şi examinarea documentelor medicale ale altor persoane afectate din familie şi a fotografiilor de familie, care pot pune în evidenţă unele trăsături familiale sau existenţa unor dismorfii sugestive pentru diagnostic; Explorările genetice asigură studierea materialului genetic – cromosomi, prin efectuarea cariotipului sau gene, prin diverse teste moleculare - precum şi a efectelor genei mutante la nivel de proteină, ţesut sau organ. Sfatul genetic este un act medical specific prin care bolnavul sau rudele cu risc primesc informaţii de la medicul genetician referitoare la natura şi consecinţele bolii, riscul de recurenţă şi căile prin care riscul poate fi redus sau prevenit (vezi capitolul 12 Sfatul genetic).

Consultul genetic

195

Consultul genetic este un act medical specializat şi complex prin care se evaluează diagnosticul bolii (diagnostic corect şi complet prin colaborări interdisciplinare) se precizează implicarea componentei genetice (prin anamneza familială şi teste genetice) şi se acordă sfat genetic bolnavului sau familiei sale.

1. CADRU ORGANIZATORIC Consultul genetic este realizat de către un medic genetician care trebuie să aibă pe lângă cunoştinţe medicale vaste, necesare înţelegerii diagnosticului iniţial al altor specialişti şi o pregătire specifică în domeniul Geneticii medicale care să-i permită recunoaşterea numeroaselor sindroame din domeniu, a criteriilor de diferenţiere între entităţi asemănătoare, indicarea investigaţiilor specifice obligatorii pentru stabilirea unui diagnostic corect şi complet, aprecierea riscului de recurenţă şi a posibilităţilor de tratament (acolo unde este posibil). În plus, medicul genetician trebuie să posede calităţi psihologice pentru a putea depăşi situaţiile dificile din domeniu, cu care deseori se confruntă. Consultul genetic se realizează în centre de Genetică medicală (în spitale universitare) sau în cabinete de Genetică medicală (pentru spitalele judeţene). Centrele de genetică medicală trebuie să îndeplinească anumite condiţii: să fie localizate într-un spital mare unde să fie posibilă explorarea completă clinică şi paraclinică; spitalul trebuie să conţină o unitate de ambulator de specialitate şi să permită colaborări interclinice de calitate; să permită accesul liber al pacienţilor; să fie dotat cu capacităţi proprii de explorare (investigaţii la nivel cromosomic, biochimic şi molecular). Consultul genetic este realizat de medicul genetician care trebuie să aibă bună pregătire medicală de bază, la care se adaugă o pregătire temeinică de genetică medicală, asociată cu certe calităţi psihologice; Consultului genetic are loc în centre sau cabinete de genetică medicală care permit explorarea completă clinică şi paraclinică, accesul liber al pacienţilor şi sunt dotate cu capacităţi proprii de explorare.

2. INDICAŢIILE CONSULTULUI GENETIC În mod obişnuit, consultul genetic debutează cu prezentarea la medicul genetician a unui pacient sau a unui cuplu. În cazul pacienţilor unici care se adresează geneticianului pot exista două situaţii: Pacientul este sănătos, circumstanţă întâlnită de obicei premarital, în condiţiile în care există o anamneză familială pozitivă, cei doi membri ai viitorului cuplu fac parte din aceeaşi familie (căsătorie consanguină) sau consultantul solicită un diagnostic presimptomatic; Pacientul este bolnav, prezentând o anomalie congenitală, o boală monogenică, retard mintal, tulburări de sexualizare sau reproducere, o formă de cancer ereditar. Adresarea cuplurilor către un centru de genetică medicală se produce în următoarele situaţii: preconcepţional când există: anamneză familială pozitivă sau consanguinitate, vârstă parentală înaintată (maternă mai mare de 35 ani, paternă mai mare de 45 de ani) expunere la agenţi mutageni;

196

Consultul genetic

prenatal în condiţia expunerii mamei la agenţi teratogeni sau depistarea unor semne ecografice de alarmă; postnatal în situaţia în care cuplul consultant are un copil afectat. Indicaţiile practice ale consultului genetic sunt următoarele: Anamneză familială pozitivă, mai ales dacă cuplul consultant este consanguin: în cazul existenţei unor persoane afectate în familie, riscul de recurenţă al bolii este mai mare comparativ cu cel al cuplurilor cu anamneză familială negativă; în cazul căsătoriilor consanguine riscul cuplului de a avea un descendent afectat este crescut, deoarece probabilitatea celor doi părinţi de a fi heterozigoţi pentru o mutaţie recesiv autosomală este mai mare decât cea din populaţia generală. Vârstă maternă avansată (peste 35 ani) creşte riscul cuplului de a avea un copil cu trisomie, în special cu trisomie 21 (sindrom Down) datorită existenţei unei corelaţii certe între creşterea frecvenţei nedisjuncţiilor meiotice şi creşterea vârstei materne; Tulburări de sexualizare sau reproducere – de multe ori aceste manifestări patologice sunt consecinţa unor anomalii cromosomice echilibrate prezente la unul dintre părinţi, care deşi este normal fenotipic, poate avea copii cu anomalii cromosomice neechilibrate, care se pot manifesta clinic prin: Sterilitate – un cuplu este considerat steril, în condiţiile în care femeia nu a avut nici o sarcină după 2 ani de viaţă sexuală normală, ritmică, în absenţa folosirii unor mijloace contraceptive; Avorturi spontane, precoce (până la sfârşitul lunii a doua de sarcină) şi repetate; Nou născuţi morţi plurimalformaţi (vezi capitolul 5 Anomaliile şi bolile cromosomice); Anomalii congenitale multiple: Prezenţa unei anomalii congenitale unice nu implică un risc de transmitere la descendenţi, deoarece în majoritatea cazurilor acestea sunt produse de factori de mediu; Anomaliile congenitale multiple (asocierea a mai mult de trei anomalii) sunt frecvent produse de defecte genice sau cromosomice, iar riscul de recurenţă este semnificativ. Retard mintal cu sau fără tulburări de comportament: Retardul mintal uşor este datorit unor factori nefavorabili de mediu, aspect dovedit de dispariţia progresivă a deficitului la scoaterea individului din mediul social sau familial, iar riscul de recurenţă este cvasinul. Majoritatea cazurilor de retard mintal moderat sau sever sunt produse de anomalii genetice (monogenice sau cromosomice) ceea ce implică un risc crescut la descendenţi. Boală monogenică - indivizii afectaţi de o astfel de boală au un risc semnificativ de a avea descendenţi bolnavi, riscul depinzând de tipul bolii (recesivă sau dominantă) şi de sexul persoanei afectate (vezi capitolul 12 Sfatul genetic) Boală multifactorială - riscul este crescut în cazul în care există rude de gradul întâi afectate; Diagnostic prenatal - depistarea unor semne ecografice de alarmă la examenul ecografic sau valori anormale ale triplu testului reprezintă o indicaţie majoră de consult genetic (vezi capitolul 14 Screenigul şi diagnosticul prenatal). Pentru consult genetic se poate adresa o persoană (sănătoasă sau bolnavă) sau un cuplu (preconcepţional, prenatal sau postnatal); Indicaţiile consultului genetic sunt: anamneză familială pozitivă sau consangvinitate, vârstă maternă avansată, tulburări de sexualizare sau reproducere, anomalii congenitale multiple, retard mintal, boală genetică sau diagnostic prenatal.

Consultul genetic

197

3. ETAPELE CONSULTULUI GENETIC Consultul genetic se desfăşoară în mai multe etape, secvenţa lor fiind următoarea: Înregistrarea datelor personale şi a motivelor de consult - în cadrul acestei etape sunt analizate şi documentele medicale existente; 2. Anamneza familială, materno- fetală, neonatală şi postnatală; 3. Examenul fizic – corelarea datelor anamnestice cu rezultatele examenului fizic permit stabilirea unor ipoteze de diagnostic; 4. Examenele paraclinice, inclusiv cele genetice; 5. Analiza şi sinteza datelor clinice şi paraclinice permit stabilirea diagnosticului pozitiv şi a celui diferenţial; 6. Evaluarea prognosticului, a posibilităţilor de recuperare şi a riscului genetic; 7. Comunicarea verbală şi scrisă a rezultatelor - comunicarea acestor date trebuie făcută individualizat, verificând dacă persoanele care s-au adresat geneticianului au înţeles interpretarea datelor medicale şi valoarea riscului de recurenţă; comunicarea rezultatului consultului genetic se face în scris atât pacientului (pentru a sublinia încă o dată datele importante), cât şi medicului de familie sau medicului specialist care a trimis pacientul sau cuplul la consultaţie. Deosebit de importantă este urmărirea evoluţiei bolii la pacienţii diagnosticaţi atât datorită expresivităţii variabile a multor boli genetice, cât şi datorită apariţiei de noi posibilităţi de explorare, diagnostic şi tratament. 1.

a. ÎNREGISTRAREA DATELOR MEDICALE ALE PACIENTULUI Înregistrarea datelor personale se face sistematizat, pentru a nu scăpa din vedere detalii ce vor fi ulterior necesare pentru comunicarea cu pacientul şi familia sa. Cu această ocazie se înregistrează şi documentele medicale furnizate de specialistul ce trimite pacientul pentru consultaţie. b. ANAMNEZA FAMILIALĂ Anamneza familială se face în mod diferit dacă pacientul este copil sau dacă este adult. În cazul unui copil mic se pune accent pe anamneza materno-fetală, neonatală şi postnatală, în timp ce la adulţi accentul se pune pe dezvoltarea pubertară, anamneza reproductivă şi istoricul propriu-zis al bolii. Realizarea unei anamneze corectă implică: o bună experienţă clinică, cunoştinţe despre evoluţia normală fetală şi postnatală, abilitate de comunicare, acordarea unui timp suficient pentru a putea culege toate datele esenţiale din istoricul afecţiunii. Anamneza familială furnizează informaţii utile în următoarele domenii: diagnostic (mai ales în bolile cu expresivitate variabilă) – deseori este întâlnită situaţia când persoane din aceeaşi familie prezintă semne diferite ce sunt interpretate eronat ca entităţi separate, dar care la un examen genetic atent se dovedesc a fi manifestări diferite ale aceleiaşi boli (caracter pleiotrop); originea genetică a bolii – anamneza familială identifică uneori persoana la care a apărut mutaţia şi în raport cu aceasta se poate stabili riscul de recurenţă al maladiei; modul de transmitere – analiza arborelui genealogic este particulară în bolile monogenice, fiind utilă pentru stabilirea unui diagnostic corect (de exemplu transmitere tată- fiu în bolile autosomal dominante sau mamă- fiică în bolile autosomal recesive); în bolile comune ale adultului (afecţiuni multifactoriale) deseori este prezentă o agregare familială, fiind posibilă calcularea empirică a riscului de recurenţă.

198

Consultul genetic

Anamneza familială se realizează pe baza informaţiilor furnizate de pacient sau de alţi membri ai familiei, punându-se accent asupra rudelor până la III. Deosebit de utile sunt documentele medicale care atestă informaţiile furnizate de pacient şi examenul direct al membrilor familiei (mai ales al rudelor de gradul I). De asemenea, este utilă examinarea fotografiilor de familie care pot să sugereze existenţa unor trăsături familiale sau existenţa în familie şi a altor persoane afectate (nediagnosticate până în prezent). În cadrul anamnezei familiale trebuie înregistrate următoarele date: vârsta maternă, paternă şi a bunicilor în momentul concepţiei – vârsta maternă înanintată este asociată cu un risc crescut de aneuploidii, în timp ce vârsta paternă avansată este asociată cu un risc crescut de mutaţii gametice cu transmitere dominant autosomală; originea etnică şi religioasă – unele boli sunt mai frecvente în anumite comunităţi; prezenţa în familie a altor boli sau simptome asemănătoare sau nu cazului index - aceste boli (boli cronice, retard mintal, cancer) pot fi entităţi diferite, dar pot reprezenta alte forme de manifestarea ale aceleiaşi afecţiuni (boli cu expresivitate variabilă); decese în familie – se cer date referitoare la: cauze, vârstă, rezultate necroptice; tulburări de reproducere – sterilitate, avorturi spontane repetate, nou născuţi morţi; caractere morfologice familiale – este utilă examinarea fotografiilor de familie. Pe baza datelor anamnezei familiale va fi realizat arborele genealogic. Arborele genealogic reprezintă o prezentare schematică a persoanelor dintr-o familie şi a relaţiilor de rudenie dintre acestea, folosind o serie de simboluri convenţionale, valabile pe plan mondial şi care au fost standardizate la Conferinţele internaţionale de genetică. Simbolurile folosite pentru întocmirea arborelui genealogic sunt prezentate în figura 10.1. În raport cu rezultatele obţinute, anamneza familială poate fi: pozitivă - când există şi alte cazuri de boală în familie; negativă, dar semnificativă (de exemplu consanguinitate parentală); fals negativă - din diferite motive (date insuficiente, nonpaternitate, mutaţii noi, expresivitate variabilă); real negativă. Anamneza materno-fetală furnizează informaţii referitoare la toate stadiile evolutive ale produsului de concepţie, atât prenatal, cât şi postnatal. Concepţia Datele anamnestice referitoare la concepţie care trebuie analizate sunt: Antecedentele reproductive ale cuplului - tratamente pentru sterilitate, metode anticoncepţionale, alte sarcini şi evoluţia lor (avorturi spontane, nou născuţi morţi, copii afectaţi); Vârsta părinţilor la momentul concepţiei, fiind cunoscut că vârsta maternă avansată (peste 35-38 ani) predispune la anomalii cromosomice numerice, iar vârsta paternă avansată (peste 50-55 ani) la mutaţii genice; Bolile cronice ale mamei şi în special: diabetul zaharat (hiperglicemia este teratogenă, fiind necesară o monitorizare continuă a diabetului în timpul sarcinii) epilepsia (multe dintre medicamentele anticonvulsivante sunt teratogene, fiind recomandată evitarea folosirii lor sau utilizarea de preparate mai puţin nocive în primele 3 luni de sarcină); Persoană sănătoasă de sex masculin

Persoană afectată de sex masculin

Persoană sănătoasă de sex feminin

Persoană bolnavă de sex feminin

Individ sănătos cu sex necunoscut

Individ afectat cu sex necunoscut

3

4

S

S

S

Consultul genetic

199

Indivizi sănătoşi care fac prate din aceeaşi fratrie43 Sarcină cu făt de sex masculin, feminin, respectiv necunoscut Avort spontan cu făt neafectat, respectiv afectat Întrerupere de sarcină cu făt neafectat, respectiv afectat

P

Copil adoptat

Heterozigot cert

Proband

Consultant

P Gemeni monozigoţi

Gemeni dizigoţi

Gemeni cu zigoţie necunoscută Individ decedat datorită unei cauze negenetice Individ decedat datorită unei cauze genetice Căsătorie

Căsătorie consanguină

Legătură nelegitimă

Căsătorie întreruptă Linia fratriei

Cuplu steril

Figura 10.1. Simboluri internaţionale folosite pentru întocmirea arborelui genealogic Obiceiurile nocive ale mamei, precum consumul de alcool sau droguri, respectiv fumatul afectează dezvoltarea fătului; Grupele sanguine ABO şi Rh pentru depistarea precoce a unei incompatibilităţi maternofetale. Evoluţia sarcinii Principalele elemente anamnestice referitoare la evoluţia sarcinii sunt: Faptul dacă sarcina a fost planificată sau nu; în cazul sarcinilor nedorite, prin aplicarea unor metode abortive inadecvate este posibilă apariţia unor anomalii congenitale la copil; Data ultimului ciclu menstrual pentru aprecierea corectă a vârstei gestaţionale şi a dezvoltării somatometrice a fătului; Expunerile la teratogene în trimestrul I – expunerile cele mai frecvente sunt:

43

Fratrie – toţi copiii unui cuplu parental

200

Consultul genetic

alcoolul - expunerea zilnică la doze mari produce sindromul alcool fetal, caracterizat prin retard mintal, cu hiperactivitate şi întârzierea apariţiei limbajului, microcefalie, microftalmie şi anomalii cardiace; hipertermia – menţinerea unei stări febrile, cu temperaturi peste 39ºC, timp de mai mult de 2-3 zile poate produce diverse anomalii congenitale; Primele mişcări fetale, în mod normal, sunt percepute de la vârsta de 4-5 luni, cresc în intensitate până în luna 7-8, apoi scad în intensitate; mişcările fetale diminuate apar în boli cerebrale, boli neuro- musculare sau diminuarea spaţiului intrauterin (pot produce artrogripoză şi deformaţii); în cazul primei sarcini mişcările fetale sunt percepute mai tardiv; Cantitatea de lichid amniotic – oligohidramniosul (deficitul de lichid amniotic) poate semnifica existenţa unei malformaţii renale) iar polihidramniosul (excesul de lichid amniotic) poate semnifica existenţa unei atrezii esofagiene; Ecografia fetală: apreciază dimensiunile şi morfologia fătului, aspectul placentei (poziţie, dimensiuni, morfologie) şi al cordonului ombilical, cantitatea de lichid amniotic; Alte metode de diagnostic prenatal (dacă au fost aplicate) şi rezultatele acestora. Naşterea Pentru realizarea unui diagnostic corect trebuie culese următoarele date anamnestice referitoare la naştere: Vârsta gestaţională: este stabilită în raport cu data ultimei menstruaţii şi prin examen ecografic, prin măsurarea diametrului biparietal şi a lungimii femurului fetal; exactitatea datelor este deosebit de importantă pentru aprecierea corectă a dezvoltării antropometrice a fătului - de exemplu, când nou-născutul are greutate mică, este important să stabilim dacă acesta este prematur sau dismatur; Durata travaliului - un travaliu mai lung de 6 ore poate provoca suferinţă fetală, cu apariţia ulterioară de fenomene neurologice şi retard mintal; Prezentaţia - o prezentaţie distocică (pelvină, transversală) poate produce deformaţii sau suferinţă fetală, în condiţiile în care naşterea se produce pe cale naturală; Anomaliile cordonului ombilical sau ale placentei pot cauza un retard de creştere intrauterină printr-o suferinţă fetală cronică; Scorul APGAR – valori scăzute ale acestui indice sau necesitatea reanimării la naştere sunt date anamnestice deosebit de importante, care atrag atenţia asupra unei suferinţe fetale, care pot determina ulterior semne neurologice şi retard mintal; Datele morfometrice (talia, greutatea, perimetrul cranian, perimetrul toracic) sunt esenţiale atât pentru evaluarea copilului la naştere, cât şi pentru urmărirea în dinamică a dezvoltării lui (de exemplu un perimetru cranian care creşte rapid atrage atenţia asupra unei hidrocefalii). Anamneza neonatală furnizează date despre parametrii copilului în prima lună de viaţă, perioadă deosebit de importantă pentru dezvoltarea ulterioară. Parametrii care se iau în discuţie sunt: Respiraţia (frecvenţa respiratorie, amplitudinea şi regularitatea respiraţiilor, existenţa semnelor de dispnee) activitatea cardiacă (frecvenţa şi ritmicitatea zgomotelor cardiace, apariţia cianozei la efort de plâns sau supt) tonusul muscular, aspectul tegumentelor (roz, cianotice sau palide) şi reactivitatea la stimuli (pe baza acestor date se stabileşte scorul APGAR);

Consultul genetic

201

Permeabilitatea esofagului şi anusului – poate fi identificată de la naştere prin evidenţierea eliminării de meconiu; Adaptarea respiratorie şi alimentară; Particularităţile icterului neonatal (se înregistrează momentul apariţiei, intensitatea, durata lui şi eventualul tratament); Existenţa convulsiilor poate sugera o cauză metabolică, precum hipoglicemia sau hipocalcemia; Vărsăturile şi regurgitările pot atrage atenţia asupra unei despicături velo- palatine sau a unei stenoze hipertrofice de pilor. Anamneza postnatală furnizează date despre dezvoltarea individului în special în primii ani de viaţă. Principalele date anamnestice care trebuie analizate sunt: Dezvoltarea psihomotorie, cu evidenţierea datelor principalelor achiziţii un copil normal ţine capul la 3 luni, stă în şezut singur la 6 luni, merge şi vorbeşte la un an; regresia cu pierderea achiziţiilor sugerează existenţa unei boli de metabolism; Creşterea staturală, ponderală şi a perimetrului cranian este apreciată comparativ cu curbele de creştere corespunzătoare populaţiei respective; în paralel se apreciază viteza de creştere, dezvoltarea staturo- ponderală fiind dependentă şi de dimensiunile antropometrice ale părinţilor; Erupţia dentară – în mod normal incisivii centrali inferiori erup la 6 luni, cei laterali superiori la 8 luni, cei mediani la 9 luni etc; Dezvoltarea pubertară – trebuie analizată diferenţiat în funcţie de sexul pacientului: la o persoană de sex feminin trebuie evidenţiată vârsta menarhei, cea a debutului dezvoltării glandelor mamare, ritmicitatea ciclurilor menstruale, momentul apariţiei pilozităţii sexuale; la o persoană de sex masculin trebuie notate vârsta apariţiei pilozităţii sexuale, a schimbării tonalităţii vocei, a momentului primei poluţii etc. c. EXAMENUL CLINIC Pentru desfăşurarea în condiţii bune a examenului fizic este necesară îndeplinirea unor criterii: Condiţiile să fie optime – pacientul trebuie să fie relaxat şi cooperant, lumina şi temperatura trebuie să fie în parametri optimi, în cazul în care pacientul este copil trebuie să fie prezentă mama sau altă persoană în care copilul are încredere; Tehnică impecabilă, care să includă: evaluare generală: talie, perimetru cranian, dimensiunile unor segmente şi proporţia dintre segmente, evoluţia achiziţiilor motorii şi psihice, evoluţia pubertăţii; evaluare metodică: a tuturor aparatelor şi sistemelor asociată cu un examen locoregional amănunţit al regiunilor de interes; examinare completă: examenul trebuie să cuprindă şi organele de simţ şi sistemul nervos (tonus, reflexe, examinarea nervilor cranieni); examen minuţios pentru evidenţierea unor semne minore evocatoare pentru unele boli sau sindroame (îngustează aria diagnosticului diferenţial); Reevaluarea pacientului (+/- spitalizare) este necesară în condiţiile unui examen iniţial incomplet; a incertitudinii diagnosticului iniţial, a introducerii unei metodologii speciale de diagnostic sau pentru aprecierea evoluţiei pacientului. Obiectivarea datelor se realizează prin: măsurători generale (pe segmente şi regiuni) fotografierea pacientului (permite definirea mai corectă a anomaliilor, comparaţii cu alte cazuri şi realizarea unei bănci de date);

202

Consultul genetic

Înregistrarea datelor impune descrierea precisă, cu o terminologie adecvată (conform unei semiologii malformative) şi descrierea completă (inclusiv înregistrarea datelor normale sau absenţa unor semne patologice). O situaţie particulară o reprezintă examenul fizic al nou născutului mort. În acest caz sunt foarte importante următoarele etape: stabilirea vârstei gestaţionale; măsurarea taliei, greutăţii, perimetrului cranian; examinarea fătului, a cordonului ombilical (posibilitatea existenţei unei artere ombilicale unice) şi a placentei (mare, mică, prezenţa altor modificări); fotografierea generală şi pe segmente; efectuarea unei radiografii de schelet; necropsia sistematică şi atentă efectuată de către un fetopatolog; puncţia cardiacă (permite prelevarea unei cantităţi de sânge) sau biopsia cutanată în vederea obţinerii de celelule ce pot fi cultivate in vitro, care ar permite efectuarea unui cariotip (incidenţa anomaliilor cromosomice la nou-născuţii morţi este de circa 1/30). Examenul fizic şi anamneza trebuie să permită stabilirea unor supoziţii de diagnostic pozitiv şi diferenţial, care să fie validate ulterior de rezultatele investigaţiilor paraclinice. d. INVESTIGAŢII PARACLINICE Pentru explorarea completă a pacientului sunt necesare următoarele acţiuni: Consultarea altor specialişti (cardiolog, neuropsihiatru, endocrinolog, oftalmolog, psiholog etc) care vor aprecia cu exactitate anomaliile din domeniul lor de activitate, ceea ce va contribui la stabilirea unui diagnostic corect. Realizarea de explorări imagistice: radiografii pentru vârstă osoasă sau modificări ale oaselor lungi; ecografie pentru aspectul viscerelor; tomografie computerizată, RMN pentru aprecierea malformaţiilor cerebrale etc. Examenele biochimice sau hormonale vor completa diagnosticul afecţiunilor metabolice sau endocrine; Testele serologice sunt utile în diagnosticul unor embriopatii; Testele genetice citogenetice (analiză cromosomică pre- sau postnatală pe cromosomi marcaţi sau prin tehnica FISH) şi moleculare (identificarea mutaţiei sau a proteinei anormale) confirmă etiologia genetică a bolii diagnosticate clinic şi paraclinic. e. ANALIZA ŞI SINTEZA DATELOR Diagnosticul bolilor genetice şi al sindroamelor plurimalformative este de obicei dificil, principalele probleme de diagnostic fiind generate de vârsta mică a pacienţilor şi existenţa de boli cu expresivitate variabilă. Stabilirea unui diagnostic corect şi complet este esenţială în bolile genetice, deoarece acesta rămâne valabil întreaga viaţă. După stabilirea diagnosticului este obligatorie întocmirea unui program de urmărire a pacientului pentru depistarea precoce a complicaţiilor, adaptarea tratamentului şi acordarea sfatului genetic. În majoritatea cazurilor diagnosticul nu este o urgenţă, dar părinţii sunt nerăbdători şi de aceea este utilă stabilirea unui diagnostic preliminar, cu menţionarea anomaliilor identificate. Pentru elaborarea diagnosticului pozitiv al unei afecţiuni genetice se efectuează următoarele operaţiuni: se rememorează şi se ordonează datele provenite din diferite surse; se stabilesc elementele prezente şi absente (certe şi probabile) sunt identificate aparatele şi sistemele afectate şi se încearcă stabilirea de chei, algoritmi şi scoruri de diagnostic, iar în final se face o documentare amplă, pe baza datelor existente în diverse tratate de genetică medicală, a celor stocate în programele de diagnostic computerizat (POSSUM, Oxford Medical Databases) sau a celor furnizate de diferite site-uri de Internet.

Consultul genetic

203

În condiţiile în care stabilirea unui diagnostic specific este imposibilă, este obligatorie urmărirea în timp a pacientului pentru a evidenţia apariţia de noi semne relevante pentru o anumită afecţiune. O atenţie deosebită trebuie acordată erorilor de diagnostic, determinate de o tehnică deficitară sau de cunoaşterea incompletă a datelor din domeniu. Principalele etape ale consultului genetic sunt: înregistrarea datelor personale şi a motivelor de consult; anamneza familială, materno- fetală, natală, postnatală, examenul fizic; examenele paraclinice; analiza şi sinteza datelor; evaluarea prognosticului, a posibilităţilor de recuperare şi a riscului de recurenţă; comunicarea verbală şi scrisă a rezultatelor. Anamneza familială furnizează informaţii legate de diagnostic, originea genetică a bolii şi modul de transmitere şi asigură înregistrarea: vârstei parentale, originii etnice şi religioase, existenţei altor cazuri de boală, deceselor şi tulburărilor reproductive prezente în familie; aceasta poate fi pozitivă; negativă semnificativă; fals negativă sau real negativă. Anamneza materno- fetală trebuie să înregistreze date legate de concepţie, evoluţia sarcinii şi naştere; Anamneza neonatală apreciază starea copilului imediat după naştere şi înregistrează următoarele elemente: scorul APGAR; permeabilitatea esofagului şi anusului; adaptarea respiratorie şi alimentară; existenţa icterului, convulsiilor, a vărsăturilor sau regurgitărilor. Anamneza postnatală apreciază dezvoltarea copilului după naştere şi înregistrează: dezvoltarea psiho- motorie, creşterea staturo- ponderală, erupţia dentară şi dezvoltarea pubertară. Examenul clinic al pacientului necesită: condiţii optime, tehnică impecabilă reevaluarea pacientului, obiectivarea şi înregistrarea datelor; Paleta explorărilor paraclinice conţine: examene clinice de specialitate, explorări imagistice, teste biochimice, hormonale, serologice şi nu în ultimul rând, teste genetice (citogenetice şi moleculare).

II. APLICAŢII PRACTICE A. ANAMNEZA FAMILIALĂ 1 Cuplul Popescu Ion (sănătos, în vârstă de 42 ani) şi Maria (sănătoasă, 37 ani), se prezintă la consultaţie pentru a afla riscul ca sarcina în curs de evoluţie a Mariei să fie afectată. Anamneza reproductivă a cuplului relevă că Ion şi Maria au un băiat sănătos (Gheorghe, 18 ani) o fată bolnavă (Ioana, 16 ani) un băiat bolnav (Vasile, 12 ani), un avort spontan cu făt sănătos, iar în prezent Maria este însărcinată (sarcină în vârstă de 10 săptămâni). Afecţiunea identificată în descendenţa consultanţilor se manifestă prin tegumente, fanere şi iris decolorate, fiind catalogată de medicul genetician ca fiind albinism. Ion şi Maria sunt veri de gradul I, mama lui Ion şi tatăl Mariei fiind fraţi. Ion face parte dintr-o fratrie de 3 persoane. Prima din fratrie este Elena (sănătoasă, 45 ani), care este căsătorită cu un bărbat sănătos (Ilie, 48 ani). Cei doi au un băiat sănătos (Constantin, 22 ani) şi o fată sănătoasă (Irina, 18 ani). Al doilea în fratria consultantului este Daniel (sănătos, 44 ani) care iniţial a fost căsătorit cu o femeie sănătoasă (Vasilica) – cuplu steril. Daniel a divorţat şi are o relaţie nelegitimă cu o femeie sănătoasă (Violeta, 38 ani), din care a rezultat un băiat sănătos (Ciprian, 14 ani), după care cei doi au înfiat o fată sănătoasă (Matilda, 12 ani). Părinţii consultantului, Elisabeta (69 ani) şi Toma (74 ani) sunt amândoi sănătoşi.

204

Consultul genetic

Maria face parte dintr-o fratrie de trei persoane, fiind cea mai mare. În fratrie, după Maria urmează o soră afectată (Svetlana, 33 ani) şi un frate bolnav (Marius, 31 ani). Svetlana este măritată cu un bărbat sănătos, iar anamneza reproductivă a cuplului indică: doi gemeni monozigoţi sănătoşi (Cornel şi Costel, 11 ani), o întrerupere de sarcină cu făt sănătos, o fată sănătoasă (Domnica, 9 ani) şi un băiat sănătos (Dorel, 5 ani). Marius este însurat cu o femeie afectată (Florica, 30 ani) cei doi având două gemene dizigote afectate (Corina şi Dorina, 9 ani), o întrerupere de sarcină cu făt afectat, un avort spontan cu făt afectat, iar momentan Florica este însărcinată cu făt de sex feminin (sarcină în vârstă de 26 săptămâni). Părinţii Mariei, Costache (66 ani) şi Ecaterina (62 ani) sunt amândoi sănătoşi. Bunicii comuni ai consultanţilor, Toader (92 ani) şi Maria (88 ani) sunt, de asemenea, sănătoşi. 1. Desenaţi arborele genealogic folosind simbolurile specifice (figura 10.2.). 2. Stabiliţi, pe baza criteriilor de recunoaştere a afecţiunilor monogeneice tipul de transmitere al afecţiunii prezente în familia consultaţilor (vezi capitolul 7). I 1 2 II

1 1

2 3

2 4

3

5

6

7

4 8

9

10

11

III 1 IV

2

3

4

5

6

7

8

9 10 S

11 12 13

14 15 16 17

18 19 S

Figura 10.2. Arborele genealogic stabilit pe baza anamnezei familiale 1 Boala prezentă în familia consultanţilor este recesivă deoarece: frecvenţa bolii în familie este redusă, transmiterea afecţiunii în familie este discontinuă, există consanguinitate, doi părinţi sănătoşi pot avea copii bolnavi (cuplul III.6. – III.7.), iar doi părinţi bolnavi au toţi copii afectaţi (cuplul III.10. – III.11.). Afecţiunea este recesiv autosomală deoarece: doi părinţi sănătoşi (cuplul III.6. – III.7.) au o fată afectată (IV.6.) iar un cuplu în care tatăl este sănătos şi mama afectată (cuplul III.8. – III.9.) are băieţi sănătoşi (IV.10., IV.11., IV.14.).

B. ANAMNEZA FAMILIALĂ 2 Cuplul Ionescu Ion (afectat, în vârstă de 46 ani) şi Maria (afectată, 40 ani), se prezintă la consultaţie pentru a afla riscul ca sarcina în curs de evoluţie a Mariei să fie afectată. Anamneza reproductivă a cuplului relevă că Ion şi Maria au un băiat bolnav (Gheorghe, 20 ani) o fată bolnavă (Ioana, 17 ani) un băiat sănătos (Vasile, 12 ani), iar în prezent Maria este însărcinată (sarcină în vârstă de 10 săptămâni). Afecţiunea identificată în descendenţa consultanţilor se manifestă prin deformaţii osoase grave la nivelul craniului, toracelui şi membrelor, deficit de creştere, hipofosfatemie şi absenţa răspunsului terapeutic la administrarea de vitamină D. Diagnosticul stabilit de medicul genetician a fost de rahitism rezistent la administrarea de vitamină D. Ion este cel mai mic dintr-o fratrie de 2 persoane. Prima din fratrie este Elena (afectată, 50 ani), care este căsătorită cu un bărbat sănătos (Ilie, 52 ani). Cei doi au un băiat sănătos (Constantin, 28 ani) şi o fată sănătoasă (Irina, 26 ani). Părinţii consultantului: Elisabeta a fost afectată şi a decedat la vârsta de 69 ani şi Toma, sănătos (77 ani). Maria face parte dintr-o fratrie de trei persoane, fiind cea mai mare. În fratrie, după Maria urmează o soră afectată (Svetlana, 36 ani) şi un frate sănătos (Marius, 31 ani). Svetlana este măritată cu un bărbat sănătos, iar anamneza reproductivă a cuplului indică: o fată sănătoasă (Domnica, 14 ani) şi un băiat sănătos (Cornel 13 ani). Marius este însurat cu o femeie sănătoasă (Florica, 30 ani) cei doi având

Consultul genetic

205

doi gemeni dizigoţi sănătoşi (Corina şi Dorin, 9 ani), un avort spontan cu făt sănătos, iar momentan Florica este însărcinată cu făt de sex feminin (sarcină în vârstă de 26 săptămâni). Părinţii Mariei, tatăl, Costache, a fost afectat şi a decedat la vârsta de 66 ani, iar mama, Ecaterina, are 69 ani şi este sănătoasă. 1. Desenaţi arborele genealogic folosind simbolurile specifice (figura 10.3.). 2. Stabiliţi, pe baza criteriilor de recunoaştere a afecţiunilor monogeneice tipul de transmitere al afecţiunii prezente în familia consultaţilor (vezi capitolul 7). I

1 1

2

1

2

2

3 3

4

4 5

6

7

8

II III

3

4

5

6 7 S

8

9

10

11

12 S

Figura 10.3. Arborele genealogic stabilit pe baza anamnezei familiale 2 Boala prezentă în familia consultanţilor este dominantă deoarece: frecvenţa bolii în familie este mare, transmiterea afecţiunii în familie este continuă, nu există consanguinitate, doi părinţi sănătoşi au toţi copii sănătoşi (cuplul II.7. – II.8.), iar doi părinţi bolnavi pot avea copii sănătoşi (cuplul II.3. – II.4.). Afecţiunea este dominată legată de cromosomul X deoarece: un cuplu în care tatăl este afectat şi mama este sănătoasă (cuplul I.3. – I.4.) are toţi băieţii sănătoşi (II.7.), iar tatăl bolnav (I.3.) are toate fetele afectate (II.4., II.6.).

C. ANAMNEZA FAMILIALĂ 3 Cuplul Ionescu Ion (afectat, în vârstă de 47 ani) şi Maria (afectată, 43 ani), se prezintă la consultaţie pentru a afla riscul ca sarcina în curs de evoluţie a Mariei să fie afectată. Anamneza reproductivă a cuplului relevă că Ion şi Maria au un băiat sănătos (Gheorghe, 22 ani) o fată sănătoasă (Ioana, 19 ani) un băiat bolnav (Vasile, 15 ani), iar în prezent Maria este însărcinată (sarcină în vârstă de 10 săptămâni). Afecţiunea identificată în descendenţa consultanţilor se manifestă prin elasticitate excesivă a pielii, hiperlaxitate şi hipermobilitate articulară, fragilitate tegumentară şi vasculară cu sângerări mari la traumatisme minime. Diagnosticul stabilit de medicul genetician a fost de sindrom Ehlers-Danlos tip I. Ion este cel mai mic dintr-o fratrie de 3 persoane. Prima din fratrie este Elena (sănătoasă, 50 ani), care este căsătorită cu un bărbat sănătos (Ilie, 52 ani). Cei doi au un băiat sănătos (Constantin, 29 ani) şi o fată sănătoasă (Irina, 23 ani). Al doilea în fratria consultantului este Valeria (49 ani) sănătoasă, măritată cu un bărbat sănătos, cuplul fiind steril. Părinţii consultantului: mama, Elisabeta, are 69 ani şi este sănătoasă, iar tatăl Toma are 72 ani şi este afectat. Maria face parte dintr-o fratrie de două persoane, fiind cea mai mare. În fratrie, după Maria urmează un frate bolnav (Marius, 41 ani). Marius este însurat cu o femeie sănătoasă (Florica, 30 ani) cei doi având două gemene dizigote afectate (Corina şi Dorina, 12 ani), iar momentan Florica este însărcinată cu făt de sex masculin (sarcină în vârstă de 26 săptămâni). Părinţii Mariei, tatăl, Costache, are 66 ani şi este sănătos, iar mama, Ecaterina, are 69 ani şi este bolnavă. 1. Desenaţi arborele genealogic folosind simbolurile specifice (figura 10.4.). 2. Stabiliţi, pe baza criteriilor de recunoaştere a afecţiunilor monogeneice tipul de transmitere al afecţiunii prezente în familia consultaţilor (vezi capitolul 7). 1 2 3 4 I

206

Consultul genetic 1

2

3

4

5

6

8

9

II 1

2

3

4

5

6

7

III

8

9

10

S

S

Figura 10.4. Arborele genealogic stabilit pe baza anamnezei familiale 3 Boala prezentă în familia consultanţilor este dominantă deoarece: frecvenţa bolii în familie este mare, transmiterea afecţiunii în familie este continuă, nu există consanguinitate, doi părinţi sănătoşi au toţi copii sănătoşi (cuplul II.1. – II.2.), iar doi părinţi bolnavi pot avea copii sănătoşi (cuplul II.5. – II.6.). Afecţiunea este dominat autosomală deoarece: doi părinţi afectaţi (cuplul II.5. – II.6.) au fată sănătoasă (III.4.) un cuplu în care tatăl este afectat şi mama este sănătoasă (cuplul I.1. – I.2.) are băieţi bolnavi (II.5.), iar tatăl bolnav (I.1.) are fete sănătoase (II.2., II.4.).

D. ANAMNEZA FAMILIALĂ 4 Cuplul Vasilescu Ion (sănătos, în vârstă de 42 ani) şi Maria (sănătoasă, 37 ani), se prezintă la consultaţie pentru a afla riscul ca sarcina în curs de evoluţie a Mariei să fie afectată. Anamneza reproductivă a cuplului relevă că Ion şi Maria au un băiat sănătos (Gheorghe, 18 ani) o fată sănătoasă (Gabriela, 16 ani) un băiat bolnav (Nicolae, 12 ani), un avort spontan cu făt sănătos, iar în prezent Maria este însărcinată (sarcină în vârstă de 10 săptămâni). Afecţiunea identificată în descendenţa consultanţilor se manifestă prin anemie, sângerări masive la traumatisme minime, blocări articulare la nivelul articulaţiilor genunchilor, secundare unor hemartroze. Analiza sângelui a indicat un timp de coagulare anormal şi absenţa factorului de coagulare VIII, ceea ce a permis medicului genetician stabilirea diagnosticului hemofilie tip A. Ion şi Maria sunt veri de gradul I, mama lui Ion şi tatăl Mariei fiind fraţi. Ion face parte dintr-o fratrie de 2 persoane. Prima din fratrie este Elena (sănătoasă, 45 ani), care este căsătorită cu un bărbat sănătos (Ilie, 48 ani). Cei doi au un băiat afectat (Constantin, 22 ani) şi o fată sănătoasă (Irina, 18 ani). Părinţii consultantului, Elisabeta (69 ani) şi Toma (74 ani) sunt amândoi sănătoşi. Maria face parte dintr-o fratrie de două persoane, fiind cea mai mare. Ea are un frate sănătos (Marius, 31 ani). Marius este însurat cu o femeie afectată (Florica, 30 ani) cei doi băieţi afectaţi (Caludiu, 10 ani şi Dorin, 9 ani), iar momentan Florica este însărcinată cu făt de sex feminin (sarcină în vârstă de 26 săptămâni). Părinţii Mariei, Costache (66 ani) şi Ecaterina (62 ani) sunt amândoi sănătoşi. Bunicii comuni ai consultanţilor, Toader (92 ani) are hemofilie tip A, iar Maria (88 ani) este sănătoasă. 1. Desenaţi arborele genealogic folosind simbolurile specifice (figura 10.5.). 2. Stabiliţi, pe baza criteriilor de recunoaştere a afecţiunilor monogeneice tipul de transmitere al afecţiunii prezente în familia consultaţilor (vezi capitolul 7). 1 2 I 1

2

3

4

II 1

2

3

4

5

6

III 1 IV

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Consultul genetic

207

Figura 10.5. Arborele genealogic stabilit pe baza anamnezei familiale 4 Boala prezentă în familia consultanţilor este recesivă deoarece: frecvenţa bolii în familie este redusă, transmiterea afecţiunii în familie este discontinuă, există consanguinitate şi doi părinţi sănătoşi pot avea copii bolnavi (cuplul III.3. – III.4.). Afecţiunea este recesivă legată de cromosomul X deoarece: doi părinţi sănătoşi (cuplul III.3. – III.4.) au doar băieţi afectaţi (IV.5.) iar un cuplu în care tatăl este sănătos şi mama afectată (cuplul III.5. – III.6.) are toţi băieţii afectaţi (IV.8., IV.9.).

III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR A. DEFINIŢI URMĂTOARELE NOŢIUNI: Manifestare congenitală Anamneză neonatală

Consult genetic Anamneză postnatală

Anamneză familială Arbore genealogic

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1 2 3 4 5 6 7 8

9

Care sunt particularităţile caracterelor ereditare? Care sunt simbolurile convenţionale internaţionale pentru următoarele situaţii: legătură nelegitimă, divorţ, cuplu steril, sarcină cu făt de sex feminin în vârstă de 28 săptămâni, întrerupere de sarcină, nou născut mort de sex feminin, băiat adoptat. Care sunt indicaţiile consultului genetic? Ce elemente trebuie să înregistreze anamneza familială? Care sunt elementele anamnestice ce trebuie avute în vedere în evaluarea unui copil în vârstă de o lună? Dar la o femeie în vârstă de 32 ani? Cum se apreciază dezvoltarea postnatală a unui individ? Cum se examinează un nou născut mort? Presupunând că sunteţi medic de familie, pe care dintre următorii pacienţi îi veţi trimite pentru consult genetic? g. Cuplu tânăr, neînrudit, care are 2 copii sănătoşi, dar planifică o nouă sarcină; h. Cuplu consangvin (verişori de gradul doi); i. Cuplu steril; j. Cuplu aparent sănătos, cu 3 copii sănătoşi, în prezent femeia fiind însărcinată (luna a doua); femeia are 42 ani; k. Cuplu tânăr, neînrudit, cu 3 avorturi spontane (lună mică) în antecedente. Se prezintă la consultaţie un cuplu tânăr, neînrudit, care cer informaţii privind riscul pentru o eventuală sarcină. Anamneza reproductivă a cuplului arată că ei au un băiat sănătos, un avort spontan în luna a doua şi o fată cu dismorfie facială (hipotelorism, despicătură labio- maxilopalatină) şi polidactilie postaxială. Ultimul copil a decedat la vârsta de o lună. Examenul necroptic a evidenţiat anomalii la nivel cerebral (holoprozencefalie) şi cardiac. Cariotipul efectuat în acest caz a arătat o trisomie 13 prin translocaţie 13/21. În prezent, cuplul ar mai dori un copil, motiv pentru care se prezintă la consultaţie. a. Care sunt principalele etape de abordare a situaţiei din această familie? b. Pentru clarificarea situaţiei, doriţi să efectuaţi teste genetice? Care anume? La cine? c. Care este riscul ca următoarea sarcină să fie afectată? Cum ar trebui comunicat acest risc?

C. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun dintre cele enunţate ("complement simplu"): 1. Doamna X.A. (22 ani) şi domnul X.B. (27 ani) se prezintă pentru consult genetic deoarece au un copil cu retard al dezvoltării psiho-motorii. În prezent doamna X este însărcinată (6 săptămâni) şi ar vrea să ştie riscul ca şi această sarcină să fie afectată. Anamneza familială relevă faptul că o verişoară

208

Consultul genetic

primară a doamnei X a avut 2 avorturi spontane şi un copil (momentan decedat) diagnosticat cu sindrom Patau (trisomie 13). Medicul genetician a examinat copilul X, a remarcat existenţa semnelor clinice sugestive pentru diagnosticul de sindrom Down şi a indicat efectuarea cariotipului la copil şi la mamă. a. De ce a cerut geneticianul efectuarea cariotipului la mamă? A. vârsta mare a mamei. B. vârsta mare a tatălui. C. contextul familial D. toate răspunsurile sunt corecte. E. nici unul dintre răspunsuri nu este corect b. Dintre variantele posibile de cariotip la copil, care este mai probabilă, având în vedere contextul familial? A. trisomie 21 omogenă B. trisomie 21 prin translocaţie Robertsoniană 13/21 C. trisomie 21 în mozaic C. trisomie 21 prin translocaţie Robertsoniană 21/21 E. trisomie 21 prin translocaţie Robertsoniană 15/21 c. Cariotipurile efectuate la mamă şi copil au relevat existenţa unei translocaţii robertsoniene 13/21 echilibrată la mamă şi neechilibrată la copil. Ce investigaţii suplimentare sunt necesare pentru un management corect al familiei X? A. efectuarea cariotipului la tată B. efectuarea cariotipului la verişoara mamei C. efectuarea cariotipului la soţul verişoarei D. toate răspunsurile sunt corecte E. nici un răspuns corect d. Dacă s-ar efectua cariotipul fetal şi testul ar evidenţia existenţa unui băiat, cu 45 cromosomi şi prezenţa translocaţiei, care ar fi prognosticul pentru această sarcină? A. băiatul va avea sindrom Down B. băiatul va avea sindrom Patau C. băiatul va avea sindrom Turner D. băiatul va fi fenotipic normal E. nici unul dintre răspunsuri nu estecorect 2. Cuplul Z (tineri, aparent sănătoşi) se prezintă pentru consult genetic deoarece au un copil afectat cu fibroză chistică (mucoviscidoză, boală autosomal recesivă) şi îşi mai doresc un copil. Anamneza familială relevă că domnul şi doamna Z sunt verişori de gradul doi. a. Care este genotipul părinţilor? A. ambii sunt homozigoţi NN B. ambii sunt heterozigoţi Na C. ambii sunt homozigoţi aa D. unul este homozigot NN şi unul heterozigot Na E. unul este homozigot aa şi unul heterozigot Na b. Care este riscul lor de a avea un copil afectat? A. 100% B. 50% C. 25% D. 10% E. 0% c. Ce analize paraclinice ar trebui geneticianul să indice în cazul cuplului Z? A. efectuarea cariotipului B. efectuarea testului cromatinei X C. efectuarea dozării clorurii de potasiu în sudoare D. determinarea glicemiei E. aplicarea unei metode de analiză molecualră pentru identificarea precisă a mutaţiei

11. DIAGNOSTICUL MOLECULAR AL BOLILOR GENETICE I. DATE TEORETICE A. DEFINIŢIE. OBIECTIVE. Orice boală este definită ca entitate clinică prin mai multe caracteristici: una sau mai multe cauze (factori etiologici), un proces patogenic care determină manifestările clinice şi tabloul clinic şi paraclinic specific (fenotipul specific). Cu cât aceste elemente sunt mai bine definite, cu atât diagnosticul este mai precis, iar strategiile terapeutice şi preventive sunt mai clar direcţionate. În medicina clasică, procesul diagnostic este bazat pe identificarea unui fenotip clinic şi analiza anatomopatologică in vitro a celulelor sau ţesuturilor, a modificărilor biochimice sau a unor agenţi infecţioşi. Cu toate că analiza fenotipică a fost constant îmbunătăţită, prin aplicarea unor tehnici şi metode noi, ca microscopia, spectrometria, enzimologia sau imunohistochimia, multe boli nu au putut fi complet definite din punct de vedere etiopatogenic în absenţa studiilor la nivelul ADN-ului sau ARN-ului celular. Conceptul de diagnostic molecular se referă la noile tehnologii de diagnostic, al căror obiect de studiu este ADN-ul sau ARN-ul celular. În prezent, metodele de analiză a mutaţiilor şi polimorfismelor genice reprezintă un sprijin important în identificarea cauzelor de boală. În ultimii ani au fost clonate numeroase gene şi au fost identificate mutaţiile care cauzează unele dintre bolile genetice frecvente. Aceste boli pot fi identificate acum la nivel genomic. În plus, analiza acizilor nucleici s-a dovedit utilă pentru diagnosticul unor boli multifactoriale (polimorfisme genice sau gene majore de susceptibilitate), unor forme de cancer (deleţii sau amplificări genice, fuziuni genice ca urmare a unor rearanjamente cromosomice), unor boli infecţioase (prezenţa genomurilor patogene) sau pentru identificarea precisă a persoanelor (amprenta genetică – DNA fingerprinting) (figura 11.1.). În esenţă, diagnosticul molecular al bolilor genetice urmăreşte identificarea mutaţiilor la nivelul genomului uman. Obiectivele diagnosticului molecular al bolilor genetice sunt: diagnosticul genotipic al bolnavilor cu boli monogenice (identificarea alelelor); diagnosticul prenatal al unor boli genetice; diagnosticul presimptomatic al purtătorilor de gene dominante cu expresie tardivă; identificarea purtătorilor sănătoşi (heterozigoţi) de gene recesive; identificarea persoanelor purtătoare de premutaţii (pentru afecţiunile determinate de mutaţii dinamice); identificarea unor mutaţii genice sau rearanjamente cromosomice în vederea evaluării stadiului şi prognosticului unor tumori sau hemopatii maligne.

210

Diagnosticul molecular al bolilor genetice Fenotip

Semne, simptome +/- rezultate de laborator

Diagnostic clinic Transmitere mendeliană?

Baza de calcul pentru riscul de recurenţă

Elemente de diagnostic

Risc empiric

Imagistică medicală Cariotip Teste biochimice

Genă localizată?

Genă clonată?

Câteva mutaţii frecvente

Legile lui Mendel

Analiza înlănţuirii genice (“gene tracking”) Identificarea directă a mutaţiei sau înlănţuire

Detecţia mutaţiei specifice Figura 11.1. Diagnosticul molecular ca parte integrantă a procesului de diagnostic (după Strachan şi Reed, 1999) În funcţie de nivelul cunoştinţelor referitoare la substratul genetic al afecţiunii, numărul şi frecvenţa populaţională a mutaţiilor, se disting două categorii de metode de diagnostic molecular: Metodele directe – aplicabile atunci când gena şi/sau mutaţia sunt cunoscute - urmăresc evidenţierea unei mutaţii la nivelul genotipului unui individ. Probele (ADN, ARN, proteine, etc.) provenite de la consultant sunt testate pentru identificarea unui anumit genotip (un anumit tip de mutaţie); testul este individual şi furnizează informaţii doar despre respectivul individ. Metodele indirecte – aplicabile atunci când gena nu a fost secvenţializată sau este greu accesibilă diagnosticului direct - urmăresc transmiterea intrafamilială a unor markeri genetici înlănţuiţi cu locusul morbid, pentru a descoperi dacă consultantul a moştenit sau nu alela mutantă de la un părinte heterozigot; testul vizează toată familia şi furnizează informaţii referitoare la segregarea unui anumit segment cromosomic în această familie.

Diagnosticul molecular al bolilor genetice

211

Diagnosticul molecular se bazează pe noi metode de diagnostic ce permit analiza directă a ADN-ului şi ARN-ului; Diagnosticul molecular are aplicabilitate pentru identificarea alelelor mutante, a heterozigoţilor în boli recesive, a indivizilor cu premutaţie în boli produse prin mutaţii dinamice, în cancere; Există două categorii de tehnici de analiză moleculară: directă (pentru gene cunoscute) şi indirectă (pentru gene nesecvenţializate)

B. TEHNICI DE DIAGNOSTIC MOLECULAR Diagnosticul molecular la nivel de ADN necesită izolarea ADN genomic din celule. Metodele de izolare impun înlăturarea ARN-ului, proteinelor, lipidelor şi nucleazelor, care pot interfera cu activitatea enzimelor de restricţie, ligazelor sau polimerazei. Detecţia mutaţiilor este realizată prin metode, bazate pe: digestia cu enzime de restricţie, electroforeza ADN-ului în gel, amplificarea in vitro a ADN-ului (PCR) şi hibridarea acizilor nucleici.

1. DIGESTIA CU ENZIME DE RESTRICŢIE Dificultăţile legate de izolarea şi purificarea unei gene au fost depăşite prin descoperirea enzimelor de restricţie. Acestea sunt enzime bacteriene care clivează ADN-ul dublu catenar în situsuri specifice, definite de secvenţa nucleotidică locală. Enzimele de restricţie pot cliva ADN-ul în două moduri: tăiere asimetrică a situsului de recunoaştere cu generarea unor capete monocatenare 5’ şi 3’ (sticky ends) sau tăiere simetrică a situsului cu generarea de capete identice (blunt ends). Enzimele de restricţie sunt numite după bacteria din care au fost izolate (figura 11.2., tabelul 11.1.). Enzima de Fragmente Situs de restricţie restricţie rezultate

HaeIII1

MboI2

5’---GG  CC---3’

5’ GG—CC

3’---CC  GG---5’

3’

5’---GA  TC---3’ 3’---CT  AG---5’

BamHI3

PstI4

5’---GGA  TCC---3’ 3’---CCT  AGG---5’ 5’---CTG  CAG---3’ 3’---GAC  GTC---5’

5’ GATC---3’ 3’---CTAG 5’ 5’GATCC—G 3’ 3’G—CCTAG 5’ 5’ G—CTGCA 3’ 3’ACGTC—G 5’

Figura 11.2. Modalitatea de acţiune a diferitelor tipuri de enzime de restricţie capete drepte; 2 capăt proeminent 5’ GATC; 3 capăt proeminent 5’ GATC; 4 capăt proeminent 3’ TGCA

1

212

Diagnosticul molecular al bolilor genetice Tabelul 11.1. Enzime de restricţie

Enzima1 Alu I Hae III Taq I Mn/I Hind III EcoRI BamHI

Bacteria Artrobacter lutesu Haemophilus aegyptus Thermus aquaticus Moraxella nonliquefaciens Hemophilus influenzae Rd Escherichia coli R factor Bacillus amyloliquefaciens H

Secvenţa specifică2 AGCT GGCC TCGA CCTC/GAGG AAGCTT GAATTC GGATCC

1 Denumirea indică: specia şi ordinea descoperirii enzimei de restricţie. (De exemplu, EcoRI:Esherichia coli, prima restrictază descoperită; Hind III: Haemophilus influenzae) 2 A – adenină, G – guanină, C – citozină; T – timină; N – oricare nucleotidă

Enzima de restricţie este incubată cu ADN-ul într-o soluţie ionică. Deoarece enzima recunoaşte o anumită secvenţă nucleotidică, sub acţiunea ei vor rezulta fragmente caracteristice de lungimi diferite. Aceste fragmente de ADN pot fi identificate, după separare prin electroforeză în gel, alcătuind “hărţi de restricţie” ale moleculelor de ADN, ce permit compararea moleculelor de ADN de la diferiţi indivizi, fără a fi necesară determinarea în detaliu a secvenţei nucleotidice. Pe această bază pot fi identificate mutaţiile care anulează un situs de restricţie sau generează situsuri de restricţie noi. O a doua aplicaţie majoră a enzimelor de restricţie este ingineria genetică, în cadrul căreia acestea sunt folosite pentru tăierea unor fragmente de ADN (izolarea unor gene sau fragmente de genă) şi transferarea lor în alte molecule în scopul de a genera noi secvenţe de ADN (ADN recombinant).

2. SEPARAREA FRAGMENTELOR DE ADN PRIN ELECTROFOREZĂ ÎN GEL În prezenţa unui câmp electric continuu, fragmentele de ADN vor migra spre anod, datorită prezenţei grupurilor fosfat, încărcate negativ. În gel frecarea modifică viteza migrării, astfel că moleculele mai mari se vor deplasa mai încet, deoarece trec mai greu prin pori decât moleculele mici. Pot fi utilizate trei tehnici de electroforeză în gel: electroforeza în gel de agaroză, electroforeza în gel de poliacrilamidă şi electroforeza în gel în câmp electric pulsatil (pulse-field gel electrophoresis). Astfel, pot fi separate fragmente de ADN cu lungimi cuprinse între 5 nucleotide şi 5000000 de nucleotide. a. ELECTROFOREZA ÎN GEL DE AGAROZĂ Metoda implică utilizarea unei plăci-suport, introdusă într-o cuvă de electroforeză, pe care este fixat gelul de agaroză, la nivelul căruia sunt formate godeuri în care va fi depozitat ADN-ul. Cuva de electroforeză este conectată la o sursă de curent electric continuu care asigură migrarea fragmentelor. Trebuie ales un raport optim între tensiunea şi intensitatea sursei de curent şi dimensiunea cuvei, astfel încât migrarea să se producă suficient de repede, dar benzile să fie clar conturate. Eşantioanele de ADN sunt amestecate cu o soluţie tampon ce conţine un colorant (de exemplu bromură de etidium) pentru detecţia migrării şi sunt introduse, cu o micropipetă, în godeuri. Benzile obţinute, prin electroforeză în gel, sunt comparate cu cele obţinute la migrarea unei soluţii martor a căror fragmente au greutate moleculară cunoscută.

Diagnosticul molecular al bolilor genetice

213

Electroforeza în gel de agaroză este folosită în scop analitic (pentru a determina cantitatea de ADN sau rezultatul unei digestii enzimatice sau a unei reacţii PCR), sau în scop preparativ (pentru a purifica un fragment de ADN dintr-un complex de produse ale digestiei enzimatice sau ale PCR). b. ELECTROFOREZA ÎN GEL DE POLIACRILAMIDĂ Separarea elecroforetică a ADN în gel de poliacrilamidă este similară celei în gel de agaroză, migrarea făcându-se spre anod, iar discriminarea pe baza mărimii porilor. Gelurile de poliacrilamidă pot separa molecule cuprinse între 6 şi 2.000 de nucleotide. Spre deosebire de electroforeza în gel de agaroză, această metodă poate fi utilizată atât pentru ADN-ul bicatenar, cât şi pentru cel monocatenar. c. ELECTROFOREZA ÎN CÂMP ELECTRIC PULSATIL Electroforeza în gel de agaroză sau poliacrilamidă nu poate separa molecule de ADN mai mari de 750 kb. Separarea unor molecule de până la 2 Mb poate fi realizată prin alternarea direcţiei câmpului electric. Aceasta determină moleculele de ADN să îşi schimbe orientarea înainte de a putea migra în noua direcţie impusă de noul câmp electric. Cu cât molecula este mai mare, cu atât timpul necesar reorientării este mai mare. Această metodă este frecvent utilizată în cartografierea genică şi la clonarea YACs-ilor (yeast artificial chromosomes cromosomi artificiali de levuri).

3. AMPLIFICAREA IN VITRO A SECVENŢELOR DE ADN Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR - polymerase chain reaction) permite amplificarea enzimatică exponenţială a ADN-ului, pornind de la cantităţi foarte mici de material, mimând mecanismul de bază al replicării ADN. Amplificarea in vitro a ADN prin PCR este un proces ciclic, ce implică: denaturare, legarea amorselor şi extensia acestora. Denaturarea se realizează prin încălzirea ADN-ului la peste 90°C timp de cel puţin 60 s. În a doua fază, temperatura este redusă la 40-68°C, timp de 60-120 s, pentru a permite amorselor oligonucleotidice să se lege la secvenţele de ADN complementare de pe catenele produse în faza de denaturare. Ultima fază a unui ciclu constă într-o reacţie de extensie enzimatică, în direcţia 5’ – 3’, a amorselor cu producerea unor copii complementare ale ADN-ului bicatenar la care acestea sau legat. Această reacţie are loc la 72°C şi durează 60-180 s, fiind realizată de o ADNpolimerază termostabilă denumită Taq, de la bacteria Thermophilus Aquaticus. Repetarea de 25-40 ori a acestor cicluri duce la amplificarea unei secvenţe originale de ADN de până la 1.000.000 ori în 3-4 ore (figura 11.3.). Reactivii necesari amplificării PCR sunt: ADN polimerază, amorse oligonucleotidice şi deoxiribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Amorsele sunt oligonucleotide (15-30 baze) complementare secvenţelor care flanchează regiunea ţintă. Confirmarea mărimii produsului amplificat se realizează de obicei prin electroforeză în gel. Tehnica PCR este utilizată pentru manipularea genică, deoarece generează cantităţi mari dintr-un anumit fragment de ADN şi dă posibilitatea de a modifica ADN-ul prin crearea de noi situsuri de restricţie sau prin producerea de mutaţii în vederea studierii efectelor acestora asupra funcţiei proteinei modificate. PCR-ul poate fi utilizat şi pentru a amplifica fragmente de ARN mesager pentru identificarea genei care codifică un anumit produs. Această reacţie duce la producţia de ADN complementar (ADNc) secvenţei de ARN, cu ajutorul unei amorse specifice, dNTP şi a transcriptazei inverse. PCR-ul este frecvent utilizat ca metodă de diagnostic în medicină, deoarece permite detecţia directă sau indirectă a mutaţiilor genice.

214

Diagnosticul molecular al bolilor genetice

5’

3’

3’

5’

Denaturare termică 5’

3’

3’

5’

3’

Hibridare cu amorsă specifică

5’

3’

5’

Ciclul I

5’

3’ 5’

3’

3’

5’

Polimerizare în prezenţa Taq polimerazei 3’

5’

5’

3’ 5’

3’

3’

3’

5’

5’

3’

5’

3’ 5’ 3’

5’

5’

3’

3’ 5’ 3’

5’

3’ 5’

Ciclul II Figura 11.3. Schema reacţiei de polimerizare în lanţ (PCR)

4. SECVENŢIALIZAREA ADN Cunoaşterea secvenţei ADN-ului este esenţială pentru înţelegerea modului în care este controlată expresia genelor şi a mecanismelor moleculare implicate în patologia umană. Secvenţializarea ADN-ului se bazează pe replicarea controlată, in vitro, a ADN-ului. În cursul secvenţializării sunt folosite dideoxinucleotide (ddNTP) cărora le lipseşte grupul 3’-OH, necesar pentru extensia lanţului de către ADN polimerază. În momentul încorporării unui ddNTP în ADN, sinteza se încheie. În reacţie se folosesc 4 tipuri de ddNTP corespunzătoare fiecărui tip de nucleotid: ddATP, ddCTP, ddGTP şi ddTTP. Într-un set de patru reacţii, fiecare conţinând cele patru nucleotide (dNTP), dar un singur tip de ddNTP, fragmentele rezultate din reacţie vor începe în acelaşi punct (la nivelul amorsei), dar se vor termina în funcţie de ddNTP incluse în reacţie. Dacă se păstrează un echilibru corespunzător între dNTP şi ddNTP (raport molar de aprox. 200:1), atunci reacţia va produce toate lanţurile posibile cu lungimi cuprinse între 1-1.000 baze, numărate de la poziţia primerului.

Diagnosticul molecular al bolilor genetice

215

Produsele reacţiei pot fi detectate prin încorporarea în reacţie (în amorsă sau în nucleotide) a unor markeri, urmată de electroforeza în gel de poliacrilamidă. Există două tipuri de marcaj: radioactiv sau fluorescent. Metoda clasică utilizează marcajul radioactiv, fragmentele fiind marcate prin încorporarea unui dNTP radioactiv (de obicei dATP). Cei mai utilizaţi izotopi sunt 35S şi 33P. După electroforeză şi uscarea gelului, fragmentele sunt vizualizate prin autoradiografie. În cazul marcajului fluorescent pot fi folosiţi 4 fluorocromi, specifici celor patru baze azotate sau un fluorocrom nespecific, care se fixează la nucleotidul modificat. Unul din avantajele acestei metode este că informaţia referitoare la secvenţă poate fi colectată chiar în timpul electroforezei, prelungirea timpului acesteia permiţând extragerea unei cantităţi mai mari de date. Dezavantajul secvenţializării cu marcaj fluorescent este sensibilitatea redusă.

5. HIBRIDAREA ACIZILOR NUCLEICI Detecţia şi identificarea unor secvenţe specifice de acid nucleic constituie o procedură de rutină în biologia moleculară. O astfel de metodă se bazează pe faptul că, în condiţii favorabile, două molecule monocatenare de acizi nucleici pot forma o moleculă hibrid, în funcţie de gradul de complementaritate a secvenţelor lor nucleotidice. Formarea duplexului se realizează prin legături de hidrogen între guanozină şi citozină, respectiv între adenozină şi timidină (sau uracil, în cazul ARN-ului). Astfel, hibridarea moleculară asociată cu o metodă de marcare şi detecţie devine utilă pentru identificarea unor secvenţe identice cu o secvenţă nucleotidică de referinţă (probă). a. SOUTHERN BLOTTING În cazul metodei Southern blot, ADN-ul conţinând secvenţa ţintă este digerat cu una sau mai multe enzime de restricţie, după care fragmentele sunt separate în funcţie de mărime prin electroforeză în gel. Moleculele migrate în gel sunt denaturate prin tratament cu alcali, apoi neutralizate şi transferate prin capilaritate pe o membrană de hibridare (“blotting”), utilizând o soluţie ionică concentrată. Ulterior, ADN-ul este fixat ireversibil la membrană, devenind disponibilă pentru hibridarea cu o probă marcată (radioactiv sau fluorescent) de ADN monocatenar. După înlăturarea hibridărilor nespecifice, moleculele hibride sunt detectate fie prin autoradiografie, fie prin metode de detecţie non-radioactive (figura 11.4.). De la introducerea metodei, în 1975, analiza ADN-ului prin Southern blotting a devenit o tehnică de rutină în analiza organizării genelor, identificarea şi clonarea unor secvenţe specifice, studiul mutanţilor, caracterizarea genotipurilor prin RFLP, diagnosticul bolilor genetice şi al cancerului, detecţia unor microorganisme, sau identificarea genetică în medicina legală (“DNA fingerprinting”). b. NORTHERN BLOTTING Analiza ARN-ului prin Northern blot asigură obţinerea de informaţii privind expresia genelor în organismele multicelulare, deoarece detectează cantitativ secvenţa de acid ribonucleic dintr-un ţesut sau celulă. Interpretarea datelor obţinute trebuie să ţină cont de particularităţile tisulare ale transcripţiei genei, a maturării, transportului şi stabilităţii ARNm rezultat în transcripţie şi de modificările translaţionale şi posttranslaţionale ale peptidului sintetizat. În ciuda limitărilor sale, metoda este utilizată în continuare pentru studiul specificităţii de ţesut/organ a expresiei genice, în analiza activităţii genelor endogene sau exogene în organismele transgenice, şi pentru studiul expresiei genice în cursul dezvoltării organismelor. Principiul analizei este similar metodei Southern blot, fiind bazat pe capacitatea moleculelor complementare monocatenare de ARN şi ADN de a forma molecule hibrid. Moleculele de ARN separate pe baza mărimii (prin electroforeză în gel de agaroză) şi

216

Diagnosticul molecular al bolilor genetice

transferate pe un filtru (membrană de nylon sau nitroceluloză) sunt hibridate cu o probă de acid nucleic, cu secvenţă cunoscută, marcată radioactiv sau non-radioactiv. După spălarea probei nehibridate sau legate nespecific, moleculele de ARN hibride sunt identificate prin autoradiografie sau detecţia semnalelor fluorescente. ADN ţintă Clivare cu restricţie

enzime

Sonda de ADN de

Marcaj specific izotopic

Fixare pe un gel de agaroză

–

Denaturare termică

+ Hibridare cu ADN-ul ţintă fixat pe membrană

Denaturare în soluţii alcaline

Aplicarea unei membrane nitroceluloză sau nylon

de

Transferul ADN-ului membrană

pe

Spălare pentru îndepărtarea excesului de probă Aplicarea unui film radiografic

Developarea filmului

Figura 11.4. Principiul metodei Southern blotting

Diagnosticul molecular al bolilor genetice

217

Digestia cu enzime de restricţie a unui fragment cromosomic permite secţionarea acestuia într-un număr de fragmente cu capete identice, în raport cu secvenţa nucleotidică specifică situsului de restricţie; Separarea fragmentelor de ADN, generate de enzimele de restricţie, este asigurată prin elecroforeză în gel de agaroză, gel de poliacrilamidă sau câmp electric pulsatil; Identificarea precisă a fragmentelor genice impune, în prealabil, obţinerea unui număr suficient de mare de probe, deziderat asigurat prin aplicarea metodei de polimerizare în lanţ (PCR); Stabilirea secvenţei genice (secvenţializare) este posibilă prin replicarea controlată a ADN-ului, folosind dideoxinucleotide marcate radiactiv sau fluorescent; Detecţia secvenţelor cunoscute de acizi nucleici se face prin aplicarea metodelor Southern blott (pentru ADN) sau Northern blott (pentru ARN)

C. METODE DE DIAGNOSTIC MOLECULAR Identificarea unei mutaţii cunoscute poate fi realizată prin mai multe metode, prezentate în tabelul 11.2. Tabelul 11.2. Metode de identificare a unei mutaţii cunoscute Metoda Comentarii Digestie enzimatică a ADN-ului, În situaţiile în care mutaţia creează sau anulează amplificat prin PCR şi evaluarea un situs de restricţie natural sau unul introdus fragmentelor prin electroforeză în gel prin utilizarea unor amorse PCR speciale Hibridarea ADN-ului amplificat cu Detectează mutaţii punctiforme cunoscute oligonucleotide specifice de alelă (ASO) PCR cu amorse cu specificitate de alelă Metodă generală pentru mutaţii punctiforme; (ARMS) Poate fi adaptat pentru tehnologia cipurilor. Test de legare a oligonucleotidelor Metodă generală pentru mutaţii punctiforme (OLA) determinate. PCR cu amorse situate de o parte şi de Amplificarea reuşită indică prezenţa alta al unui punct de translocaţie rearanjamentului cromosomic suspicionat. Evaluarea numărului de repetiţii Pentru boli prin mutaţii dinamice; expansiunile nucleotidice nucleotidice mari sunt identificate prin Southern blot, cele mai mici prin PCR. Mutaţiile punctiforme ale unei gene pot fi detectate cu ajutorul PCR, dacă secvenţa genică din vecinătatea mutaţiei este cunoscută. În acest caz, amorsele utilizate sunt specifice (complementare) fie alelei normale (ASO-N), fie celei mutante (ASO-M), fiind denumite oligonucleotide cu specificitate de alelă (figura 11.5.). Cele două oligonucleotide diferă doar printr-o singură bază, dar acest fapt este suficient pentru ca hibridarea oligonucleotidelor să fie specifică pentru o anumită alelă. Când se realizează detecţia unei mutaţii, proba de ADN este amplificată concomitent cu 3 martori corespunzători: unui homozigot normal (NN), unui heterozigot (Na) şi unui homozigot mutant (aa). Produsele PCR sunt transferate pe filtre de nitroceluloză ("dot blot") şi apoi sunt hibridate (separat, în două reacţii) cu cele două oligonucleotide specifice, marcate radioactiv (cu 32P). Dacă o probă de ADN este recunoscută de oligonucleotidul specific alelei mutante,

218

Diagnosticul molecular al bolilor genetice

înseamnă ca persoana este purtătoarea a cel puţin unei gene mutante. Diferenţierea între heterozigoţi şi homozigoţii mutanţi se realizează prin analiza filtrului cu oligonucleotidul normal, hibridarea acestuia cu acelaşi specimen de ADN semnificând faptul că persoana este heterozigotă. PCR-ul poate fi utilizat şi pentru detecţia indirectă a mutaţiilor, prin analiza polimorfismului conformaţiei catenelor unice de ADN (single-strand conformational polymorphism - SSCP) sau prin analiza înlănţuirii cu secvenţe scurte de ADN repetate în tandem (variable number of tandem repeats - VNTR). Avantajul principal al SSCP constă în faptul că nu este necesară cunoaşterea precisă a mutaţiei sau a secvenţei complete a genei. ADN-ul amplificat prin PCR este denaturat şi apoi aplicat imediat pe un gel. În gel, catenele rămân separate, dar formează structuri secundare prin legături de hidrogen, deoarece ADN-ul bicatenar este mai stabil decât cel linear, monocatenar. Prezenţa unei mutaţii punctiforme determină modificarea legăturilor de hidrogen din interiorul moleculei şi deci şi a conformaţiei moleculei. Catenele cu structuri diferite au mobilitate Figura 11.5. Principiul metodei ASO electroforetică diferită, SSCP putând detecta o diferenţă de o bază dintr-o catenă de 500 nucleotide. Izolarea din gel a fragmentului de ADN cu migrare anormală permite secvenţializarea şi determinarea precisă a modificării nucleotidice. Această modificare poate fi sau nu cauza unei afecţiuni, ştiut fiind că orice polimorfism poate genera o modificare conformaţională a ADN-ului. În ceea ce priveşte secvenţele scurte repetate în tandem, acestea sunt secvenţe de ADN repetitiv, răspândite în întreg genomul, cel mai frecvent constituite din două nucleotide. Numărul de repetiţii dinucleotidice este variabil, polimorfismul unei astfel de secvenţe, asociat unui anumit locus, putând servi la urmărirea transmiterii unei alele specifice într-o familie. Pentru "tiparea" unei alele sunt necesare amorse complementare secvenţelor care flanchează secvenţa repetitivă, urmată de amplificarea PCR a specimenelor de ADN de la membrii familiei. Produsele PCR pot fi marcate fie radioactiv, fie fluorescent. Diferenţierea între alele se face pe baza mărimii secvenţelor amplificate, prin electroforeză în gel, urmată de autoradiografie sau detecţie într-un aparat de secvenţializare automată. Analiza unei gene pentru identificarea unei mutaţii necunoscute se poate face prin mai multe metode (tabelul 11.3.).

Diagnosticul molecular al bolilor genetice

219

Tabelul 11.3. Metode de scanare a unei gene pentru identificarea mutatiilor Metoda Avantaje Dezavantaje Southern blot; hibridare Identifică deleţiile mari sau Metodă laborioasă, scumpă. cu probe de ADNc rearanjamentele. Necesită câteva μg de ADN. Secvenţializare Mutaţiile sunt caracterizate Costisitoare. complet. Poate fi dificil de interpretat. Migrare electroforetică Metodă simplă şi ieftină. Numai pentru secvenţe sub a heteroduplexurilor 200pb. Sensibilitate limitată. HPLC denaturant Metodă rapidă, cantitativă. Echipament costisitor. Nu relevă poziţia mutaţiilor. Polimorfismul Metodă simplă, echipament Numai pentru secvenţe sub conformaţiei ADN necostisitor. 200pb. Sensibilitate limitată. Nu monocatenar (SSCP) relevă poziţia anomaliilor. Electroforeză în gel- Metodă sensibilă. Alegerea primerilor este critică. gradient denaturant Primerii sunt costisitori. Nu (DGGE) relevă poziţia anomaliei. Testul de trunchiere a Identifică mutaţiile cu Numai pentru mutaţii cu proteinelor (PTT) terminare prematură a încheiere prematură a lanţului. translaţiei. Metodă costisitoare, dificilă. Identifică poziţia mutaţiei. Necesită ARN. Dideoxy fingerprinting Mare sensibilitate. Dificil de interpretat. Gene chips Metodă rapidă, eficientă. Echipament costisitor. Poate defini toate mutaţiile. Gamă limitată de gene.. Principalele metode de identificare directă a unei mutaţii cunoscute sunt: digestia enzimatică a ADN-ului, cu amplificare prin PCR, hibridarea ADNului cu oligonucleotide specifice de alelă, PCR cu amorse cu specificitate de alelă, testul de legare al oligonucleotidelor; Detecţia indirectă a mutaţiilor, bazată pe PCR, se face prin analiza polimorfismului catenelor unice de ADN (SSCP) sau analiza înlînţuirii cu secvenţe scurte de ADN, repetate în tandem (VNTR).

D. URMĂRIREA TRANSMITERII MUTAŢIEI Urmărirea transmiterii genealogice a unei mutaţii se face prin studii de înlănţuire genică. Pentru aplicarea metodei este necesară îndeplinirea următoarelor condiţii: cromosomul pe care este situată gena mutantă trebuie să fie cartografiat, astfel încât să fie cunoscuţi markerii genetici care sunt înlănţuiţi strâns cu locusul morbid; recombinarea intracromosomică stabileşte acurateţea metodei: markerii aleşi trebuie să prezinte o rată a recombinărilor cu locusul morbid de cel mult 1% (situaţi la cel mult 1Mb distanţă). Se utilizează frecvent markeri polimorfici intragenici, dar se pot utiliza şi combinaţii de markeri situaţi de o parte şi de alta a genei ("flanking / bridging markers"). structura arborelui genealogic şi probele de ADN disponibile să permită determinarea "fazei" (asocierea dintre o anumită variantă a markerului şi alela mutantă). familiile analizate să fie suficient de mari pentru a fi posibilă obţinerea de date concludente. să fie cunoscută cu precizie etiologia afecţiunii, pentru a fi eliminată posibilitatea existenţei unui tip de heterogenitate genetică.

220

Diagnosticul molecular al bolilor genetice

Etapele care sunt urmărite pentru stabilirea înlănţuirii genice dintre un locus morbid şi un locus marker sunt următoarele: diferenţierea celor doi cromosomi omologi la cuplul proband (găsirea unui marker strâns înlănţuit cu alela mutantă pentru care părinţii sunt heterozigoţi); determinarea "fazei" - identificarea cromosomului purtător al genei mutante; identificarea setului de cromosomi primit de consultant de la părinţi. Categoriile de markeri genetici utilizaţi sunt: microsateliţi polimorfici (repetiţii bi-, tri- sau tetranucleotidice), detectaţi prin PCR; minisateliţi (VNTR) (repetiţii succesive ale unor scurte secvenţe de ADN 0,1-1 kb) - foarte polimorfici, detectaţi prin digestie cu enzime de restricţie, electroforeză în gel de agaroză şi Southern blot; RFLP (polimorfismul lungimii fragmentelor de restricţie); există cel mult două variante pentru fiecare locus. Se detectează prin digestie cu enzime de restricţie, electroforeză în gel de agaroză şi Southern blot.

II. APLICAŢII PRACTICE 1. CAZ CLINIC 1 La consult genetic se prezintă familia P. Ion şi Maria, ambii sănătoşi, care se interesează de posibilităţile de diagnostic molecular, în condiţiile în care cei doi au un copil cu mucoviscidoză. Ancheta familială a relevat că Maria a avut trei sarcini, din care au rezultat o fată afectată, un băiat sănătos şi o fată sănătoasă (figura 11.6.a). La ora actuală se cunoaşte că în mucoviscidoză, cea mai frecventă mutaţie la nivelul genei CFTR este mutaţia ΔF 508. Această mutaţie, localizată la nivelul exonului 10, se caracterizează prin deleţia codonului 508, care codifică fenilalanina, efectul mutaţiei fiind sinteza unui canal anormal transmembranar de clor.

I

II

1

1

2

2

3 a.

b Figura 11.6. Arborele genealogic al familiei P Ţinând cont de aceste date, în cazul familiei P, în condiţiile în care există posibilităţi de diagnostic molecular, trebuie încercată detecţia ţintită a mutaţiei ΔF 508. În acest scop este utilă amplificarea prin tehnica PCR a secvenţei genice cuprinsă de exonul 10 al genei CFTR. Acest exon cuprinde în mod normal 50 pb, în timp ce la persoanele care au mutaţia ΔF 508 exonul are doar 47 pb. Prin analiza PCR pe gel de poliacrilamidă a probelor recoltate de la membrii familiei P au fost obţinute rezultatele prezentate în figura 11.6.b.

Diagnosticul molecular al bolilor genetice

221

Analizând rezultatele analizei moleculare se pot desprinde următoarele concluzii: Persoana II.1. este homozigotă pentru alele mutantă, purtătoare a deleţiei ΔF 508, aspect confirmat de existenţa unei singure benzi electroforetice, corespunzătoare exonului cu 47 pb; Ambii consultanţi sunt heterozigoţi pentru aceeaşi mutaţie, prezentând două benzi electroforetice; Ceilalţi doi copii ai familiei sunt cert homozigoţi normali (NN) deoarece prezintă doar banda electroforetică corespunzătoare exonului cu 50 pb.

2. CAZ CLINIC 2 La consult genetic se prezintă familia M. Paul şi Nicoleta, ambii sănătoşi. Ei doresc să afle dacă pentru maladia genetică prezentă în familia lor există posibilităţi de diagnostic molecular. Cei doi soţi au un copil care prezintă semne clinice de acondroplazie (nanism dizarmonic cu membre scurte, în special la nivelul segmentului proximal şi cap mare cu rădăcină nazală turtită). Momentan Nicoleta este însărcinată şi doreşte să afle dacă viitorul copil va fi şi el afectat. Anamneza familială a relevat absenţa altor cazuri de boală în familie şi faptul că Paul este mai în vârstă decât soţia lui cu 25 de ani, având la momentul consultului vârsta de 49 de ani (figura 11.7.a). Afecţiunea prezintă o transmitere dominant autosomală, dar majoritatea cazurilor de boală sunt consecinţa unor mutaţii noi, deoarece persoanele afectate au o fertilitate redusă. Mutaţiile de novo sunt asociate cu vârsta paternă înaintată în momentul concepţiei. Aproape toţi indivizii afectaţi prezintă o mutaţie la nivelul codonului 380 al genei receptorului factorului de creştere fibroblastică 3 (FGFR3 – fibroblast growth factor receptor 3). Această mutaţie punctiformă are ca efect substituţia glicinei cu arginina la nivelul proteinei. Ţinând cont de datele anamnestice se poate presupune că în familia analizată există o mutaţie de novo produsă la nivelul liniei germinale a consultantului şi că probabil acesta prezintă un mozaic germinal. Pentru determinarea prezenţei mutaţiei se poate aplica digestia genei cu enzimă de restricţie EcoNI, urmată de amplificarea secvenţelor rezultate prin PCR, deoarece mutaţia de la nivelul codonului 380 a genei FGFR3 determină apariţia unui situs de restricţie nou. Aplicând cele două tehnici au fost obţinute rezultatele prezentate în figura 11.7.b.

I

1

2

1

2

II a

b Figura 11.7. a – Arborele genealogic al familiei M; b – rezultatele analizei moleculare efectuată prin digestia genei FGFR3 cu enzima de restricţie EcoNI, urmată de amplificare prin PCR  

Analizând această figură se poate concluziona următoarele: Copilul afectat al familiei M. prezintă mutaţia căutată, aspect confirmat de existenţa a două fragmente genice; Cei doi consultanţi şi viitorul lor copil nu prezintă mutaţia, aspect confirmat de existenţa unei singure benzi electroforetice (absenţa noului situs de restricţie EcoNI).

222

Diagnosticul molecular al bolilor genetice

III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR A. DEFINIŢI URMĂTORII TERMENI Diagnostic genotipic Reacţie de polimerizare în lanţ Southern Blotting

Enzimă de restricţie Hartă de restricţie Oligonucleotide cu specificitate de alelă ADNc Northern blotting

B. ÎNTREBĂRI CU RĂSPUNS SIMPLU 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.

Care sunt obiectivele diagnosticului molecular? Care sunt metodele de diagnostic molecular? Prin ce se caracterizează metodele directe de diagnostic molecular? Prin ce se caracterizează metodele indirecte de diagnostic molecular? Care sunt metodele care permit detecţia mutaţiilor? Ce sunt enzimele de restricţie? Câte tipuri de enzime de restricţie cunoaşteţi ? Câte tipuri de electroforeză pot fi aplicate pentru analiza ADN-ului? Care sunt acestea? Care sunt etapele metodei PCR? ADN-polimeraza utilizată la reacţia PCR este termostabilă? (adevărat sau fals) Cum sunt nucleotidele folosite pentru secvenţializarea ADN-ului? Ce grupare funcţională le lipseşte? Care sunt modalităţile de detecţie a secvenţializării? Câte metode de hibridare moelculară cunoaşteţi? Care este substratul molecular al metodei Southern blot? Dar a metodei Northern blot? Care sunt aplicaţiile metodei Southern blot? Prin metoda Northern blot ce se poate analiza: structura sau funcţia unei gene? Care este principiul metodei ASO?

3. TESTE CU ALEGERE MULTIPLĂ I. La următoarele întrebări răspundeţi alegând un singur răspuns, cel mai bun din cele enunţate. 1.

Care dintre următoarele afirmaţii nu constituie o indicaţie pentru diagnosticul molecular? A. diagnosticul genotipic al bolnavilor cu boli monogenice; B. identificarea persoanelor purtătoare de premutaţii C. identificarea purtătorilor sănătoşi de gene recesive D. diagnosticul prenatal al bolilor monogenice E. diagnosticul prenatal al aneuploidiilor 2. Care dintre următoarele afirmaţii referitoare la metodele directe de diagnostic molecular sunt adevărate? A. au aplicabilitate când gena şi/sau mutaţia sunt cunoscute B. evidenţiază mutaţia la nivelul genotipului unui singur individ C. testul este individual D. testul nu furnizează informaţii refritoare la familie E. Toate răspunsurile sunt corecte. II. La următoarele întrebări răspundeţi astfel ("complement grupat"): A, dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2 şi 3 B, dacă sunt corecte răspunsurile 1 şi 3 C, dacă sunt corecte răspunsurile 2 şi 4 D, dacă este corect răspunsul 4 E, dacă sunt corecte răspunsurile 1, 2, 3 şi 4 3.

Care dintre următoarele metode sunt folosite pentru detecţia mutaţiilor 1. digestia cu enzime de restricţie 2. electroforeza ADN-ului în gel

Diagnosticul molecular al bolilor genetice 5.

6.

223

3. amplificarea in vitro a ADN-ului (PCR) 4. hibridarea acizilor nucleici. Care dintre următoarele afirmaţii referitoare la tehnica PCR sunt false 1. permite amplificarea enzimatică exponenţială a ADN-ului; 2. se realizează la temperatura camerei; 3. necesită cantităţi minime de probă; 4. se realizează in vivo. Care dintre următoarele afirmaţii constituie aplicaţii ale tehnicii PCR 1. identificarea şi clonarea unor secvenţe specifice; 2. caracterizarea genotipurilor prin RFLP; 3. diagnosticul bolilor genetice şi al cancerului; 4. detecţia trisomiei 21.

III. La următoarele întrebări răspundeţi astfel: A: dacă cele două propoziţii sunt adevărate şi între ele există o relaţie tip cauză-efect B: dacă cele două propoziţii sunt adevărate dar nu există o relaţie tip cauză-efect C: dacă prima propoziţie este adevărată şi a doua este falsă D: dacă prima propoziţie este falsă şi a doua este adevărată E: dacă ambele propoziţii sunt false 7. Enzimele de restricţie sunt folosite în tehnologia ADN recombinant, deoarece aceste enzime determină formarea de segmente de ADN cu capete diferite în organisme diferite 8. Separarea electroforetică a fragmentelor de ADN cu dimensiuni cuprinse între 750kb şi 2 Mb este posibilă doar în câmp pulsatil, deoarece fragmentele mari au o inerţie proporţională cu dimensiunea la schimbarea direcţiei de mişcare

12. SFATUL GENETIC I. DATE TEORETICE A. DEFINIŢIE Termenul de sfat genetic a fost introdus în 1947 pentru a descrie relaţia dintre genetician şi pacienţii cărora le furnizează informaţii referitoare la etiologia, evoluţia şi riscul de recurenţă al bolilor ereditare. Conform Societăţii Americane de Genetică Umană, sfatul genetic reprezintă un proces de comunicare, în conexiune cu problemele legate de apariţia şi riscul de recurenţă al unei boli genetice în familie. Acest proces este asigurat de una sau mai multe persoane special pregătite în acest domeniu şi vizează următoarele probleme: ajutarea familiei sau persoanei implicate să înţeleagă aspectele medicale legate de diagnosticul bolii, evoluţia acesteia şi modalităţile posibile de tratament; aprecierea implicării factorilor genetici în etiologia bolii şi a riscului de recurenţă la alţi membri ai familiei; identificarea modalităţilor de prevenire a apariţiei unor cazuri noi de boală, în concordanţă cu interesele familiei, dependent de particularităţile etnice şi religioase; ajutarea familiei să aleagă cele mai bune opţiuni pentru persoana afectată, dependent de riscul de recurenţă, evoluţia şi posibilităţile de tratament ale maladiei în cauză. Pe baza acestei definiţii este evident că, la acordarea sfatului genetic, medicul genetician are mai multe sarcini: stabilirea diagnosticului afecţiunii şi a modalităţilor de influenţare a evoluţiei bolii; stabilirea ponderii factorilor genetici în determinismul bolii; determinarea riscului de recurenţă, dependent de tipul de transmitere al bolii; discutarea cu membrii familiei a opţiunilor reproductive, respectând autonomia şi conceptele religioase sau etnice ale familiei – în acest caz este deosebit de important faptul că geneticianul sfătuieşte familia, dar nu el este cel care ia decizia (principiul nondirectiv); asigurarea unui suport psihologic adecvat, necesar datorită existenţei impactului major al bolii asupra pacientului şi membrilor familiei acestuia.

B. CIRCUMSTANŢE DE ACORDARE A SFATULUI GENETIC Sfatul genetic poate fi acordat în mai multe cazuri (tabelul 12.1), dar cel mai frecvent acest lucru se întâmplă în cazul apariţiei unui copil afectat de o boală genetică sau în cazul în care cuplul consultant prezintă numeroase eşecuri reproductive (avorturi spontane repetate şi/sau nou-născuţi morţi plurimalformaţi). Circumstanţele de acordare a sfatului genetic pot fi împărţite în două categorii: sfat genetic premarital şi sfat genetic postmarital.

226

Sfatul genetic Tabelul 12.1. Categorii de afecţiuni pentru care este solicitat sfatul genetic

Anomalii congenitale unice majore Anomalii congenitale multiple sindromice sau nu Ambiguitate sexuală Debilitate mentală de cauză neprecizată Tulburări de creştere şi dezvoltare Afecţiuni monogenice dominante sau recesive Erori înnăscute de metabolism Cancere familiale cu debut precoce Sfatul genetic premarital poate fi acordat în următoarele situaţii: unul sau ambii membri ai cuplului sunt afectaţi de o boală genetică, în familia unuia dintre viitorii soţi există cazuri de boală genetică, viitorul cuplu este consanguin, femeia are vârsta mai mare de 35 de ani, unul dintre membrii cuplului prezintă o anomalie cromosomică structurală echilibrată, unul sau ambii membri ai viitorului cuplu lucrează într-un mediu mutagen. Sfatul genetic postmarital este acordat de obicei în următoarele circumstanţe: cuplul consultant are un copil afectat de o boală genetică, cuplul prezintă tulburări reproductive manifestate prin sterilitate (masculină, feminină sau de cuplu) infertilitate (avorturi spontane repetate sau nou-născuţi morţi malformaţi) sau femeia are o afecţiune de bază, al cărei tratament poate influenţa dezvoltarea fătului.

C. ETAPELE ACORDĂRII SFATULUI GENETIC Etapele acordării sfatului genetic sunt prezentate în figura 12.1. Acordarea sfatului genetic începe prin stabilirea cu exactitate a diagnosticului afecţiunii analizate. În acest scop, geneticianul trebuie să facă un examen clinic detaliat care permite depistarea unor semne minore de boală sau a unor particularităţi dismorfice. Acest consult este completat cu examene clinice de alte specializări şi analize paraclinice. Cea de-a doua etapă a sfatului genetic o constituie identificarea componentei genetice implicate în determinismul afecţiunii analizate. Pentru stabilirea naturii genetice a afecţiunii de maximă importanţă este efectuarea anchetei familiale, completată cu anamneza personală amănunţită a pacientului (cuplului). După încheierea anamnezei familiale se întocmeşte arborele genealogic, etapă de regulă greu de realizat, datorită lipsei de informaţii sau a informaţiilor eronate furnizate de proband (consultant). Arborele genealogic trebuie să cuprindă cel puţin trei generaţii, iar în cadrul generaţiei din care face parte probandul (consultantul) este necesar a fi notate toate rudele de gradul I şi II. Datorită frecvenţei reduse a majorităţii afecţiunilor genetice şi a numărului crescut de astfel de boli, pentru stabilirea unui diagnostic corect este utilă consultarea programelor de diagnostic computerizat (POSSUM, OMD) sau a unor situri de internet (OMIM, ORPHANET). Pentru identificarea componentei genetice sunt utile diferite investigaţii paraclinice în funcţie de tipul de boală suspectat. De exemplu, în cazul unui sindrom plurimalformativ de etiologie necunoscută, în special când există şi retard mental, este utilă analiza cromosomică. În schimb, în cazul unor malformaţii izolate, a unei afecţiuni monogenice sau a uneia multifactoriale efectuarea analizei cromosomice este inutilă. Analiza datelor clinice şi paraclinice permite stabilirea unui diagnostic corect, pe baza căruia se face evaluarea prognosticului, modalităţilor de tratament şi a riscurilor de recurenţă în cazul afecţiunii respective şi se pot stabili opţiunile reproductive ale cuplului consultant.

Sfatul genetic

227

Consultul pacientului ASISTENŢĂ

ANAMNEZĂ

Educaţională Familială Religioasă Grupuri de pacienţi

Gestaţională Familială

CONSULT MEDICAL Consult primar Consult de specialitate Examen radiologic Examene de laborator

SFAT MEDICAL Alegerea tratamentului

DIAGNOSTIC

ETIOLOGIE

DATE INFORMATIVE

Date referitoare la boală Terapie posibilă

Risc de recurenţă Opţiuni reproductive

EVALUARE Prognostic Complicaţii posibile Profilaxie

SFAT GENETIC Figura 12.1. Etapele acordării sfatului genetic În următoarea etapă de acordare a sfatului genetic se stabileşte riscul de recurenţă a bolii. Stabilirea categoriei de risc genetic se face dependent de tipul afecţiunii, fiind mai simplă în cazul bolilor cu transmitere monogenică sau mitocondrială şi dificilă în bolile multifactoriale şi în unele afecţiuni cromosomice. Riscurile genetice pot fi clasificate în cinci categorii: total, foarte mare, mare, moderat şi mic (vezi următoarele paragrafe). Ultima etapă a acordării sfatului genetic o constituie comunicarea concluziilor. Comunicarea rezultatelor trebuie realizată de o echipă complexă (geneticieni, psihologi etc.) şi necesită stabilirea unei relaţii afective adecvate cu membrii cuplului consultant. Rezultatele trebuie comunicate atât oral, cât şi în scris. Pentru comunicarea orală a concluziilor trebuie respectate o serie de condiţii, astfel încât impactul psihologic al comunicării să fie cât mai limitat: în momentul comunicării datelor trebuie să fie prezenţi ambii membri ai cuplului; comunicarea nu trebuie făcută în grabă; comunicarea trebuie realizată într-o încăpere cu aspect diferit de cel spitalicesc; medicul şi consultanţii trebuie să stea aşezaţi;

228

Sfatul genetic

comunicarea nu trebuie realizată prea curând după un eveniment traumatizant pentru cuplu (naşterea unui copil malformat, decesul unui copil, pierderea unei sarcini dorite); comunicarea trebuie efectuată în termeni care să fie pe înţelesul consultantului. În cadrul comunicării trebuie subliniate particularităţile bolii (simptomatologie, evoluţie, prognostic, tratament, posibilităţi de profilaxie) şi explicată natura genetică a afecţiunii şi riscul de recurenţă al acesteia la următoarele sarcini. De obicei, este util a compara riscul de recurenţă al cuplului cu riscurile prezente în populaţia generală (tabelul 12.2.). Un alt aspect important este acela de a combate o serie de “false adevăruri” referitoare la afecţiunile ereditare (tabelul 12.3.). Tabelul 12.2. Riscuri în populaţia generală Afecţiune Cancer în perioada adultă Avort spontan Malformaţii congenitale majore Handicap mental major Deces perinatal Deces neonatal Deces în primul an de viaţă

Risc general 1/4 1/6 1/33 1/50 1/30 – 1/100 1/150 1/500

Tabelul 12.3. False adevăruri referitoare la afecţiunile ereditare Absenţa cazurilor de boală în familie înseamnă că boala nu este ereditară şi viceversa Orice afecţiune congenitală este şi genetică Traumele mentale sau psihice în cursul sarcinii produc malformaţii Toate bolile genetice sunt netratabile Dacă în familie există doar femei sau bărbaţi afectaţi boala are transmitere legată de un cromosom sexual Dacă cuplul consultant are un copil afectat de o boală recesivă, însemană că următorii trei copii vor fi sănătoşi deoarece riscul de recurenţă este de 1/4 Toate bolile genetice pot fi detectate prin analiză cromosomică După comunicarea riscului de recurenţă geneticianul trebuie să detalieze opţiunile reproductive, dependent de nivelul riscului. În condiţiile în care riscul nu este mult diferit de cel din populaţia generală trebuie combătută teama nejustificată. În schimb, dacă riscul de recurenţă este important (mare, foarte mare sau total) trebuie luate în discuţie alte opţiuni reproductive într-o şedinţă ulterioară, în situaţia în care cuplul hotărăşte să-şi asume riscul (figura 12.2.). Când riscul nu este total, iar diagnosticul prenatal al bolii este posibil, cuplul poate să aibă o nouă sarcină, în condiţiile în care există condiţii pentru eliminarea produsului de concepţie afectat. Dacă pacienţii sunt hotărâţi să nu aibă un alt copil, este obligatorie consilierea contraceptivă, cu scopul alegerii metodei optime. Un aspect deosebit al sfatului genetic este acela că medicul sfătuieşte cuplul consultant, dar nu ia decizii în locul acestuia. Important este ca membrii cuplului consultant să conştientizeze toate implicaţiile bolii şi să ia deciziile cunoscând toate informaţiile referitoare la aceasta. CAZ DE BOALĂ Reducerea riscului

Ignorarea sau acceptarea riscului

Sfatul genetic

229

Figura 12.2. Opţiunile reproductive în cazul prezenţei unei afecţiuni genetice (modificat după Connor şi Fergusson-Smith, 1997) Sfatul genetic reprezintă un proces de comunicare, corelat cu problemele legate de apariţia şi riscul de recurenţă al unei boli genetice în familie; Medicul genetician are mai multe sarcini: stabilirea diagnosticului afecţiunii, a ponderii factorilor genetici, determinarea riscului de recurenţă a afecţiunii, discutarea cu membrii familiei a opţiunilor reproductive şi asigurarea unui suport psihologic adecvat; Sfatul genetic este acordat cel mai frecvent în cazul apariţiei unui copil afectat de o boală genetică sau în cazul în care cuplul consultant prezintă numeroase eşecuri reproductive; Etapele acordării sfatului genetic sunt: stabilirea cu exactitate a diagnosticului afecţiunii, identificarea componentei genetice, stabilirea riscului de recurenţă al afecţiunii şi comunicarea rezultatelor la membrii familiei.

D. RISCUL DE RECURENŢĂ ÎN BOLI GENETICE 1. RISCUL GENETIC ÎN BOLI CROMOSOMICE Sfatul genetic în bolile cromosomice prezintă dificultăţi legate de tipul anomaliei cromosomice, sexul pacientului la care este prezentă anomalia, gradul de afectare a reproducerii, modalitatea de segregare a cromosomilor în cursul meiozei şi viabilitatea produşilor de concepţie. a. SFATUL GENETIC ÎN FAMILIILE CU BOLI CROMOSOMICE În cazul existenţei unui pacient cu o aneuploidie este important a determina tipul anomaliei, deoarece aceasta influenţează riscul de recurenţă a bolii la următorii descendenţi ai părinţilor pacientului. Un exemplu în acest sens este sindromul Down, al cărui diagnostic clinic este uşor de stabilit, dar la care riscul de recurenţă depinde de tipul anomaliei: trisomie 21 liberă omogenă, trisomie 21 liberă în mozaic sau trisomie 21 prin translocaţie Robertsoniană neechilibrată.

230

Sfatul genetic

În cazul trisomiei 21 libere omogene un factor deosebit de important pentru calcularea riscului de recurenţă îl reprezintă vârsta maternă în momentul concepţiei. Datele epidemiologice au evidenţiat existenţa unei corelaţii între vârsta maternă crescută şi incidenţa sindromului Down la copii acestor femei (tabelul 12.4.). Tabelul 12.4. Corelaţia între vârsta maternă în momentul concepţiei şi riscul de sindrom Down la descendenţi (după Hecht şi Hook, 1994) Vârsta maternă Prevalenţa sindromului Down la naştere (ani) ‰ 1/ nn 20 0,65 1560 25 0,74 1350 30 1,12 890 33 1,83 545 35 2,81 355 36 3,57 280 37 4,59 220 38 5,98 170 39 7,84 130 40 10,4 97 41 13,8 73 42 18,3 55 43 24,5 41 44 32,8 30 45 44,1 23 46 59,1 17 47 79,7 13 48 107 9 49 145 7 50 195 5 Riscul de apariţie al sindromului Down, prin trisomie 21 liberă omogenă, la copiii unei femei este de 0,1% la 30 de ani, de 0,3% la 35 de ani şi de 1% la 40 de ani, ceea ce reflectă o creştere geometrică a riscului după vârsta de 30 de ani. Practic, înainte de 30 de ani riscul de apariţie al sindromului Down este nesemnificativ. Pe baza acestor date în majoritatea ţărilor a fost stabilită vârsta de 35 de ani ca limită minimă de vârstă pentru aplicarea diagnosticului prenatal citogenetic. La femeile care au un copil cu sindrom Down prin trisomie 21 liberă omogenă este utilă efectuarea analizei cromosomice prenatale la următoarele sarcini, indiferent de vârsta mamei, deoarece riscul de recurenţă al afecţiunii este de aproximativ 1%. În cazul în care în fratrie există mai multe cazuri de sindrom Down prin trisomie omogenă, estimarea riscului de recurenţă se face empiric, valoarea acestuia fiind de 10-20%, fiind posibilă prezenţa la unul dintre părinţi a unui mozaic germinal. În cazurile de sindrom Down prin trisomie 21 în mozaic, riscul de recurenţă a afecţiunii este nesemnificativ, deoarece anomalia este rezultatul unui accident mitotic în primele etape ale dezvoltării embrionare, puţin probabil a se repeta. Prezenţa unui caz de sindrom Down prin translocaţie Robertsoniană impune obligatoriu efectuarea analizei cromosomice la ambii părinţi. În cazul în care translocaţia este de novo, ambii părinţi având cariotip normal, riscul de recurenţă a bolii este mai mic de 1%.

Sfatul genetic

231

Dacă unul dintre părinţi prezintă o translocaţie Robertsoniană echilibrată riscul de recurenţă depinde de doi factori: sexul purtătorului de translocaţie şi tipul translocaţiei. În cazul în care translocaţia este prezentă la bărbat, riscul de recurenţă este mai mic de 1%, deoarece prezenţa anomaliei cromosomice induce o dereglare a formării veziculei sexuale, ceea ce cauzează blocarea meiozei masculine cu hipofertilitate sau chiar sterilitate. În cazul în care translocaţia este prezentă la femeie, riscul de recurenţă depinde de tipul anomaliei. În translocaţiile Robertsoniene între cromosomi acrocentrici neomologi, riscul de naştere al unui nou copil cu sindrom Down este de 10%, iar probabilitatea detecţiei trisomiei 21 prin amniocenteză este de 15%. În schimb, în cazul prezenţei unei translocaţii Robertsoniene (21;21) riscul de recurenţă este total de 100%. În cazul celorlalte aneuploidii viabile (trisomiile 13, 18, X, XXY, XYY şi monosomia X) riscul de recurenţă este mai mic de 1%. În aceste cazuri, este indicată efectuarea analizei cromosomice prenatale mai mult din motive psihologice. În cazul prezenţei în antecedente a unei sarcini cu făt poliploid asociat cu molă hidatiformă, riscul de recurenţă al anomaliei este de 1-1,5%, dar creşte la 20% dacă au existat mai mult de 2 sarcini anormale. b. SFATUL GENETIC ÎN ANOMALII CROMOSOMICE STRUCTURALE ECHILIBRATE În translocaţiile reciproce echilibrate riscul purtătorului de a avea un descendent cu o anomalie cromosomică structurală neechilibrată (asociere între trisomia parţială a unuia dintre cromosomii implicaţi şi monosomia parţială a celuilalt cromosom) este de circa 510%, dependent de tipul anomaliei şi sexul purtătorului. Riscul de transmitere a anomaliei este mic la bărbaţii purtători de translocaţie, deoarece deseori aceştia sunt sterili, fiind blocată gametogeneza. De regulă, meioza feminină nu este afectată de existenţa unor translocaţii, astfel că prin malsegregarea cromosomilor derivativi rezultă zigoţi anormali, neviabili, care vor fi avortaţi. Calcularea riscului în translocaţiile echilibrate impune considerarea următorilor factori: istoricul familial, modelul de segregare, sexul purtătorului translocaţiei şi nivelul aneuploidiei determinate de malsegregare. Majoritatea aneuploidiilor viabile (96%) conţin monosomii parţiale mai mici de 2% din materialul genetic al unui set haploid de cromosomi sau trisomii parţiale mai mici de 4% din materialul genetic al unui set haploid de cromosomi. Produşii de concepţie cu anomalii cromosomice intens dezechilibrate sunt avortaţi. Riscul unui purtător de translocaţie ca sarcina să se încheie prin avort spontan este mai mare decât în populaţia generală, fiind de aproximativ 20-30%. O situaţie particulară apare în cazul existenţei unor translocaţii ce implică cromosomul X. În aceste situaţii, fertilitatea este deseori afectată la heterozigoţii şi hemizigoţii cu translocaţie X-autosom. În cazul femeilor fertile, purtătoare de translocaţii Xautosom, riscul de a avea un copil anormal este de 20-40%. În cazul translocaţiilor Robertsoniene echilibrate, riscul depinde de sexul purtătorului anomaliei şi de tipul anomaliei. De regulă, bărbaţii au un risc mai mic de 1%, deoarece sunt sterili. Femeile au un risc de 1-10%, dependent de tipul anomaliei, riscul fiind mai mare când în translocaţie sunt implicaţi cromosomii 21 sau 13, a căror trisomie este uneori viabilă. Un caz special există în translocaţiile Robertsoniene între cromosomi omologi, când riscul de apariţie a unui copil afectat este de 100% Inserţiile reprezintă rearanjamentele cromosomice cu cel mai mare risc de copii anormali. Riscul global în inserţiile intracromosomice este de 15%. Dependent de tipul inserţiei riscul poate varia între 50 şi 0%.

232

Sfatul genetic

Riscul unui purtător de inserţie de a avea un copil anormal depinde, în special, de dimensiunea fragmentului inserat şi de conţinutul genic al acestuia. Inserţiile mari se asociază cu recombinări intracromosomice, ce conduc la produşi de concepţie cu dezechilibre genetice, care vor fi avortaţi. În cazul inserţiilor mici, prin recombinare intracromosomică rezultă produşi de concepţie cu trisomie parţială viabili, riscul de recurenţă al anomaliei fiind de 10-20%. Riscul de recurenţă la descendenţii purtătorilor de inversii pericentrice depinde de: tipul inversiei, cromosomii implicaţi, lungimea fragmentelor interesate, sexul purtătorului de translocaţie. Riscul general al unui pacient cu o inversie pericentrică de a avea un descendent cu anomalie cromosomică neechilibrată datorită recombinării intracromosomice este de circa 5-10%. Purtătorii de inversii paracentrice nu au descendenţi cu anomalii cromosomice structurale neechilibrate, deoarece prin crossing-over la nivelul buclei de inversie rezultă gameţi cu cromosomi acentrici sau dicentrici. Sfatul genetic în bolile cromosomice depinde de tipul anomaliei, sexul pacientului, gradul de afectare a reproducerii, segregarea meiotică a cromosomilor şi viabilitatea produşilor de concepţie; În sindromul Down prin trisomie liberă omogenă riscul de recurenţă creşte exponenţial cu vârsta maternă, fiind nesemnificativ înainte de 30 ani; În trisomia 21 prin mozaic şi în cele prin translocaţii Robertsoniene de novo riscul de recurenţă a afecţiunii este mai mic de 0,1%; În cazul translocaţiilor Robertsoniene între cromosomul 21 şi un alt cromosom prezente la unul dintre părinţi, riscul de recurenţă este: