Carte Genetica [PDF]

Zitiervorschau

CAPITOLUL I 1. Genetica – ştiinţa eredităţii şi variabilităţii organismelor vii 1.1. Definiţia şi obiectul de studiu Genetica este ştiinţa biologică a cărei obiect de studiu îl constituie ereditatea şi variabilitatea organismelor, stabilind mecanismele care asigură conservarea informaţiei genetice precum şi cele ale modificării ereditare. Anul apariţiei geneticii ca ştiinţă este 1865, când GREGOR MENDEL a emis primele legi ale eredităţii, redescoperite în 1900 de HUGO de VRIES, CORRENS şi TSCHERMACK (BOTEZ, 1991). Denumirea de genetică a fost introdusă de BATESON la Congresul de genetică din anul 1906. Ereditatea, ca obiect de studiu a geneticii reprezintă însuşirea descendenţilor de a moşteni de la părinţi caracteristici asemănătoare. Această însuşire asigură stabilitatea caracterelor de-a lungul generaţiilor, continuitatea biologică a indivizilor în cadrul speciei de la o generaţie la alta. Potenţialitatea realizării acestui caracter se face prin intermediul genelor. Gena este definită ca particula materială a eredităţii localizată în cromozom şi care condiţionează formarea uneia sau mai multor caractere sau însuşiri. Totalitatea genelor unui organism viu (cele nucleare) reprezintă genotipul. Totalitatea genelor din cadrul unui set haploid de cromozomi, transmise ca o unitate de la unul din părinţi reprezintă genomul. Felul de a fi a unui individ ca mod de manifestare a genotipului, în interacţiune cu condiţiile de mediu reprezintă fenotipul. Noţiunile de genotip şi fenotip au fost introduse de JOHANSEN în 1909 (PANFIL, 1980). Variabilitatea ca cel de al doilea obiect de studiu a geneticii, reprezintă însuşirea organismelor vii, cu diferite grade de înrudire, de a se deosebi între ele. În natură nu există doi indivizi identici. Chiar şi gemenii uniovulari nu sunt identici din punct de vedere genetic, ei manifestând profile imunologice diferite, constituite în primele şase luni de viaţă (BOTEZ, 1991). Variabilitatea poate fi ereditară şi neereditară. a) Variabilitatea ereditară se transmite în descendenţă, de la părinţi la urmaşi şi are ca sursă recombinarea genelor în procesul de formare a gameţilor şi fecundare (variabilitate recombinativă), sau prin modificarea materialului genetic sub acţiunea unor factori mutageni (variabilitate mutaţională).

b) Variabilitatea neereditară este determinată exclusiv de influenţa condiţiilor de mediu şi cu toate că nu se transmite în descendenţi, face parte din aspectul fenotipic al unui anumit individ. Variabilitatea fenotipică, sau diferenţele constatate între indivizi are două surse primare şi inseparabile de variabilitate: variabilitatea genotipică şi variabilitatea indusă de mediu sau ecologică. Această relaţie poate fi exemplificată prin formula VP=VG+VE, în care VP reprezintă variabilitatea fenotipică; VG reprezintă variabilitatea genetică şi VE variabilitatea ecologică. 1.2. Scopul şi importanţa geneticii Variabilitatea genotipică sau ereditară are cel mai important rol în evoluţie precum şi în munca de ameliorare. Diversitatea genetică a organismelor vii a permis ca prin intermediul selecţiei naturale sau artificiale să fie promovate, în generaţiile succesive, doar genotipurile cel mai bine adaptate condiţiilor de mediu, sau a celor ce răspund obiectivelor ameliorării. Datorită dezideratelor prezentate, genetica este considerată o adevărată placă turnantă în cadrul ştiinţelor biologice, fiind esenţială pentru toţi cei care studiază viaţa plantelor, a animalelor sau microorganismelor. Ea ocupă o poziţie centrală în diverse sectoare ale activităţii umane (agricultură, alimentaţie, medicină, ecologie ş.a.) (Elena TĂMAŞ, 2000). Pentru creşterea producţiei agricole apare necesitatea ameliorării materialului biologic existent. Orice program de ameliorare necesită un studiu a determinismului genetic a materialului iniţial pentru stabilirea metodei de ameliorare. Genetica constituie de fapt baza teoretică a ameliorării plantelor. Descoperirile din domeniul geneticii moleculare şi a ingineriei genetice sunt în prezent tot mai utile, fiind utilizate în elucidarea unor probleme de interes major. Obiectivul principal al ingineriei genetice constă în modificarea genomului unor plante sau animale prin introducerea unor gene sau a unor fragmente de ADN de la o celulă donatoare la una receptoare, obţinându-se specii transgenice. Pe această cale, la plante s-au obţinut genotipuri rezistente la boli şi dăunători, la ierbicide, pesticide, stresuri climatice ş.a. Prin intermediul ingineriei genetice au fost obţinute surse bacteriene capabile de a produce proteine specifice mamiferelor, cum ar fi insulina, interferonul, hormonul de creştere ş.a. De asemenea prin aplicarea metodelor genetice se pot contracara acumulărilor tarelor genetice (caractere nefavorabile patogenetice ş.a.). În ceea ce priveşte genetica forestieră, ea se individualizează în primul rând datorită naturii aparte a plantelor lemnoase din păduri, cu 2

deosebire, arborii. Ca plante sălbatice, extrem de vechi, policarpice, foarte longevive, de dimensiuni mari, arborii deţin un grad avansat de heterozigoţie şi mari rezerve de variabilitate genetică, se diferenţiază prin ponderea mare a caracterelor cantitative supuse unui control poligenic aditiv, convieţuind adeseori în întinse comunităţi (populaţii) naturale, politipice, polimorfe, în care panmixia se manifestă cu deosebită intensitate, iar mecanismele generale de homeostazie genetică sunt extrem de perfecţionate (STĂNESU, 1982). 1.3. Ramurile geneticii şi metodele de cercetare utilizate Genetica formală sau genetica clasică, studiază legile eredităţii descoperite de GREGOR MENDEL (transmiterea în descendenţă a caracterelor determinate de gene plasate pe cromozomi diferiţi) şi THOMAS HUNT MORGAN şi colaboratorii săi (transmiterea în descendenţă a caracterelor determinate de gene plasate pe aceiaşi pereche de cromozomi). În studiul mecanismelor eredităţii genetica a utilizat metode de lucru şi baze de date oferite de alte ştiinţe. Din îmbinarea acestora, au luat naştere numeroase ramuri ale geneticii, dintre care menţionăm:  Citogenetica, care studiază structurile celulare cu rol genetic.  Radiogenetica, studiază efectele radiaţiilor asupra bazei materiale a eredităţii.  Genetica moleculară, studiază ereditatea la nivel molecular, biochimic.  Genetica populaţiilor, studiază structura genetică a organismelor vii, precum şi factorii care modifică structura populaţiilor.  Genetica ecologică, studiază procesele de adaptare a populaţiilor naturale la mediul lor de viaţă.  Genetica cantitativă, studiază legitatea variabilităţii caracterelor, prin aplicarea metodelor matematice la studiul variabilităţii.  Genetica umană, cu rol major în prevenirea, combaterea şi tratarea bolilor ereditare la om. Genetica fiind o disciplină experimentală, dezvoltarea ei a fost condiţionată de metodele şi posibilităţile de cercetare proprii, dar şi de altele specifice altor discipline, de care genetica se poate folosi pentru înţelegerea şi explicarea legităţilor şi fenomenelor sale. Metoda genealogică, constă în înregistrarea şi analiza datelor privind relaţiile dintre indivizi într-o succesiune de generaţii. Prin utilizarea acestei metode se poate stabili modul de transmitere ereditară a caracterelor, precum şi modul de manifestare. Metoda hibridologică, constă în încrucişarea unor organisme cu ereditate diferită şi analiza statistică-matematică a moştenirii caracterelor la 3

urmaşi. Prin intermediul ei se poate urmări modul de transmitere ereditară a caracterelor, a acţiunii genelor şi a grupelor de linkage ale acestora ş.a. Cu ajutorul acestei metode au fost descoperite primele legi ale eredităţii de către G. MENDEL şi T.H. MORGAN. Metoda biometrică, constă în studierea diferitelor caracteristici cantitative şi stabilirea corelaţiilor dintre diferite caractere. Această metodă oferă informaţii asupra variabilităţii diferitelor caractere şi corelaţiilor existente între ele, gradul de menţinere şi îmbunătăţirea caracterelor şi a însuşirilor obţinute prin selecţie ş.a. Metoda citogenetică, este utilizată pentru studiul structurilor celulare cu rol genetic, cu ajutorul aparaturii de laborator specifice (microscoape, tehnici cromatografice, difracţie cu raze X ş.a.). Cu ajutorul ei s-au studiat caracteristicile cromozomilor şi a altor structuri cu rol genetic. Metoda radiaţiilor, permite utilizarea diferitelor tipuri de radiaţii pentru modificarea eredităţii organismelor. Metode biochimice şi biofizice, contribuie la cunoaşterea structurii materialului genetic la nivel molecular. Materialul genetic utilizat, în general pentru studiile de genetică clasică trebuie să prezinte următoarele particularităţi: - să aibă caractere bine conturate, uşor de urmărit (markeri genetici); - să aibă ciclul scurt de dezvoltare; - să permită obţinerea unui număr mare de descendenţi; - să posede un număr relativ mic de cromozomi; - să fie acceptabil la acţiunea factorilor mutageni; - să nu fie foarte scump şi să fie relativ uşor de întreţinut. Ca teste genetice ce îndeplinesc condiţiile de mai sus, se poate utiliza: Drosophila, Neurospora, Escherichia, diferite virusuri, mai ales fagi, porumbul, bobul ş.a. 1.4. Scurt istoric a dezvoltării geneticii În anul 1865, GREGOR MENDEL a comunicat rezultatul cercetărilor sale privind hibridarea la plante, marcând începuturile geneticii, ştiinţa eredităţii. El a fost primul naturalist care a aplicat cu succes teoria probabilităţilor, pentru a explica fenomenul de dominanţă şi segregare a factorilor ereditari la hibrizi, fiind considerat unul dintre fondatorii geneticii ca ştiinţă. Cercetările lui MENDEL au rămas necunoscute până în 1900, când au fost redescoperite de HUGO de VRIES, CORRENS şi TSCHERMACK,

4

simultan şi independent unul de celălalt, moment care marchează cu adevărat apariţia geneticii ca ştiinţă. Trebuie menţionat faptul, că problemele legate de genetică şi transmiterea ereditară a caracterelor au preocupat din totdeauna omenirea. Primele dovezi scrise privind cunoştinţele despre ereditate ale civilizaţiilor antice, au fost întâlnite la popoarele asiro-caldeene din Orientul mijlociu. În Mesopotamia, la Elam, a fost descoperită o tăbliţă de piatră cu o vechime de 6.000 de ani, cu pedigre-ul capului şi copitei la cinci generaţii de cai. În Grecia Antică filozofii greci încercau să găsească răspuns la înterbarea “de ce copii seamănă cu părinţii”, sau care sunt cauzele bolilor moştenite. Ei au emis aşa numita teorie preformistă prin care explicau că noul organism este preformat în gameţi, spermatozoid (teoria spermatocistă), sau în ovul (teoria ovocistă). Un reprezentant de seamă a teoriei spermatociste a fost filozoful ANAXAGORA. În Evul Mediu, ideile gânditorilor greci au fost perpetuate, fără însă a se aduce noi argumente sau supoziţii referitoare la problemele eredităţii. Cercetările legate de genetică iau o amploare deosebită începând din secolul al 19-lea, când diferiţi biologi au elaborat o serie de ipoteze teoretice, speculative despre mecanismele eredităţii. În toate aceste teorii se susţine că moştenirea caracterelor se realizează prin intermediul unor particule care migrează din toate organele corpului către celulele sexuale, unde se activează şi se transmit, după fecundare, în descendenţi. Deşi au un principiu comun privind transmiterea ereditară a caracterelor, poartă denumirea dată de autorii lor: - teoria panspermiei sau teoria pangenezei, elaborată de DARWIN - teoria plastidulelor, elaborată de HAECKEL; - teoria micelară, elaborată de NÄGELI; - teoria pangenelor, elaborată de H. de VRIES. În acelaşi secol, WOLFF şi BAER au formulat teoria epigenetică, după care noul organism se formează în momentul fecundării, iar WEISMANN teoria plasmei germinative care a stabilit experimental că încă de la primele diviziuni ale zigotului are loc separarea liniei germinale (care va da naştere la glandele sexuale), de linia somatică (din care se vor forma celelalte organe ale embrionului şi ale adultului). Importanţa acestor teorii rezidă din faptul că deşi speculative, au căutat să găsească un suport material fenomenului eredităţii. Toate se caracterizează prin aceea că admiteau dualitatea germen – soma în sensul că organismul oricărui individ este alcătuit din două părţi distincte, independente una de alta, germenul sau plasma germinativă, răspunzătoare de păstrarea caracterelor ereditare şi transmiterea lor şi soma, restul corpului.

5

După fecundare, germenul se separă de somă şi nu poate fi influenţat de condiţiile de mediu, urmând a fi integrat în gameţi (BOTEZ, 1991). Teoria factorilor ereditari formulată de MENDEL (1865), constituie prima teorie ştiinţifică a eredităţii, legile formulate de el fiind valabile şi astăzi. Conform acestei teorii, caracterele unui organism sunt determinate de factori ereditari grupaţi în perechi, care în momentul formării gameţilor se separă, fiecare gamet cuprinzând un singur factor, factori ce se reunesc în moduri diferite în momentul fecundării, conducând, ca urmare a relaţiilor de dominanţă şi recesivitate ce se stabilesc între ei, la apariţia segregării (diferenţierea caracterelor parentale în anumite proporţii) (BOTEZ, 1991). În primii ani ai secolului 20, BATESON descoperă că legile mendeliene au valabilitate şi în lumea animală, iar în 1908 tot el este acela care denumeşte noua ştiinţă biologică ce se ocupă de studiul eredităţii, genetica (după RAICU, 1980). Ulterior, JOHANSEN a emis noţiunea de genotip, prin care se înţelege baza ereditară a organismelor care cuprinde totalitatea factorilor ereditari (gene) şi fenotip, prin care se înţelege totalitatea caracterelor şi însuşirilor organismului. În 1906, a introdus în ştiinţă noţiunea de genă. Cu toate că în urma cercetărilor efectuate de HERTWIG în 1875 şi apoi de FLEMMING (1882)şi alţii, au fost descoperiţi cromozomii, denumiţi astfel de WALDEYER (1888), legătura dintre aceştia şi factorii mendelieni nu s-a făcut decât după 1900 în urma cercetărilor lui SUTTON şi BOVERII, care în 1902 au formulat ipoteza conform căreia factorii ereditari se regăsesc în cromozomi, fiecare specie având un anumit număr de cromozomi, cu o anumită formă şi mărime (după RAICU, 1980). Această idee a fost preluată de T. MORGAN şi colaboratorii săi, care în primele decenii ale secolului 20, au pus bazele geneticii clasice elaborând teoria cromozomală a eredităţii. În urma cercetărilor făcute de BATESON şi PUNNET în 1906, aceştia au descoperit fenomenul de linkage. MORGAN, făcând o sinteză a cunoştinţelor acumulate, consideră că genele sunt plasate în lungul cromozomului, liniar, transmiţându-se împreună cu cromozomii în procesul formării gameţilor, iar între cromozomii perechi, omologi, proveniţi de la cei doi părinţi, pot avea loc schimburi reciproce de gene (fenomenul de crossing-over). Mai târziu, AVERY, McLEOD şi McCARTY (1944) au demonstrat faptul că ADN-ul (acidul dezoxiribonucleic), din care sunt constituiţi în mare parte cromozomii, este purtătorul material al eredităţii. După cel de al doilea Război Mondial, s-au dezvoltat considerabil cercetările privind materialul genetic la nivel molecular. Printre cele mai importante realizări ale geneticii moleculare pot fi citate, descoperirea fenomenului de transformare la bacterii cu ajutorul ADN (AVERY şi colab., 1944), descoperirea structurii macromoleculei de AND, deschizând calea 6

cercetărilor privind acizii nucleici (WATSON, CRICK şi WILKINS, 1953), realizarea biosintezei artificiale a ARN (GRUNBERG-MANAGO şi OCHOA, 1955) şi ADN (KORNBERG, 1956), descoperirea faptului că la ribovirusuri ARN-ul constituie materialul genetic în care se găseşte codificată informaţia genetică (FRAENKEL şi colab., 1956), descifrarea codului genetic (OCHOA, NIRENBERG şi alţii, 1961-1967), descoperirea reglajului genetic (JACOB şi MONOD, 1961), sinteza artificială a genei (KHORANA, 1970) ş.a. După 1970 s-au dezvoltat considerabil cercetările de inginerie genetică care îşi propune: izolarea şi sinteza artificială a genelor, transferul intraspecific şi interspecific a genelor, de la organisme procariote la cele eucariote şi invers, manipularea materialului genetic la nivel celular prin realizarea de haploizi prin androgeneză experimentală la plante, crearea de microorganisme capabile să sintetizeze aminoacizi, proteine, hormoni, vitamine, antibiotice ş.a. În 1981, BERG şi GILBERT, au reuşit să sintetizeze in vitro şi să construiască o moleculă de ADN-recombinant, prin care s-au demarat spectaculos cercetările în domeniul ingineriei genetice şi ale biotehnologiilor. Dintre realizările spectaculoase, în acest domeniu, din ultima jumătate a secolului 20, merită menţionate: 1951 - primul transfer de embrioni la o vacă; 1952 - primul viţel născut prin însămânţare artificială; 1952 - prima clonare la amfibieni; 1952 - prima plantă regenerată in vitro; 1970 - prima plantă regenerată pornind de la protoplaşti; 1972 - primul hibrid interspecific obţinut prin fuziune de protoplaşti (la tutun); 1973 - identificarea plasmidului Ti (tumor inducting); 1978 – identificarea primei gene umane; 1983 - obţinerea primei plante transgenice; 1984 - prima naştere umană, pornind de la un embrion congelat; 1985 - prima plantă transgenică rezistentă la o insectă; 1986 - prima clonare la mamifere, utilizând celule embrionare; 1987 - prima plantă transgenică rezistentă la ierbicid; 1983 - prima cereală transgenică; 1991 - prima utilizare a unui segment de ADN ca medicament; 1995 - primul copil pornind de la fecundarea in vitro a unui ovocit; 1997 - prima clonare somatică in vitro la mamifere (oaia Dolly); 2001 - descifrarea genomului uman (după Mihaela CORNEANU, 2001). La noi în ţară primele cercetări de genetică au fost efectuate încă înainte de 1900. C. VASILESCU (1840-1902) a urmărit în experienţele 7

hibridologice modul de transmitere a unor caractere la suine, semnalând fenomenul de dominanţă şi recesivitate precum şi segregare în generaţia F 2 (după RAICU, 1980). C. SANDU-ALDEA (1874-1927), a publicat în 1915 primul manual de ameliorarea plantelor fundamentat pe principii genetice. E. RACOVIŢĂ (1868-1947), a dezvoltat teoria legăturii dintre ereditate şi mediu. Gh. IONESCU SISEŞTI (1885-1963) s-a afirmat prin realizări remarcabile de crearea unor soiuri de grâu. Traian SĂVULESCU (1889-1963), fondatorul şcolii moderne de fitopatologie la baza căreia stă conceptul evoluţiei conjugate gazdă-parazit şi al modificărilor ereditare în urma interacţiunilor bilaterale. N. SĂULESCU (1898-1977), are contribuţii remarcabile în domeniul geneticii cantitative. În 1936, la iniţiativa savantului Gh. MARINESCU a luat fiinţă prima Societate de Genetică din România (BOTEZ, 1991). Ultimii 20 de ani constituie perioada celor mai remarcabile realizări materializate prin lucrări de mare valoare teoretică şi practică. Prin aplicarea principiilor de genetică, în ameliorarea plantelor s-au făcut progrese remarcabile, creându-se hibrizi şi soiuri valoroase, la majoritatea speciilor cultivate. Au fost obţinuţi hibrizi interspecifici şi intergenerici la grâu (PRIADCENCU, 1901-1975) la Bucureşti, linii homozigote obţinute artificial la porumb (C. BOTEZ) şi hibrizi obţinuţi din linii dihaploide, haploizi la cartof prin încrucişări interspecifice (PANFIL şi MARIN), linii poliploide de trifoi roşu la Cluj-Napoca. Realizări remarcabile s-au obţinut la Institutul Agronomic Bucureşti mai ales în domeniul geneticii cantitative (T. CRĂCIUN). Realizări deosebite în domeniul ameliorării plantelor au fost obţinute de N.N. SĂULESCU, la grâu, Al. VRÂNCEANU la floarea soarelui, CĂBULEA şi O. COSMIN, la porumb, L. DRĂGHICI la orz ş.a. În domeniul ingineriei genetice s-au obţinut rezultate notabile obţinute de colectivul condus de P. RAICU de la Universitatea Bucureşti, precum şi în cadrul Institutului de Biologie şi ICCPT Fundulea.

8

CAPITOLUL II 2. Legile mendeliene ale eredităţii G. MENDEL a început cunoscutele sale experienţe de hibridare la plante în 1857 şi opt ani mai târziu el sintetizează rezultatele obţinute în cele două legi ale segregării şi anume: - legea purităţii gameţilor sau segregării factorilor ereditari; - legea liberei combinaţii a factorilor ereditari, sau a segregării independente a perechilor de caractere. G. MENDEL a început experienţele de hibridare la diferite specii de plante ca: Pisum, Hieracium, Phaseolus, Cirsium, Linaria, Mirabilis, Zea etc., însă în mod deosebit a făcut cercetări la mazăre (Pisum sativum), plantă autogamă care are caractere morfologice ce se pot uşor recunoaşte. El a început să lucreze cu 34 de soiuri de mazăre, dar după doi ani de experienţe s-a fixat asupra a 22 de soiuri ce se deosebesc prin caracterele distincte (bob galben - bob verde, plante înalte - plante pitice, bob neted - bob zbârcit etc.) şi constante, dând naştere unei descendenţe omogene. 2.1. Monohibridismul şi legea purităţii gameţilor Monohibridarea constă în încrucişarea a doi indivizi, care se deosebesc printr-o singură pereche de caractere. GREGOR MENDEL a încrucişat mazărea cu bobul neted (caracter datorat prezenţei amidonului) cu mazărea cu bobul zbârcit (caracter datorat prezenţei dextrinei), obţinând în prima generaţie numai plante cu bob neted. Acest caracter a fost denumit dominant, în timp ce caracterul “bob zbârcit”, care nu a apărut în prima generaţie, a fost denumit recesiv. Prin autopolenizarea plantelor din prima generaţie, a obţinut în generaţia a doua atât plante cu bob neted, cât şi cu boabe zbârcite, proporţia dintre caracterul dominant şi cel recesiv fiind de 3:1. G. MENDEL a cercetat modul de segregare şi la alte perechi de caractere, rezultatele fiind prezentate în tabelul 2.1. G. MENDEL explică segregarea celor două caractere studiate, bob neted şi bob zbârcit, ca fiind datorate prezenţei în celulă a două tipuri de factori ereditari, notaţi cu A şi a. Plantele din soiul cu boabe netede (AA) conţin excesiv factorul ereditar care determină acest caracter, iar cele din soiul cu boabe zbârcite (aa) conţin exclusiv factorul ereditar al caracterului respectiv. La hibrizii din prima generaţie, factorii ereditari ai mamei şi tatălui se alătură (Aa), astfel că atunci când acestea formează gameţi, factorii

9

ereditari se separă, fiecare gamet neavând decât un singur tip de factor ereditar (fig. 2.1.) Tabelul 2.1. Rezultatele încrucişărilor între diferite soiuri de mazăre (efectuate de G. MENDEL) Însuşirea Forma boabelor Culoarea cotiledoanelor Culoarea cojii boabelor Consistenţa păstăilor Culoarea păstăilor Dispoziţia florilor Forma plantei Total pentru toate însuşirile

Dominante (D) Netedă Galbenă Colorată Tare Verde Axilară Înaltă

Caractere Proporţia Recesive D: r Dominante Recesive (r) Zbârcită 5.474 1.850 2,989 :1,0104 Verde 6.022 2.001 3,0023:0,9977 Albă 705 224 3,0355:0,9645 Moale 882 299 2,9873:1,0127 Galbenă 428 152 2,9517:1,0483 Terminală 651 207 3,0349:0,9651 Pitică 787 277 2,9586:1,0414 14.949 5.010 2,9933:1,0067

Fig. 2.1. Schema experienţei de hibridare între mazărea cu boabe netede (AA) şi cea cu boabe zbârcite (aa)

În mod asemănător, poate să se desfăşoare şi o ipotetică monohibridare la salcâm (fig. 2.2.)

10

Fig. 2.2. Monohibridare ipotetică la salcâm: AA – forma normală cu flori albe; aa – forma decaisneana cu flori roz

Gameţii sunt, în felul acesta, puri din punct de vedere genetic. Prin unirea acestor gameţi pe bază de probabilitate în F 2, în procesul fecundării, se obţin plantele generaţiei a doua, care se comportă astfel: - 25% din plante sunt pure cu bobul neted, având un singur tip de factori ereditari (AA); - 25% din plante sunt pure cu bobul zbârcit, având exclusiv celălalt tip de factori ereditari (aa); - 50% din plante cu bobul neted, poartă ambii factori ereditari alăturaţi (Aa). MENDEL a denumit plantele, care conţin un singur tip de factor ereditar homozigote, iar cele care conţin ambele tipuri, heterozigote. La indivizii heterozigoţi nu se manifestă decât unul dintre factorii ereditari, cel dominant (bob neted), celălalt rămânând în stare ascunsă (bob zbârcit). În acest fel, G. MENDEL a reuşit să descopere deosebirea dintre structura 11

genetică a organismelor şi înfăţişarea lor, noţiune care mai târziu a fost denumită de JOHANSEN genotip şi respectiv fenotip. Genotipul reprezintă totalitatea genelor conţinute de un organism. Fenotipul reprezintă suma însuşirilor morfologice, fiziologice, biochimice şi de comportament a unui organism ca rezultantă a interacţiunii dintre genotip şi mediu. Din exemplul anterior se remarcă faptul că plantele cu acelaşi fenotip (75% bob neted), prezintă genotipuri diferite: 25% sunt homozigote şi 50% sunt heterozigote. Studiul comportării în descendenţă a hibrizilor obţinuţi l-a condus pe Mendel la elaborarea primei legi a eredităţii, legea purităţii gameţilor. Gameţii sunt întotdeauna puri din punct de vedere genetic, adică nu conţin decât unul dintre factorii ereditari. Prin combinarea probabilistică a acestor gameţi rezultă în generaţia a doua, în urma fenomenului de segregare, un raport de 3 dominant : 1 recesiv. Prin autofecundarea generaţiei a doua se obţine generaţia a treia, la care se observă următoarele: - din plantele pure cu bobul neted se obţin exclusiv plante cu bobul neted; - din plantele pure cu bobul zbârcit se obţin exclusiv plante de acest tip; - plantele heterozigote cu bobul neted segregă în felul următor: 25% plante homozigote cu bobul neted, 25% plante homozigote cu bobul zbârcit şi 50% plante heterozigote cu bobul neted. Deci, plantele heterozigote din generaţia a doua se comportă în generaţia a treia la fel cum se comportă hibrizii din prima generaţie. Dacă florile plantelor hibride din prima generaţie se polenizează cu polen de la plantele genitorului cu bob neted (backcross), atunci se obţin în generaţia a doua numai plante cu boabe netede, din care 50% sunt homozigote şi 50% heterozigote. În caz contrar, dacă polenizarea se realizează cu polen de la plantele cu bobul zbârcit, se va forma în generaţia a doua jumătate plante heterozigote cu bobul neted şi jumătate homozigote cu bobul zbârcit (fig. 2.3.).

Fig. 2.3. Segregarea la încrucişarea heterozigoţilor (Aa) din F1 cu genitorii (AA sau aa)

12

Obţinerea ultimei combinaţii nu ar fi posibilă dacă gameţii ar conţine ambii factori ereditari, deci gameţii sunt puri din punct de vedere genetic, adică conţin un singur factor ereditar (o singură genă) din perechea considerată. 2.2. Dihibridarea şi legea segregării independente a perechilor de caractere Încrucişarea între părinţi care se deosebesc prin două perechi de caractere poartă numele de dihibridare. G. MENDEL a studiat cazul când genitorii se deosebesc prin două perechi de caractere. El a încrucişat mazărea cu bobul neted şi culoare galbenă cu mazărea cu bobul zbârcit şi de culoare verde. În prima generaţie hibridă, toate plantele aveau boabe netede şi de culoare galbenă (caractere dominante). Prin autopolenizarea plantelor din prima generaţie s-a obţinut generaţia a doua (F2) în care aproximativ 9/16 din plante aveau boabe netede şi galbene, 3/16 zbârcite şi galbene, 3/16 netede şi verzi şi 1/16 zbârcite şi verzi (fig. 2.4.) În mod ipotetic, încrucişarea unei forme de salcâm cu flori albe (AA) şi cu lujeri spinoşi (SS) caractere dominante, cu o formă cu flori roze (aa) şi lujeri nespinoşi (ss) – caractere recesice – în prima generaţie s-ar obţine numai exemplare cu flori albe şi lujeri spinoşi. În F2, la arborii obţinuţi prin autofecundarea hibrizilor F1 s-ar ajunge la următoarea repartiţie a caracterelor: 9/16 plante cu flori albe şi lujeri spinoşi, 3/16 plante cu flori albe şi lujeri nespinoşi, 3/16 plante cu flori roze şi lujeri spinoşi şi 1/16 plante cu flori roze şi lujeri spinoşi (STĂNESCU, 1982). Această segregare se explică prin aceea că hibrizii din prima generaţie proveniţi din părinţi ce se deosebesc prin două perechi de caractere, formează patru categorii de gameţi în care se află câte un singur factor ereditar din fiecare pereche. Prin combinarea celor patru categorii de gameţi se formează 16 combinaţii care reprezintă segregarea în cazul încrucişării părinţilor ce se deosebesc prin două perechi de caractere, care se realizează astfel: 9:3:3:1. În cazul unei trihibridări, când se încrucişează organisme care se deosebesc prin trei perechi de caractere, se formează opt tipuri de gameţi masculi şi opt tipuri de gameţi femeli, prin a căror unire pe bază de probabilitate se formează 64 de combinaţii şi 8 tipuri de organisme: - 27/64 cu trei caractere dominante (ABC); - 9/64 cu două caractere dominante şi unul recesiv (ABc); - 9/64 cu două caractere dominante şi unul recesiv (AbC);

13

Fig. 2.4. Dihibridarea tip Pisum (raport de segregare fenotipic 9:3:3:1)

14

-

9/64 cu două caractere dominante şi unul recesiv (aBC); 3/64 cu un caracter dominant şi două recesive (Abc); 3/64 cu un caracter dominant şi două recesive (aBc); 3/64 cu un caracter dominant şi două recesive (abC); 1/64 cu trei caractere recesive (abc).

În acest fel, MENDEL a ajuns la concluzia că la încrucişarea între organisme ce se deosebesc prin două sau mai multe perechi de caractere are loc fenomenul segregării independente a perechilor de caractere. El a considerat, de asemenea, că ereditatea unei perechi de caractere este independentă de ereditatea celeilalte perechi de caractere, astfel că şi segregarea are loc independent. Dacă în exemplul cu dihibridarea, se studiază segregarea perechii de caractere bob neted şi bob zbârcit, fără să se ţină seama de culoarea bobului (galbenă sau verde), atunci se obţine acelaşi raport de segregare de 3:1 între boabele netede şi cele zbârcite. Acelaşi lucru se întâmplă şi în cazul culorii boabelor. Aceasta este segregarea de tip Pisum denumită astfel deoarece a fost descoperită la mazăre. În conformitate cu acest tip de segregare, în F2 heterozigoţii de tip Aa sunt identici fenotipic cu homozigoţii AA. 2.3. Alte tipuri de segregare Abaterile de la legile mendeliene ale eredităţii apar în urma mecanismelor de interacţiune a genelor, ce generează fenomene de dominanţă completă, incompletă, letalitate ş.a. Raportul de segregare genotipic în F2 este acelaşi, dar în funcţie de relaţiile existente între genele alele sau nealele, aceste constituţii genotipice determină fenotipuri diferite. 2.3.1. Semidominanţa În cazul dominanţei complete, organismele homozigote (AA) prezintă acelaşi fenotip cu cele heterozigote (Aa). În unele cazuri însă, fenotipul organismelor ce conţin genele alele în stare heterozigotă se deosebeşte de cel al organismelor ce conţin genele respective în stare homozigotă (deci AA≠Aa). Fenomenul menţionat este cunoscut sub denumirea de semidominanţă sau dominanţă incompletă. Semidominanţa a fost descoperită de CORRENS în 1912 la specia Mirabilis jalapa. Încrucişând o plantă cu flori roşii (RR), cu una cu flori albe (rr), a obţinut în generaţia F1 plante cu flori de o culoare intermediară, roz (Rr). Indivizii heterozigoţi (Rr) manifestă caractere intermediare între fenotipurile genitorilor, datorită dominanţei incomplete sau semidominanţei genei R – dominantă asupra genei r – recesivă. Prin autopolenizarea plantelor hibride F1, în F2 s-au obţinut atât plante cu flori roşii şi albe, dar şi plante cu 15

flori roz. Raportul fenotipic este identic cu cel genotipic 1RR (flori roşii):2Rr (flori roz):1rr (flori albe) (fig. 2.5.).

Fig. 2.5. Fenomenul de semidominanţă în transmiterea culorii florii la Mirabilis jalapa (raport de segregare fenotipic 1 roşu:2 roz:1 alb)

La Zea mays, din încrucişarea unei varietăţi cu boabe albastre cu una cu boabe galbene au rezultat în F1 plante cu boabe violete, culoare intermediară între genitori. În F2 s-a produs segregarea astfel:1 albastru: 2 violet:1 galben. Acest tip de segregare (1:2:1), în care organismele heterozigote prezintă fenomenul dominanţei incomplete, este cunoscut sub denumirea de segregare de tip Zea, pentru a-l deosebi de segregarea de tip Pisum de 3:1 observată de MENDEL. La păsări fenomenul de dominanţă incompletă a fost observat la găinile de Andaluzia, cu penaj de culoare albăstruie. Ele provin din încrucişarea unei rase de găini cu penajul negru cu una cu penajul alb. În F 1 toate păsările au penaj albastru. În F2 se produce segregarea astfel: 25% penaj negru, 25% penaj alb şi 50% penaj albastru. Aceasta înseamnă că găinile de Andaluzia cu penaj albastru sunt heterozigote, fapt pentru care ele segregă mereu, neputându-se crea o rasă de găini de Andaluzia. Dominanţa incompletă intervine şi în cazul raporturilor de segregare la arbori, fenomenul acţionând probabil, în cazul unor caractere cum sunt forma acuminată a solzilor conurilor de molid, în raport cu forma rotunjită

16

sau culoarea roşcată a ritidomului, la pinul silvestru, în raport cu culoarea cenuşie-închisă a ritidomului ş.a. 2.3.2. Supradominanţa În acest caz, indivizii heterozigoţi depăşesc în productivitate, fertilitate, viabilitate etc., genitorii homozigoţi, dominanţi sau recesivi, AAaa. Fenomenul se numeşte supradominanţă şi el poate fi observat atât la plante cât şi la animale. În procesul de apariţie a supradominanţei sunt de obicei, implicate mai multe gene cu caracter aditiv. Fenomenul mai poartă denumirea de heterozis monogenic. La Drosophila melanogaster, heterozigoţii ww+, prezintă o cantitate mai mare de pigmenţi în ochi (sepiaterina), faţă de genitorii homozigoţi w +w+ (ochi roşu-cărămiziu) şi ww (ochi albi). 2.3.3. Codominanţa Codominanţa determină apariţia la indivizii heterozigoţi pentru genele dominante a unui fenotip nou, comparativ cu indivizii homozigoţi. Se ştie că indivizii din populaţia umană pot să aibă patru grupe de sânge notate cu A, B, AB şi 0. Aceste grupe de sânge sunt determinate genetic de trei grupe de gene polialele notate LA, LB şi l. Genele LA şi LB sunt dominante asupra genei l, iar împreună sunt codominante, adică determină un fenotip nou – grupa de sânge AB. Ca urmare, indivizii pot fi fenotipic şi genotipic de mai multe tipuri (tabelul 2.2.) Fenotip

Genotip

0

ll A A

LL LAl LBLB LBl LALB

A B AB

Fig. 2.2. Schema grupelor de sânge din sistemul AB0

În cazul fenomenului de codominanţă, ambele gene sunt funcţionale, determinând apariţia unui fenotip nou. Genotipul heterozigot LALB se manifestă prin grupa de sânge AB. Pentru realizarea unor transfuzii sangvine trebuie cunoscute grupele de sânge ale donatorului şi receptorului. Cunoaşterea modului cum se moştenesc grupele sangvine are importanţă şi în stabilirea paternităţii. 17

2.3.4. Pleiotropia Prin fenomenul de pleiotropie se înţelege efectul fenotipic multiplu a unei singure gene. Genele care au capacitatea de a determina la acelaşi organism două sau mai multe caractere se numesc pleiotropice. Fenomenul a fost observat de MENDEL, care a demonstrat că mazărea cu flori albe are boabe cu tegumentul alb, cea cu flori colorate are tegumentul cenuşiu sau brun. NILLSON-EHLE a arătat că o anumită genă la ovăz modifică simultan forma aristelor spicului, pilozitatea şi fragilitatea tulpinilor. Un exemplu caracteristic de pleiotropie îl oferă hibridul Nicotiana silvestris×Nicotiana tabacum, la care apar şase caractere distincte, deschiderea carpelelor, transformarea ovulelor în carpele, alungirea axei florale deasupra carpelelor, placentaţia, cantitatea de nectar şi încreţirea bazală a corolei, care sunt controlate de aceiaşi genă. 2.3.5. Genele letale Genele letale schimbă raportul mendelian de segregare, deoarece prezenţa lor în stare homozigotă (dominantă sau recesivă) determină moartea indivizilor purtători, înainte de maturitatea sexuală. După gradul de manifestare, efectul genelor letale poate fi: - gene letale, ce cauzează o mortalitate de 100% a indivizilor purtători; - gene semiletale, în acest caz 50% dintre indivizii purtători mor; - gene subvitale, care cauzează moartea unui număr mai mic decât 50% dintre indivizii purtători. Noţiunea de genă letală a fost introdusă în ştiinţă de către CUÉNOT (1911), în urma cercetărilor intreprinse pe şoareci de culoare galbenă. Aceştia s-au dovedit a fi întotdeauna heterozigoţi, deoarece prin încrucişarea a doi şoareci galbeni, nu se obţin niciodată numai şoareci galbeni, ci un amestec cu indivizi de altă culoare. Raportul între şoarecii galbeni şi cei de altă culoare este în general de 2:1. Dacă se notează gene pentru culoarea normală a blănii cu a şi mutanta sa care determină culoarea galbenă a blănii cu A y (yellow = galben), prin încrucişarea între organisme heterozigote ar trebui să se obţină raportul de 3:1 între indivizii galbeni şi de altă culoare (fig. 2.6.)

18

Fig. 2.6. Fenomenul de letalitate de dominanţă la şoareci (raport de segregare fenotipic 1:2:1 letal)

Aya×Aya=AyAy+2Aya+aa Dacă se ţine seama de tipul AyAy, adică galben homozigot lipseşte, s-a dedus că gena Ay este o alelă mutantă letală, care în stare homozigotă duce la moartea organismului. S-a constatat că prin sacrificarea unei femele gestante, o parte a şoarecilor de culoare galbenă mor în stadiu embrionar. La plante au fost identificate numeroase gene letale care în stare homozigotă provoacă moartea embrionilor, sau plantelor înainte de maturitate. La porumb se cunosc 15 gene diferite care în stare homozigotă blochează fotosinteza şi formarea clorofilei (plante albinotice), incapabile să supravieţuiască. Acelaşi fenomen a fost semnalat şi la Antirrhium majus (fig. 2.7.).

Fig. 2.7. Fenomenul de letalitate de recesivitate, la specia Antirrhium majus (raport de segregare 1:2:1 letal)

19

2.3.6. Complementaritatea genelor Interacţiunea dintre două sau mai multe gene nealele, prezente împreună, determină apariţia unui alt fenotip, decât fenotipul determinat de fiecare genă în parte. A. Complementaritatea de dominanţă a fost evidenţiată de BATESON şi PUNNET (1908) la specia Lathyrus odoratus. S-a remarcat că în urma încrucişării a două varietăţi de L. odoratus, cu flori albe, în generaţia F1 s-au obţinut plante cu flori roşii, iar în generaţia F 2, raportul de segregare a fost 9/16 plante cu flori roşii, 7/16 plante cu flori albe. Pentru formarea antocianului este necesară prezenţa concomitentă a două gene dominante (C şi P). Fiecare genitor prezintă în stare homozigotă o genă dominantă şi una recesivă (CCpp, respectiv ccPP). În stare dominantă ambele gene sunt întâlnite numai în F1 (CcPp) şi 9/16 din plantele obţinute în F 2 (C-P-). Raportul fenotipic de segregare este de 9:7 (fig. 2.8.) B. Complementaritatea de recesivitate, a fost evidenţiată de SHULL în 1914, la specia Capsella bursa pastoris (traista ciobanului). S-a remarcat că forma capsulei plantei este determinată de interacţiunea dintre două gene nealele. În starea de recesivitate a ambelor gene, apare tipul cu capsulă ovoidă. Dacă una sau ambele gene se află în stare dominantă, apare tipul cu capsulă triunghiulară. Raportul genotipic de segregare în F2 este de 9/16 A-B (capsulă triunghiulară):3/16 aaB (capsulă triunghiulară):3/16 A-bb (capsulă triunghiulară):1/16 aabb (capsulă ovoidă), iar cel fenotipic de 15:1 (fig. 2.9). Acţiunea complementară a genelor recesive se explică prin prezenţa unor gene duplicate, adică a unor gene similare ca acţiune, care însă se transmit independent. Planta Capsella bursa pastoris fiind un tetraploid, are două perechi din fiecare cromozom omolog şi ca atare posedă gene duplicate, care determină acţiunea de complementaritate recesivă.

20

Fig. 2.8. Fenomenul de complementaritate de dominanţă în transmiterea culorii florii la Lathyrus odoratus (raport de segregare fenotipic 9 roşu:7 alb)

21

Fig. 2.9. Fenomenul de complementaritate în transmiterea formei capsulei la Capsella bursa pastoris (raport de segregare fenotipic 15 triunghiulară:1 ovoidă)

22

2.3.7. Interacţiunea dintre gene Interacţiunea dintre genele nealele poate determina apariţia unui fenotip nou. Forma crestei la găini este determinată de interacţiunea a două gene nealele P şi R. În funcţie de interacţiunea lor, forma crestei poate să fie: - pprr – creastă simplă; - P-rr – creastă măzărată; - pp-R – creastă trandafir; - P-R – creastă nucă. În urma încrucişării între doi indivizi homozigoţi, pentru ambele gene, PPrr şi ppRR, cu creastă măzărată, respectiv trandafir, în F 1 se obţin numai indivizi cu creasta tip nucă RrPp, iar în F2 se obţin cele patru tipuri de creastă în raport de 9 nucă:3: trandafir:3 mazăre:1 simplă (fig. 2.10.)

Fig. 2.10. Fenomenul de interacţiune în transmiterea formei crestei la găini (raport de segregare fenotipic 9 nucă: 3 trandafir: 3 mazăre:1 simplă)

23

Interacţiunile dintre genele nealele intervin şi în formarea şi transmiterea caracterelor la arbori, numai că, până în prezent, ele au fost puţin studiate din cauza dificultăţilor metodologice de care s-a amintit. 2.3.8. Epistazia Epistazia constă în mascarea expresiei fenotipice a unei gene numită hipostatică, de către o altă genă nealelă numită epistatică. Epistazia poate fi de dominanţă sau de recesivitate, după cum gena epistatică este dominantă sau recesivă. A. Epistazia de dominanţă. Culoarea glumelor şi bobului la ovăz este determinată de două gene: N, epistatică, pentru culoarea neagră şi C hipostatică, pentru culoarea cenuşie. Prezenţa genei N, în stare dominantă împiedecă manifestarea genei C. Încrucişând ovăzul sălbatic (Avena fatua), NNCC, cu boabe negre, cu ovăzul cultivat (A. sativa), nncc, cu boabe galbene, s-au obţinut în F1 plante hibride, heterozigote pentru ambele gene NnCc, cu boabe negre. Prin autopolenizarea generaţiei F1 s-a obţinut în F2 raportul de segregare fenotipică: 12 boabe negre:3 boabe cenuşii: 1 boabe galbene (fig. 2.11.). Raportul de segregare geonotipic a fost: 9/16 N-C: 3/16 N-Cc: 3/16 nnCC: 1/16 nncc.

Fig. 2.11. Fenomenul de epistazie de dominanţă în transmiterea culorii glumelor şi boabelor la ovăz (raport de segregare fenotipic 12 negre: 3 cenuşii: 1 galbene)

24

B. Epistazia de dominanţă şi recesivitate a fost evidenţiată de BATESON şi PUNNET, în experienţele lor privind transmiterea colorată a penajului la găini. Culoarea penajului este determinată de două gene nealele. Una dintre gene I – epistatică, care determină penajul alb (fie că este în stare homozigotă dominantă II, sau heterozigotă Ii) maschează manifestarea celeilalte gene, hipostatică C, care determină penajul colorat. În urma încrucişării a două rase de găini cu pene de culoare albă, Leghorn (IICC) şi Wyandotte (iicc), în F1, s-au obţinut heterozigoţi IiCi, cu penaj de culoare albă. Prin încrucişarea indivizilor F1 între ei, în F2 s-au obţinut indivizi cu penajul alb şi colorat în raport de 13:3; cei 3/16 indivizi cu penaj colorat (negru) având combinaţia C-ii, în care gena C nu mai este represată de gena I, aflată în stare recesivă (fig. 2.12.).

Fig. 2.12. Fenomenul de epistazie de dominanţă şi recesivitate în transmiterea culorii penajului la găini (raport de segregare fenotipic: 13 alb: 3 colorat)

25

C. Epistazia de recesivitate. Acţiunea unei gene recesive în stare homozigotă, genă epistatică, inhibă manifestarea altei gene nealele, în stare homozigotă sau heterozigotă, gena hipostatică. Culoarea blănii la câini este controlată de două gene: cc (gena epistatică), determină culoarea albă; B – (gena hipostatică), care în absenţa cc, determină culoarea neagră; bb (genă hipostatică), în absenţa cc, determină culoarea maron. În urma încrucişării între două rase de câini, una homozigotă cu blana albă, BBcc, şi alta homozigotă cu blana maron, bbCC, se obţin în F1 numai indivizi cu blană neagră, BbCc. În F2 se obţine raportul de segregare fenotipică: 9 blană neagră: 4 blană albă: 3 blană maron (fig. 2.13.)

P

×

BBcc

bbCC

(alb)

(maron)

F1

F2

BbCc (negru)

♀/♂ BC Bc bC bc

BC BBCC negru BBCc negru BbCC negru BbCc negru

P

Bc BBCc negru BBcc alb BbCc negru Bbcc alb

F1

bC BbCC negru BbCc negru bbCC maron bbCc maron

bc BcCc negru Bbcc alb bbCc maron bbcc alb

F2

Fig. 2.13. Fenomenul de epistazie de recesivitate, în transmiterea culorii blănii la câini (raport de segregare 9 blană neagră: 4 blană albă: 3 blană maron

2.3.9.Poligenia (polimeria) Mai multe gene nealele, care segregă independent, pot afecta acelaşi caracter, expresia sa fenotipică depinzând de numărul de gene dominante prezente. NILSSON-EHLE a constat că la grâu, în determinarea culorii bobului sunt implicate 2 (3) perechi de gene nealele, notate cu R 1, R2, (R3). Culoarea bobului depinde de numărul de gene dominante prezente şi numărul de gene nealele (2 sau 3), implicate. Din figura 2.14, rezultă că intensitatea culorii boabelor de grâu, la indivizi rezultaţi în F2, este proporţională cu numărul de 26

gene în stare dominantă prezente în genotipul lor. Indivizii cu 4 gene R (R1R1R2R2) în genotipul lor, vor avea bobul roşu închis, cei cu trei gene R, vor avea bobul roşu, cei cu două gene R, vor avea bobul roşietic, cei cu o genă R, vor avea bobul roşu pal, iar cei cu ambele gene în stare recesivă (r1r1r2r2), vor avea bobul alb. Raportul de segregare în F1 este de 1:4:6:4:1, formându-se 5 grupe fenotipice. P

×

R1R1R2R2

r1r1r2r2

bob roşu închis

P

bob alb

F1

F1

R1r1R2r2 bob roşietic

F2

♀/♂ R1R2 R1r2 r1R2 r1r2

R1R2

R1r2

r1R2

r1r2

R1R1R2R2 roşu închis R1R1R2r2 roşu R1r1R2R2 roşu R1r1R2r2 roşietic

R1R1R2r2 roşu R1R1r2r2 roşietic R1r1R2r2 roşietic R1r1r2r2 roşu-pal

R1r1R2R2 roşu R1r1R2r2 roşietic r1r1R2R2 roşietic r1r1R2r2 roşu pal

R1r1R2r2 roşietic R1r1r2r2 roşu pal r1r1R2r2 roşu pal r1r1r2r2 alb

F2

Fig. 2.14. Fenomenul de poligenie (polimerie) în transmiterea culorii cariopsei la grâu (raport de segregare fenotipic 1 roşu închis:4 roşu:6 roşietic:1 alb)

2.3.10. Transgresiunea Mai multe gene nealele, determină în generaţiile de segregare F2-F5, la o parte din descendenţi, depăşirea expresiei maximale şi minimale a unui caracter, faţă de gradul de manifestare a acestui caracter la genitori. Prin încrucişarea unor iepuri, cu blană de culoare închisă (M1M1M2M2M3M3m4m4), cu iepuri cu blană de culoare deschisă (m1m1m2m2m3m3M4M4), în prima generaţie s-au obţinut indivizi heterozigoţi cu blană de culoare intermediară (M1m1M2m2M3m3M4m4). Din descendenţa acestora, pe lângă indivizi cu diferite nuanţe ale blănii, apar şi iepuri cu blană albă (m1m1m2m2m3m3m4m4), transgresiune negativă (înglobează toate genele recesive), precum şi iepuri cu blană de culoare neagră (M1M1M2M2M3M3M4M4), transgresiune pozitivă (înglobează toate genele dominante). Formele transgresive pozitive pot fi utilizate ca genitori valoroşi, în procesul de ameliorare.

27

Excepţiile de la tipurile de segregare mendeliană prezentate, sunt în fond aparente, deoarece mecanismul separării factorilor ereditari şi al formării combinaţiilor rămâne de tip mendelian. Există însă şi abateri reale de la proporţiile respective, având o altă sursă, cum ar fi segregarea preferenţială a cromozomilor, nesepararea cromozomilor omologi în meioză, formarea nerandomizată a zigoţilor la fecundare. Astfel, repartiţia întâmplătoare în meioză a cromozomilor omologi la celulele fiice şi formarea gameţilor cu cromozomi omologi şi gene alele în raport de 1:1 sunt uneori deranjate, producându-se segregarea preferenţială a unor cromozomi. În consecinţă, în macrosporogeneză, la plante, se întâmplă ca un cromozom să se localizeze de preferinţă în oosferă, iar omologul lui în unul din ceilalţi nuclei ai sacului embrionar, neparticipând astfel la formarea zigotului. Aberaţii similare pot să apară şi la formarea spermaţiilor şi a polenului şi ele afectează proporţiile în care apar grupele de fenotipuri în descendenţă. Nondisjuncţia cromozomilor în meioză are ca efect la prima diviziune apariţia unei celule haploide cu un cromozom suplimentar şi a celeilalte celule haploide cu un cromozom în minus celulele sexuale care iau naştere vor produce astfel în procesul fecundării zigoţi cu 2n+1 şi 2n-1 cromozomi, deci cu alte caractere şi cu altă repartiţie la descendenţi decât în cazul normal. Formarea nerandomizată a zigoţilor, adică unirea gameţilor în procesul fecundării nu în mod întâmplător, după cum se realizează de obicei, ci după anumite preferinţe condiţionate genetic, cum ar fi viabilitatea inegală a celulelor sexuale mascule sau capacitatea de formare şi maturizarea inegală a stigmatului. Fecundarea nerandomizată duce, de asemenea, la modificarea raporturilor de segregare mendelian. 2.4. Ereditatea caracterelor calitative şi cantitative Însuşirile organismelor sunt de o mare diversitate. Ele se pot totuşi grupa în două categorii importante: caractere calitative şi caractere cantitative. Caracterele calitative sunt trăsături ale unui organism care-l fac să se deosebească categoric de un alt organism. Diferenţele calitative împart indivizii în tipuri distincte, fără legături prin intermediari. Cele mai tipice prezintă stări alternative ca : prezenţa aristelor la grâu - lipsa lor, prezenţalipsa coarnelor la animale, prezenţa - lipsa pigmentului, pigment de o culoare - pigment de altă culoare.

28

În această categorie se înscriu şi trăsăturile definitorii la arbori, forma, structura anatomică, însuşirile metabolice caracteristice la frunze, flori, fructe, tulpină ş.a. Caracterele calitative au un grad ridicat de stabilitate şi sunt prea puţin influenţate de factorii de mediu, care nu pot determina decât mici variaţii de expresie, structură sau comportament, niciodată fundamentale. La om, un exemplu concludent îl oferă grupele sangvine, care depind în exclusivitate de fondul genetic. În analizele genetice, MENDEL, ca şi alţi cercetători, au exprimat în cercetările lor, îndeosebi, caractere calitative. Ele sunt determinate adesea de una sau două perechi de gene (gene majore), iar efectul fluctuaţiilor mediului înconjurător asupra lor, poate fi imperceptibil după cum s-a mai amintit. Din aceste considerente, în urma încrucişărilor apar fenotipuri distincte, bine conturate, cu dominanţă completă sau incompletă (gene semidominante), ceea ce determină o variabilitate discontinuă. Caracterele cantitative se caracterizează prin următoarele: se apreciază cantitativ prin măsurare, cântărire, numărare, cronometrare etc., de aceea se mai numesc şi caractere metrice; sunt determinate, adesea, de mai multe gene şi nu pot fi separate uşor şi categoric pe clase de fenotipuri. Sunt puternic influenţate de condiţiile de mediu şi prezintă o variabilitate continuă, adică fenotipuri cu valori cuprinse între cele mai mici şi cele mai mari valori, ca un şir continuu de fenotipuri. Variabilitatea unor asemenea caractere se studiază cu ajutorul biometriei. 2.4.1. Caracteristicile eredităţii caracterelor cantitative Un exemplu privind ereditatea mendeliană a caracterelor cantitave şi punerea în evidenţă a principalelor sale caracteristici o reprezintă cercetările lui EAST (1916) la Nicotiana longiflora. Încrucişând între ele două varietăţi de Nicotiana, una cu corola de 40 mm lungime (P 1), iar cealaltă cu corola de 93 mm (P2), caractere foarte constante, EAST a obţinut în F 1 şi F2 plante cu lungime intermediară, cu deosebirea că variabilitatea hibrizilor F 2 a fost dublă faţă de cea a hibrizilor din F1 (fig. 2.15).

Fig. 2.15. Variaţia lungimii corolei la două varietăţi deNicotiana longiflora şi la hibrizii din diferite generaţii obţinuţi din încrucişarea acestora

29

Autofecundând plante din F2, deosebite în ceea ce priveşte lungimea corolei, s-au obţinut în F3 familii care în medie au avut aceeaşi lungime a corolei ca şi formele parentale din F2. Mai mult, prin selecţia divergentă a plantelor din F2 şi F3 s-au obţinut familii care au avut valori foarte apropiate de valorile tipice părinţilor iniţiali (P1 şi P2). Aplicând selecţia în F4 şi F5 s-a reuşit să se deplaseze media formelor extreme şi mai mult către cea a varietăţilor parentale (P 1 şi P2). Rezultatele obţinute l-au făcut pe EAST să emită următoarele postulate: - încrucişarea între varietăţi homozigote va da în F1 populaţii având aceiaşi uniformitate ca cea a formelor parentale; - variabilitatea populaţiilor din F2, va fi mai mare decât a populaţiilor din F1 ; - în cazul când populaţiile din F2 sunt suficient de mari, pot fi întâlniţi indivizi cu valori egale cu ale formelor parentale ; - în unele cazuri unii indivizi din generaţia F 2 pot chiar depăşi tipurile parentale, apar deci transgresiuni ; - indivizii situaţi în diferite puncte ale curbei de frecvenţă a populaţiilor F2, vor da în F3 şi în generaţiile următoare familii care se vor deosebi marcant între ele. Rezultatele obţinute de EAST în urma hibridării celor două varietăţi de Nicotiana şi postulatele stabilite au dus la concluzia că genele joacă un rol foarte important în ereditatea caracterelor cantitative. NILSSON-EHLE (1909) cercetând ereditatea culorii la boabele de grâu a stabilit că aceasta este determinată de trei perechi de gene şi anume: R1r1, R2r2, R3r3 din care genele dominante R1, R2 şi R3 condiţionează culoarea roşie, iar genele recesive r1, r2 şi r3 culoarea albă. Fiecare din cele 3 perechi de gene segregă independent conform legii segregării independente a perechilor de caractere a lui MENDEL. Astfel, în urma autofecundării indivizilor R1r1 se obţin plante cu boabe roşii şi cu boabe albe în raport de 3 roşii (R1-) : 1 alb (r1r1). În cazul segregării a două perechi de gene (R 1r1, R2r2) raportul dintre cele două categorii de plante este de 15 roşii : 1 alb, iar în cazul segregării a trei perechi de gene (R1r1, R2r2, R3r3) raportul de segregare este de 63 roşii : 1 alb. Interpretând rezultatele, NILSSON-EHLE a elaborat teoria genelor polimere potrivit căreia există factori ereditari cu acţiune foarte asemănătoare, care îşi însumează efectele, determinând formarea aceluiaşi caracter cantitativ. Cu cât numărul factorilor creşte, cu atât caracterul controlat devine mai expresiv. Astfel de gene cu acţiune individuală redusă care participă la formarea aceluiaşi caracter au fost numite gene polimere (gene multiple, factori multipli). Fiecare genă în parte urmează ereditatea de tip mendelian 30

întocmai ca genele cu efect calitativ. Când genele respective se asociază produc, în urma adiţiei efectelor, o variaţie cantitativă continuă. La arbori, un exemplu ipotetic de determinism polimeric poate fi dat la molid, în ceea ce priveşte forma solzilor conurilor. Molidul carpatic (Picea abiens var. montana) prezintă conuri cu solzi acuminaţi (ascuţiţi), în timp ce molidul de origine austriacă (P. abiens var. europaea) are conuri cu solzi rotunjiţi la vârf. Este posibil ca formarea solzilor să fie codificată de două perechi de gene alele A 1a1 şi A2a2 care, prin încrucişări, în F2 să dea combinaţii genotipice de 9 şi clase fenotipice în număr de 5 (fig. 2.16 ). Reiese din analiza datelor din tabel că în funcţie de cota de participare a alelelor A1a1 şi A2a2, vârfurile solzilor variază de la puternic acuminaţi în genotipul A1A1A2A2, la evident rotunjit în genotipul a1a1a2a2. În acest caz, însă, nu numai genele A1 şi A2 ar fi active ci şi alelele a1 şi a2 care codifică forma rotunjită a conurilor, fără însă ca între aceste gene să apară relaţii de dominanţă şi recesivitate.

Fig. 2.16. Ereditatea formei solzilor la conurile de molid - ipoteză

Teoria genelor polimere a lui NILSSON-EHLE a fost confirmată prin cercetările lui EMERSON şi EAST (1913) la porumb, DEVENPORT la om, SHULL (1914) la traista ciobanului şi EAST (1916) la tutun. 31

Ereditatea caracterelor cantitative a fost fundamentată sub aspect ştiinţific de către MATHER (1949, 1953). Potrivit concepţiei sale transmiterea caracterelor se efectuează prin două categorii de gene : poligenele minore şi obligogenele sau genele majore. Primele controlează caracterele cantitative iar ultimele caracterele calitative. Poligenele sunt gene cu efect slab, de unde şi numele de gene minore. Pe măsură ce se acumulează ele exercită o acţiune puternică în procesul de formare a caracterelor, fiind echivalentă cu genele polimere.

CAPITOLUL III Bazele citologice ale eredităţii 3. Organizarea celulară a matariei vii Celula, ca formă superioară de organizare a materiei vii, este unitatea morfologică şi funcţională de constituire a tuturor organismelor vii, cu excepţia virusurilor. Celula posedă metabolism individual, ciclu de viaţă şi energie proprie, fiind capabilă de creştere şi autoreproducere independentă. În raport cu complexitatea structurală a celulei şi mai ales a nucleului, organismele vii aparţin la două tipuri de organizări: tipul procariot şi tipul eucariot. 3.1. Organizarea celulară la eucariote Organizarea eucariotă, mai complexă, este caracteristică algelor verzi, brune şi roşii, ciuperci, muşchi, ferigi, gimnosperme şi angiosperme, şi organismelor animale. În linii mari, o celulă eucariotă este alcătuită din membrană, citoplasmă şi nucleu (fig. 3.1.) Membrana celulară (plasmalema) la plante este protejată, de regulă, de un perete celular de natură pectică-celulozică, având rol de schelet. La animale, plasmalema reprezintă un strat superficial de condensare plasmatică, peretele celular lipsind.

32

Fig. 3.1. Organizarea celulară la eucariote

Citoplasma, înalt diferenţiată structural şi funcţional, este alcătuită din : a) citosolul (hialoplasma), reprezintă mediul în care sunt incluse celelalte componente putând să existe în stare de gel, sau de sol. b) sistemul de membrane sau reticolul endoplasmetic, poate fi neted (alfa), sau rugos (beta). Cel neted este reprezentat printr-o reţea de tubuşoare şi vezicole la nivelul cărora se sintetizează în principal hormoni. Sistemul endoplasmatic rugos are pe suprafaţa sa formaţiuni granulare ribozomale, constituind ergastoplasma, activă în sinteza proteinelor de secreţie. Organitele celulare sunt formaţiuni intracelulare, unele prezente în toate celulele (mitocondriile, aparatul Golgi, lizozomii, ribozomii), altele prezente numai în celulele vegetale (plastidele), cu rol în procesele metabolice specifice. a) Ribozomii sau granulele lui Palade sunt constituite din ARNribozomal şi proteine, cu rol important în sinteza proteică. Au o structură constantă, sub formă sferică sau elipsoidală. Ribozomii pot exista în citoplasmă, sau ataşaţi de reticolul endoplasmatic. Ei se pot cupla cu ARN-m în procesul de biosinteză formând polizomii. b) Mitocondriile sunt structuri mici, independente, considerate centrele energetice ale celulei. La nivelul lor a fost pus în evidenţă ADN, cu rol în ereditatea extracelulară. ADN-ul mitocondrial este 33

dublu eliciodal circular şi reprezintă mai puţin de 1% din ADN-ul celular. Mitocondriile sunt capabile de autoreplicare, de creştere, de stocare şi transmitere a informaţiei genetice specifice, comportânduse ca nişte organite semiautonome, cu continuitate citologică şi genetică. c) Plastidele sunt organite citoplasmatice proprii celulei vegetale, cu rol esenţial în procesul de sinteză şi stocare a substanţelor organice. Conţin toate elementele unui sistem genetic (ADN şi ARN), având astfel rol ereditar. d) Aparatul Golgi este o reţea perinucleară, alcătuit din formaţiuni numite dictiozomi, cu rol în procesul de maturare proteică, în transportul şi depozitarea substanţelor elaborate. e) Centrozomul, depistat în celula animală şi vegetală, este format din doi centrioli şi centrosferi şi are rol în formarea fusului de diviziune. Fiind purtător de ADN, are rol ereditar. f) Lizozomii sunt corpusculi de formă ovoidă, ce conţin enzime digestive fiind responsabili de digestia intracelulară. Beneficiază de enzime hidrolitice (proteoză, ribonucleoză, fosfatază ş.a.) şi sunt specifice celulei animale. Formaţiuni cu funcţii asemănătoare au fost semnalate şi la plante (peroxizomi, sferozomi şi glioxizomi). Nucleul sau carionul este partea cea mai reprezentativă a celulei sub aspect genetic, reprezentând 1/4-1/3 din volumul total al celulei. Nucleul ca entitate morfologică, este alcătuit din membrană nucleară, cariolimfă, nucleol, cromocentrul şi cromatină (cromozomi). a) Membrana nucleară se evidenţiază în interfază. Este formată din două membrane lipoproteice, prevăzute cu pori prin care se realizează schimburile dintre cariolimfă şi citoplasmă. Membrana exterioară se racordează cu reticolul endoplasmatic, prin care realizează legătura între membrana nucleară şi cea celulară. Are rol important în organizarea şi funcţionarea cromozomilor, precum şi în procesul de replicare şi transcriere de ADN. b) Cariolimfa, nucleoplasma sau matrixul nuclear, este mediul în care sunt incluse formaţiunile nucleare, putând exista în stare de gel sau sol. c) Nucleolul, este prezent în nucleu ca un corp sferic, vizibil în interfază şi profază ataşat la unii cromozomi în zona strangulaţiei secundare. Numărul nucleolilor este caracteristic fiecărei specii. d) Cromatina reprezintă starea în care se găseşte materialul cromozomal în interfază sub forma fibrei elementare de

34

cromatină. Prin condensarea fibrei elementare de cromatină, în cursul diviziunii celulare se pot evidenţia cromozomii. 3.1.1. Cromozomii la organismele eucariote Principalii purtători ai informaţiei genetice la eucariote sunt cromozomii prezenţi în nucleul celular. Aceştia sunt constituiţi din cromatină, ce conţin aproximativ 60% proteine, 35% acid dezoxiribonucleic (ADN) şi 5% acid ribonucleic (ARN). După funcţiile lor, cromozomii sunt de două tipuri: autozomi, ce se regăsesc în celulele somatice şi variază ca număr de la o specie la alta şi heterozomi, sau cromozomi ai sexului. Celulele somatice conţin două seturi de autozomi şi doi heterozomi XX sau XY, iar celulele sexuale conţin un set de autozomi şi un heterozom. 3.1.1.1. Morfologia cromozomului la eucariote Sub aspect morfologic, cromozomul eucariot prezintă următoarele formaţiuni: cromatidele surori, centromerul, constricţia secundară, telomerii, satelitul şi knobul. Cromatidele surori sunt două unităţi structurale identice genetic, unite la nivelul centromerului. Centromerul (strangulaţia sau constricţia primară) este zona cu care cromozomul se fixează de fibrele fusului de diviziune celular. El împarte cromozomul în două braţe scurt, sau proximal (p) şi braţul lung, sau distal (q) (fig. 3.2). În raport cu poziţia centromerului, distingem următoarele tipuri morfologice de cromozomi: - telocentrici, cu poziţia centromerului terminală; - acrocentrici, poziţia centromerului fiind subterminală ; - submetacentrici, cu poziţia centromerului submediană ; - metacentrici, poziţia centromerului fiind mediană. Strangulaţia sau constricţia secundară este asemănătoare centromerului, însă la nivelul ei cromatidele nu se unesc. Zona se mai numeşte şi organizator nucleolar, la acest nivel fiind ataşat de obicei nucleolul. Telomerii sunt formaţiuni terminale ale cromozomilor ce le conferă stabilitate. În lipsa acestora apar restructurări cromozomale şi modificarea morfologică. Satelitul sau trabantul este o formaţiune facultativă, separată de restul cromozomului prin strangulaţia secundară. De regulă este dispus pe braţul proximal (scurt) al cromozomului.

35

Knobul este o formaţiune terminală sau subterminală heterocromatică, dispus pe anumiţi cromozomi, cu valoare de marker citologic (fig. 3.3.).

Fig. 3.2. Morfologia generală a cromozomului

Fig. 3.3. Morfologia cromozomului eucariot

36

3.1.1.2. Structura cromozomului eucariot Elementul structural de bază al cromozomului este nucleosomul. La microscopul electronic, nucleosomii apar ca un şirag de perle, fiecare fiind alcătuit dintr-un miez histonic pe care se înfăşoară două spire de ADN. Între doi nucleosomi există elemente de legătură constituite din segmente scurte de ADN asociate cu o componentă histonică H1 (fig. 3.4). Succesiunea mai multor nucleosomi determină formarea fibrei simple de cromatină, care la rândul ei se spiralează sub formă de selenoid şi formează fibra elementară de cromatină, care constituie elementul de bază a cromozomului. În interfază cromozomii se găsesc sub această formă elementară de cromatină.

Fig. 3.4. Formarea fibrei simple şi a fibrei elementare de cromatină

37

3.1.1.2. Compoziţia chimică a cromozomului eucariot Cromozomii sunt alcătuiţi din cromatină, substanţă fundamentală ce conţine acizi nucleici şi proteine, lipide şi poliglucide, ioni de calciu şi magneziu. ADN-ul nuclear reprezintă aproximativ 95% din totalitatea ADN-ului celular, şi răspunde de stocarea informaţiei genetice şi continuitatea ei de la o generaţie la alta. Cantitatea constantă de ADN din fiecare cromozom este supusă unei variaţiuni ciclice, determinată de separarea cromatidelor în cadrul ciclului celular. ADN-ul din care este constituită cromatina poate fi de două feluri : ADN cu corespondenţă de codare şi fără corespondentă de codare. - ADN-ul cu corespondenţă de codare este activ în procesul de transcripţie, putând fi de două feluri : a) ADN nerepetitiv (unic) care conţine gene active în procesul de sinteză a proteinelor celulare, ce poartă mesajul genetic necesar transcrierii ARN-m ; b) ADN repetitiv, corespunde genelor ce poartă mesajul genetic transcrierii ARN-r, ARN-t şi ARN-m necesar biosintezei histomelor. - AND-ul fără corespondenţă de codare, inactiv în procesul de transcripţie este înalt repetitiv, fiind sub două forme: a) ADN spaţiator, dispus între secvenţele unice; b) AND satelit cu localizare telomerică, sau în vecinătatea centromerului şi a satelitului. ARN-ul cromozomal se găseşte în cantitate diferită în celulele diferitelor organe, reprezentând cca. 10% comparativ cu ADN. Proteinele se prezintă sub forma de nucleoproteine şi sunt: histon şi nonhiston. Histonele sau proteinele bazice sunt omogene, cu rol de reglare nespecific al activităţii genelor şi rol structural. Nonhistonele sunt foarte heterogene, cu rol enzimatic, structural şi reglator specific a activităţii genelor. 3.1.1.3. Caracteristicile cariotipului la eucariote Alături de elementele morfologice, caracteristicile cromozomilor sunt exprimate prin numărul, forma şi mărimea acestora. Numărul, forma şi mărimea cromozomilor dintr-o celulă somatică constituie cariotipul unui individ sau a unei specii. Acesta reprezintă un criteriu de identificare a speciilor. Numărul cromozomilor oscilează de la o specie la alta şi este relativ stabil pentru indivizii aparţinând unei entităţi taxonomice. În celulele 38

somatice cromozomii sunt dispuşi în perechi, unul de origine maternă şi unul de origine paternă (cromozomi omologi), având aceiaşi formă, aceiaşi mărime şi aceiaşi valoare genetică, alcătuind garnitura diploidă, notată cu 2n. În celulele sexuale, sau gameţi, există un singur set de cromozomi, adică câte un cromozom din fiecare pereche, numărul lor fiind redus la jumătate. Aceasta este starea haploidă şi se notează cu n. La monocotiledonate numărul de cromozomi este cuprins între 2n=4 şi 2n=300, iar la dicotiledonate între 2n=6 şi 2n=226 (DARLINGTON şi WHYLIE, 1995). La arbori în celulele somatice numărul cromozomilor (2n) este cuprins între 12 şi 14 (la genurile Cercis, alnus, Laurus ş.a. şi 62-82 la genurile Ailanthus, Tilia etc. majoritatea speciilor forestiere de interes, de la noi – molidul, bradul, laricele, pinul, fagul, stejarul, castanul ş.a. au 24 de cromozomi. Forma cromozomilor se stabileşte în metafaza diviziunii mitotice, când cromozomii ating maximum de contracţie, în funcţie de poziţia centromerului. În anafază, ca urmare a îndoirii braţelor cromozomale la nivelul centromerului, pot să apară configuraţii în forma literei V, L sau I. Mărimea cromozomilor diferă de la o specie la alta. Lungimea lor variază între 2 şi 220 microni, iar grosimea între 0,2 şi 2 microni. Datorită caracteristicilor morfologice, fiecare cromozom poate fi identificat în celulele indivizilor. Cu toate modificările care apar pe parcursul diviziunilor celulare, cromozomii apar în acelaşi număr, cu aceiaşi formă şi mărime, ceea ce permite individualizarea şi recunoaşterea lor în cadrul complexului cromozomal. 3.2. Reproducerea celulară Substratul material al eredităţii se caracterizează prin continuitate. Această proprietate se realizează la nivel celular şi se asigură prin reproducerea sa cu fidelitate, transmiţându-se odată cu diviziunea, de la o celulă la alta şi în procesul reproducerii, de la o generaţie la alta. 3.2.1. Ciclul celular mitotic şi semnificaţia sa genetică Ciclul celular mitotic se desfăşoară în celulele somatice şi poate fi definit ca fiind diviziunea celulară în urma căreia plecând de la o celulă mamă cu un anumit număr de cromozomi, rezultă două celule fiice cu acelaşi număr de cromozomi ca şi celula mamă, identice genetic între ele, identice şi cu celula mamă de la care provine. În cadrul ciclului mitotic se disting două etape : diviziunea nucleului sau cariochineza şi diviziunea citoplasmei sau citochineza (fig. 3.5.) 39

Fig. 3.4. Ciclul celular mitotic: 1,2,3-profaza; 4-metafaza; 5 începutul şi 6-sfârşitul anafazei, 7,8-telofaza; 9-citochineza; c.p.-calote polare; m.n.-membrană nucleară; z.c.-zona clară; chr-cromocentre; ph-fragmoplast; p.c.-placă celulară

Chariochineza. Procesele prin care trece materialul genetic din nucleu în cariochineză se regăseşte în interfază şi mitoza propriu-zisă. Interfaza sau interchineza, este faza dintre două mitoze succesive. La microscop se observă nucleul conturat de membrana nucleară, cromozomii fiind prezenţi sub forma fibrei elementare de cromatină şi nu pot fi individualizaţi. În cadrul nucleului pot fi văzuţi unul sau mai mulţi nucleoli.

40

În funcţie de momentul sintezei ADN-ului, interfaza se împarte în trei etape : G1, S şi G2. Faza G1 sau prereplicativă se caracterizează prin sinteza proteinelor şi a ARN-ului. Cromozomii sunt monocromatidici. Faza S (de sinteză sau replicativă) este caracterizată de sinteza ADNului, concomitent cu a proteinelor histonice, astfel că fiecare cromozom devine bicromatidic, cele două cromatide surori fiind identice. Faza G2 (postreplicativă) este perioada de postsinteză în care are loc maturarea nucleului şi pregătirea sa pentru diviziunea propriu-zisă. Mitoza sau mitoza propriu-zisă, cuprinde patru faze : profaza, metafaza, anafaza şi telofaza. • Profaza este marcată de apariţia în cadrul nucleului a cromozomilor sub forma unor fibre subţiri şi lungi. În profază dispar nucleoli, se dezorganizează membrana nucleară şi se constituie fusul de diviziune. • Metafaza. Cromozomii ajunşi la condensarea maximă se ataşează cu ajutorul centromerului de fibrele fusului de diviziune şi se aliniază la centrul celular formând placa metafazică sau ecuatorială. În metafază se pot determina numărul, forma şi mărimea cromozomilor, elemente ce definesc cariotipul unei specii. • Anafaza se caracterizează prin clivarea longitudinală a cromozomilor, după ce în prealabil s-a produs clivarea centromerilor. Cromozomii monocromatici se deplasează cu centromerul înainte, spre polii celulei. În anafază se asigură repartizarea aceleaşi informaţii genetice la celulele fiice, având în vedere că cele două cromatide surori sunt identice. • Telofaza este un proces invers profazei. În cursul telofazei fibrele fusului de diviziune dispar, iar cromozomii monocromatici ajunşi la cei doi poli se despiralează, se subţiază şi iau aspectul unui ghem (spirem). Are loc procesul de reconstituire a membranei nucleare şi a nucleotidelor. Citochineza. În ţesuturile somatice, în condiţii normale, cariochineza este urmată de diviziunea citoplasmei. În celula vegetală, cu perete celular rigid, diviziunea citoplasmatică are loc la apariţia la centrul celulei a unui corpuscul plasmatic denumit fragmoplast, de forma unui inel care treptat îşi umple lumenul cu substanţe celulozo-pectice, care se transformă în perete celular. La animale citochineza constă în apariţia unei strangulaţii în zona ecuatorială a celulei, care asigură separarea celulelor fiice.

41

Distribuţia tuturor componentelor protoplasmatice este foarte precisă şi exactă, realizată sub control genetic, fapt ce determină formarea a două celule fiice cu aceiaşi alcătuire structurală şi constituţie genetică. Semnificaţia esenţială a diviziunii celulare mitotice constă în aceea că ea asigură continuitatea genetică de-a lungul generaţiilor celulare succesive. Ciclul celular, prin sporirea numărului de celule şi procesele de biosinteză ce le implică, asigură creşterea organismului, asigurându-se continuitatea genetică în ontogeneză, de la o celulă la alta, prin copierea mesajului genetic în interfază şi repartizarea acestui mesaj în condiţii riguros exacte celulelor fiice prin mecanismul mitozei, în anafază. În consecinţă, în privinţa informaţiei genetice nucleare, toate celulele sunt identice. Prin desfăşurarea mitozei se asigură constanţa numerică morfologică şi structurală a cromozomilor. 3.2.2. Ciclul celular meiotic şi semnificaţia sa genetică Ciclul celular meiotic, sau diviziunea meiotică este un tip particular de diviziune celulară, caracteristic organismelor ce se înmulţesc pe cale sexuată şi în urma căruia dintr-o celulă somatică cu 2n cromozomi se formează 4 celule fiice cu n cromozomi, diferite genetic între ele, diferite şi de celula mamă de la care provin. Diviziunea meiotică se desfăşoară în celule germinale, localizate în organele de reproducere şi implică două diviziuni succesive, meioza I şi meioza II, interfaza fiind prezentă o singură dată, la începutul ciclului celular, având ca finalitate formarea gameţilor (fig. 3.6.) Meioza I (primară sau reducţională). În această fază are loc reducerea la jumătate a numărului de cromozomi şi fenomenul de recombinare genetică. Diviziunea meiotică are aceleaşi faze ca şi cea mitotică, atât pentru metafaza I şi II, însă profaza este mai complexă. • Profaza I-a. În această fază cromozomii parcurg o serie de procese ce se realizează în următoarele subfaze: leptonem, zigonem, pachinem, diplonem şi diachineză. În leptonem – nucleul se măreşte în volum, cromozomii apar sub forma unor filamente subţiri, în lungul cărora încep să se contureze cromozomii. În zigonem cromozomii omologi, unul de provenienţă maternă şi altul de provenienţă paternă, se alătură şi se unesc doi câte doi, formând cromozomi bivalenţi. Fenomenul de conjugare a cromozomilor se numeşte sinapsă. Împerecherea cromozomilor omologi este controlată genetic, realiazându-se strict genă alelă la genă alelă şi se caracterizează prin formarea complexului sinaptomenal, care permite realizarea recombinării genetice prin crossing-over. 42

Pachinemul, se caracterizează prin condensarea cromozomilor, legatura dintre ei devine din ce în ce mai intimă, devenind posibile fenomenele de recombinare prin crossing-over. Diplomenul se caracterizează prin faptul că la fiecare bivalent se pot observa 4 cromatide, datorită tendinţei omologilor de a se separa, rămânând uniţi însă la nivelul chiasmelor. Această configuraţie poartă denumirea de tetradă cromatidică. Diachineza este reprezentată de condensarea şi scurtarea puternică a cromozomilor. Spaţiile dintre chiasme se măresc, chiasmele fiind deplasate spre extremităţile cromozomilor, fenomen denumit terminalizare. La sfârşitul profazei I nucleolul şi membrana nucleară dispar, formându-se fusul nuclear, pe care se ataşează configuraţiile cromozomale bivalente. Metafaza I. Cromozomii bivalenţi se aşează pe fibrele fusului de diviziune, orientaţi cu centromerii spre polii opuşi, formând placa ecuatorială. În metafază sunt vizibile incă chiasmele care leagă cromozomii fiecărei perechi. Anafaza I. Legătura dintre cromozomii omologi se diminuează, bivalenţii se separă în cromozomi bicromatici, ce migrează spre polii celulei. În anafaza I are loc reducerea numărului de cromozomi şi recombinarea genetică intracromozomială, datorită segregării libere a perechilor de cromozomi. Telofaza I. Cromozomii, în număr haploid, se grupează în cei doi nuclei, se formează membrana nucleară, se reorganizează nucleolii şi apar două celule haploide (o diadă). Cu aceasta se încheie prima diviziune meiotică. Nucleii nou formaţi intră într-un stadiu numit interchineză. În urma meiozei I, uneori citoplasma se divide, alteori nu. În acest ultim caz rezultă celule binucleate, numite diade. Meioza II (mitoză haploidă) este asemănătoare unei mitoze. Ea se petrece în celule cu număr haploid de cromozomi. Profaza II. În nucleul normal constituit, cromozomii se condensează şi se individualizează. La sfârşitul profazei II are loc dezintegrarea membranei nucleare şi formarea fusului de diviziune. Metafaza II. Cromozomii se deplasează spre centrul celulei, unde se fixează cu centromerul de fusul de diviziune, formând placa metafazică (ecuatorială). Aspectul cromozomilor este de forma literei “X”, configuraţie determinată de prezenţa unui singur centromer pentru cele două cromatide, iar braţele lor se resping. Centromerul fiecărui cromozom, care a ţinut unite cromatidele surori, se dublează structural şi funcţional. 43

Anafaza II. Are loc separarea centromerilor şi a cromozomilor în cromatide, care devin cromozomi independenţi ce migrează spre poli. Telofaza II. Se formează patru nuclei cu număr haploid de cromozomi monocromatidici. Membrana nucleară se reface în jurul fiecărui grup de cromozomi haploizi şi are loc apoi citokineza.

Fig. 3.6. Ciclul celular meiotic la Aloe thraskii 1-5-profaza heterotipică:1-leptoten, 2-zigoten, 3-pachitem, 4-diploten, 5-diachineză 6-metafaza heterotipică; 7- anafaza; 8-telofaza; 9-interchineză; 10-metafaza homeotipică; 11-anafaza; 12-teleofaza

Formaţiunea formată din patru celule haploide ce ia naştere la sfârşitul meiozei II se numeşte tetradă celulară. Astfel, dintr-o celulă diploidă cu 2n cromozomi, în urma celor două diviziuni ale meiozei, rezultă patru celule fiice haploide, cu n cromozomi. 44

Fiecare din cele patru celule formate, conţin combinaţii diferite de gene, asigurându-se astfel variabilitatea genetică. * *

*

Ciclul celular mitotic este, de fapt, un ciclu închis în sensul că celulele rezultate în urma meiozei nu mai reiau ciclul întrucât, la animale, acestea nu se mai divid urmând a funcţiona ca şi gameţi în procesul de fecundare, iar la plante suferă un număr limitat de diviziuni mitotice haploide în procesul de formarea gameţilor. Ciclul celular mitotic contribuie la realizarea a două funcţii biologice majore: diversitatea lumii vii prin asigurarea variabilităţii genetice a gameţilor şi continuitatea genetică de la o generaţie la alta în procesul de fecundare, asigurând constanţa numărului de cromozomi a descendenţelor. Variabilitatea genetică a gameţilor se asigură în cadrul proceselor de recombinare intracromozomală prin crossing-over în profaza meiozei I şi intercromozomală la nivelul setului haploid de cromozomi prin segregarea independentă a perechilor de cromozomi omologi în anafaza meiozei I (fig. 3.7.).

Fig. 3.7. Reprezentarea schematică a consecinţelor fenomenului de crossing-over: T = cromozom patern; M = cromozom matern

3.2.3. Ciclul de viaţă şi recombinarea genetică la plantele superioare; semnificaţia biologică şi genetică Prin ciclul de viaţă se asigură continuitatea genetică de la o generaţie la alta în filogeneză şi cuprinde alternarea unor generaţii celulare haploide, în procesul de formare a gameţilor (gametogeneza), cu a unor generaţii celulare 45

diploide, datorită fecundării. Gradul de reprezentare a celor două generaţii celulare, haploidă şi diploidă, diferă la plante şi animale. La plante, gradul de reprezentare a nivelului haploid şi diploid diferă în raport de poziţia ocupată pe scara evolutivă. În urma meiozei rezultă celule haploide, care nu reprezintă gameţi ca şi în cazul animalelor ci spori din care în urma mitozei haploide succesive va rezulta gametofitul (generaţia haploidă), formaţiune ce va da naştere gameţilor. Gameţii în urma procesului de fecundare vor da naştere zigotului diploid şi apoi prin diviziuni mitotice succesive se va forma sporofitul (generaţia diploidă), care în urma meiozei va produce din nou celule haploide (spori), încheindu-se astfel ciclul de viaţă. Diviziunea reducţională (meioza), se produce atât la animale, în spermatogeneză şi ovogeneză, cât şi la plante, în microsporogeneză şi macrosporogeneză. În spermatogeneză (meioza, la animale mascule), toate cele patru celule rezultate sunt de regulă, funcţionale, reprezentând spermatozoizii. În ovogeneză (meioza, la animale femele), doar una dintre cele patru celule este funcţională – ovulul – gametul femel. Gametogeneza la plantele superioare cuprinde microgametogeneza, sau procesul de formare a gameţilor masculi şi mega sau macrosporogeneza, adică procesul de formare a gameţilor femeli (fig. 3.8)

46

Fig. 3.8. Microsporogeneza (b) şi megasporogeneza (a) (după E.A. WHINCHESTER, 1961, modificat de A. MÜNTZIG, 1967)

În microsporogeneză (meioza la plante, în cazul grăunciorilor de polen) din fiecare celulă haploidă a tetradei se formează câte un grăuncior de polen (fig. 3.8.). Acesta, în timpul germinării, suferă două diviziuni mitotice succesive, în urma cărora rezultă un nucleu generativ şi unul vegetativ. Nucleul vegetativ se resoarbe, iar nucleul generativ haploid trece printr-o nouă diviziune mitotică, dând naştere la doi nuclei spermatici, care reprezintă gameţii masculi. În macrosporogeneză (meioză, în cazul gameţilor femeli), numai una dintre cele patru celule ale tetradei este funcţională, devenind sacul embrionar. Nucleul haploid al sacului embrionar parcurge trei diviziuni mitotoce succesive în urma cărora rezultă opt nuclei. Unul dintre aceşti nuclei haploizi ai sacului embrionar devine nucleul oosferei (gametul femel la plante), doi se contopesc dând nucleul secundar diploid al sacului embrionar, trei formează nucleii antipodelor şi doi devin nucleii sinergidelor. În urma procesului de fecundare se realizează fuziunea celor două celule sexuale, masculă şi femelă. Sub aspect genetic, semnificaţia fecundării este primordială, deoarece prilejuieşte întâlnirea şi regruparea cromozomilor omologi din gameţi, unul de provenienţă maternă, celălalt de provenienţă paternă. Celula, dispune astfel de 2n cromozomi fiind diploidă, faţă de gameţii care sunt haploizi cu n cromozomi. Unirea gameţilor la fecundare se produce în mod întâmplător, nedirijat, ceea ce constituie o sursă primordială de variabilitate genetică. Astfel, în cazul combinării a n gene, fiecare fiind reprezentată prin câte a alele, numărul de genotipuri (g) ce vor rezulta, sunt:  a (a +1)  g =  2  

n

Din exemplul dat, dacă se iau în calcul numai 10 gene, fiecare cu câte 2, 3 sau 4 alele, numărul de combinaţii este de 310, respectiv 610 şi 1010 etc. În cazul plantelor superioare, Angiosperme, se produce dubla fecundare, din contopirea oosferei cu gametul mascul, rezultând oul sau zigotul, iar din unirea nucleului secundar cu al doilea gamet se formează zigotul accesoriu (fig. 3.9.). 47

Dacă zigotul este diploid, zigotul accesoriu are trei seturi de cromozomi, fiind tetraploid, deoarece rezultă din fuziunea nucleului secundar diploid cu gametul mascul haploid. Faptul că în setul triploid (3n) cromozomi, un număr de 2n cromozomi provin de la părintele matern şi numai n cromozomi de la cel patern are consecinţe în producerea unor fenomene genetice, de tipul eredităţii citoplasmatice.

Fig. 3.9. Fazele fecundării la Angiosperme

Din zigot, prin diviziuni celulare succesive mitotice, ia naştere embrionul, iar din zigotul accesoriu, se formează endospermul secundar şi albumenul. În cazul Gymnospermelor fecundarea este simplă, un singur gamet contopindu-se cu oosfera (fig. 3.10.)

48

Fig. 3.10. Fecundarea la Pinus

Endospermul primar al gimnospermelor, deşi îndeplineşte aceleaşi funcţiuni ca şi la angiosperme, are origine diferită, luând naştere dintr-o celulă a nucelei aflată în apropierea micropilului şi fiind haploid (n cromozomi). În esenţă, diferenţierea timpurie a ţesuturilor embrionului, ca şi diferenţierea postembrionară care urmează, atât la angiosperme cât şi la gimnosperme, are ca sursă primordială informaţia genetică din structurile ADN ale celulei-ou în care sunt memorizate de la început toate caracterele organismului.

CAPITOLUL IV Teoria cromozomală a eredităţii 4. Noţiuni introductive Pentru genetică, studiul celulei şi a diviziunii celulare prezintă o mare importanţă deoarece face posibilă identificarea materialului genetic, a mecanismului prin care genele se transmit de la celula mamă la celulele fiice, de la ascendenţi la descendenţi, a modului cum se realizează recombinarea genetică şi cum se produc mutaţiile la nivel genetic, precum şi restructurările la nivelul cromozomilor. Teoria celulară elaborată de SCHLEIDEN şi SCHWANN (1838) şi completată de WIRCHOW (1855), au demonstrat că organismele au o alcătuire celulară sau pluricelulară şi că celulele provin exclusiv din alte celule. După elaborarea teroriei celulare, studiul celulei a luat un avânt deosebit spre sfârşitul secolului al 19-lea şi începutul secolului al 20-lea, permiţându-i lui MORGAN să sintetizeze cunoştinţele acumulate într-o teorie cromozomială a eredităţii, completată şi cu rezultatele experimentale proprii. Legile eredităţii elaborate de MORGAN, explică transmiterea ereditară a caracterelor determinate de gene plasate pe perechi diferite de cromozomi. 49

Teoria cromozomială a eredităţii are patru principii de bază: • plasarea liniară a genelor pe cromozomi; • fenomenul de linkage, sau transmiterea genelor plasate pe aceeaşi pereche de cromozomi; • fenomenul de crossing-over sau schimbul reciproc de gene între cromozomii pereche; • numărul limitat a grupelor de înlănţuire a genelor. Cercetările lui MORGAN şi colaboratorii săi, au fost efectuate în special asupra musculiţei de oţet (Drosophila melanogaster). Aceasta se înmulţeşte foarte repede, o generaţie putând fi obţinută, la o temperatură de 20ºC în numai 12 zile. Acest lucru, a permis ca pe parcursul unui an să se poată studia un număr mare de generaţii succesive. Fiecare femelă produce câteva sute de descendenţi. Numărul de cromozomi somatici la D. melanogaster este mic (2n=8), putând fi uşor identificaţi la microscop, datorită deosebirilor lor morfologice. Studiind câteva sute de mii de indivizi timp de mai mulţi ani, T.H. MORGAN şi colab. au reuşit să identifice peste 500 de mutaţii care afectau toate organele insectei. Aceste mutaţii au servit ca material de studiu transmiterii ereditare a caracterelor la descendenţi şi respectiv a mecanismului cromozomial al eredităţii. Prin încrucişarea mutantelor între ele sau cu tipul normal, denumit şi “sălbatic” s-a studiat modul de transmitere ereditară a diferitelor gene în cursul generaţiilor succesive. Aceste rezultate corelate cu cercetările citologice ale materialului respectiv, au dus la elaborarea principiilor menţionate la începutul capitolului. 4.1. Plasarea liniară a genelor pe cromozomi Prima teză a teoriei cromozomiale a eredităţii consideră că factorii ereditari (genele) sunt plasaţi pe cromozom în anumite poziţii precise, denumite loci (locus). De obicei, genele se prezintă sub formă de perechi alele ce determină dezvoltarea unor caractere contrastante, din care una este dominantă şi cealaltă recesivă. T.H. MORGAN a constat că genele pot suferi mutaţii transformânduse în gene alele. Prin mutaţie, gena dominantă A ce determină tipul normal (sălbatic) se poate transforma în gena alelă recesivă a. Ca urmare, genele se găsesc de regulă sub formă de pereche (alele). Genele se notează cu primele 1-4 litere ce desemnează prescurtat caracterul afectat de gena respectivă (în limba engleză sau latină). De exemplu, gena mutantă recesivă ce determină ochi de culoare albă la musculiţa de oţet se notează cu w (de la engl. white = alb), iar gena alelă ce determină tipul normal cu ochi roşii, cu aceeaşi literă având indicele + (w+). Gena ce determină corpul de culoare galbenă se 50

notează cu y (de la engl. yellow = galben), iar alela sa ce determină corpul normal gri, cu y+. Din cele de mai sus se confirmă ideea că genele alele sunt situate în aceiaşi pereche de cromozomi, în loci omologi, şi influenţează aceiaşi însuşire a organismului, determinând apariţia unor caractere contrastante (tabelul 4.1).

Tabelul 4.1.

Caracterul 1

Culorae ochilor

2

Culoarea corpului

3

Forma aripilor

Genele alele w ochi de culoare roşie w ochi de culoare albă y+ corp de culoare gri y corp de culoare galbenă vg+ aripi normale vg aripi vertigiale +

Încrucişând indivizi normali cu diverse mutante sau diferite mutante între ele, MORGAN constată că transmiterea multor caractere se abate de la cea de-a a doua lege a lui MENDEL. Admiţând că diferitele caractere ale organismului sunt determinate de genele plasate pe cromozomi, MORGAN îşi dă seama că numărul genelor este mult mai mare decât numărul cromozomilor unui organism. De aici concluzia că mai multe gene sunt plasate în acelaşi cromozom, într-o succesiune liniară, în anumiţi loci. MORGAN, analizând un mare număr de indivizi de D. melanogaster, femeli şi masculi, insectă ce are un număr de 8 cromozomi, constată că femelele au o pereche de cromozomi omologi (XX), iar masculii un cromozom X de formă lineară şi un cromozom neomolog, Y de forma unui bastonaş frânt. Aşadar, prezenţa cromozomilor XY determină sexul mascul, iar prezenţa perechii XX determină sexul femel. Aceşti cromozomi au fost denumiţi cromozomi ai sexului, heterozomi sau gonozomi, spre deosebire de restul cromozomilor somatici, denumiţi autozomi. Această descoperire constituie un argument în favoarea ideii plasării genelor pe cromozomi, întrucât s-a pus în evidenţă că o anumită structură cromozomică este corelată cu un caracter important, şi anume sexul. 4.2. Fenomenul de înlănţuire a genelor (linkage) Studiul celor peste 500 de mutante de D. melanogaster au dus la constatarea nu numai că genele trebuie să fie plasate în cromozomi, dar 51

ţinând seama de numărul mare al genelor şi numărul redus al cromozomilor, mai multe gene trebuie să fie plasate în acelaşi cromozom. S-a ajuns la concluzia că pe fiecare cromozom există un număr mare de gene şi că ele se transmit împreună, înlănţuite la descendenţi, manifestând fenomenul de linkage. La Drosophila melanogaster experienţele făcute de MORGAN au arătat că transmiterea caracterelor nu se face conform tipurilor de segregare cunoscute, fapt consemnat încă din 1905 de BATESON şi PUNETT. Cei doi, au constatat că prin încrucişarea a două varietăţi de Latyrus odoratus, unul cu flori purpurii şi grăunciori de polen alungiţi, celălalt cu flori roşii şi grăunciori de polen rotunzi, dacă în prima generaţie s-au obţinut hibrizi cu flori purpurii şi polen alungit, conform tezei dominanţei al lui MENDEL, în generaţia a doua (F2) s-au realizat raporturi de segregare diferite de cele mendeliene. Excedentul de flori purpurii şi polen alungit, ca şi de flori roşii şi polen rotund, care s-au înregistrat faţă de raportul de segregare 9:3:3:1 a fost pus pe seama tendinţei caracterelor respective de a se transmite împreună, fenomen denumit de BATESON şi PUNETT, cuplajul gameţilor. La Drosophila, încrucişându-se un individ mutant pentru două caractere (corp negru şi aripi vertigiale) cu un individ normal – sălbatic – (corp cenuşiu şi aripi normale = caractere dominante), în F1 s-au obţinut numai musculiţe cu fenotip sălbatic – corp gri şi aripi normale (fig. 4.1.), din heterozigoţi normali.

52

Fig. 4.1. Ereditatea la două gene înlănţuite la Drosophila

Aceştia, masculii (♂) se încrucişează cu indivizi dublu mutanţi homozigoţi (femele ♀) realizându-se aşa numita retroîncrucişare sau backcross. În F3 reapar tipurile genitoare în raport de 1:1 datorită faptului că genele respective fiind plasate pe acelaşi cromozom, se transmit înlănţuite (linkage). Constatând că fenomenul se repetă şi în cazul altor mutante, MORGAN consideră că faptul se datorează plasării celor două gene (corp gri şi aripi normale) pe acelaşi cromozom şi transmiterea lor se face înlănţuit, fenomen pe care l-a numit linkage. Conform celei de a doua legi mendeliene, în F 2 trebuia să se realizeze o segregare independentă a caracterelor şi să apară următoarele tipuri de indivizi: (1) aripi normale şi corp gri, (2) aripi normale şi corp negru, (3) aripi vertigiale şi corp gri şi (4) aripi vertigiale şi corp negru. În realitate, în urma încrucişării respective, s-au obţinut numai două tipuri de indivizi - cu aripi normale, corp gri şi cu aripi vertigiale şi corp negru -, identici cu formele parentale. Întrucât numărul genelor este mult mai mare decât numărul cromozomilor şi implicit unele dintre gene fiind localizate pe acelaşi cromozom, este normal ca acestea să nu se supună legii liberei combinări a genelor, ci să aibă tendinţa de a se transmite la descendenţi împreună, odată cu cromozomul respectiv. Genele ale căror locuşi sunt situaţi în cromozomi omologi şi care au tendinţa de a se transmite împreună, în bloc, la descendenţi, aparţin aceluiaşi grup de linkage. Numărul grupurilor de linkage este egal cu numărul haploid de cromozomi (n) din celulă. Astfel, la Drosophila (2n=8) sunt patru grupe de linkage (n=4); la mazăre (2n=14) – 7 grupe de linkage; la porumb (2n=20) – 10 grupe. Extrapolând, la principalele specii forestiere numărul grupelor de linkage ar fi: 12 la molid, pin, brad, larice, tisa, fag, stejar, castan (fiecare specie având 2n=24 şi n=12); 11 la ienupăr, tuia, chiparos de California (2n=22 şi n=11); 13 la duglas (2n=26, n=13); 14 la mesteceni, ulmi şi duzi (2n=28, n=14); la salcâm 10 (2n=20, n=10). De remarcat că problema numărului grupelor de înlănţuire nu este foarte simplă. Sunt specii la care numărul grupelor de înlănţuire este inferior numărului perechilor de cromozomi. La tomate (Solanum lycopersicum) se 53

cunosc numai 10 grupe de linkage, faţă de cele 12 posibile (2n=24), iar la iepure numai 11 grupe de linkage, în raport cu cele 22 posibile (2n=44). Fenomenul de linkage se manifestă numai în cazul genelor plasate pe acelaşi cromozom, în timp ce pentru genele plasate pe cromozomi diferiţi transmiterea ereditară a perechilor de gene se face independent, aşa cum a descoperit MENDEL. Intensitatea linkage-ului, capacitatea de transmitere înlănţuită a genelor în descendenţă, depinde de distanţa dintre ele pe cromozom, genele apropiate transmiţându-se linkat cu o frecvenţă mai mare decât cele situate la distanţe mai mari. Această constatare a permis lui MORGAN să pună bazele teoretice privind dispunerea liniară a genelor pe cromozomi şi să obţină date pentru întocmirea hărţilor cromozomale. La speciile forestiere, fenomenul transmiterii înlănţuite a genelor de pe acelaşi cromozom acţionează ca şi în cazul altor specii de plante, dar depistarea caracterelor linkate rămâne incertă din cauza greutăţilor metodologice ale cercetării, a structurii genetice practic necunoscute la cromozomii respectivi. În multe încrucişări între forme şi varietăţi ale speciilor forestiere se remarcă faptul că numeroase caractere nu sunt independente, foarte posibil ca efect al fenomenului de linkage. La foiase, WRIGHT semnalează, că în general, tipul nervaţiunilor la frunze corespunde cu grosimea frunzei şi conţinutul acestora în ulei. La frunza de fag multe caractere se asociază foarte strâns în timp ce marginea frunzei vădeşte o anumită independenţă, ceea ce duce la supoziţia că gena respectivă are raporturi slabe de asociere cu alte gene implicate în specificitea frunzei. 4.3. Recombinarea genelor între cromozomii pereche (crossingover) – Schimbul reciproc de gene Studiul mecanismului de transmitere ereditară a arătat că nu întotdeauna genele care fac parte din aceiaşi grupă de linkage, adică sunt plasate în acelaşi cromozom, se transmit înlănţuit şi că de la acest fenomen există o serie de excepţii. Pentru a explica aceste excepţii s-a ajuns la concluzia că între cromozomii pereche are loc un schimb reciproc de gene, fenomen denumit crossing-over. La Drosophila, în experienţele clasice ale lui MORGAN, s-au studiat transmiterea ereditară a caracterelor de la mutante, una cu aripi vestigiale (vgvg) şi corp normal (b+b+) şi alta cu aripi normale (vg +vg+) şi corp mutant negru (bb). Genele respective sunt plasate în perechea a doua de cromozomi. În F1 au rezultat indivizi heterozogoţi care aveau caracterele normale (corp gri şi aripi normale). Ulterior, o femelă obţinută în prima generaţie după 54

încrucişare a fost retroîncrucişată cu un mascul care prezenta ambele mutante, aripi vestigiale şi corp negru (vgvg-bb). În F2 s-au obţinut patru tipuri de musculiţe, adică cele două tipuri intrate în combinaţie (vestigiale-gri şi normale-negru) şi două recombinate genetic (fig. 4.2.). Ultimele două categorii de organisme se datoreşte segregării genelor care de obicei se transmit înlănţuit. Cauza constă în schimbul reciproc de gene plasate pe cromozomii pereche în timpul diviziunii meiotice. Analiza hibridologică arată că hibridul femel F1 produce patru tipuri de gameţi şi anume: b+vg şi bvg+ şi doi gameţi noi cu genele bvg şi b+vg+. Cei doi gameţi noi apar prin schimbul segmentelor între cromozomii omologi (crossing-over). Crossing-overul este o altă teză a teoriei cromozomale a eredităţii, supranumită şi teza schimbului echilibrat de gene între cromozomii pereche. În loc să apară jumătate din descendenţi cu aripi vestigiale şi corp normal şi jumătate cu aripi normale şi corp negru, se obţin 41,5% indivizi cu aripi vestigiale şi corp gri, 41,5% cu aripi normale şi corp negru, 8,5% cu aripi şi corp normale şi 8,5% cu aripi vestigiale şi corp negru.

Fig. 4.2.

Explicaţia pe care o dă MORGAN este următoarea: în timpul diviziunii mitotice, cromozomii omologi se apropie foarte mult şi se ating 55

unul de altul, în unul sau mai multe puncte de contact.. În aceste puncte de contact cromatidele se pot rupe, astfel că între cromozomii pereche poate avea loc un schimb reciproc de segmente cromatidice. Dacă pe aceste segmente se află localizate gene diferite, dar alele, schimbarea unor segmente cromatidice duce la schimbul de gene, în urma cărora apar cromozomi şi gameţi recombinaţi. Fenomenul de crossing-over, aşa cum s-a văzut, se produce în stadiul de zigonem-pachinem al profazei primei diviziuni meiotice, când cromozomii omologi bivalenţi (fiecare cu câte două cromatide) se apropie foarte mult unul de altul şi vin în contact direct cu unul sau mai multe puncte – chiasme, în care, din cauza tensiunilor dintre cromatidele externe şi interne se pot produce rupturi şi implicit, transfer reciproc de segmente (stadiul de diplomen). În funcţie de numărul de rupturi în punctele de contact, se ajunge la crossing-over simplu, dublu, multiplu. În timp ce MORGAN şi colab. săi limitau crossing-over-ul la nivel intergenic, gena fiind ultima unitate de recombinare, cercetările ulterioare (după 1950), au demonstrat şi existenţa crossing-over-ului intragenic. În afara recombinării genetice reciproce s-a mai relevat şi existenţa recombinării nereciproce, unidirecţională, numită conversie. 4.3.1. Factorii care modifică frecvenţa crossing-overului În condiţii normale şi uniforme de viaţă, de la o generaţie la alta, valoarea crossing-over între două puncte rămâne constantă. Regularitatea manifestării crossing-over-ului, precum şi lipsa acestui fenomen la o serie de organisme (moluşte, viermi), fac să se admită că atât crossing-over-ul cât şi linkage-ul se găsesc sub un anumit control genetic. Frecvenţa fenomenului de crossing-over este determinată de o serie de factori, dintre care menţionăm: Genotipul. La unele organisme fenomenul de crossing-over este frecvent, în timp ce la altele este practic absent. Constituţia genetică influenţează frecvenţa fenomenului de crossingover. S-a constatat la toate organismele că, în segmentele adiacente centromerului, frecvenţa chiasmei este mai redusă. Cauza principală se datoreşte faptului că în aceste segmente, în general, genele sunt foarte dense şi tot aici se află principalele zone heterocromatice. Aberaţiile cromozomale – structurale şi numerice afectează frecvenţa crossing-over-ului. Inversia într-o cromatidă suprimă omologia şi deci conjugarea regiunii afectate şi ca urmare nu pot apărea chiasma şi implicit, nici crossing-over-ul. modificarea numărului de cromozomi (autopoliploidia, alopoliploidia, monosomia) afectează în diferite moduri producerea chiasmei 56

şi ca urmare apariţia crossing-over-ului. procentul de crossing-over creşte odată cu creşterea distanţei dintre gene. Sexul. La diptere şi lepidoptere la sexul heterogametic (mascul XY, respectiv femela ZW) nu apare în meioză fenomenul de crossing-over. Faptul este explicat prin lipsa de omologie între cromozomii X şi Y, respectiv Z şi W, care nu conjugă în meioză. Vârsta. Frecvenţa crossing-over-ului este maximă la maturitatea sexuală şi scade odată cu înaintarea în vârstă. La om, frecvenţa procesului de crossing-over este mai mare la femeile de peste 36 de ani. Factorii de mediu. Temperatura, lumina, nutriţia pot produce perturbări în apariţia fenomenului de crossing-over. la Drosophila melanogaster s-a remarcat faptul că temperatura scăzută măreşte frecvenţa crossing-over-ului în unele segmente şi o micşorează în alta. 4.4. Hărţile cromozomale Determinarea frecvenţei crossing-over-ului şi a linkage-ului şi, implicit a distanţelor dintre diferitele gene din acelaşi grup de linkage, a permis să se elaboreze hărţile cromozomale (hărţi genetice), adică reprezentările grafice ale cromozomilor cu indicarea poziţiei relative a genelor linkage (a markerilor genetici), constituente. Pentru aceasta s-a încercat să se stabilească distanţa existentă între diferite gene, utilizându-se ca unitate de măsură frecvenţa cu care se manifestă fenomenul de crossingover, deci frecvenţa cu care apar organismele recombinate. Procentul de crossing-over în cadrul unei perechi de cromozomi depinde de distanţa dintre gene. Aceasta porneşte de la raţionamentul logic că dacă genele de pe acelaşi cromozom sunt plasate mai departe una de alta, posibilitatea manifestării crossing-over-ului este mult mai mare decât dacă sunt alăturate (fig. 4.3.). Pentru întocmirea hărţilor cromozomale se foloseşte deci analiza genetică, care constă în efectuarea de hibridări între indivizi diferiţi din punct de vedere genetic şi studierea descendenţei la mai multe generaţii. În acest fel se determină atât grupele de linkage, cât şi frecvenţa crossing-over-elor, adică distanţa dintre gene. Hărţile cromozomiale constituie reprezentarea grafică a cromozomilor şi a genelor care alcătuiesc diferite grupe de linkage, gene plasate în cromozomi la distanţe relative, exprimate în procente de recombinare. O altă metodă pentru întocmirea hărţilor cromozomiale la unele diptere (D. melanogaster) este metoda studiului citologic al cromozomilor uriaşi (politeni) Cromozomii uriaşi sunt de 150 de ori mai lungi decât cromozomii metafazici. ei sunt formaţi dintr-un mare număr de cromatide paralele, 57

datorită unei replicări succesive ale cromozomilor fără ca aceasta să fie urmată de separarea cromatidelor. Fenomenul poartă denumirea de politenie. Deci, celulele glandelor salivare care conţin cromozomii politeni rămân în profază şi ca urmare nu se mai divid.

Fig. 4.3. Harta genetică a perechii nr. 1 (X) de cromozomi de la Drosophila melanogaster

Prin colorare, de-a lungul cromozomilor politenici se disting benzi (întunecate) şi interbenzi (luminoase). Cromozomii uriaşi de la D. melanogaster prezintă circa 5.000 de astfel de benzi, cu o morfologie caracteristică şi o poziţie constantă. Studiul comparativ a numărului, morfologiei şi poziţiei benzilor din cromozomii uriaşi de la musculiţe de oţet normale şi diferitele mutante au arătat că între poziţia genelor pe cromozomi şi distribuţia benzilor există o 58

corelaţie directă. Cercetările mai recente au arătat că numărul de gene de la D. melanogaster este de circa 5.000, ceea ce corespunde cu numărul de benzi din cromozomii politenici. Aceste observaţii au contribuit la alcătuirea hărţii citologice la D. melanogaster. Aceasta a permis găsirea unui suport celular localizării genelor în cromozomi (fig. 4.4.). Primele hărţi cromozomale au fost realizate de MORGAN şi colab. încă din anul 1920, la Drosophila şi la Zea mays, specii cu însuşiri genetice foarte adecvate acestui scop. Rezultatele notabile în stabilirea grupelor de linkage şi constituirea hărţilor cromozomale sunt cunoscute la tomate, grâu, orz, gura leului şi în ultimul timp şi la om.

Fig. 4.4. Microfotografia unui cromozom uriaş din glanda salivară la Drosophia melanogaste

La arbori, întocmirea hărţilor cromozomale rămâne o problemă deschisă, deoarece identificarea genelor marker şi verificarea segregării mutantelor în descendenţi prin metoda hibridărilor sunt greu de analizat. În plus, în cazul arborilor intervin complicaţii din cauza frecvenţei mari a sistemelor poligenice. Problema nu este totuşi de nerezolvat dacă, de exemplu, se vor putea găsi markeri fenotipici şi se vor desfăşura studii la specii cu forme şi varietăţi distincte sau interhibride, cum ar fi molidul, pinul silvestru, stejarul sau, într-o măsură mai mică, bradul, fagul ş.a. (tabelul 4.2.). Tabelul 4.1. Caractere controlate de gene simple Specia Caragana arborescens Caragana arborescens Picea abies

Caracterul Culoarea puieţilor Ramuri Culoarea puieţilor

59

AA verde verde verde

Fenotipuri Aa verde erecte verde

aa galbenă pendante albă

Fagus silvatica

Culoarea frunzelor

-

arămie

verde

* * * Teoria cromozomială a eredităţii a avut şi are importante aplicaţii practice. Aceste cunoştinţe sunt importante în alcătuirea programelor de ameliorare a soiurilor de plante şi a raselor de animale. Astfel, printr-o alegere judicioasă a genitorilor se obţin hibrizi la care, în urma fenomenului de recombinare genetică apar noi combinaţii de gene, creându-se posibilitatea selecţionării unor forme utile pentru practică. Prin cunoaşterea hărţilor cromozomiale, a devenit posibil transferul anumitor cromozomi sau segmente cromozomiale de la un soi la altul, sau chiar de la o specie la alta. În acest fel s-au transferat gene utile pentru procesul de ameliorare a plantelor şi animalelor (ex. tranferul rezistenţei la rugini de la speciile sălbatice la grâu). Elaborarea hărţilor cromozomiale la om prezintă importanţă pentru studiul maladiilor ereditare.

CAPITOLUL V Ereditatea caracterelor sexuale 5. Consideraţii generale Caracterele sexuale de ordin morfologic, anatomic, fiziologic, comportamental sunt foarte bine evidenţiate la animale, respectiv la om. La plantele superioare ele sunt mai puţin distincte, deoarece atât la speciile dioice, cât şi la cele unisexuate – monoice, diferenţele dintre exemplarele mascule sau femele se limitează adeseori la structura aparatelor florale. Faptul se corelează, de altfel, cu existenţa şi evoluţia paralelă a capacităţii de regenerare, atât pe cale sexuată, cât şi pe cale vegetativă mai

60

ales la Angiosperme, ca şi cu capacitatea remarcabilă a celulelor de a-şi păstra timp îndelungat multipotenţa informaţională. La animale, caracterele sexuale determinate genetic rămân numai acelea care asigură formarea unui anumit gen de celule sexuale şi care condiţionează deosebiri în structura organelor interne şi externe de reproducere, implicate în procesul fecundării. Aceste deosebiri intră în sfera caracterelor sexuale primare, în timp ce caracterele sexuale secundare, au un anumit rol în reproducerea sexuată, dar nu participă în procesele de gametogeneză şi fecundare şi nu sunt supuse unui control genetic direct, formându-se sub influenţa sistemului hormonal (ex. penajul la păsări, talia, pilozitatea, vocea la om ş.a). Apariţia şi determinarea sexelor au început să fie explicate încă din antichitate printr-o serie de ipoteze naive, cum ar fi aceea a lui Hipocrate privind “puterea sexuală” a “seminţei” la părinţi sau în legătură cu funcţiile specifice ale testiculelor, cu direcţia din care bate vântul ş.a. Primele cercetări privind mecanismul determinării sexelor se datoresc citologului HENKING. În anul 1906 WILSON, pe baza cercetărilor citologice la diferite insecte din genul Protenor, clarifică rolul şi semnificaţia cromozomului X în sexualizare şi introduce termenul de cromozomi ai sexului, numiţi ulterior heterocromozomi, gonozomi ş.a. Se poate vorbi de un determinism cromozomal al sexelor. Asociat cu determinismul cromozomal există şi un determinism genic al sexelor, descoperit la Drosophila de către BRIDGES. Determinismul cromozomal, ca şi cel genic, al sexelor trebuie să fie prezent şi la plantele lemnoase dioice, Ginko biloba, Taxus bacata, Juniperus communis, dintre răşinoase, Populus alba, P. nigra, P. trenula, Salix alba, Acer negrendo, dintre foioase. Existenţa unui asemenea determinism genetic rezultă cu certitudine din faptul că la înmulţirea vegetativă, în cazul plopilor negri hibrizi, sexul arborelui mamă se păstrează cu stricteţe la descendenţi. 5.1. Tipuri de determinism cromozomal al sexelor La plante şi la animale s-au pus în evidenţă mai multe tipuri de determinism cromozomal al sexelor, tipul Drosophila, cu subtipul Lygaeus şi Protenor, tipul Abraxas cu subtipurile fluture şi pasăre şi tipul cu haploidie masculă. • Tipul Drosophila, se caracterizează prin masculi heterogametici şi femele homogametice şi au fost identificate la insecte, mamifere, inclusiv la om, precum şi la plante. Sexul femel, prezintă o pereche de cromozomi ai sexului (heterozomi) identici (XX), astfel că toţi gameţii femeli produşi de astfel de 61

organisme vor poseda câte un cromozom X, fiind deci un sex homogametic. Sexul mascul posedă doi cromozomi sexuali diferiţi (XY), astfel că jumătate din gameţi vor poseda cromozomul X şi jumătate cromozomul Y. Este deci un sex heterogametic. Din unirea în procesul fecundării a unui gamet femel ce posedă cromozomul X, cu unul mascul ce posedă cromozomul X, va rezulta o femelă (XX). Din contră, prin unirea unui gamet femel cu cromozomul X, cu unul mascul ce posedă cromozomul Y, va rezulta un mascul (YX) (fig. 5.1.).

Fig. 5.1. Tipul Drosophila de determinism cromozomial al sexelor

De obicei, cromozomul Y este mai mic ca dimensiune decât cel X şi posedă mai puţine gene. În unele cazuri cromozomul Y a dispărut complet. Este vorba de subtipul Protenor de determinare a sexelor la care femela este XX iar masculul X0, având deci un cromozom mai puţin (se întâlneşte la lăcuste şi la nevertebrate). În general, la tipul Drosophila, cu subtipurile Lygaeus şi Protenor, raportul numărului de masculi şi femele numit sex-ratio este egal (1:1) şi a fost verificat la numeroase specii de plante şi animale (Melandrium, Brygonia, Canabis ş.a). Sex-ratio deşi, în general constant, poate suferi modificări condiţionate de factorii de mediu, cum ar fi termo- şi fotoperioada. În cazul tipului de determinism sexual de tip Drosophila, ca de altfel şi a altor tipuri, sexul se hotăreşte în momentul fecundării – tipul singamic – în funcţie de natura cromozomilor sexului din gameţi. De asemenea, din cele de mai sus rezultă că genele care determină sexul se transmit de la o generaţie 62

la alta prin acelaşi mecanism ca şi genele ce specifică alte caractere – raportul genotipic şi fenotipic sex-ratio 1:1 fiind de factură mendeliană. Sexul mascul (XY) se comportă ca heterozigot dominant, iar sexul femel (XX) ca homozigot recesiv. În ceea ce priveşte determinismul sexual genetic, la Drosophila doar cromozomul X conţine gene ale sexului, respectiv ale feminităţii, în timp ce cromozomul Y, este heterogametic şi practic lipsit de gene ale formării sexului mascul. Încrucişările dintre musculiţe cu număr variabil de cromozomi X (diploizi şi poliploizi) şi seturi de autozomi au dovedit că genele determinării sexului se găsesc atât în heterozomi, cât şi în autozomi, iar sexualizarea depinde de balanţa dintre genele feminităţii din cromozomul X şi genele masculinităţii din autozomi. Această teorie a echilibrului genelor în determinarea sexului, este valabilă în cazul Drosophilei, la o serie de animale şi probabil, la arborii dioici. • Tipul Abraxas. În comparaţie cu tipul Drosophila, tipul Abraxas de determinism cromozomal al sexelor se caracterizează prin sex femel heterogametic şi sex mascul homogametic. Astfel, femelele posedă doi cromozomi ai sexului diferiţi (ZW sau XY) fiind deci heterogametici. Masculii sunt homogametici având doi cromozomi ai sexului identici (ZZ sau XX). Prin fecundarea gameţilor femeli cu cromozomul Z sau Y, cu gameţii masculi Z sau X, vor rezulta descendenţi masculi (ZZ sau XX). Dacă însă fecundarea se realizează între femele ce posedă cromozomul W sau Y,cu gameţi masculi cu cromozomul Z sau X, vor rezulta în descendenţă femele (fig. 5.2.). Acest tip de determinare a sexelor este întâlnit la păsări, la unele specii de amfibieni şi reptile, precum şi la unele nevertebrate.

63

Fig. 5.2. Tipul Abraxas de determinism cromozomial al sexelor

Adesea cromozomul W sau Y este mai mic ca dimensiuni decât perechea lui (Z sau X), iar în unele cazuri el a dispărut complet. Este vorba de subtipul fluture, la care femela este Z0 sau X0, iar masculii ZZ sau XX. Cele două tipuri de determinism cromozomal al sexelor asigură totodată un raport constant şi egal între sexe (sex-ratio) de 1:1. • Tipul de determinism al sexelor cu haploidie masculină (femel 2n şi mascul n). Se întâlneşte la diferite specii de himenoptere, ca de exemplu albina (Apis mellifera). Femelele provin din ovule fecundate şi sunt diploide (2n=32), iar masculii din ovule nefecundate pe cale partenogenetică şi sunt haploizi. Masculul generează însă spermatozoizi normali cu 16 cromozomi, datorită formării nucleilor de restituţie, prin care toţi cromozomii dintr-o celulă se dirijează către un singur pol. În determinismul genetic al sexelor la albine intervin mai multe gene alele, iar femelele diploide sunt heterozigote pentru aceste alele, în timp ce masculii, haploizi, sunt hemizigoţi, incluzând o altă alelă decât femela. Încrucişarea dintre o femelă diploidă cu un mascul haploid heteroalelic, duce la apariţia de femele diplogenotipice, moştenind atât caracterul mamei cât şi al tatălui, în timp ce trântorii sunt haplogenotipici, moştenind numai caracterul mamei. 64

5.2. Alţi factori care influenţează determinismul genetic al sexelor Determinismul genetic al sexelor şi funcţionarea sau nefuncţuinarea genelor pentru masculinitate sau feminitate sunt influenţate de o seamă de factori dintre care menţionăm: cantitatea de citoplasmă, modul de viaţă, condiţiile de mediu (temperatura, lumina, umiditatea), hormonii sexuali etc. Cantitatea de citoplasmă. La viermele marin Dinophilus, femele depun două tipuri de ouă: cu multă citoplasmă, din care apar femelele şi altele mai mici, cu citoplasmă mai puţină, din care apar masculii. La omida păroasă a stejarului (Lymantria dispar), GOLDSCHMIDT a semnalat existenţa unor factori genetici nucleari şi citoplasmatici ai sexualizării. Insecta manifestă un puternic dimorfism sexual, masculii fiind homogametici (ZZ), iar femelele heterogametice (ZW) (determinism sexual tip Abraxas). Prin încrucişarea unor indivizi masculi şi femeli din rasa europeană, cu femele şi masculi din rasa japoneză, GOLDSCHMIDT, a obţinut în afară de descendenţi de un anumit sex şi descendenţi intersexuaţi. Pentru a explica fenomenul el presupune că sexul este determinat de interacţiunea dintre factorii masculinizaţi (M), localizaţi în cromozomul Z şi factorii feminizaţi (F), localizaţi în citoplasmă. Modul de viaţă. Deosebit de interesantă este determinarea sexelor la viermele nematod Mermis subnigrescens. Acesta îşi depune ouăle pe frunze care fiind mâncate de lăcuste ajung în intestinul acestora unde are loc ecloziunea. Larvele pătrund apoi în corpul lăcustei unde îşi completează dezvoltarea, ducând o viaţă parazitară, viermii părăsind la maturitate gazda pentru a trăi liber pe sol. Sexul viermilor depinde de numărul paraziţilor care infectează o aceiaşi lăcustă: dacă numărul este de 1-3 indivizi ei devin femele care se reproduc prin partenogeneză, dacă numărul paraziţilor este de 4-23 ei se transformă o parte în masculi, o parte în femele şi o parte sunt intersexuaţi. În fine, când numărul paraziţilor depăşeşte 24 ei devin toţi masculi. Exemplul de mai sus evidenţiază importanţa modului de viaţă a unor organisme, în procesul de sexualizare. Condiţiile de mediu La plante s-a remarcat faptul că sub influenţa condiţiilor modificate de mediu (lungimea zilei, temperatura, umiditatea etc.), au loc schimbări importante privind raportul dintre sexe şi modificări profunde ale inflorescenţelor. Astfel, la cânepă (Cannabis sativa), plantă dioică, prin cultivarea sa iarna în seră, sub influenţa zilelor scurte se măreşte proporţia de plante femele de la 50%, la 80-90%.

65

Mutaţiile suferite de genele care controlează organele sexuale, sau anumite condiţii de mediu, pot să conducă la apariţia de rudimente ale florii femele în floarea masculă sau invers, ajungându-se uneori să se formeze gameţi masculi în inflorescenţa femelă sau ovule şi stigmate în inflorescenţa masculă (ex. porumb). Un arbore monoic cum este molidul dezvoltă flori femele numai în vârful ramurilor, în timp ce florile mascule sunt plasate lateral pe lugeri. Aceasţă diferenţiere strictă a unor celule identice ca potenţial sexual genetic se găsesc sub control fiziologic programat, condiţionat de nivelul sintezei auxinelor. S-a constatat că auxinele în concentraţie de 0,1% administrate pe cale artificială alterează expresia sexului, în sensul feminizării, în timp ce giberelinele induc o puternică tendinţă de masculinizare. Detaşarea frunzelor tinere dinspre partea superioară a ramurilor, cauzând reducerea cantităţii de auxine în zonele apicale, conduce la o masculinizare evidentă a florilor. Influenţa condiţiilor de mediu asupra formării mugurilor florali nu poate fi contestată la arborii monoici, care ajung să înflorească şi să fructifice la vârste înaintate (în masivele păduri, la fag, stejari, brad, molid, chiar la 6070 de ani) şi la care înflorirea este periodică. Hormonii sexuali. Determinismul genetic al sexelor la animalele vertebrate are un caracter complex, în sensul că diferenţierea cromozomală a sexelor este completată cu un mecanism care desăvârşeşte sexualizarea în cursul dezvoltării ontogenetice. La mamifere, de pildă, zigotul are o structură cromozomială bine determinată, fiind genetic mascul sau femel. Aceasta este etapa genetică a procesului de sexualizare. La om, această etapă ţine de la fecundare şi formarea zigotului, până ce embrionul atinge vârsta de 35 de zile. Cu toate acestea embrionul îşi începe dezvoltarea ca organism hermafrodit şi numai ulterior din progonada hermafrodită, în funcţie de informaţia genetică a autozomilor şi heterozomilor, se dezvoltă gonadele unisexuate (ovarele şi testicolele). Se poate deci conchide că informaţia genetică mai ales a heterozomilor determină formarea de gonade unisexuate. Aceasta este etapa gonadică a procesului de sexualizare care la om ţine până în a 60-a zi de dezvoltare embrionară. Procesul de sexualizare masculină este continuat apoi cu ajutorul hormonilor androgeni elaboraţi de testicolul embrionar, în timp ce procesul de sexualizare feminină se continuă “pasiv” fără a necesita astfel de hormoni. Un argument în acest sens, îl constituie castrarea embrionilor în perioada în care organele genitale sunt nediferenţiate sexual şi care – indiferent de sexul genetic – duce la sexualizarea sa feminină. Apariţia organelor genitale mascule şi femele constituie astfel o nouă etapă în procesul de sexualizare a organismelor, etapa hormonală. În etapa pubertăţii are loc desăvârşirea diferenţierii sexuale a organismelor sub influenţa hormonilor secretaţi de ovar (foliculina şi progesteronul) şi de testicole (testosteronul) (RAICU, 1980). 66

Punerea în evidenţă a rolului hormonilor sexuali la vertebrate s-a realizat cu ajutorul unor experienţe de castrare, transplantare a gonadelor, parabioză, tratamente cu hormoni etc. 5.3. Fenomenul de sex-linkage Cromozomii X şi Y conţin şi alte gene în afara celor sexuale. Aceste gene au tendinţa să se transmită la descendenţi împreună, legate de sex. Astfel, D. melanogaster conţine pe cromozomul X peste 140 de gene care se transmit înlănţuit, manifestând sex-linkage. Se diferenţiază gene complet sex-linkage cu cromozomul X, gene complet sex-linkage cu cromozomul Y, gene incomplet sex-linkage cu cromozomul X şi gene incomplet sex-linkage cu cromozomul Y. • Genele complet sex-linkage se transmit după mecanisme particulare, în funcţie de tipul de determinism sexual Drosophila sau Abraxas. La D. melanogaster, pe cromozomul Y se găsesc foarte puţine gene – gene ale fertilităţii masculilor şi gene pentru ţepi – aşa că genele de pe cromozomul X nu au alele corespondente, fiind homozigote. De aceea, în cazul musculiţei de oţet, fenomenul complet de sex-linkage nu se manifestă numai la cromozomul X. Ca exemplu, în acest sens, se poate da caracterul culoarea ochilor, care, în experienţele făcute de MORGAN, a permis găsirea unor prime concluzii privind sex-linkage. Astfel, la încrucişarea unei femele cu ochi roşii, normali, cu un mascul cu ochi albi (white eyes – w), mutant, în prima generaţie s-au obţinut numai indivizi cu ochi roşii. Prin încrucişarea descendenţilor în F2 s-a ajuns, conform raporturilor mendeliene la 75% indivizi normali (ochi roşii) şi 25% indivizi cu ochi albi (raport 3:1), ceea ce dovedeşte că însuşirea ochi roşii este dominantă, iar cea de ochi albi, recesivă şi că genele respective segregă independent. Important de reţinut este faptul că toţi indivizii cu ochi albi erau masculi, în timp ce indivizii cu ochi roşii se structurau 2/3 femele şi 1/3 masculi (fig. 5.3.). Încrucişând femele cu ochi roşii, heterozigote, din F1, cu masculi cu ochi albi, au apărut în F2 50% descendenţi cu ochi roşii, dintre care 1/2 femele şi 1/2 masculi şi 50% indivizi cu ochi albi, de asemenea 1/2 femele şi 1/2 masculi. S-a putut deduce astfel că genele care determină culoarea roşie sunt plasate pe cromozomul X, întrucât transmiterea lor din generaţie în generaţie urmează calea transmiterii cromozomului X.

67

Fig. 5.3. Fenomenul de sex-linkage la Drosophila melanogaster

• Ereditatea complet legată de cromozomul Y la D. melanogaster, se datoreşte genelor situate pe segmentul specific, neomolog, a heterozomului Y. Genele Y complet sex-linkage sunt numite gene holandrice, iar modul de transmitere ereditate holandrică. Ele se moştenesc exclusiv de descendenţii masculi – cazul genelor care afectează forma urechilor sau formarea membranelor dintre degetele de la picioare etc. Genele incomplet sex-linkage formează perechi de alele în heterozomii X şi Y, în segmentele lor omoloage. Aşa sunt genele mutante care controlează daltonismul, retinita pigmentară, un tip de nefrită ş.a.

68

Transmiterea ereditară a caracterelor prin sex-linkage pe cromozomul X a fost relevată şi la plantele dioice din genurile Melandrium, Rumex ş.a. şi nu există motive să se conteste că s-ar putea manifesta şi la speciile din genurile Populus sau Salix.

CAPITOLUL VI Noţiuni de genetică moleculară 6. Genetica moleculară este acea ramură a biologiei care studiază ereditatea organismelor la nivel molecular biochimic. La toate organismele materialul genetic este reprezentat de acizii nucleici (ADN şi ARN). Aceştia au capacitatea de a înregistra sub o formă codificată biochimic informaţia genetică, care determină toate caracterele şi însuşirile organismelor vii. 6.1. Acizii nucleici şi rolul lor genetic Primele experienţe care urmăreau să descopere determinismul genetic al unor caractere la bacterii au fost efectuate de GRIFFITH (1928). Acesta a injectat la şoareci pneumococi vii nevirulenţi, împreună cu pneumococi virulenţi, dar care în prealabil au fost omorâţi prin căldură. S-a constatat că şoarecii din experienţă au murit de pneumonie. Din animalele moarte au fost izolaţi pneumococi virulenţi vii. De aici s-a desprins concluzia că pneumococii nevirulenţi în contact cu “resturile” pneumococilor virulenţi, devin şi ei virulenţi. Deci, are loc un proces de transformare a pneumococilor nevirulenţi în pneumococi virulenţi (fig. 6.1.). Procesul de transformare în acest caz, a fost descifrat, în 1944, de către AVERY şi colab. care au descoperit experimental că acidul dezoxiribonucleic (ADN) este capabil să transforme caracterele ereditare de la un tip de pneumococi la altul. Unii pneumococi, notaţi cu litera “S”, formează colonii netede, au o capsulă şi sunt virulenţi; alţii notaţi cu litera “R” alcătuiesc colonii rugoase, nu au capsulă şi sunt nevirulenţi. Din cauză că la tipul “S” capsula poate fi formată din diferite polizaharide, există mai multe tipuri de pneumococi SI, SII,SIII etc.

69

Fig. 6.1. Schema experienţei lui E. GRIFFITH: 1 - pneumococi nevirulenţi; 2 - pneumococi virulenţi; 3 - pneumococi virulenţi omorâţi prin căldură; 4 - pneumococi virulenţi omorâţi prin căldură împreună cu cei nevirulenţi.

În mod spontan, prin mutaţie, aceşti pneumococi îşi pot pierde capsula şi devin nevirulenţi de tipul RI, RII, RIII etc. AVERY şi colab. au extras ADN din celulele pneumococilor de tipul SIII, pe care l-au introdus în mediul de cultură al pneumococilor nevirulenţi de tipul RII (fig. 6.2.). După 24 h s-a constatat că printre pneumococi de tip RII apare şi un anumit număr de pneumococi SIII. S-a dovedit că pneumococi RII s-au transformat în pneumococi SIII sub influenţa ADN de tipul donor. Pneumococii transformaţi transmit caracterele respective în descendenţi.

70

Fig. 6.2. Schema experienţei lui O.T. AVERY: a – mediu de cultură

La eucariote, primele tentative de transformare genetică s-au făcut la raţe de către BENOIT şi colab., în 1959. Raţele de rasă Peking injectate cu ADN extras din testicolele şi eritrocitele sângelui rasei Khaki Campell au suferit modificări importante în ce priveşte culoarea ciocului, a penajului, talia, forma şi poziţia capului, comportamentul ş.a. creâindu-se o nouă rasă de raţe, Blanche neige. Fenomenul de transformare a fost pus, ulterior, în evidenţă la numeroase specii de plante şi animale fapt ce a demonstrat că ADN reprezintă substratul biochimic al eredităţii, de la virusuri până la sistemele biologice celulare. ADN-ul constituie, în mod indiscutabil materialul genetic celular, având capacitate transformatoare atât la microorganisme, cât şi la organismele superioare. Cantitatea de ADN în celule este constantă, spre deosebire de cantitatea de acid ribonucleic (ARN) sau proteine, care suferă variaţii substanţiale. De asemenea, ADN are o mare stabilitate, ceea ce atestă, odată în plus, semnificaţia sa majoră de substrat genetic, transmis ca atare de la o generaţie la alta. ADN reprezintă substratul ereditar universal al eredităţii. Structurile ADN joacă rol de stocare sau memorizare a informaţiei genetice, secvenţele succesive de baze azotate constituindu-se în ceea ce se cunoaşte sub numele de gene. Unele virusuri nu posedă ADN, ci ARN, fiind denumite ribovirusuri. Evidenţierea rolului genetic al ARN viral s-a realizat la virusul mozaicului tutunului (VMT). Rolul genetic al ARN la VMT s-a pus în evidenţă prin separarea pe cale chimică a ARN de proteina virală, după care s-au făcut infecţii artificiale cu ambele componente ale virusului. S-a constatat că numai ARN viral are capacitate infecţioasă. La plantele infectate cu ARN a avut loc sinteza de ARN viral, dar şi a proteinei virale. Aceasta dovedeşte că materialul genetic în cazul ribovirusurilor este acidul 71

ribonucleic (ARN). La ribovirusuri, genele sunt constituite din ARN. La viroizi, organisme mai simple ca virusurile, capabile de a provoca boli la plante, materialul genetic este reprezentat de o moleculă de ARN. În concluzie, la unele virusuri şi la viroizi, ARN-ul este materialul genetic cu rol în transmiterea ereditară a caracterelor. 6.2. Structura chimică a acizilor nucleici Acizii nucleici sunt substanţe chimice macromoleculare alcătuite din unităţi mai simple denumite nucleotide. O nucleotidă este alcătuită dintr-o bază azotată, un zahar şi un radical fosforic. Bazele azotate din molecula acizilor nucleici sunt de două tipuri: purinice şi pirimidinice, ele rezultând dintr-un nucleu denumit purină şi respectiv pirimidină. Structura moleculară a ADN-ului a fost descoperit în 1953 de către WATSON şi colab. Purina este un tip de bază de azotaţi, alcătuită dintr-un heterociclu format din 5 atomi de carbon şi 4 de azot, în timp ce pirimidina are o alcătuire ceva mai simplă, fiind o bază azotată formată dintr-un heterociclu de 6 atomi din care 4 de carbon şi 2 de azot. Cele mai importante baze purinice sunt adenina (A) şi gaunina (G). Acestea sunt prezente atât în molecula de ADN cât şi în cea de ARN. Cele mai importante pirimidine sunt: citozina (C), şi timina (T) în ADN. La ARN, în locul timinei se află uracilul (U). Zaharurile care intră în alcătuirea acizilor nucleici sunt riboza la ARN şi dezoxiriboza la ADN. Aceste zaharuri sunt pentoze, având câte 5 atomi de carbon (fig. 6.3., 6.4., 6.5.).

72

Fig. 6.3., 6.4., 6.5.

Prin unirea unei baze azotate cu un zahar, riboza sau dezoxiriboza, se obţin aşa numitele nucleozide. Prin fosfatizarea nucleozidelor se obţin nucleotidele care sunt unităţile de bază ale acizilor nucleici. Prin înlănţuirea nucleotidelor se obţin polinucleotide sau acizi nucleici, în care intră mai mult de 10 nucleotide. 6.2.1. Acidul dezoxiribonucleic (ADN) Macromolecula de ADN este bicatenară fiind formată din două lanţuri polinucleotidice, înfăşurate elicoidal în jurul unui ax comun, formând un dublu helix. Cele două catene ale helixului de ADN sunt antiparalele. Cele două lanţuri polinucleotidice sunt complementare, în sensul că întotdeauna o nucleotidă care conţine o bază azotată purinică se leagă cu una ce conţine o bază azotată pirimidinică şi invers. Ca urmare în macromolecula de ADN nu există decât 4 tipuri de legături: A-T, T-A, G-C, C-G. Structura bicatenară a ADN se realizează cu ajutorul unor punţi de hidrogen - duble între adenină şi timină şi triple între guanină şi citozină. Aceste legături sunt de natură electrostatică (fig. 6.6.).

73

Fig. 6.6.Un segment din macro-molecula de ADN

Denaturarea şi renaturarea ADN. Un fenomen legat de structura bicatenară a ADN este denaturarea. Prin încălzirea unei soluţii în care se găseşte ADN, cele două catene se despart şi ADN-ul devine monocatenar. Dacă se realizează o răcire bruscă a soluţiei, macromoleculele rămân sub forma monocatenară şi poartă denumirea de ADN denaturat. Dacă răcirea se realizează treptat, se refac punţile de hidrogen dintre cele două tipuri de catene complementare şi macromoleculele devin bicatenare, rezultând ADN renaturat. Pe această bază se pot realiza hibrizi moleculari dintr-un amestec de catene de ADN, provenind de la diferite specii. Prin realizarea de hibrizi moleculari de tip ADN-ADN de origini diferite se poate determina gradul de complementaritate a nucleotidelor şi respectiv înrudirea filogenetică a organismelor de la care s-a preluat ADN-ul. 6.2.2. Replicaţia macromoleculei de ADN În celulele fiecărei specii se găseşte o anumită cantitate de ADN, în care se află sub formă codificată informaţia genetică. Pentru realizarea diviziunii celulare este necesară, printre altele, dublarea prealabilă a cantităţii de material genetic. În acest fel, celulele fiice vor avea aceeaşi cantitate de ADN cu celula mamă. Sinteza ADN poartă denumirea de replicaţie deoarece se realizează după modelul semiconservativ (fig. 6.7.). Prin ruperea punţilor de hidrogen, moleculele de ADN se separă în cele două catene complementare, iar nucleotidele libere din citoplasmă se ataşează pe bază de complementaritate 74

de catenele vechi. Vor rezulta două molecule de ADN bicatenar, fiecare având o catenă veche (care are rol de matriţă) şi catenă nouă sintetizată. În acest fel se asigură sinteza noilor molecule de ADN cu mare fidelitate, moleculele-fiice fiind identice cu moleculele-mamă.

Fig. 6.7. Replicaţia ADN după tipul semiconservativ

Ipoteze privind sinteza ADN consideră că aceasta s-ar realiza după tipul conservativ (sinteza “de novo”) sau după tipul dispesriv (dispersarea ADN în părţi componente). Studiul sintezei ADN in vivo şi in vitro a demonstrat că ea se realizează după tipul semiconservativ propus de WATSON şi CRICK deoarece acest mecanism asigură o înaltă fidelitate în sinteza noilor macromolecule de ADN, identice cu cele vechi. Ţinând seama că sinteza 75

ADN se realizează după sistemul semiconservativ, că în acest proces cele două catene servesc drept matriţe pentru catenele nou sintetizate şi că prin acest proces informaţia ereditară este transmisă fidel noilor macromolecule, procesul de sinteză a ADN a primit denumirea de replicaţie. ADN a fost replicat in vitro, ce către KORNBERG în 1954, cu ajutorul enzimelor celulare. 6.2.3. Acizii ribonucleici (ARN) Acizii ribonucleici (ARN) au, în general, o structură monocatenară, fiind alcătuiţi dintr-un singur lanţ polinucleotidic. Există mai multe tipuri de ARN, având funcţii diferite: 1) ARN viral constituie materialul genetic al unor ribovirusuri cum sunt: virusul mozaicului tutunului (VMT), virusul poliomelitei, virusul gripal ş.a. 2) ARN mesager (ARN-m) are rol de a copia informaţia genetică a unei catene din macromolecula de ADN şi, în felul acesta, realizează ceea ce se cheamă fenomenul transcripţie, o etapă în procesul de decodificare a informaţiei genetice şi de sinteză proteică. La ARN-m succesiunea nucleotidelor este complementară cu aceea a catenei de ADN de la care a copiat informaţia. Greutatea moleculară a ARN-m este variabilă, deoarece şi mărimea informaţiei copiate este variabilă. 3) ARN de transfer (ARN-t) are rolul de a transfera aminoacizii la locul sintezei proteice. Are o greutate moleculară mică şi relativ constantă, alcătuit dintr-o succesiune de 70-90 de nucleotide. Este monocatenar, cu porţiuni bicatenare, care formează o tijă şi trei bucle mari, fapt care îi conferă forma de trifoi. 4) ARN ribozomal (ARN-r) intră în alcătuirea ribozomilor şi are rol în sinteza celulară a proteinelor. În molecula sa sunt numeroase plieri neuniforme datorită legăturilor dintre nucleotidele complementare U-A sau G-C. 5) ARN nuclear mic (ARN-sn) se găseşte în nucleul eucariotelor, legat în mod stabil de proteinele nucleare. Acest tip de ARN este alcătuit dintr-o secvenţă de circa 100 de nucleotide, având un rol important în funcţionarea nucleului. 6.3. Codul genetic şi sinteza proteică În anul 1953, după descoperirea structurii macromoleculei de ADN, s-a lansat supoziţia existenţei unui cod genetic şi că secvenţa nucleotidelor de-a lungul macromoleculei de ADN trebuie să conţină sub formă codificată 76

informaţia genetică a organismelor. Evident că s-a pus problema legăturii dintre secvenţa celor 4 tipuri de nucleotide, ce conţin diferite baze azotate purinice şi pirimidinice (adenina, guanina, citozina şi timina) cu secvenţa aminoacizilor din catenele polipeptidice. SAMOV (1954) a emis ipoteza că în macromolecula acizilor nucleici se găseşte codificată informaţia genetică necesară sintezei moleculelor de proteine. Macromoleculele de acizi nucleici conţin un număr mare de nucleotide, astfel că prin modificarea secvenţei nucleotidelor se poate înregistra o enormă cantitate de informaţie genetică. Dacă se consideră că o genă este formată în medie dintr-o secvenţă de 1000 de nucleotide, numărul posibil de schimbări în secvenţa nucleotidelor este imens, fiind egal cu 41000 sau 10602. Prin înlocuirea unei singure nucleotide din cele 1000 ale unei gene, se pot produce 3000 de tipuri de gene alele. Evident că în felul acesta macromoleculele de acizi nucleici au o capacitate practic infinită de variaţie şi respectiv de înregistrare a informaţiei genetice. Macromoleculele de ADN conţin programul sintezei proteinelor, informaţia genetică ce determină ordinea de succesiune a aminoacizilor. Legăturile dintre secvenţa nucleotidelor în ADN şi succesiunea aminoacizilor în molecula proteică se realizează cu ajutorul codului genetic. Unităţile de codificare a informaţiei genetice sunt reprezentate de codoni. Codonul este alcătuit dintr-o secvenţă de trei nucleotide din macromolecula de ADN, având capacitatea de a determina includerea unui anumit aminoacid în molecula proteică. Prin codificarea celor 20 de aminoacizi care intră în alcătuirea proteinelor, există 64 de codoni, fiecare fiind format dintr-o secvenţă de trei nucleotide. Informaţia genetică din moleculele de ADN este mai întâi transferată într-o macromoleculă de ARN mesager (ARN-m), prin fenomenul de transcripţie, după care este decodificată şi transformată într-o secvenţă de aminoacizi prin translaţie (fig. 6.8.) Între secvenţa nucleotidelor din ADN şi secvenţa aminoacizilor din molecula proteică există o strânsă corelaţie, fenomen denumit colinearitate. Prin combinarea variată a celor 20 de aminoacizi, prin modificarea secvenţei lor în catenele polipeptidice, se poate realiza un număr imens de proteine. Macromoleculele de ADN sunt alcătuite dintr-un număr mare de nucleotide, care sunt însă de numai 4 tipuri. Prin modificarea secvenţei celor 4 tipuri de nucleotide, se poate înregistra, cu ajutorul codului genetic, o cantitate imensă de informaţie genetică. ADN-ul este deci alcătuit dintr-o secvenţă de codoni, ce determină succesiunea aminoacizilor în moleculele proteinelor.

77

Fig. 6.8. Transcripţia şi translaţia macromolecului de ADN

6.3.1. Codul genetic şi caracteristicile sale Codul genetic este alcătuit din 64 de codoni, cifra reprezentând totalitatea combinaţiilor posibile a celor 4 tipuri de nucleotide luate câte 3, adică 43 (fig. 6.9.). S-a reuşit descifrarea completă a codului genetic, în sensul că sunt cunoscute toate tripletele de nucleotide (codoni) din ARN-m ce codifică diferiţii aminoacizi. Aceşti codoni sunt formaţi din 4 tipuri de nucleotide conţinând bazele azotate adenină, uracil, guanină şi citozină. Adevăratul cod genetic conţinut în macromolecula de ADN poate fi foarte uşor cunoscut prin înlocuirea nucleotidelor din ARN-m (fig. 6.9.) cu componentele lor: citozina (C) prin guanină (G), guanina (G) prin citozină (C), adenina (A) prin timină (T) şi uracilul (U) prin adenină (A). Ţinând seama că există mai mulţi codoni decât aminoacizi (20), s-a dovedit experimental că mai mulţi codoni pot codifica un acelaşi aminoacid. Deci codul genetic este degenerat. Datorită fenomenului de degenerare a codului genetic, un anumit aminoacid poate fi codificat de mai mulţi codoni diferiţi. Astfel, leucina este codificată de codonii UUA, UUG, CUU, CUC şi CUG. Prima nucleotidă a codonului 5

A doua nucleotidă U

C

UUU Fenil UUC alanină

UCU UCC

UUA Leucină UUG Leucină CUU CUC Leucină CUA CUG AUU Izoleucină

UCA UCG CCU CCC

U

C A

A

G

A treia nucleotidă a codonului 3

UAU UAC Tirozină

UGU Cisteină UGC

U C

UAA Stop UAG Stop CAU CAC Histidină

UGA Stop UGG Triptofan CGU CGC Arginină CGA CGG AGU

A G U C

Serină

Prolină CCA CCG ACU

CAA CAG Glutamină AAU

78

A G U

G

AUC AUA AUG Metionină GUU GUC Valină GUA GUG

ACC ACG Treonină ACG GCU GCC Alanină GCA GCG

AAC AAA Asparagină AAG Lizină GAU Acid GAC aspartic GAA Acid GAG glutamic

AGC AGA Serină AGG Arginină GGU GGC Glicină GGA GGG

C A G U C A G

Fig. 6.9. Codul genetic ARN

Codul genetic este nesuprapus, adică doi codoni succesivi nu au nici o nucleotidă comună şi este fără virgulă (citirea informaţiei genetice se face continuu: între doi codoni succesivi nu există semne de punctuaţie). Din totalul de 64 de codoni ai codului genetic, un număr de 61 codifică cei 20 de aminoacizi, iar 3 codoni (UAA, UAG şi UGA) nu codifică aminoacizii, ci numai marchează sfârşitul unui mesaj genetic (STOP). Codul genetic este universal. Acest fapt a fost dovedit prin studiul proteinelor biosintetizate în sisteme celulare libere, provenite de la bacterii şi de la mamifere, sub influenţa unor ARN sintetizaţi artificial. S-a constatat că indiferent de originea sistemului celular liber se obţin aceleaşi proteine, fapt ce constituie argumentul că aminoacizii ce intră în alcătuirea proteinelor respective sunt codificate de aceeaşi codoni. Ţinându-se seama de universalitatea codului genetic, s-a dedus că are o origine foarte veche, luând naştere în însăşi procesul de apariţie a vieţii pe pământ. Recent, s-a demonstrat existenţa unor excepţii de la “universalitatea” codului genetic. Astfel, în genomul mitocondriilor (organite celulare de la eucariote) codul genetic prezintă mici deosebiri faţă de cel “universal”. De pildă, codonul UGA, care în nucleu are semnificaţia de STOP, în genomul mitocondrial (ADN-mt) codifică aminoacidul triptofan. Existenţa unor deosebiri minore în ADN-mt nu afectează în ansamblu, universalitatea codului genetic, acelaşi la procariotele acelulare şi celulare, precum şi la eucariote. O altă caracteristică a codului genetic este modalitatea în care se realizează descifrarea mesajului genetic conţinut într-o succesiune de nucleotide. S-a demonstrat că citirea mesajului genetic se face într-un singur sens, astfel că, absenţa unei singure nucleotide (deleţia) sau adăugarea unei nucleotide (adiţia) face ca mesajul să fie citit eronat, în continuare. 6.3.2. Funcţiile materialului genetic (transcripţia şi translaţia informaţiei genetice) Rezultatele cercetărilor privind funcţiile materialului genetic pot fi sintetizate în relaţia ADN → ARN → proteine (fig. 6.10). 79

Fig. 6.10. Relaţia ADN

→

ARN → proteine

Conform acesteia informaţia genetică se reproduce prin replicaţie şi este decodificată (transformată într-o proteină sau enzimă specifică) prin transcripţie şi translaţie. Transcripţia constituie fenomenul prin care informaţia unei catene de ADN este transmisă la ARN-mesager (ARN-m), precum şi altor tipuri de ARN. Translaţia înseamnă transformarea unei secvenţe de nucleotide şi respectiv de codoni din ARN-m într-o secvenţă de aminoacizi în catena polipeptidică. După cum se ştie, proteinele, care au un rol extrem de important structural şi funcţional, sunt foarte variate în natură. Ele reprezintă, de regulă, circa 50% din substanţa uscată a celulelor. Unele proteine, cum este colagenul, au rol în realizarea structurilor organismului, iar altele, cum sunt enzimele, au rol de a cataliza reacţiile metabolice. Sinteza proteinelor in vivo se realizează pe baza informaţiei genetice din acizii nucleici. Până în prezent au fost identificate peste 100.000 proteine diferite, vegetale şi animale. În linii mari, toate aceste proteine sunt alcătuite din variaţia secvenţei a 20 de aminoacizi. În procesul de sinteză proteică la nivel celular, intervin trei tipuri de acizi ribonucleici: ARN-mesager (ARN-m), ARN-ribozomal (ARN-r) şi 80

ARN-solubil (ARN-s), fiecare având un rol bine determinat. Rolul ARN în decodificarea informaţiei genetice a fost pus în evidenţă de BRACHET şi colab. (1950-1955), care au demonstrat că în celulă sinteza proteică este însoţită de o mărire considerabilă a cantităţii de ARN. Recent s-a descoperit că unele ribovirusuri, la care materialul genetic este o moleculă de ARN, sunt capabile să determine în celula respectivă sinteza unui ADN cu ajutorul căruia se replică. Este pentru prima oară când se demonstrează experimental că ARN-viral (ARN-v) poate servi ca matriţă pentru sinteza ADN-ului. Fenomenul poartă denumirea de reverstranscripţie sau inverstranscripţie. 6.3.3. Etapele sintezei proteice Dependenţa sintezei proteice de informaţia genetică din nucleu a fost pusă în evidenţă la alga monocelulară Acetabularia mediteraneea. Dacă se îndepărtează nucleul celular, biosinteza proteinelor continuă câtva timp în celula anucleată a algei, însă cu viteză redusă. După aproximativ 20 de zile, activitatea biosintetică încetează complet şi alga anucleată moare. Dacă însă în acest timp se introduce un nucleu în citoplasma respectivă, în câteva minute alga îşi reia pe deplin activitatea. Prima etapă în procesul de sinteză proteică o constituie transcripţia informaţiei din ADN în ARN-m. Fenomenul de transcripţie a informaţiei genetice de la ADN la ARN se realizează cu ajutorul enzimei ARN polimeraza. ARN-m copiază informaţia genetică numai a unei catene din macromolecula de ADN. În celulele procariotelor, ARN-m copiază informaţia genetică a mai multor gene adiacente care alcătuiesc un operon. Ca urmare, se sintetizează mai multe proteine, de care celula are nevoie la un moment dat. Pe măsură ce se sintetizează moleculele de ARN-m, începe sinteza catenelor polipeptidice. La eucariote, ARN-m copiază de regulă informaţia genetică a unei singure gene. Acest ARN-m, după ce suferă unele modificări prin eliminarea secvenţelor non-informaţionale, migrează în citoplasmă, unde are loc sinteza proteică. Prin transcripţia informaţiei genetice se înţelege nu numai sinteza ARN-m ci şi a celorlalte două tipuri de acizi ribonucleici (ARN-r şi ARN-t), care sunt necesari pentru realizarea sintezei proteice. A doua etapă a sintezei proteice este reprezentată de translaţie, în urma căreia o secvenţă de nucleotide din ARN-m este transformată într-o secvenţă de aminoacizi în molecula proteică. ARN-m se cuplează cu ribozomii din citoplasmă formând poliribozomi. Concomitent are loc activarea aminoacizilor (AA) din citoplasmă prin legarea lor de ATP (adenozintrifosfat), substanţă chimică ce serveşte ca donator de energie. 81

Cele trei faze ale biosintezei proteice pot fi redate sintetic astfel:

1.

min oacil sin tetaza AA + ATP a →

AA~AMP+P~P

In această fază un aminoacid oarecare AA este activat în urma reacţiei cu molecula de ATP donatoare de energie sub influenţa enzimelor denumite aminoacilsintetaze. Ca urmare, aminoacidul se leagă de AMP (adezinmonofosfat), iar două grupuri fosfat sunt puse în libertate.

2. AA~AMP+ARN-t

min oacil sin tetaze a →

AA~ARN-t+AMP

În această fază are loc transferul aminoacizilor activi la ARN-t, sub influenţa aceloraşi enzime din etapa precedentă. Cu ajutorul moleculelor de ARN-t aminoacizii sunt transferaţi la locul sintezei proteice în ribozomi. 3. AA1~ARN-t1+AA2~ARN-t2 peptidpo lim eraze  → AA1~AA2+ARNt1+ARN-t2

În aceasţă fază, aminoacizii, de exemplu, AA 1 şi AA2 se unesc între ei prin legături peptidice cu ajutorul enzimelor peptidpolimeraze. Se formează în acest fel catene polipeptidice, iar moleculele de ARN-t sunt puse în libertate şi sunt reciclate, adică refolosite în procesul sintezei proteice. De asemenea şi ribozomii sunt reciclaţi în cursul sintezei proteice.

6.4. Gena. Structură şi funcţii În concepţia clasică, gena era definită de către JOHANNSEN (1909), ca unitate a materialului genetic, localizată în cromozomi. În organismele haploide genele se prezintă sub formă simplă, iar în cele diploide sub formă de alele. Tipul primar al genei (tipul sălbatic) se modifică prin mutaţii formând una sau mai multe alele ce afectează acelaşi caracter. În cazul organismelor diploide descendenţii primesc numai câte un membru al perechii respective de alele, de la fiecare genitor. În concepţia clasică, gena are trei trăsături de bază: - uniformitatea funcţională, în sensul că determină producerea unui efect fenotipic ;

82

unitate mutaţională, prin care gena normală ce determină tipul sălbatic se transformă prin mutaţii în alela, sau alelele sale, astfel că este afectat caracterul respectiv ; - unitate de recombinare genetică, prin care genele se pot transfera de pe un cromozom pe perechea sa, prin fenomenul de crossingover. Genele, pe baza localizării lor pot să fie autozomale şi heterozomale. Determinarea poziţiei unei gene într-un anumit cromozom a făcut posibilă alcătuirea hărţilor genetice. Sub aspectul manifestării lor genele pot să fie recesive, dominante, codominante, epistatice, hipostatice, complementare sau indiferente. În timp ce genele nucleare se transmit la descendenţi şi segregă după tipul mendelian, genele extranucleare prezintă un tip de moştenire nemendelian. Între cele două tipuri de gene de la organismele eucariote poate exista un fenomen de interacţiune, în sensul că cele nucleare pot determina funcţionarea sau nefuncţionarea celor extranucleare, împreună putând produce un anumit fenotip. Apogeul în concepţia clasică despre genă a fost reprezentată de ipoteza o genă - o enzimă, elaborată de BEADLE şi TATUM (1941). Această ipoteză poate fi sintetizată astfel: • Toate procesele biochimice din organisme sunt controlate genetic, fiecare reacţie dintr-un lanţ metabolic fiind determinată primar de o genă. Între gene şi enzimele respective există raportul de 1:1. Prin mutaţia unei singure gene are loc blocarea sintezei enzimei corespunzătoare şi a reacţiei biochimice catalizată de ea. Ca urmare are loc blocarea întregului lanţ metabolic. Ipoteza consideră că fiecare genă controlează sinteza, funcţionarea şi specificitatea unei anumite enzime. Noţiunea de genă a evoluat foarte mult odată cu apariţia geneticii moleculare şi a perfecţionării metodelor de investigaţie la nivel molecular. Gena în concepţia actuală poate fi definită drept un segment al macromoleculei de ADN (sau ARN în cazul unor virusuri), format dintr-o anumită secvenţă de nucleotide, care acţionează ca o unitate funcţională şi care conţine secvenţa nucleotidelor într-o moleculă de ARN-m (transcripţia genetică) şi respectiv a aminoacizilor într-o catenă polipeptidică (translaţia genetică) Gena este alcătuită dintr-un mare număr de subloci potenţial mutabili, dispuşi linear într-o anumită ordine şi între care poate avea loc fenomenul recombinării genetice. Dimensiunea genelor este variabilă, în funcţie de cantitatea de informaţie genetică pe care o posedă. La bacterii s-a calculat că în medie o -

83

genă este formată dintr-o secvenţă de 900-1.500 nucleotide, fiecare aminoacid fiind controlat genetic de o tripletă de nucleotide denumită codon. Dacă o proteină este alcătuită dintr-o singură catenă polipeptidică sau din mai multe dar identice, ea este codificată de o singură genă. În cazul când molecula proteică este formată din mai multe catene polipeptidice nonidentice, ea este codificată de mai multe gene. De exemplu, hemoglobina A este alcătuită din 4 catene polipeptidice, identice două câte două (α şi β), ea fiind codificată de două gene diferite. Sub aspect funcţional, genele pot fi clasificate în 4 categorii : 1) Gene structurale care determină secvenţa aminoacizilor într-o catenă polipeptidică, astfel că între secvenţa nucleotidelor în acidul nucleic şi cea a aminoacizilor din proteina corespunzătoare se observă fenomenul colinearităţii. 2) Gene reglatoare, au rolul de a controla sinteza proteică la nivelul celulei, în funcţie de condiţiile de mediu extracelular sau de necesităţile funcţionale ale celulei. 3) Gene arhitecturale care asigură integrarea proteinelor sintetizate în structurile celulare. 4) Gene temporare care activează cele 3 gene anterioare, pe baza unui program în timp şi spaţiu, astfel că în organism se realizează fenomenul citodiferenţierii. WADDINGTON (1965), a denumit întreaga serie de procese biochimice care duc de la genă la caracterul fenotipic respectiv sistem de acţiune a genelor. În timp ce la procariote genele sunt formate dintr-o secvenţă de nucleotide continuă, ce codifică o secvenţă de aminoacizi, la eucariote genele sunt alcătuite din segmente informaţionale, separate de segmente noninformaţionale. De exemplu, gena ce determină sinteza ovalbuminei la găină este constituită din “bucăţi” prezentând întreruperi de secvenţe de nucleotide care este transcrisă în ARN-m. Aceasta înseamnă că în şapte regiuni ale genei există inserţii de secvenţe de nucleotide care nu sunt transcrise în ARN-m. Ca urmare gena este alcătuită din segmente informaţionale, separate prin segmente de ADN non-informaţional, sau silenţios. Secvenţele de nucleotide non-informaţionale incluse în gena respectivă se numesc introni. Au o mărime variabilă între 300 şi 1.400 perechi de nucleotide. Regiunile intercalare se numesc extroni şi ele constituie cu adevărat gena. În genomul eucariotelor există un număr relativ mic de gene, comparativ cu cantitatea totală de ADN. De exemplu, la om, s-a calculat că numărul posibil de gene ar fi egal cu 3×106. În realitate, numărul de gene este mult mai mic, fiind egal cu 5×104. Aceasta înseamnă că numai o mică parte din genomul uman este constituit din gene funcţionale, în timp ce cea mai 84

mare parte din genom este constituit din ADN non-informaţional, cu alte roluri. 6.4.1. Funcţiile genelor şi dogma centrală a geneticii Genele au două funcţii: autocatalitică şi heterocatalitică. Dogma centrală a geneticii constă în faptul că informaţia genetică se găseşte în ADN, ea putând să fie replicată (funcţie autocatalitică) şi decodificată prin transcripţie şi translaţie (funcţie heterocatalitică). Ca urmare, fluxul de informaţii este unidirecţional : ADN → ARN – proteine. Funcţia autocatalitică a genelor. Constă în capacitatea lor de a se autoreplica cu mare fidelitate, astfel că în procesul diviziunii celulele fiice moştenesc, de regulă, aceleaşi gene existente şi în celula mamă. La organismele pluricelulare, fiecare celulă a organismului posedă totalitatea genelor caracteristice speciei respective, numai că în celule specializate funcţionează anumite gene, restul găsindu-se în stare represată. La plante s-a demonstrat că atât celulele diploide ale organismului, cât şi cele haploide, sunt capabile să regenereze în culturi celulare întreg organismul. Deoarece la majoritatea organismelor materialul genetic este reprezentat de ADN şi numai în cazul unor virusuri este reprezentat de ARN, funcţia autocatalitică a genelor este reprezentată de procesul de replicaţie a acizilor nucleici. Acest proces se realizează după tipul semiconservativ, prin care moleculele de ADN nou sintetizate sunt de fapt numai pe jumătate, deoarece ele sunt formate dintr-o catenă polinucleotidică veche şi una nou sintetizată. Existenţa complementarităţii nucleotidelor de-a lungul macromoleculei de acizi nucleici, permite sinteza materialului genetic, cu o mare fidelitate. Numai aşa se poate explica stabilitatea relativă a organismelor vii, transmiterea informaţiei genetice în cursul generaţiilor succesive. Funcţia heterocatalitică a genelor. Constă în capacitatea lor de a determina sinteze specifice de proteine, enzime şi alte biomolecule. Aceasta înseamnă că informaţia genetică pe care o conţine fiecare genă este la un moment dat decodificată şi transformată într-o secvenţă de aminoacizi, adică în catene polipeptidice. În fiecare celulă de tip procariot sau eucariot, genele se găsesc, de regulă, într-un singur exemplar sau formă de alele, în timp ce numărul moleculelor proteice este foarte mare, de zeci sau sute de mii. Aceasta înseamnă că decodificarea informaţiei genetice conţinută în moleculele de ADN se realizează cu o viteză foarte mare, încât celulele pot sintetiza rapid cantităţi mari de molecule proteice. Pentru aceasta există un sistem de amplificare, prin care genele sunt copiate în numeroase exemplare de

85

ARN-m prin fenomenul de transcripţie şi apoi prin translaţie sunt transformate în secvenţe de aminoacizi, adică în catene polipeptidice. Recent s-a descoperit că la eucariote genele cuprind secvenţe de nucleotide informaţionale denumite exoni şi secvenţe non-informaţionale denumite introni. Astfel, gena este alcătuită din mai multe bucăţi, din care numai exonii sunt transcrişi în ARN-m şi informaţia lor genetică este decodificată şi transformată în segmente de aminoacizi. În procesul de transcripţie intronii sunt eliminaţi. De exemplu, gena ovalbuminei, a proteinei din albuşul ouălor de găină, este format dintr-o secvenţă de 8 exoni şi 7 introni, care alternează. Ca urmare, genele de la eucariote sunt mult mai mari decât cele de la procariote, deoarece au segmente de ADN non-informaţional. Acest ultim tip de ADN are rol în procesul de evoluţie prin duplicarea genelor. Genele de la eucariote au o structură discontinuă sau în mozaic. 6.4.2. Gene suprapuse. La bacteriofagul phix 174, care are un genom circular, s-au descoperit gene suprapuse. Gena A a acestui virus bacterian este mai mare, iar gena B de dimensiuni mai reduse, fiind inclus în gene A. De asemenea genele D şi E sunt suprapuse (fig. 6.11.). Aceasta înseamnă că sinteza ARN-m poate începe din două puncte diferite ale aceleaşi gene, astfel că se pot sintetiza două catene polipeptidice de mărimi diferite.

Fig. 6.11. Harta genetică a fagului phiX 174

6.4.3. Pseudogene. În genomul unor eucariote au fost evidenţiate pseudogene, adică nişte gene relicte, care şi-au pierdut funcţiile şi care au numai rol în menţinerea arhitecturii moleculare a cromozomilor. Astfel de gene se regăsesc în familia genelor hemoglobinelor, a imunoglobinelor etc. cu care se înrudesc structural. Fiind nefuncţionale, pseudogenele acumulează mutaţii cu o frecvenţă mărită. 6.4.4. Elemente genetice transpozabile

86

Elementele genetice transpozabile sau transpozonii sunt segmente de ADN de 750-40.000 perechi de baze, capabile să circule în cadrul genomului atât la procariote, cât şi la eucariote şi să se insere în diverse locusuri. Ele pot determina mutaţii genice, restructurări cromozomale, activarea unor gene silenţioase, inactivarea unor gene etc. Traspozonii sunt de două tipuri : - traspozoni simpli, mai mici ca dimensiuni şi care conţin numai gena traspozazei, enzimă cu ajutorul căreia se realizează transpoziţia ; - transpozoni complecşi, de dimensiuni mai mari, care pe lângă gena traspozazei conţin una sau mai multe gene care sunt transpozate dintr-un locus în altul al genomului. Inducerea transpoziţiei se realizează în condiţii de stress provocat de agenţii fizici (radiaţii, şocuri de temperatură) şi chimici (substanţe mutagene, poluante etc.) sau prin cultura de celule şi ţesuturi pe medii artificiale. În aceste condiţii se produce o destabilizare a genomului, fapt ce determină o mare variabilitate genetică. Aceasta permite o capacitate mărită de adaptare a organismelor la condiţiile nefavorabile de mediu şi bineînţeles supraviaţuirea. Elementele genetice transpozabile au un rol important în evoluţia rapidă a organismelor vii în condiţii de stress.

87

CAPITOLUL VII 7. Ereditatea extranucleră 7.1. Gene extranucleare În celulele eucariotelor marea majoritate a genelor, respectiv a materialului genetic sunt localizate în nucleu. Ca urmare, genele nucleare se manifestă în conformitate cu legile mendeliene şi cu teoria cromozomială a eredităţii. O mică parte din materialul genetic celular se găseşte însă plasat în citoplasmă, alcătuind ereditatea extracromozomială sau citoplasmatică. Fenomenul eredităţii extranucleare este determinat de prezenţa în citoplasma celulelor a unor gene denumite gene extranucleare sau plasmagene, spre deosebire de genele nucleare sau cromogene. În timp ce o mică parte din fenomenele de ereditate extranucleară sunt controlate exclusiv de genele citoplasmatice, în cazul majorităţii fenomenelor de acest tip, au un control dublu rezultat din interacţiunea cromogenelor şi plasmagenelor. Determinanţii genetici necromiozomiali pot fi clasificaţi, după natura lor, în trei grupe : 1) Gene necromozomiale localizate în diferite organite de tipul cloroplastelor şi mitocomdriilor ; 2) Gene necromozomiale localizate în particole infecţioase stabilizate în celulă (particole kappa şi lambda la parameci, particole sigma şi cele ce modifică sex-ratio la Drosophila etc.) ; 3) Gene necromozomiale plasate în constituienţi citoplasmatici foarte mici, nedetectabili citologic (gene care determină androsterilitateea citoplasmatică). 7.1.1. Genele mitocondriale şi cloroplastice Mitocondriile şi cloroplastele sunt organite celulare care conţin ADN sub forma unui singur cromozom, de formă circulară şi care se replică independent de materialul genetic din nucleu. Acest ADN extranuclear se deosebeşte de cel nuclear prin greutatea moleculară şi prin raportul bazelor A+T/G+C. În cloroplaste şi în mitocondrii se găsesc ribozomi asemănători celor bacterieni şi se realizează sinteza unor proteine, pe baza informaţiei genetice din ADN propriu.

88

Genele mitocondriale. Fiecare celulă vegetală sau animală conţine circa 100 de mitocondrii, însă în unele cazuri numărul lor este mult mai mare. De exemplu, în celulele hepatice de la mamifere există circa 800 de mitocondrii. În mitocondrii se găseşte un tip special de ADN mitocondrial (ADNmt), în care se găsesc în special genele ce codifică enzimele necesare respiraţiei celulare. În genomul mitocondrial de la om se găsesc un număr de 37 de gene. Genele cloroplastice. Cloroplastele sunt organite celulare în care se găseşte clorofila, pigmentul verde cu rol esenţial în fotosinteză. Numărul de cloroplaste per celulă vegetală variază de la 1 la alga Spyrogira, la 30-50 în frunzele plantelor superioare. În cloroplaste se găseşte un tip special de ADN cloroplastic (ADNcp). Cantitatea de ADNcp este de regulă mai mare decât cea din mitocondrii, astfel că pot fi codificate 100-150 de polipeptide diferite. ADNcp alcătuieşte un singur cromozom şi deci, un singur grup de linkage. Mitocondriile şi cloroplastele sunt transmise ereditar exclusiv pe linie maternă. 7.2. Ereditatea de tip matern CORRENS (1902) a studiat la planta Mirabilis jalopa (barba împăratului) un fenomen de apariţie a unor ramuri pe care frunzele erau de culoare albă sau erau de tip amestecat, regiuni albe alternând cu cele verzi (mozaicate) Acest ultim tip de frunze l-a denumit albomaculatus, şi se transmite în descendenţă pe linie maternă, fenomen care a fost pus în evidenţă prin efectuarea de încrucişări între tipul normal de plante, albinotice şi cele albomaculatus (tabel 7.1.) Tabelul 7.1. Rezultatele încrucişărilor între florile de pe ramurile de diverse tipuri de Mirabilis jalopa Ramura cu flori paterne verde (normal) Albinotic Albomaculatus

Ramura cu flori materne Verde Albinotic Albomaculatus Verde Albinotic Albomaculatus Verde Albinotic Albomaculatus

89

Generaţia F1 Verde Albinotic Verde, albinotic, albomaculatus Verde Albinotic Verde, albinotic, albomaculatus Verde Albinotic Verde, albinotic, albomaculatus

Se observă, că descendenţii seamănă cu forma maternă şi că numai în cazul florilor materne de tip albomaculatus se produce o segregare. Această segregare se datoreşte faptului că pe ramurile de tip albomaculatus există atât celule cu cloroplaste, cât şi celule lipite de cloroplaste. Plantele albinotice neavând posibilitatea de a realiza fotosinteza, piereau de timpuriu. Transmiterea ereditară pe linie maternă a caracterelor se datoreşte faptului că cloroplastele se găsesc exclusiv în citoplasmă, se reproduc independent de nucleu şi zigotul moşteneşte tipul de plastide ale mamei. Cauza o constituie faptul că în sacul embrionar se află primordiile cloroplastelor în citoplasma oosferei, în timp ce nucleii spermatici care realizează fecundarea sunt lipsiţi de astfel de primordii. Deosebiri importante între hibrizii reciproci, datorită influenţei materne au fost semnalate şi la animale. De exemplu, din încrucişarea unui iepe (Equus caballus, 2n=64), cu un asin (E. asinus, 2n=62) se obţine catârul (2n=63); din încrucişarea inversă dintre o măgăriţă şi un armăsar rezultă bardoul (2n=63). Între catâr şi bardou există deosebiri însemnate în ceea ce priveşte talia, culoarea, puterea de muncă etc. deşi ambii hibrizi au 2n=63 de cromozomi. Non-identitatea hibrizilor reciproci interspecifici ne se poate explica decât datorită existenţei unor gene extranucleare, care se transmit pe linie maternă. 7.3. Merogonia Un exemplu interesant de ereditate extranucleară îl constituie fenomenul de merogonie, prin care se înţelege obţinerea unor hibrizi prin fecundarea unei ovule enucleate cu un spermatozoid normal, hibrizi care manifestă multe caractere materne. BOVERI (1899) a demonstrat acest lucru prin introducerea într-o ovulă enucleată de arici de mare a unor spermatozoizi de la crinul de mare, obţinând larve haploide care nu aveau decât o garnitură de cromozomi provenită de nucleul patern. Larvele haploide nu erau exclusive de tip patern, deşi cromozomii proveneau exclusiv de la forma tată, ci prezentau şi caractere materne transmise din citoplasmă (RAICU, 1980). * * * Fenomenul de transmitere a unor caractere prin intermediul citoplasmei materne se numeşte matroclinie. Faptul este explicabil având în vedere că celulele sexuale femele conţin o cantitate sporită de citoplasmă, în comparaţie cu cele mascule, ceea ce asigură transmiterea ereditară a unor anumite însuşiri. La mamifere 90

organismul poate influenţa dezvoltarea hibridului în cursul vieţii intrauterine. De asemenea, la plantele superioare, zigotul începe să se dividă imediat după fecundare, formând embrionul încă din perioada când acesta se află în organismul matern. Pe de altă parte, la Angiosperme endospermul este format din celule triploide (3n), cu două garnituri de cromozomi (2n) de origine maternă şi numai o garnitură (n) de origine paternă, ceea ce face ca influenţa endospermului să fie mai pronunţată pe linie maternă. Esenţial însă în ereditatea extranucleară este faptul că în citoplasmă se localizează genomuri specifice (cloroplaste, mitocondrial) sau factori genetici necromozomali, cu aparat genetic propriu, care au rol direct în ereditate. 7.4. Gene extranucleare localizate în particole infecţioase În diferite organisme au fost evidenţiate gene necromozomiale localizate în particole de tip infecţios care sunt particolele kappa (K), lambda (λ) şi miu (μ) la parameci, particole care afectează sex-ratio şi cele de tip sigma la Drosophila melanogaster etc. La parameci s-au pus în evidenţă mai multe particole infecţioase. SONNEBORG (1945) a studiat la Paramecium aurela modul cum se produce segregarea la încrucişarea între două tipuri de indivizi : tipul “rezistent” care segregă în mediul înconjurător o substanţă toxică denumită paramecină, care nu aparţine tipului “sensibil ”. Capacitatea de a segrega paramecina se datoreşte unor particole kappa aflate în citoplasmă şi care se transmit pe linie maternă, lipsind complet la cele sensibile. 7.5. Gene extranucleare nelocalizate Pe lângă determinanţi genetici extranucleari localizaţi în diferite organite celulare există, de asemenea, o seamă de fenomene de ereditate extranucleară cărora nu li s-a descoperit suportul celular corespunzător. pentru aceste fenomene poate fi citată şi androsteriltatea citoplasmatică la porumb, sorg, ceapă, petunii etc. Androsterilitatea sau sterilitatea masculă face ca polenizarea străină să devină obligatorie, deoarece gametul mascul (polenul) este nefuncţional. Androsterilitatea duce la modificări profunde ale florii şi în special a organelor sexuale mascule (stamine, grăunciori de polen), favorizând apariţia polenului steril, incapabil de fecundare. Fenomenul androsterilităţii citoplasmatice a fost descoperit în 1904 de CORRENS la planta Satureja hortensis. Ulterior fenomenul androsterilităţii a fost remarcat la mai multe specii de plante : ceapă, porumb, in, sorg, sfecla de zahăr, grâu ş.a. studiul acestor plante au evidenţiat trei tipuri de androsteri

91

ereditari (fig. 7.1.) şi anume : citoplasmatică, nucleo-citoplasmatică şi nucleară.

Fig. 7.1.

Androsteriltatea nucleară (tipul I) este determinată de gene recesive localizate în nucleu (msms). Aceste plante nu se pot reproduce singure neavând polen şi de aceea pentru a le păstra ele se încrucişează cu plante androfertile heterozigote (Msms), obţinându-se în descendenţa F1, 50% plante homozigote androsterile (msms) şi 50% plante heterozigote (Msms) androfertile. Androsterilitatea citoplasmatică (tipul II) este determinată de gene localizate în citoplasmă. prin încrucişarea acestor plante androsterile (S), transmisă prin citoplasmă, cu plante normale fertile (F), în descendenţă domină androsteriltatea (S) transmisă prin citoplasmă. Ca urmare, plantele ce posedă acest tip de androsteriltate se reproduc numai pe cale vegetativă sau prin încrucişări cu alte plante androfertile. Sterilitatea masculă citoplasmatică poate fi transmisă de la un soi la altul prin încrucişări repetate, în care genitorul patern se foloseşte mereu soiul ce trebuie transformat. De exemplu, soiul de ceapă Crystal Wax poate fi transformat în soi androsteril prin încrucişarea cu soiul Roşu italian (cu androsterilitate citoplasmatică) (fig. 7.2.) Folosind ca genitor matern soiul Roşu italian şi ca genitor patern Crystal Wax se obţine în prima generaţie androsterilă, care este în ceea ce priveşte nucleul, 50% de tip Crystal Wax. retoîncrucişând această generaţie (F1) cu Crystal Wax, descendenţa va fi androsterilă dar cu nucleul în proporţie de 75% de tipul Crystal wax. repetând retroîncrucişarea mai multe generaţii se obţine o plantă care va fi androsterilă, dar cu genomul de la 92

Crystal Wax. Experienţa prezentată constituie o certitudine în ceea ce priveşte responsabilitatea plasmagenelor în expresia caracterului de androsterilitate.

Fig. 7.2.

Androsterilitatea citoplasmatică poate fi utilizată cu succes în producerea de seminţe hibride la speciile la care plantele F1 se cultivă pentru diverse organe vegetative, cum sunt rădăcinile, tulpinile, frunzele sau florile. Plantele hibride F1 sunt viguroase, prezentând organe vegetative bine dezvoltate. Androsterilitatea nucleo-citoplasmatică (tipul III) este determinată de interacţiunea unor factori ereditari, situaţi atât în nucleu, cât şi în citoplasmă. Acest tip de androsterilitate diferă în manifestare faţă de cea citoplasmatică prin aceea că descendentele plantelor androsterile nu sunt în mod obligatoriu androsterile. Prin încrucişarea plantelor androsterile ca genitori materni cu plante fertile (F) heterozigote (Rfrf) se obţine o descendenţă care în F1 este 50% androfertilă (F, Rfrf) şi 50% sterilă homozogotă (S, rfrf). În acest fel tipul de androsterilitate poate fi păstrat la descendenţi.

93

În sfârşit, dacă se încrucişează plante androsterile (S, rfrf) cu plante androfertile dar care nu au capacitatea de restaurare a polenului (F, rfrf) se obţine în F1 o descendenţă androsterilă şi homozigotă (S, rfrf), deoarece, după cum s-a văzut, androsterilitatea determinată de factori din nucleu se transmite ca un caracter minor. Acest tip aparţine de fapt androsterilităţii citoplasmatice. Androsterilitatea de tipul III (nucleo-citoplasmatic) este utilizat în producerea de hibrizi la porumb, sorg şi alte plante, având importanţă economică. 7.6. Caracteristicile eredităţii citoplasmatice În general, fenomenul eredităţii citoplasmatice se caracterizează prin : - transmitarea caracterelor în alte proporţii decât cele mendeliene, şi anume în mod uniparental, adică de la părintele care participă cu cea mai mare cantitate de citoplasmă (fig.7.3.);

Fig. 7.3.

94

-

-

-

manifestarea în F1 a caracterelor genitorului matern, indiferent de constituţia genetică a organismelor respective ; fenomenul de linkage este absent vis-à-vis de grupele reprezentate de cromozomii nucleari, fapt ce face să nu se poată întocmi hărţi genetice pentru genele necromozomiale ; manifestarea unor caractere fenotipice depinzând de constituţia genotipică a organismului matern, independent de genotipul propriu ; posibilitatea apariţiei mutaţiilor spontane sau induse artificial la genele extranucleare.

O seamă de cercetări relativ recente au demonstrat existenţa în citoplasmă a unui aparat genetic propriu, realtiv independent de cel nuclear. Deosebirile dintre ADN nuclear şi ADN din organitele celulare se manifestă în imposibilitatea obţinerii de hibrizi moleculari între ADN nuclear şi ADN din organite.

CAPITOLUL VIII 8. Reproducerea plantelor de cultură 8.1. Sistemele de reproducere şi implicaţiile lor genetice O variabilitate genetică corespunzătoare nu poate fi creată fără existenţa reproducerii sexuate. Majoritatea plantelor de cultură se reproduc pe cale sexuată, prin fuziunea a doi gameţi identici sau diferiţi din punct de vedere genetic, pentru a da naştere unui zigot. În general, suprafaţa receptoare a stigmatului în acel moment este aptă de a primi polen de la planta care-l poartă (autopolen), sau polenul plantelor vecine (alopolen). În această situaţie, în mod normal, sunt realizate autofecundări şi fecundări încrucişate. În cele mai multe cazuri reglările biologice impun o predominanţă a unuia sau a celuilalt sistem de polenizare, iar în funcţie de natura genetică a gameţilor vor rezulta indivizi homozigoţi sau heterozigoţi (SAVATTI, 1983). După modul în care are loc polenizarea şi fecundarea, speciile se împart în două grupe: autogame şi alogame. Trebuie menţionat faptul că autogamia şi alogamia nu este perfectă, în natură existând specii ce manifestă şi un anumit grad de auto- sau alogamie.

95

În unele cazuri, speciile au scăpat sexualităţii prin adaptarea unor regimuri de reproducere asexuată, sau chiar pe calea multiplicării vegetative. 8.2. Bazele genetice ale plantelor autogame Speciile autogame au în general flori hermafrodite, organele sexuale ajungând în acelaşi timp la maturitate (homogamie). Ele se reproduc prin autogamie naturală, adică prin unirea a doi gameţi sexuali diferiti, dar identici genetic, formaţi pe acelaşi individ, cel mai adesea în aceeaşi floare. Un mare număr de specii se reproduc prin autopolenizare. Sunt considerate autogame speciile la care fecundarea străină nu depăşeşte în mod obişnuit 4%, cum sunt: grâul, orzul, ovărul, orezul, inul, mazărea, soia, fasolea, tutunul, tomatele ş.a. Incidenţa alogamiei la speciile autogame depinde de genotip, factorii de mediu şi interacţiunea dintre aceştia. Procentul tinde să crească în condiţiile care favorizează, mai ales, perioada prelungită de înflorire şi de deschidere a florilor. Mecanismele care asigură autogamia pot fi riguros fixate la speciile cleistogame, la care florile nu se deschid înaintea polenizării. Anterele, situate la nivelul stigmatului, asigură polenizarea în interiorul corolei. În această categorie de specii, menţionăm violetele şi numeroasele specii floricole spontane de primăvară, care emit şi flori de vară, cleistogame, mai mici, destinate să producă seminţe. În numeroase cazuri, florile fără a fi cleistogame, nu se deschid decât după ce fecundaţia a fost realizată; este cazul grâului unde inflorescenţele sunt închise în glume, iar florile în glumele, a căror deschidere se realizează tardiv. La fel, în cazul inului, fecundaţia are loc înaintea deschiderii florilor. Un alt dispozitiv floral, îl prezintă leguminoasele autogame, la care, în carenă este închis pistilul, înconjurat de cele zece stamine. La Solanaceae, la tomate, florile sunt aparent casmogame, adică floarea lor posedă o corolă deschisă în momentul fecundării, însă pistilul, în cursul creşterii sale, trece prin tubul format din anterele sale (DEMARLY, 1977). După cum am mai menţionat, descendenţii proveniţi de la plantele autogame homozigote, sunt identici din punct de vedere genetic, toate variaţiile sunt datorate modificaţiilor. În natură se pot întâlni rar linii pure; cultivarele autogame sunt în majoritatea cazurilor constituite dintr-un amestec de linii pure. Datorită autogamiei, ele prezintă o omogenitate şi o stabilitate mai pronunţată decât cultivarele alogame. 8.2.1. Teoria liniilor pure (Structura genetică a descendenţei la plantele autogame) 96

Teoria a fost elaborată de botanistul danez JOHANNSEN în 1903, plecându-se de la supoziţia că există o variabilitate şi la plantele autogame, aparţinând aceleaşi varietaţi. Pentru a stabili acest fapt, el a aplicat metoda selecţiei individuale la cultivarul de fasole Princess. Descendenţii plantelor alese au fost diferiţi în ceea ce priveşte înălţimea, perioada de vegetaţie, mărimea seminţelor şi alte caractere. JOHANNSEN a diferenţiat 19 tipuri de plante, foarte diferite între ele, numindu-le linii. Desecendenţii acestor linii au fost foarte uniformi din punct de vedere genetic, capabili să transmită această uniformitate şi descendentele lor, fapt ce a făcut să fie denumite linii pure. JOHANNSEN a fost interesat să estimeze efectele selecţiei în cadrul unei linii pure. El a împărţit seminţele unei linii pure în trei grupe, mari, mijlocii şi mici. Cele care au provenit din seminţe mari produc şi seminţe mijlocii şi mici. Acelaşi lucru s-a întâmplat şi în cazul descendenţelor provenite din celelalte categorii de sămânţă. Privitor la producţia de seminţe pe unitatea de suprafaţă, cele trei grupe de descendenţi au produs aproximativ aceeaşi cantitate de sămânţă. Rezultatele obţinute pe parcursul a şase ani de selecţie individuală, în cadrul unei linii pure, au arătat că nu apar diferenţe semnificative în greutatea medie a seminţelor care provin din seminţe mari sau mici. JOHANNSEN a concluzionat că orice încercare de selecţie în cadrul unei linii pure este ineficientă. Rezultatele sale sunt în concordanţă cu constituţia genetică a liniilor pure. O linie pură este constituită din descendenţii unei singure plante homozigote şi toţi indivizii sunt homozigoţi, având acelaşi genotip. Homozigoţia lor este rezultatul autopolenizării, a unirii gameţilor de sex opus cu alele identice din punct de vedere genetic (tabelul 8.1.). Tabelul 8.1. Efectele selecţiei pe parcursul a şase generaţii, într-o linie a varietăţii Princess (JOHANNSEN, după ALLARD, 1969) Anul de cultură

1902 1903 1904 1905 1906 1907

Greutatea medie a seminţelor parentale mici

mari

60 55 50 43 46 56

70 80 87 73 84 81

Diferenţa

10 25 37 30 38 25

97

Greutatea medie a seminţelor

descendenţilor mici

mari

63,15 75,19 54,59 63,55 74,38 69,07

64,85 70,88 56,68 63,64 73,00 67,66

Diferenţa

+1,70 -4,31 +2,09 -0,09 -1,38 -1,41

Din moment ce toţi indivizii dintr-o linie pură sunt homozigoţi, neexistând o variabilitate genetică în cadrul lor, selecţia într-o linie pură va trebui să fie inevitabil ineficientă. Variabilitatea care se observă la o linie pură se datorează efectului factorilor de mediu, selecţia putând avea efect numai dacă materialul ales posedă o variabilitate heritabilă (MAYO, 1980; ARDELEAN, 1986). În mod normal, o linie pură nu este absolut uniformă şi permanent homozigotă pentru toate caracterele. În silvicultură obţinerea de linii pure la speciile hermafrodite - tei, salcâm, ulmi, cireşi ş.a. se dovedeşte dificilă, deoarece, în natură autogamia acestora nu este perfectă, iar vârsta înaintată a maternităţii lor limitează mult posibilităţile de selecţie. Schimbările heritabile într-o linie pură au loc datorită mutaţiilor şi polenizării libere. Mutaţiile spontane au loc în mod regulat cu o anumită frecvenţă/genă/generaţie, iar un anumit procent de polenizare liberă este inevitabilă, fenomene ce pot constitui surse de variabilitate genetică în linia respectivă. O altă sursă de variabilitate într-o linie pură poate fi dată de heterozigotia reziduală, rămasă în urma hibridării formelor parentale. În cazul în care selecţia naturală va favoriza heterozigoţii, ei vor manifesta o productivitate mai mare, dând mai mulţi descendenţi, fenomen ce va fi reflectat în menţinerea mai îndelungată a heterozigotiei decât se aşteaptă în mod teoretic. Menţinerea variaţiei genetice în cadrul unei linii autogame, va depinde pe lângă avantajul dat de nivelul heterozigotiei şi de avantajul competitiv (MAYO, 1980). Se poate afirma că toate sursele de variabilitate genetică dintr-o linie pură, pot să se manifeste cu o frecvenţă foarte scăzută, aşa că o asemenea linie va prezenta un înalt grad de uniformitate în ansamblul ei. Se poate concluziona că selecţia aplicată într-o singură varietate a unei specii autogame (grâu, orz, soia etc.) va fi eficientă numai în cazul în care varietatea nu este constituită dintr-o linie pură, ci din câteva linii diferite în unele caractere. Odată ce se obţine o linie pură, selecţia în cadrul ei va fi ineficientă, fiind mai profitabil să se încerce o recombinare genetică prin hibridare, sau prin alte metode convenţionale sau neconvenţionale, decât să se conteze pe schimbări genetice ce pot avea loc într-o perioadă îndelungată de timp. Trebuie menţionat faptul că, timp de mulţi ani, s-a pus accentul pe crearea cultivarelor tip linie pură, considerate extrem de uniforme şi performante. În ultimele decenii, s-a ajuns la concluzia că o uniformitate excesivă nu este necesară, din contra, uneori este de nedorit. Cultivarele tip linie pură, extinse pe areale geografice întinse, au manifestat o vulnerabilitate genetică evidentă. Această schimbare de concepţie se bazează pe observaţia că un soi ce se caracterizează printr-o variabilitate genetică mai pronunţată are o mai mare adaptabilitate ecologică, realizând producţii mai stabile în condiţii climatice schimbate (POEHLMAN, 1989). 98

8.2.2. Semnificaţia genetică a hibridării la plantele autogame Încrucişarea sau hibridarea, este rezultanta fuziunii gameţilor genetic diferiţi, rezultând organisme hibride, heterozigote pentru una sau mai multe gene alele. În cazul unui organism autogam, după hibridare, în urma autopolenizării, homozigotia se instalează relativ rapid (fig. 8.1.). Se constată că în F1 toţi indivizii sunt heterozigoţi având constituţia genetică Aa. Plantele vor avea două tipuri de gameţi, A şi a. Autofecundarea în F1 oferă şanse egale fiecărui gamet de a se uni cu fiecare tip de gamet. Rezultanta acestui eveniment este generaţia F2, constituită din genotipurile: 25% AA:50% Aa:25% aa. Proporţia genotipurilor homozigote (AA şi aa) faţă de cele heterozigote (Aa) este 50%:50%. În generaţiile următoare de autopolenizare indivizii heterozigoţi vor produce descendenţi homo şi heterozigoţi (AA şi aa, respectiv Aa), numărul homozigoţilor crescând în fiecare generaţie de autofecundare cu 1/2 din diferenţa dintre cele două generaţii precedente, în timp ce procentul heterozigoţilor scade cu 1/2. După cinci generaţii de autofecundare vor rezulta 96,9% indivizi homozigoţi, iar după zece generaţii 99,9% (tabelul 8.2.). F1 Aa 25%AA 25%AA 37,5%AA 43,75%AA 46,875%AA

F2 F3 F4 F5 F6

50%Aa 12,5%AA 6,25%AA 3,125%AA 1,562%AA

25%Aa 12,5%Aa 6,26%Aa 3,125%Aa

12,5%aa 6,25%aa 3,125%aa 1,562%aa

25%aa 25%aa 37,5%aa 43,75%aa 46,875%aa

Tabelul 8.2. Fig. 8.1. Proporţia genotipurilor homozigote şi heterozigote după câteva generaţii de autofecundare (după POEHLMAN, 1989)

Efectul autofecundării asupra unei populaţii hibride, constituită din genotipuri heterozigote de tipul Aa (după BOROJEVIĆ, 1990)

Generaţia 0 1 2 3 4 5 10

Genotipurile AA 1/4 3/8 7/16 15/32 31/64 1023/2048

Aa 1 2/4 2/8 2/16 2/32 2/64 2/2048

aa 1/4 3/8 7/16 15/32 31/64 1023/2046

99

Numărul heterozigoţilor

Procentul homozigoţilor

1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/024

0 50,0 75,0 87,5 93,8 96,9 99,9

: n

(2n-1)2n-1

2/2n-1=1/2n

(2n-1)2n+1

1/2n

Procentul de homozigoti

Dacă formele parentale diferă printr-un număr mare de gene alele, homozigoţia va fi realizabilă relativ mai tardiv. În cazul diferenţelor de 100 de perechi de gene, populaţia va avea 50% de indivizi homozigoţi, pentru toate genele, după şapte generaţii de autopolenizare (fig. 8.2.)

Generaţii de consangvinizare

Fig. 8.2. Procentul de indivizi homozigoţi după mai multe generaţii de autofecundare, când numărul perechilor de gene ce se moştenesc independent este de 1,5,10,20,40 sau 100 (după ALLARD, 1960)

Procentul indivizilor homozigoţi (ho)/generaţie, după hibridare, poate fi calculată cu formula: ho = (1-he)n, unde (he) este procentul indivizilor heterozigoţi şi (n) este numărul de loci prin care diferă genitorii. Având în vedere că numărul heterozigoţilor scade cu jumătate în fiecare generaţie 100

de autofecundare, rezultă că he = (1/2)g, unde (g) reprezintă numărul generaţiilor de autofecundare. Pentru exemplificare, să considerăm că părinţii diferă în doi loci (n), procentul indivizilor homozigoţi după trei generaţii de autofecundare (g) va fi:

ho = (1 – (1/2)3)2 = 0,767 = 76,7% Chiar dacă există diferenţe de 40 de loci, peste 50 % din linii vor fi homozigote în F3 pentru toţi locii; în generaţia F 10 diferenţele în ceea ce priveşte numărul de loci nu mai sunt relevante (vezi fig. 8.2.). Formula menţionată, este aplicabilă numai în cazul în care toate genotipurile au aceeaşi rată de supravieţuire şi dacă genele nu sunt linkate. 8.2.3. Moştenirea caracterelor calitative Caracterele calitative sau alternative sunt acelea a căror apariţie este condiţionată de acţiunea genelor cu un efect puternic, aşa numitele gene majore. Culoarea şi forma florilor, fructelor, frunzelor şi altor părţi din plantă şi, uneori, chiar şi rezistenţa la patogeni pot fi încadrate în caracterele calitative. Din moment ce nu există cultivare ideale care să posede combinaţii de gene şi caracteristici satisfăcătoare pentru o lungă perioadă de timp, apare necesitatea creării în mod continu, de noi recombinări genetice şi pe baza lor, obţinerea de cultivare cu caracteristici noi, mai valoroase. Pentru exemplificare, să considerăm ca obiectiv de realizat obţinerea unui cultivar de orz cu două rânduri, care să posede rezistentă la rugină. Pentru aceasta se presupune că ne stau la dispoziţie un soi de orz de două rânduri, sensibil la rugini şi o varietate de orz (de şase rânduri) rezistentă la rugini. Se ştie că locusul genelor pentru structura spicului este localizat într-un singur cromozom şi că gena care determină apariţia spicului cu două rânduri de boabe, este dominanta (D), faţă de gena care determină apariţia a şase rânduri de boabe (d). Locusul genelor pentru rezistenţă este dominantă (R), faţă de gena ce marchează susceptibilitatea la rugini (r).

101

Dacă varietatea de orz susceptibilă la rugini este utilizată ca formă maternă, pentru a preveni autofecundarea, se efectuează castrarea manuală sau aplicarea unui gametocid. Planul de hibridare va fi următorul: DDrr × ddRR

P1 gameţi F1

P2

Dr × dR DdRr

Se constată că în generaţia F1 au apărut plante rezistente la rugini. Având în vedere că părinţii diferă în două perechi de gene alele, generaţia F 1 este heterozigotă, segregând în F2, după următorul model mendelian:

F1 gameţi ♀

Dd Rr×autofecundat DR Dr

dR

Dr

DR

DDRR

DDRr

DdRR

DdRr

Dr

DDRr

DDrr

DdRr

Ddrr

dR

DdRR

DdRr

ddRR

ddRr

dr

DdRr

Ddrr

ddRr

ddrr

♂

Din cele 16 combinaţii posibile, 9/16 din plante vor poseda combinaţia de gene dorite, rezistenţa la rugini şi două rânduri de seminţe. Fenotipul celor 9/16 combinaţii nu vor avea acelaşi genotip. Numai 1/16 va fi homozigot pentru ambele perechi de gene dominante (RRDD). Având în vedere că genele ce determină apariţia plantelor cu două rânduri şi gene pentru rezistentă sunt dominante, faţă de alelele lor recesive, starea homozigotă nu va putea fi separată din punct de vedere fenotipic de cea heterozigotă. De aceea, în generaţia F2 apare necesitatea efectuării alegerii tuturor plantelor rezistente şi cu două rânduri (D-R-) şi numai în generaţia F3 va fi posibilă selecţia genotipurilor pentru ambele caractere 102

dorite, care nu vor segrega în această descendenţă în ceea ce priveşte caracterele (DDRR). Dacă generaţia F4 nu segregă, se poate considera că s-a obţinut o linie de orz de două rânduri şi rezistenţa la rugini. Această linie multiplicată în următoarele generaţii, dacă va manifesta o calitate şi producţie satisfăcătoare, se poate considera că s-a obţinut un cultivar nou. Deoarece s-a urmărit îmbinarea într-un singur genotip a două gene majore, frecvenţa unor astfel de fenotipuri în F 2 a fost mult mai mare decât al altor fenotipuri, 9/16 din 16/16. Datorită acestui fapt, nu apare necesitatea cultivării unei populaţii numeroase de plante F 2, pentru a găsi recombinarea favorabilă a genelor. De exemplu, o populaţie de 300 de plante va conţine 9/16×300 = 168 plante rezistente şi cu două rânduri, din care 18 vor fi DDRR (1/16×300). Cazul prezentat poate fi considerat cel mai simplu exemplu. În practică, de obicei, se urmăreşte obţinerea recombinărilor utilizând trei sau mai multe caractere. Spre exemplificare, să considerăm că se urmăreşte obţinerea unui cultivar de orz cu două rânduri (DD), rezistent la rugini (RR) şi cu spicul erect (nn). În acest caz, planul de hibridare va fi: P1 gameţi F1

DDrrnn

×

ddRRNN

P2

Drn×dRN DrRrNn

În generaţia F1 plantele vor prezenta câte două rânduri de boabe, rezistenţă şi spic erect. Pentru a se realiza recombinările dorite, generaţia F1 trebuie cultivată fără nici o intervenţie. Plantele F 1, cu constituţia genetică DdRrNn, vor produce opt tipuri de gameţi: DRN,DRn, DrN, Drn, dRN, dRn, drN, drn. Aceşti gameţi pe baza recombinărilor întâmplătoare vor produce 64 combinaţii în F2. Dintre acestea, 9/64 vor prezenta recombinarea D – R –nn. În continuare plantele de orz rezistente şi cu spicul erect vor trebui reţinute şi supuse în continuare unei selecţii până se va ajunge la starea completă de homozigoţie, pentru toate caracterele. Din punct de vedere teoretic, în cazul în care avem de a face cu trei caractere şi cu o recombinare a genelor cu o frecvenţă de 9/64, este necesar să avem un număr suficient de plante pentru a se asigura combinarea de gene dorită. În cazul unei populaţii de 300 de plante, în F 2 frecvenţa recombinării aşteptate va fi de 9/64×300 = 42 plante. Acest 103

număr poate fi considerat prea mic deoarece pierderea incidentală a câtorva tipuri dorite, vor scădea şansele de succes. Datorită acestui fapt este necesară cultivarea unei populaţii de circa 1000 plante în F2, pentru a avea certitudinea că se va asigura un număr aproximativ de 100 plante cu recombinarea dorită (9/64×1.000). 8.2.5. Moştenirea caracterelor cantitative Moştenirea caracterelor dorite, cum sunt talia plantelor, numărul de seminţe, conţinutul în proteine, procentul de ulei, producţia de SU, producţia de seminţe etc. aparţin grupului de caractere cantitative, sau metrice. Aceste caractere sunt controlate de câteva gene, fiecare contribuind la formarea şi expresia caracterului în cauză, acţionând în mod obişnuit aditiv. Asemenea gene, datorită efectelor individuale mai puţin pronunţate se numesc gene minore. Din moment ce ele acţionează împreună, se numesc şi poligene. Formarea şi expresia unui caracter cantitativ depinde şi de factorii de mediu. Aceşti factori sunt capabili să modifice efectele poligenelor. Datorită acestui fapt, pot exista diferenţe privind înălţimea la o linie consangvinizată, numărul de seminţe, conţinutul în proteină şi, în special producţia totală. Din momentul în care o linie consangvinizată este practic homozigotă lipsindu-i variabilitatea genetică, orice variaţie ce se manifestă se datoreşte factorilor de mediu şi se exprimă sub forma unei distribuţii cu frecvenţă normală. O asemenea manifestare a caracterelor cantiative complică lucrările de selecţie după hibridare, deoarece variabilitatea datorată şi factorilor de meniu este menţinută în descendenţă, pe când succesul în ameliorare depinde de efectul genetic şi heritabilitatea caracterului selecţionat. Un exemplu de moştenire a unui caracter cantitativ îl constituie transmiterea caracterului de talie, la grâu, ilustrându-se efectul genelor minore şi apariţia variabilităţii. Descendenţii F1 ai varietăţii de grâu M910, cu o înălţime medie a paiului de 131 cm şi a varietăţii Acciaio, cu 57 cm, au o înălţime medie de 102,7 cm, ceea ce evidenţiază dominanţa parţială a părintelui mai înalt. Trebuie menţionat că nu toate plantele F 1 au o talie de 103 cm, dar prezintă o variabilitate mai pronunţată decât cele două forme parentale. În generaţia F2 valoarea medie a înălţimii tulpinilor a fost de 84 cm, intermediară între cei doi genitori. Variabilitatea în generaţia F 2 a fost continuă şi mai mare decât la formele genitoare şi generaţia F 1. 104

Variabilitatea în F2 se datoreşte, în principal, efectului segregării genelor. După cum s-a menţionat, acţiunea genelor pentru determinarea unui caracter cantitativ sunt, de obicei, aditive, iar când efectele ambelor gene sunt aditive se formează un fenotip care reprezintă suma efectelor pozitive şi negative ale genelor individuale. Anumite gene pentru caracterele cantitative pot exercita un efect dominant. În acest caz, valoarea medie a generaţiei F 1 este apropiată de valoarea medie a oricărui părinte şi distribuţia frecvenţelor în generaţia F2 nu va manifesta o variaţie simetrică continuă, ci una asimetrică, conducând la părintele care posedă genele dominante. În cazul dominanţei complete, valoarea fenotipică a generaţiei F1, egalează valoarea unuia dintre părinţi (BOROJEVIĆ, 1990). Cheia succesului în procesul de selecţie este dată de variabilitatea genetică ce se manifestă în generaţia F2. În exemplul dat, privind înălţimea tulpinii, variabilitatea generaţiei F1 a fost mare. Distribuţia frecvenţelor a oferit posibilitatea selecţionării genotipurilor cu o înălţime a tulpinilor diferită de cea a genotipului B, până la înălţimea tulpinii între 70 şi 90 cm, suficient de rezistente la cădere. Cercetările din ultimele decenii sub aspect citogenetic şi a geneticii moleculare, au evidenţiat faptul că nu toate caracterele cantitative sunt controlate exclusiv de gene minore; unele dintre ele pot fi controlate şi de gene majore. Au fost evidenţiate un număr de zece gene majore care sunt implicate în controlul înălţimii tulpinii la grâu, caracter tipic cantitativ. Un exemplu în acest sens, îl reprezintă genele Rht, găsite la soiul japonez Norin 10 şi care transmite fenomenul de reducere a taliei (ALLAN, 1970). Studiile lui Gale şi Youssefian (1985) efectuate pe plante monosomice, au evidenţiat că genele Rht1 şi Rht3 sunt localizate pe cromozomul 4A, Rht2 şi Rht10 pe 4D şi Rht8, pe 2D. Gene majore au fost identificate ca influenţând vernalizarea (Vrn), stadiul fotoperiodic (Ppd) şi rezistenţa la iernare (PUGSLEY, 1983; MAYSTRENKO, 1978). Poziţia frunzelor este controlată de cel puţin două gene majore, poziţia orizontală fiind dominantă faţă de cea erectă (BOJOVIĆ, 1990). Din cele menţionate reiese faptul că succesul în ameliorarea unor caractere cantitative depinde nu numai de relaţia genetică şi cea indusă de mediu, dar şi de componentele variabilităţii genotipice. 8.3. Bazele genetice ale plantelor alogame

105

Mecanismele fecundării încrucişate duc la menţinerea stadiului de heterozigoţie, deci a unei mai bune vigori hibride. În măsura în care, pentru o specie, această vigoare reprezintă un avantaj selectiv, toate mutaţiile care favorizează alogamia vor avea o puternică valoare selectivă. La speciile alogame, polenul poate fi răspândit de către insecte (plante entomofile), vânt (plante anemofile), sau în unele cazuri de apă. La numeroase plante monoice sau hermafrodite, regimul de alogamie este asigurat de un decalaj existent între organele sexuale mascule şi femele. Această dichogamie ia două forme: • protogenie, când organul femel este receptiv înainte de dehiscenţa anterelor aceleaşi flori, ca în cazul unor graminee; • protandria, când organele mascule sunt apte pentru reproducţie înainte ca stigmatul să fie receptiv. În cazul în care nu există un decalaj între maturarea celor două sexe, apare un alt tip de mecanism genetic, incompatibilitatea, care frânează mai mult sau mai puţin, creşterea tubului polinic în cazul autopolenului, în raport cu alopolenul. În natură se găsesc diferite dispozitive biologice a căror existenţă se opune autofecundării, datorită unor relative avantaje pe care le prezintă alogamia, faţă de autogamie. Principalul avantaj este menţinerea în cadrul populaţiilor alogame a unei mai mari rezerve de variabilitate, datorită în principal prezenţei genelor recesive, mai puţin favorabile în condiţii obişnuite, dar care pot deveni favorabile în condiţii schimbate. Acest fapt determină „supleţea evolutivă” a populaţiilor alogame (NAGHIU, 1978). 8.3.1. Incompatibilitatea Pe lângă mecanismele morfologice şi mecanice care asigură polenizarea liberă, mai există şi un mecanism fiziologic, condiţionat genetic, care generează efectul de incompatibilitate. Acest fenomen poate fi definit ca o reacţie intim legată de polen şi ţesuturile femele, înaintea fecundaţiei. Incompatibilitatea sexuală poate fi definită că incapacitatea organismelor hermafrodite de a produce zigoţi, cu toate că gameţii masculi şi femelei sunt normali fertili, putând în anumite condiţii să fuzioneze. Această inhibiţie, sau împiedecarea fecundării în cadrul sistemului de încrucişare sexuală se bazează pe mecanisme fiziologice dirijate de genele sau alelele incompatibilităţii şi nu exclude influenţa condiţiilor de mediu asupra procesului de reacţie care vizează exprimarea genelor implicate. 106

Incompatibilitatea se împarte în două categorii: - incompatibiltatea intraspecifică; - incompatibiltatea interspecifică. • Incompatibilitatea intraspecifică sau autoincompatibilitatea este un sistem homogenic, determinat de alelele multiple ale unui locus. În procesul fecundării, dacă ambii parteneri au alele identice de incompatibilitate, rezultă o reacţie de incompatibilitate. • Incompatibilitatea interspecifică este un sistem heterogenic, bazându-se pe cel puţin două gene situate în locusuri diferite. Acest sistem constituie o barieră în apariţia de rase şi specii noi. Uneori, sistemele genetice care impun polenizarea încrucişată pot fi asociate cu caracteristici morfologice care facilitează acest tip de polenizare. După locul, respectiv perioada de timp a reacţiei de incompatibilitate, SEARS (după LISKENS şi KROH, 1976), o clasifică astfel: • inhibarea se produce înainte sau la germinarea polenului, la suprafaţa stigmatului; • tubul polinic este stopat în procesul de creştere, când se găseşte în ţesutul stilar; • reacţia de incompatibilitate se produce în momentul intrării tubului polinic în ovar; • ca urmare a reacţiei de incompatibilitate, după cariogamie, intervine avortarea ovulei fecundate, sau a embrionului. Mecanismul autoincompatibilităţii a fost confirmat în cazul a peste 3.000 de specii, aparţinând la circa 68 de familii, mai ales la cele cultivate din familia Cruciferae, Saxifragaceae, Rosaceae, Solanacea, Compositae şi Liliaceae (BREWBAKER, 1959; FRANKEL şi GALUN, 1977). LEWIS (1954) a clasificat incompatibilitatea plantelor în două grupe mari: heteromorfică şi homomorfică. 8.3.1.1. Incompatibilitatea heteromorfică Existenţa variaţiei structurii florale din cadrul aceleaşi specii, a fost aprofundată după publicarea studiilor lui HILDEBRAND în 1869 şi a observaţiilor lui DARWIN, în 1877, constatându-se existenţa unor relaţii între variaţiile florale şi obstrucţionarea autopolenizării. Cu toate că heteromorfismul poate induce un număr mare de caractere (lungimea anterelor, mărimea grăunciorilor de polen, lungimea stilului, suprafaţa stigmatică), incompatibilitatea heteromorfică se 107

bazează pe diferenţa de lungime a stilului şi stigmatului, fenomen denumit heterostilie. LEWIS (1954) a denumit tipul de floare cu stilul lung şi antere scurte, pin, iar celălalt tip de floare cu antere lungi şi stil scurt, thrum. Constituţia genetică a tipului pin este ss, iar cea a tipului thrum Ss, S fiind dominant faţă de s (fig. 8.4.).

Fig. 8.4. Sistemul heteromorfic de incompatibilitate (după BRIGGS şi KNOWLES, 1967)

Polenizările sunt posibile numai între următoarele genotipuri: (1) (2)

pin (ss) 1 pin (ss) thrum (Ss) 1 pin (ss)

x :

thrum (Ss) 1 thrum (Ss)

x :

pin (ss) 1 thrum (Ss)

Combinaţiile pin x pin sau thrum x thrum sunt incompatibile, ceea ce înseamnă că genotipul SS nu apare. Importanţa acestui tip de incompati-bilitate este minoră pentru procesul de ameliorare. 108

8.3.1.2. Incompatibilitatea homomorfică La angiosperme, înainte ca gametofitul mascul (polenul), să întâlnească gametofitul femel, acesta trebuie să pătrundă prin ţesutul sporofit (pistilul), pentru a ajunge la acesta din urmă. Pistilul constituie secţiunea unde, cu mici excepţii, apare fenomenul de incompatibilitate. Mai mult, din moment ce pistilul este un ţesut diploid sporifitic, reacţia de incompatibilitate este controlată genetic de genom, sau sporofitic. Pe de altă parte, gametofitul mascul (polenul) poartă cel puţin câteva componente din sporofitul pe care care s-a dezvoltat. El poartă totodată şi citoplasma părintelui sporofit. Astfel, reactivitatea incompatibilităţii polenului poate fi controlată genetic sau de genomul gametofitului patern. Modificarea genetică, în declanşarea reacţiilor de incompatibilitate sunt legate de procesele reglării morfogenezei grăunciorilor de polen. Se distinge o condiţie numită gametofitică, în care specificitatea fiecărui grăuncior de polen este determinată de alela Sx, pe care o conţine. Din contra, se consideră condiţia sporofitică, cazul în care toţi grăunciorii de polen ale aceleaşi plante, au aceeaşi specificitate, determinată de genotipul SxSy ale acesteia. A. Incompatibilitatea gametofitică Acest tip de incompatibilitate a fost menţionată pentru prima dată la Nicotiana sanderae, de către EAST şi MANGELSDORF (după BRIGGS şi KNOWLES, 1967) pentru ca ulterior să fie semnalată şi la trifoiul roşu, trifoiul alb, sfecla de zahăr, tutun, cartof, ierburi perene etc. Posibilitatea polenului de a fecunda ovula depinde de o serie de alele la un singur locus, denumite S1,S2,S3…..Sn. Ţesutul stilar diploid va avea oricare dintre aceste două alele din serie, dar niciodată aceeaşi alelă. Grăunciorul de polen va avea numai o alelă, deoarece este haploid. Dacă ţesutul stilar conţine o alelă identică cu cel al grăunciorului de polen, atunci tubul polinic nu poate penetra în stigmat şi polenizarea nu poate avea loc, deoarece creşterea acestuia este inhibată. Polenizarea poate avea loc dacă alela din grăunciorul de polen diferă de cel al stigmatului şi al ovarului. Capacitatea de fecundare a polenului depinde de propriul lui genotip. De aceea, încrucişarea plantelor cu o constituţie genetică diferită poate fi: (1) complet incompatibilă; (2) jumătate incompatibilă; (3) complet 109

compatibilă (tabelul 8.3.). Această formă de incompatibilitate este ilustrată şi în figura 8.5. Dacă o plantă cu genotipul S1S2 se autopolenizează, sau se polenizează cu polen de la o altă plantă, nucleii grăunciorilor de polen pot să conţină fie alela S1 , fie alela S2. Întrucât ambele alele sunt prezentate în ţesutul stilului, tubii polinici nu străbat sau străbat în cazuri rare stilul, într-un timp destul de lung pentru a nu ajunge la timp la ovule, pentru a avea loc fecundaţia (fig. 8.5.A). Tabelul 8.3. Trei nivele de încrucişare compatibilă pentru sistemul de autoincompatibilitate gametofitică şi sporofitică (după BRIGGS şi KNOWLES, 1967) Gamet mascul Sistemul

Încrucişare gameţi Femel Mascul

V ia b il

N e v ia

Genotipuri le descendenţ ei

b

Gametofitic Ambele plante cu acelaşi genotip: polen neviabil Plante ce diferă printr-o alelă: jumătate din polen viabil

S1S2x S1S2 S1S2x S1S3 S1S3x S1S2

n u S

il t o at e S

3

1

S

S

2

1

nici unul S1S3,S2S3 S1S2, S2S3

S 3, S

Plante ce diferă în ambele alele: tot polenul viabil

4

S1S2x S3S4 S3S4x S1S2

Sporofitic* Ambele plante cu acelaşi genotip: polen neviabil

S1S2x S1S2

Plante ce diferă printr-o alelă: polen viabil şi neviabil S1S2x S1S2 S3S4x S1S2

110

S 1, S 2

n u n u S 1, S 2

n u n u t o at e S 2, S 3

n u

S1S3, S2S3, S1S4, S2S4 S1S3, S2S3, S1S4, S2S4

nici unul

nici unul S1S2, S2S3, S2S2,S2S3

Plante ce diferă în ambele alele: polen viabil S 3, S 4

S1S2x S3S4 S3S4x S1S2 *

S 1, S 2

n ic i u n u l n ic i u n u l

S1S3, S2S3, S1S4, S2S4 S1S3, S2S3, S1S4, S2S4

presupunând

Fig. 8.5. Sistemul gametofitic de incompatibilitate A – incompatibilitate totală; B – incompatibilitate parţială; C – compatibilitate totală

Dacă planta cu genotipul S1S2 este polenizată cu polenul de la o plantă cu genotipul S3S4, atât tubul polinic cu alela S3, cât şi cel cu alela S4, vor străbate stilul, fecundaţia realizându-se normal (fig. 8.5. C). După cum s-a mai menţionat, incompatibilitatea poate fi definită ca o reacţie intim legată de polen şi de ţesuturile femele înainte de fecundaţie. Aceasta este un linkat conţinând cel puţin trei gene care determină această reacţie (LEWIS, 1949; BREWBAKER, 1954; PANDEY, 1967; De NETTANCOURT; TAYLOR, 1985). Una dintre gene, de specificitate, codifică un polipeptid specific pentru fiecare alelă S; acelaşi polipetid se regăseşte în stil şi în polen. O altă genă, adiacentă, va antrena pentru polen, activitatea factorului de specificitate. O a treia genă va fi activatoare pentru stil. 111

Reacţia de incompatibilitate se derulează după cum urmează: Contactul tub polinic – ţesut femel va provoca declanşarea celor două gene activatoare încât locusul de specificitate a polenului şi a stilului vor codifica polipetida lor specifică (fig. 8.6.)

Fig. 8.6. Derularea reacţiei de incompatibilitate (DEMARLY, 1977)

În cazul în care o proteină specifică se localizează în extremitatea de creştere a tubului polinic şi se transformă într-un dimer sau un tetramer inhibitor, pe care dacă îl găseşte şi în ţesutul femel va provoca fenomenul de incompatibilitate (LISKENS, 1964; FRANKEL şi GALUN, 1977; DEMARLY, 1977). Particularităţile incompatibiltăţii gametofitice se pot rezuma la următoarele: • se manifestă în general, la speciile la care grăunciorul de polen este binucleat (Nicotiana, Trifolium, Petunia, Prunus ş.a.). • ereditatea fenomenului este condiţionată în cele mai multe cazuri, monofactorial. • în locusul S pot exista un număr foarte ridicat de alele, de la 700 la 800 la Trifolium pratense, 64 la Trifolium repens. Această 112

caracteristică îşi găseşte explicaţia considerând locusul S ca fiind un linkat. În unele cazuri, la ierburi, genetica incompatibilităţii gametofitice diferă de sistemul unui singur locus descris mai sus, acesta fiind bifactorial. Locii implicaţi în acest caz, au fost notaţi cu S şi Z. Dacă alelele din locusul S şi cei din locusul Z ale grăunciorilor de polen sunt identice cu alelele S şi Z din stil, se manifestă fenomenul de incompatibilitate. Dacă alelele din locusul S sau cele din locusul Z vor fi diferite de cele din stil, sistemul va fi compatibil. În cadrul sistemului cu doi loci, împerechierile compatibile se realizează cu o frecvenţă de 5-10% mai mare decât în cazul sistemului cu un locus, evidenţiat la trifoi şi la tutun. Sistemul cu doi loci, a fost descris la secară şi la câteva graminee perene, considerându-se că este preponderent în cadrul familiei graminee. La sfecla de zahăr a fost pus în evidenţă un sistem de incompatibilitate cu patru loci, având la bază acelaşi principiu de funcţionare ca al sistemului cu doi loci. Efectele alelelor incompatibilităţii nu sunt întotdeauna atât de puternice încât să împiedice în întregime fecundaţia. La numeroase specii se poate forma, ocazial, o sămânţă în urma străbaterii de către tubul polinic a stilului care poartă aceleaşi alele ca şi ţesutul stigmatului. În acest caz, avem de-a face cu fenomenul de pseudoautoincompatibilitate. Acest fenomen poate fi provocat de factori de mediu, cum ar fi: temperatura, mutaţiile, sau eventuale gene modificatoare. Pe lângă aceasta, pot să apară şi alele ale autofertilităţii (Sf), capabile să inactiveze alelele incompatibilităţii. Alela Sf este o alelă din seria S, ce poate da naştere unei anumite mutaţii. În unele cazuri, înfrângerea barierei de autoincompatibilitate a fost obţinută prin procedee diferite, dintre care menţionăm: polenizarea în stadiul de buton, polenizarea întârziată, acţiunea temperaturilor înalte, a substanţelor chimice şi hormonale, tetraploidizarea artificială, amestecul de polen, selecţia genelor de pseudofertilitate ş.a. (FRANKEL şi GALUN, 1977; TAYLOR, 1985; SAVATTI şi colab., 1986, 1992). B. Incompatibilitatea sporofitică Controlul sporofitic a incompatibilităţii polenului a fost sugerat de CORRENS, în 1912, la planta Cardaminae praetensis (Cruciferae), dar o explicaţie ştiinţifică a fenomenului a întârziat 38 de ani. Atunci, s-a explicat controlul genetic a sistemului de incompatibilitate la 113

Crepis foetida (Compositae) (GERSTEL, 1950). Ulterior, acest sistem de incompatibilitate a fost evidenţiat la numeroase specii cu importanţă economică din familiile Cruciferae, Compositae şi Convolvulaceae. Acest tip de incompatibilitate este şi ea condiţionată de o serie de gene alele, la un singur locus şi în contrast cu tipul gametofitic, funcţionalitatea polenului este determinată de constituţia genetică a plantei care îl produce. Particularităţile sistemului sporofitic pot fi rezumate la următoarele: • se întâlneşte la speciile la care grăunciorii de polen sunt, în general, trinucleate (Gramineae, Compositae, Cruciferae); • sistemul poate avea o condiţionare genetică mono- sau plurifactorială; • în general, se reunesc în linkajul de incompatibilitate caracteristici morfologice care întăresc incompatibilitate (exemplu, heteromorfia); • la polen, specificitatea înaintea individualizării fiecărui microspor se determină în ţesuturile diploide, în funcţie de relaţiile de aditivitate sau de dominanţa, mai mult sau mai puţin completă, între alelele omoloage; • dominanţa nu este aceeaşi pentru stamine şi pentru stil; • reacţia de incompatibilitate se declanşează din momentul în care polenul s-a depus pe stigmat; • se pot obţine plante homozigote pentru o alelă S 1, fie prin frângerea barierei de autoincompatibilitate fie prin pseudoautoincompatibilitate. Mecanismul acestui tip de incompatibilitate se explică prin aceea că dacă o plantă posedă genotipul S1S2 şi S1 este dominantă faţă de S2, întreaga cantitate de polen va funcţiona ca şi când ar fi S 1; atât grăunciorii de polen cu alelele S1, cât şi cu cele S 2, vor fi imcompatibile pe un stigmat S1 şi compatibil pe un stigmat S 2. Combinaţiile genetice din cadrul unui sistem sporofitic sunt multiple şi complexe ( vezi tabelul 8.5.). Sistemul sporofitic a fost pus în evidenţă la floarea soarelui, varză şi alte specii dicotiledonate. La diferite specii de Brassica s-au utilizat numeroase metode de îngrângere a barierelor incompatibilităţii, de la suprafaţa stigmatului. Aceste metode include polenizarea timpurie, îndepărtarea suprafeţei stigmatului, şocuri electrice, creşterea concentraţiei de CO 2, altoirea ş.a. În cazul polenizării bobocilor florali, impedimentul autoincompatibilităţii este depăşit prin aceea că se depune polen pe 114

stigmate imature, care nu au avut timpul să-şi dezvolte barierele de incompatibilitate. 8.3.2. Semnificaţia biologică a heterozigoţiei 8.3.2.1. Consangvinizarea. Noţiuni introductive Prin consangvinizare se înţelege reproducerea prin autofecundare forţaţă a plantelor alogame hermafrodite, sau monoice, sau încrucişarea între indivizii înrudiţi în cazul plantelor dioice. În mod normal, speciile alogame care nu sunt autoincompatibile pot fi consangvinizate prin autopolenizare controlată. Unde sexele sunt separate pe plante diferite, sau sunt controlate de sisteme ale incompatibilităţii, se utilizează încrucişarea frate-soră (SIB). Eficienţa comparativă a celor două sisteme de împerechere este ilustrată în fig. 8.7.

Fig. 8.7.

Din figură se desprinde faptul că trei generaţii de autopolenizare aproape că egalează efectele a zece generaţii de împerechere SIB în ceea ce priveşte homozigotizarea (BRIGGS şi KNOWLES, 1967). Structura mai mult sau mai puţin heterozigotă a unui individ, determină un efect global, extrem de important, în urma consangvinizării. La 115

cea mai mare parte a organismelor sexuate fecundarea consangvină antrenează o creştere a nivelului mediu de homozigoţie, însoţită de diminuarea generală a vigorii, fenomen semnalat ca efect al consangvinizării. Într-o situaţie inversă, creşterea heterozigoţiei este legată de fenomenul de vigoare hibridă, sau heterozis. Aceste particularităţi au fost evidenţiate încă din 1760, de către KÖELREUTER, iar noţiunea de heterozis a fost propusă de SHULL în 1914, după studiile privind vigoarea hibridă a liniilor de porumb, începute în 1909. Heterozisul este considerat ca o stare de heterozigoţie maximă, care este mai uşor de realizat prin hibridarea liniilor genetic diferite, consangvinizate. Vigoarea hibridă, sau heterozisul, se manifestă în toată plenitudinea în F1. Prin heterozis se înţelege fenomenul de superioritate a organismelor hibride faţă de formele parentale, sub aspectul vigorii generale, a adaptabilităţii, capacităţii de producţie, a calităţii etc. 8.3.2.2. Seminificaţia genetică a consangvinizării Principala seminificaţie genetică a consangvinizării este creşterea homozogoţiei. În acest sens, o importanţă deosebită o are faptul că alelele recesive apar cu frecvenţă mai mare în stare homozigotă în populaţii consangvinizate, decât în populaţiile cu încrucişare liberă. O populaţie supusă în mod normal unui sistem de consangvinizare (autofecundare repetată, încrucişări între rude), se desface într-o serie de linii reproductiv independente (subpopulaţii). La orice linie, creştrea homozigoţiei este însoţită de modificări ale frecvenţei genice şi tendinţa fixării unei sau altei alele în fiecare locus ; la liniile derivate din aceeaşi populaţie de bază, frecvenţele genice tind să devină divergente. Efectul caracteristic al consangvinizării la plantele cu fecundare încrucişată este reducerea mai mult sau mai puţin pronunţată a vigorii, adică apariţia fenomenului de depresie de consangvinizare (reducerea valorii medii a caracterelor cantitative legate de creştere, dezvoltare şi reproducere, ca urmare a creşterii gradului de homozigoţie). Mecanismul genetic care produce depresia de consangvinizare nu este pe deplin elucidat, dar presupune că un rol determinant îl joacă segregarea şi recombinarea genelor. Ca efect a acestora, menţionăm : - separarea în homozigoţi a factorilor favorabili, care au fost reuniţi în heterozigoţi ;

116

existenţa unor linkage strânse între unii factori favorabili şi alţii nefavorabili, poate face imposibilă obţinerea unui homozigot care să întrunească toate genele posibile ; - dispariţia interacţiunilor de epistazie. Oricare ar fi mecanismul genetic al depresiei de consangvinizare, s-a constatat că aceasta se accentuează pe măsura creşterii homozogoţiei materialului biologic, până când se ajunge la un minim de consangvinizare (cea mai scăzută valoare medioe a unei populaţii, valoare la care se ajunge după un număr de 7-10 generaţii de consangvinizare şi care rămâne relativ stabil în cazul continuării consangvinizării). Reducerea vigorii prin consangvinizare este diferită de la o specie la alta şi chiar de la un genotip la altul, în cadrul speciei. De exemplu, efectele consangvinizării sunt minime la dovleac, dar evidente la porumb, floarea soarelui, lucernă, trifoi etc. În urma consangvinizării, valoarea medie a multor caractere cantitative şi calitative la arbori (capacitatea de creştere în dimensiune şi volum, capacitatea de regenerare ş.a.) scade considerabil, putându-se ajunge în condiţii extreme, chiar la stress genetic – diminuarea puternică a capacităţii de adaptare – datorită segregării heterozigoţilor. Cele mai sensibile sunt populaţiile închise şi mici, la care depresiunea de consangvinizare se manifestă puternic. În populaţiile mari, la care apariţia homozogoţilor recesivi este condiţionată de legea hazardului, consangvinizarea are efecte mai slabe. Aceasta este, de fapt, situaţia principalelor specii forestiere de la noi, pentru care, în natură, problema pericolului consangvinizării nu se pune deocamdată. De altfel, chiar în cazul unor populaţii mici sau izolate – populaţiile de fag din Dobrogea sau de pin negru de Banat – s-au creat prin selecţie naturală, mecanisme speciale de echilibru genetic, care împiedică manifestarea depresiei de consangvinizare (STĂNESCU, 1982). Depresia de consangvinizare face ca la plantele alogame autopolenizarea să nu faciliteze obţinerea de genotipuri utilizate direct în producţie, ca în cazul plantelor autogame. Cu toate acestea, consangvinizarea oferă avantajul de a facilita izolarea de genotipuri homozigote, deci stabile, care pot fi utilizate în producerea de hibrizi. Întradevăr, homozigotizarea ce apare în urma consangvinizării duce la pariţia, datorită segregării şi recombinării, a unor noi genotipuri. Între aceştia, alături de numeroase tipuri aberante ca efect a trecerii în stare homozigotă a unei gene recesive dăunătoare, se întâlnesc şi genotipuri care concentrează un număr mare de gene favorabile. Încrucişarea unor asemenea linii a căror zestre genetică valoroasă se completează reciproc, într-un model echilibrat, vor da naştere la hibrizi valoroşi, decât populaţia iniţială din care au fost extrase liniile. ca un efect pozitiv, menţionăm şi uniformizarea liniilor ca urmare a autofecundării repetate, mai multe generaţii succesive. Homozigoţie completă apare după un -

117

mare număr de consangvinizări repetate, în funcţie de gradul de heterozigoţie a materialului iniţial, şi are ca urmare eliminarea genelor letale sau subletale (SAVATTI, 1983). genotipurile care apar pot să fie homozigot recesive, sau homozigot dominante. Majoritatea genotipurilor homozigot recesive prezintă fenomenul de nanism, defecte clorofiliene, malformaţii, sterilitate parţială sau totală, dar şi unele însuşiri valoroase, cum sunt : tulpini scurte şi rezistente la cădere (porumb şi sorg), tulpini erecte şi bogate în frunze (trifoiul roşu), conţinut scăzut de alcaloizi la lupin şi rapiţă, rezistenţă la stresurile climatice, boli şi dăunători ş.a. Formele homozigote receseve pot fi uşor recunoscute, eliminate sau reţinute, din prima sau a doua generaţie consangvinizată (PAMFIL şi colab., 1978, 1981). Deosebit de valoroase sunt genotipurile homozigote dominante, deoarece prin încrucişarea lor, însuşirile şi caracterele valoroase ale acestora se transmit dominant. 8.3.2.3. Bazele genetice şi tipurile de heterozis Fenomenul de heterozis reprezintă vitalitatea maximă a hibrizilor din prima generaţie hibridă, F1. Se exteriorizează prin vigoare mărită, reflectată prin cantitatea mare de rpoducţie. Afectează toate caracterele şi însuşirile biologice şi economice ale plantelor, îndeosebi producţia de seminţe sau fructe. Hibrizii heterotici (F1) prezintă cel mai înalt nivel de heterozigoţie, fiind reversul consangvinizării. Cercetările genetice privind heterozisul, efectuate de LERNER în 1954 şi MATHER în 1955 (după MUREŞAN şi CRĂCIUN, 1972), explică acest fenomen genetic pe baza faptului că hibridul F 1 prezintă în acelaşi locus două alele diferite care determină vigoarea hibridului respectiv. Această vigoare hibridâă este mai accentuată la hibrizii plantelor alogame, obţinuţi pe baza încrucişării liniilor consangvinizate şi mai puţin accentuată la hibrizii plantelor autogame. Se presupune de asemenea, că hibrizii F1 manifestă o modificare pozitivă a metabolismului, datorită genelor nealel (POTLOG şi colab., 1989). Majoritatea cercetărilor au concluzionat că în toate cazurile formele hibride F1 manifestă o vigoare sporită, o vigoare hibridă specifică mai mare decât a generaţiilor hibride mai avansate. Acest mod de manifestare a hibrizilor, în prima generaţie (F1), poartă denumirea de heterozis, fiind un fenomen pur genetic cu consecinţe biologice specifice. Fenomenul de heterozis are un spectru larg, dar intensitatea lui diferă de la un hibrid la altul, de la o specie la alta. Caracteristice de bază a fenomenului de heterozis este vigoarea maximă în F1 şi scăderea acesteia în generaţiile hibride ulterioare (F 2). Prelungirea fenomenului în generaţiile hibride avansate este posibilă numai 118

în anumite cazuri şi mai ales la plantele cu reproducere somatică sau vegetativă a căror hibrizi nu prezintă fenomenul segregării, atât de specific hibrizilor sexuaţi. Manifestarea fenomenului de heterozis diferă de la hibrizii intraspecifici unde este ami accentuat, la hibrizii interspecifici la care vigoarea hibridă este de obicei mai mică. În cadrul aceleaşi specii nu toţi hibrizii F1, între soiuri sau linii consangvinizate manifestă aceeaşi intensitate a fenomenului de heterozis. Pentru determinarea manifestării maxime a fenomenului de heterozis se determină în prealabil capacitatea combinativă generală şi specifică a genitorilor (soiuri sau linii consangvinizate). Heterozisul la plante, ca mijloc de sporire a producţiei, reprezintă una dintre problemele genetice contemporane, cu cele mai largi implicaţii teoretice şi practice pentru ameliorarea plantelor. Heterozisul, îndeosebi la o serie de specii de plante cultivate ca, porumbul, floarea soarelui, sfecla, tomatele ş.a. tinde a deveni singura şi cea mai eficientă metodă de exploatare a homozigoţiei în ameliorarea plantelor. La speciile forestiere sunt cunoscuţi numeroşi hibrizi naturali cu manifestări evidente a fenomenului de heterozis, în ceea ce priveşte capacitatea de creştere, vitalitatea ş.a. Pe primul plan se situează plopii negri hibrizi – plopi de Canada – hibrizi între plopul negru european (Populus nigra) şi plopii negri americani (P. deltoides şi P. angulata), utilizaţi pe scară largă în culturi şi în ţara noastră. În cadrul genului Quercus s-au semnalat o serie întreagă de hibrizi naturali cum sunt : Q. rosacea, (Q. robur×Q. petraea), Q. dacica (Q. polycarpa×Q. pubescens), Q. hainaldiana (Q. frainelto ×Q. robur) ş.a. care însă, în general, nu par superiori speciilor parentale. La genul Fagus, hibridul Fagus taurica (F. sylavtica×F. orientalis) întâlnit la noi în Banat, Dobrogea, Muntenia şi Oltenia, se dovedeşte deosebit de productiv (mai ales în Banat) şi viguros, precum şi o mare capacitate de adaptare la un climat relativ secetos (mai ales în Dobrogea). La genul Platanus, hibridul P. hybrida (P. acerifolia) rezultat din încrucişarea P. orientalis×P. occidentalis, manifestă fenomenul de heterozis şi este complet fertil . La genul Abies, hibrizii naturali A. bormülleria (A. nordmanniana× A. cephalonica) din Anatolia (Turcia), A. borisii-regis (A. alba× A.cephalonica) din Grecia şi Albania, A. rubrodensis (A. alba×A. cephalonica) din Sicilia (Italia) sunt deosebit de rezistenţi la secetă. În cadrul genului Larix, hibridul L. eurolepis (L.decidua×L.leptolepis) este mai repede crescător şi mai rezistent la cancer comparativ cu părinţii.

119

Hibridările controlate la specii din genurile Populus, Quercus, Fraxinus, Pinus, Picea, abies, Larix ş.a. au dus la obţinerea de rezultate contradictorii, iar în unele cazuri efectul heterozis a fost obţinut numai în prima generaţie (F1) (STĂNESCU, 1982). Hibridarea crează totuşi combinaţii de gene, unele superioare părinţilor şi în cazul speciilor lemnoase. Dacă aceste combinaţii sunt urmărite şi utilizate corespunzător în scopuri practice, hibridarea îşi păstrează, prin efectele pe care le dă, întreaga seminificaţie genetică. Multiplicarea pe cale vegetativă, reprezintă unul din mijloacele de menţinere a combinaţiilor posibile de gene şi de aici a menţinerii vigorii hibride, mai ales la speciile care se înmulţesc uşor prin butaşi, cum ar fi plopii, sălciile etc. (STĂNESCU, 1982). Dintre ipotezele şi teoriile privind baza genetică a heterozisului amintim : - teoria heterozigoţiei, elaborată de EAST şi SHULL, consideră drept cauză a fenomenului starea de heterozigoţie a hibridului în F1 ; - teoria dominanţei, elaborată de BRUCE, explică fenomenul de heterozis prin acumularea şi combinarea în F1 a genelor sau alelelor dominante provenite de la genitori ; - teoria înlănţuirii, emisă de JONES, menţionează că fenomenul are la bază înlănţuirea genelor dominante, situate în cromozomii omologi ; - teoria stimulării, după care, fenomenul se datorează unui sistem genetic stimulator ; - teoria alelomorfismului multiplu, pune la baza fenomenului ideea eredităţii cumulative alelomorfe ; - teoria supradominanţei, emisă de HULL, explică fenomenul pe baza prezenţei heterozigoţiei monofactoriale ; - teoria epistaziei, formulată de TURBIN, consideră drept cauză genetică intervenţia heterozigoţiei structurale sau a heterozigoţiei inversiunilor. Oricare ar fi teoria privind heterozisul, apare ca certitudine că fenomenul există şi se manifestă având un rol deosebit în ameliorarea plantelor. Cauzele adevărate ale heterozisului trebuie căutate în rolul şi acţiunea factorilor genetici care intervin în dezvoltarea ontogenetică a plantei. Cele mai importante tipuri de heterozis utilizate îîn ameliorarea plantelor sunt : • heterozis reproductiv, determină sporirea producţiei de sămânţă şi fructe şi în general organe reproductive, obţinute în urma polenizării şi fecundaţiei ; 120

• heterozis somatic sau vegetativ, determină formarea şi sporirea masei vegetative ; • heterozis adaptativ, accentuează însuşirile legate de capacitatea de adaptare a plantelor la condiţii ecologice diferite ; • heterozis adevărat, determină dezvoltarea luxuriantă a plantelor hibride F1, comparativ cu plantele nehibride. După modul de manifestare, faţă de populaţia iniţială, deosebim două tipuri de heterozis : • cisheterozis, prin care se înţelege tipul de heterozis în care hibridul depăşeşte nivelul productiv al formelor parentale consangvinizate, dar nu şi nivelul populaţiei cu polenizare străină din care acestea au fost extrase ; • transheterozis, este tipul de heterozis în care hibridul heterotic depăşeşte nu numai formele parentale consangvinizate ci şi nivelul populaţiei cu polenizare liberă din care au fost extrase. Intensitatea heterozisului este condiţionată genetic de factori genetici şi de mediu. Dintre factorii genetici care influenţează intensitatea de manifestare a heterozisului se pot menţionă : - modul de reproducere a plantelor, plantele alogame reacţionează, în general, mai puternic decât cele autogame ; - heterozisul, după cum s-a amintit, este în general mai accentuat în cazul hibridării intraspecifice decât în cazul celor interspecifice şi intergenerice ; apar şi excepţii cum este cazul la hibrizii Raphanus×Brassica, sau diferite tipuri de Nicotiana ; - hibrizii dintre varietăţi prezintă un heterozis mai pronunţat decât cei dintre biotipurile aceleaşi variatăţi ; - formele geografic îndepărtate manifestă o intensitate mai pronunţată a heterozisului, decât cele apropiate ; - hibrizii dintre formele homozigote (linii) prezintă un heterozis mai pronunţat decât cei rezultaţi din părinţi heterozigoţi ; - cu cât prezintă o diferenţiere genetică mai pronunţată (până la o anumită limită), cu atât hibrizii manifestă un heterozis mai pronunţat şi invers ; ordinea încrucişării genitorilor influenţează intensitatea heterozisului ; uneori genitorul matern are o influenţă mai mare asupra hibridului decât cel patern, datorită patrimoniului citoplasmatic. Heterozisul depinde de asemenea, de interacţiunea dintre genotip şi factorii de mediu. cercetările au evidenţiat că acelaşi hibrid este capabil de producţii diferite, în funcţie de condiţiile climatice ale diferiţilor ani din zona în care se cultivă, de agrotehnica aplicată. Comportarea diferită a aceluiaşi 121

hibrid în zone ecologice diferite este determinată de reacţia termoperiodică şi mai ales fotoperiodică a acestuia.

CAPITOLUL IX 9. Mutaţiile şi mecanismul lor molecular 9.1. Definiţia mutaţiei şi tipuri de mutaţii Noţiunea de mutaţie a fost elaborată în anul 1901 de H. de VRIES, cel ce a elaborat teoria mutaţionistă. Mutaţia poate fi definită ca fenomenul prin care se produc modificări ereditare în materialul genetic, modificări ce nu sunt provocate de recombinări genetice sau de segregare. Ele pot să apară în mod spontan şi atunci sunt denumite mutaţii naturale, sau pot fi induse experimental, denumite mutaţii artificiale. Între cele două tipuri de mutaţii sunt deosebiri de ordin calitativ. Mutaţiile naturale sunt produse de numeroşi agenţi mutageni din natură (radiaţii, schimbări de temperatură etc.). Mutaţia poate fi definită şi ca “modificări discontinue cu efect genetic” (MAYR, 1963). Ele pot afecta diferite unităţi ale materialului genetic. Sub acest aspect mutaţiile pot fi clasificate în : - mutaţii genice, când afectează genele ; - mutaţii cromozomiale, când afectează cromozomii ; - mutaţii genomice, în cazul când întregul genom este afectat. După modul de exprimare fenotipică ele pot fi clasificate în mutaţii dominante sau masive. În funcţie de locul unde sunt plasate genele, mutaţiile pot fi autozomale, plasate pe autozomi şi heterozomale, plasate pe heterozomi. Acest tip de mutaţii manifestă sex-linkage. De asemenea, există şi mutaţii extranucleare ale genelor din citoplasmă. O altă categorie o constituie mutaţiile letale şi semiletale, care afectează gene de importanţă majoră în organism, prin a căror blocare se realizează moartea individului înainte de maturitatea sexuală. Mutaţiile pot afecta genele de diferite tipuri (structurale, operatoare, reglatoare), care iau parte la realizarea reglajului genetic. De asemenea ele pot afecta regiuni mai mici sau mai mari de-a lungul genei, determinând mutaţii punctiforme – fiind mutaţii intragenice. Referitor la frecvenţa mutaţiilor, pot fi evidenţiate gene mutabile, care sunt mai instabile şi prezintă o frecvenţă mai mare a mutaţiilor comparativ cu celelalte gene din organism. 122

O altă categorie sunt genele mutatoare care măresc frecvenţa mutaţiilor altor gene. Dacă mutaţiile afectează celulele liniei germinate, atunci ele pot fi transmise ereditar prin gameţi la noua generaţie. În cazul când avem de a face cu mutaţii somatice, acestea nu se transmit în descendenţă decât în cazul în care ţesutul sau organul respectiv se obţine prin înmulţire vegetativă, indivizi care au apoi posibilitatea să se reproducă vegetativ. 9.2. Frecvenţa mutaţiilor şi natura lor Apariţia bruscă a unor indivizi având caractere schimbate (mutante) şi care transmit modificarea în descendenţă a fost observată de mult timp şi apar la întâmplare sub influenţa condiţiilor de mediu. La plante, după ce SPRENGER din Heidelberg a descris mutanta cu frunze lacrimate la Chelidonium majus (sec XIV), DUCHESNE a descris fragul monofil, cu frunze indivizate. O mutaţie asemănătoare a fost găsită la Robinia pseudoacacia în anul 1855 şi ea a dat naştere salcâmului monofil. Variatăţile pendula la numeroase specii de arbori, cum sunt Saphora japonica, Ulmus glabra, Quecus robur, Prunus padus ş.a. se datoresc, de asemenea, unor mutaţii spontane. DARWIN a descris numeroase mutaţii la piersici şi la animale (oile de Ancona, câini buldogi ş.a. SENBUCH (1942) a găsit o mutaţie spontană la lupinul alb (Lupinus luteus) care nu conţinea în seminţele sale alcaloizi. La pomii fructiferi şi al hamei s-au observat un mare număr de mutaţii spontane, acestea fiind utilizate direct ca soiuri noi, sau în programele de ameliorare. Un mare număr de mutante s-au semnalat la plantele ornamentale (ex. laleaua Murillo). Cea mai cunoscută mutantă spontană din natură este gena opaque, la porumb, care influenţează conţinutul în lizină. O mutaţie accidentală de tipul celei genice, poate avea loc după afectarea tautomerică a atomului de hidrogen care împiedică împerecherea bazelor complementare la nivelul acidului dezoxiribonucleic (ADN). Schimbările care pot avea loc la nivelul nucleotidelor ADN-ului provoacă schimbări de cod, care la rândul lor produc schimbări în codonii ARN-m (ARN-mesager). În această situaţie, diferiţii aminoacizi pot fi eliminaţi rezultând sinteza unor proteine diferite, ce pot să se manifeste prin apariţia unor mutaţii spontane naturale, ca de exemplu mutaţiile de culoare, de talie ş.a. WATSON (1974), consideră că mutaţiile spontane rezultate numai din modificări tautomerice pot să apară cu o frecvenţă de 10-9 la nivelul nucleotidelor şi de 10-6 la nivelul genelor/generaţie.

123

În afara acestui mecanism, mutaţiile pot fi cauzate de aberaţii cromozomiale (deleţia, duplicaţia, inversia, translocaţia) şi de multiplicările de genom (poliploidia). La microorganisme, care au o extraordinară capacitate de multiplicare, numărul mutaţiilor care apar într-un ciclu de reproducţie este foarte mare. De exemplu, numărul uredosporilor de rugină a frunzelor de grâu (Puccinia recondita ssp. tritici), în condiţiile în care infectează numai 1% din suprafaţa foliară/1 mp de teren este de 300 spori/1 mmp/zi, respectiv 1011 spori/zi/ha (PARLEVLIET şi ZADOKS, 1977). Dacă frecvenţa estimată a mutaţiilor este de 10-8 vor apărea 1.000 mutante/locus/zi/ha. Dacă se ia în considerare că fiecare organism conţine câteva mii de gene, putem afirma că fenomenul mutaţional este practic continuu. WRIGHIT (1931) menţionează că mutaţiile spontane sunt întotdeauna mai numeroase decât necesităţile evolutive ale speciei. Rata mutaţiilor depinde de genele afectate, de condiţiile ecologice ş.a.. Unele gene îşi schimbă uşor structura, dovedindu-se labile şi generând un mare număr de mutaţii. Asemenea gene, după cum s-a amintit se numesc mutabile sau instabile şi apar îndeosebi în celulele somatice ale plantelor condiţionând variaţiile în culoarea frunzelor, petalelor ş.a. Alte gene sunt stabile şi suferă foarte rar modificări structurale. Dacă se acceptă că mutaţiile au jucat un rol decisiv în evoluţia speciilor, atunci la genul Picea şi Abies cele două tipuri de gene şi-au pus amprenta. De exemplu, genele care condiţionează forma bazei acelor şi ale persistenţei sau caducităţii solzilor la conuri trebuie să fi fost foarte stabile, apărând prea puţine modificări sub acest aspect, în comparaţie cu genele ce afectează forma generală şi dimensiunea acelor sau a formei solzilor şi bracteelor la conuri, care au fost afectate probabil, în măsură mult mai mare de diverse mutaţii (STĂNESCU, 1982). Când MÜLLER (după BOROJEVIĆ, 1990) a reuşit să inducă mutaţii la Drosophila melanogaster, prin iradiere cu raze X, aceasta a marcat începutul unei noi ere a geneticii aplicate, mutaţiile induse devenind o importantă sursă de variabilitate. De la acest eveniment s-au descoperit şi utilizat, pe parcursul anilor, un număr impresionant de factori mutageni fizici şi chimici. Primele studii privind inducerea mutaţiilor la plante se datoresc italianului PIROVANO şi americanului STADLER. Frecvenţa mutaţiilor induse este mai mare decât a celor sponatne, oscilând între 10-3-10-5/genă/generaţie. Unele gene mutează cu o frecvenţă mai mare decât altele. S-a constatat că spectrul mutaţiilor sponatne şi a celor induse sunt similare şi că mutaţiile induse, s-au găsit sau se vor găsi în natură.

124

În funcţie de utilitatea lor mutaţiile pot fi folositoare, nefolositoare, sau neutre pentru organism. Deoarece procesul mutaţional este aparent întâmplător şi necontrolabil, majoritatea mutaţiilor sunt cosiderate neutre, neafectând în mod pozitiv sau negativ individul purtător. Asemenea mutaţii pot să se menţină într-o populaţie timp îndelungat, atât timp cât genele respective se găsesc în stare heterozigotă. Când genele devin homozigote mutaţiile pot să se exteriorizeze, putând aduce chiar un avataj purtătorului, în condiţii de mediu schimbat.din moment ce mutaţiile rezultă nu numai printr-o schimbare genetică faţa de tipul sălbatic, dar şi prin deleţia uneia sau mai multor baze în ADN şi în urma aberaţiilor cromozomale numeroase mutaţii pot să manifeste un efect negativ. Asemenea mutaţii sunt eliminate în procesul selecţiei naturale sau artificiale. Selecţia naturală favorizează mutaţiile care sunt avatajoase purtătorilor lor. Aceste mutaţii sunt surse potenţiale a tot ce este nou, ele jucând un rol important în evoluţia speciilor, iar pe de altă parte pot constitui o inepuizabilă sursă de variabiltate genetică. Mtaţiile structural cromozomale, numite şi aberaţii cromozomale, se corelează cu schimbări în poziţia şi numărul genelor şi se datoresc posibilităţii fragmentării cromozomului în meioză sau în mitoză. ele pot fi intracromozomale şi intercromozomale (fig. 9.1.)

Fig. 9.1. Restructurări intra- şi extracromozomale

Deleţia reprezintă pierderea de către cromozom a unui fragment acentric, cu una sau mai multe gene. Deleţiile au efecte dăunătoare sau pot fi 125

letale, dacă sunt de anvergură. La plantele superioare, deficienţele sunt transmise numai pe cale maternă nu şi pe cale paternă, întrucât polenul afectat de deficienţă nu este viabil, sau nu poate fecunda oosfera. Duplicaţia constituie fenomenul invers deleţiilor, prin care un fragment de cromozom este ataşat la un cromozom omolog. Duplicaţiile se declanşează odată cu deleţiile, ca efect a schimbului de fragmente între cromozomii omologi în locusuri neomoloage. Cromozomul omolog care cedează un segment sau o genă devine deficient pentru genele respective, iar cromozomul acceptor are două seturi de gene pentru segmentul duplicat. Duplicaţiile afectează organismele în măsura mai mică decât deleţiile, neavând efect letal. Deţin un rol important în evoluţia speciilor, putând sta la originea unora dintre sistemele de gene multiple. Se presupune că la arbori având în vedere numărul mare al poligenelor şi valoarea lor biologică definitorie, duplicaţiile trebuie să se fi manifestat pe scară largă. Duplicaţia anumitor gene poate să prezinte interes deosebit în scopul sporirii capacităţii de producţie a plantelor agricole şi a celor lemnoase, ca şi a rezistenţei faţă de dăunători. Inversia se realizează prin schimbarea cu 180º a poziţiei unui segment de cromozom care a suferit două rupturi simultane. Dacă fragmentul rotit conţine centromerul, inversia este pericentrică, iar dacă ruptura a avut loc într-un singur braţ a cromozomului ea se numeşte paracentrică şi nu include centromerul. În mod obişnuit, inversiile apar în profaza meiozei, în urma ruperii cromatidelor sau cromozomilor. Inversiile au şi ele un rol important în evoluţia unor specii, contribuind la amplificarea variaţei lor genetice. Translocaţia ia naştere prin încorporarea unui segment de cromozom, în alt sector al aceluişi cromozom – translocaţie intracromozomală sau transpoziţie, sau prin schimbul reciproc între cromozomii neomologi – translocaţii intercromozomale sau reciproce. Translocaţia afectează conjugarea normală a cromozomilor în profaza I a meiozei (zigonem), determinând apariţia de gameţi anormali în proporţie de până la 60-70%. Translocaţiile s-au manifestat activ în procesul de evoluţie. Se consideră, că la originea apariţiei hominidelor a stat la bază un fenomen de translocaţie care a facilitat trecerea de la 48 de cromozomi la 46 de cromozomi, prin fuziunea a doi cromozomi acrocentrici.

9.3. Factorii mutageni

126

Factorii mutageni care intervin în declaşarea mutaţiilor genice şi structural cromozomale sunt de natură fizică, chimică şi biologică. Factorii mutageni fizici sunt în special radiaţiile, ce pot fi ionizante şi neionizante şi care produc modificări genice şi structural cromozomale prin ruperea legăturilor chimice din molecula de ADN, cauzând deleţii, inversii, translocaţii etc. Mutaţiile induse de radiaţii sunt cunoscute şi sub denumirea de radio mutaţii. • Radiaţiile ionizante, electromagnetice (razele X şi gamma) şi corpusculare (razele beta, alfa, protonii, neutronii rapizi şi lenţi, particolele grele) produc efecte mutagene puternice prin fenomenul de ionizare. Ele induc mutaţii proporţional cu creşterea cantităţii de energie sau cu intensitatea iradierii ţesuturilor vii. Radiosensibilitatea celulelor se dovedeşte direct proporţională cu capacitatea lor de înmulţire şi invers proporţională cu gradul lor de diferenţiere (tabelul 9.1.). Doza letală, respectiv cantitatea de radiaţii ce provoacă moartea a cel puţin 50% (DL50) din indivizii expuşi iradierii variază de la 350 r (unităţi roentgen) la om, 10.000 r la păr, măr, porumb, 20.000 r la tomate, trifoi, 75.000-100.000 r la in, varză, ridichi etc.

•

Radiaţiile neionizante sunt radiaţiile ultraviolete (UV) având energie cuantică mică, cu o capacitate penetrantă redusă şi de aceea ele se folosesc pentru inducerea de mutaţii la microorganisme şi la polen.

Factorii mutageni chimici. Efectul mutagen al substanţelor chimice depinde de natura lor şi de starea ADN din celulă în momentul acţiunii acestora. Substanţele chimice mutagene au o structură chimică extrem de variată, de aceea o clasificare a lor după acest criteriu este extrem de grea. FREESE (după PAMFIL, 1980) a propus clasificarea agenţilor chimici în două grupe mari: • •

agenţi mutageni care acţionează în perioada de biosinteză replicativă a acizilor nucleici; agenţi mutageni chimici care acţionează direct asupra acizilor nucleici în repaus.

Tabelul 9.1. Radiosensibilitatea unor specii de plante la iradierea cu radiaţii gamma şi röentgen (după (I. NICOLAE, A. NASTA, 1975)

127

Specia sau grupul de specii

Organul iradiat

Doza critică (în r)

Domeniul zonei critice

Porumb

Sămânţă uscată

10.000

8.000…15.000

grâu

Sămânţă uscată

15.000

5.000-20.000

Mazăre

Sămânţă uscată

10.000

5.000…20.000

Cartof

Tuberculi

5.000

5.000…10.000

Teişor

Sămânţă uscată

10.000

100.000

Mac

Sămânţă uscată

15.000

12.000…16.000

Timoftică

Sămânţă uscată

10.000

8.000…10.000

Golomăţ

Sămânţă uscată

20.000

20.000

Ovăscior

Sămânţă uscată

40.000

40.000

Coada vulpii

Sămânţă uscată

20.000

20.000

Firuţă

Sămânţă uscată

20.000

20.000

Viţă de vie

Sămânţă uscată

10.000

10.000

Trandafir

Muguri

3.000

Viţă sălbatică

Muguri

8.000

Prun

Muguri dorminzi

3.000

2.500…4.000

Măr

Muguri dorminzi

5.000

5.000…7.500

Coacăz negru

Muguri

3.000

3.000

Dud

Sămânţă uscată

10.000

10.000…20.000

Specii forestiere

Muguri dorminzi

1.500

1.500…8.000

Specii forestiere

Sămânţă uscată

5.000

2.000…20.000

Răşinoase

Sămânţă uscată

1.000

8.000…15.000

Foiase

Sămânţă uscată

10.000

2.000…20.000

Arbuşti decorativi

Sămânţă uscată

20.000

10.000…30.000

1.500…5.000 8.000

Din prima categorie fac parte, azaserina, metiluretanul, cofeina, teobromina care sunt inhibitori de concurenţă a precursorilor acizilor nucleici; substanţe analoage bazelor purinice şi pirinidinice (2aminopurina (2-AP), 5-ioduracilul (5-IU), 2-oxipurina (2-OP) etc.),

128

care pot fi incorporate în molecula de ADN, în locul bazelor azotate naturale, ce duc la apariţia de mutaţii. Din a doua categorie fac parte: acidul nitros (HNO2), hidroxilamina şi hidrazina şi substanţele alkilante (dietilsulfatul, etilmetansulfonat), cu acţiune directă asupra acizilor nucleici în repaus. Substanţele chimice mutagene prezintă câteva caracteristici care le deosebeesc, sub aspectul acţiunii lor, de mutagenii fizici: - au o eficienţă mutagenică mai mare (de 2-100 ori mai mare) decât radiaţiile; - majoritatea mutaţiilor provocate nu sunt letale; - produc frecvent mutaţii somatice; - provoacă un număr mic de deficienţe, asemănător iradiaţiilor, dar mult mai puţine. Factorii mutageni biologici care acţionează asupra materialului ereditar din celulă, sunt virusurile şi microplasmele plasmele, ce pot provoca mutaţii genice şi aberaţii cromozomale, întrerupând sinteza ADN în celula gazdă. 9.4. Mecanismul molecular al mutaţiilor Încă din anul 1953, WATSON şi CRICK care au descoperit structura macromoleculei de ADN au emis ipoteza că mutaţia este o eroare în secvenţa nucleotidelor acizilor nucleici. Ipoteza WATSON-CRICK privind mecanismul molecular al mutaţiei consideră, în esenţă, că printre cauzele care duc la apariţia mutaţiilor la nivel molecular pot fi menţionate următoarele: - Modificarea structurii macromoleculei de ADN; - Deleţia sau adiţia uneia sau mai multor nucleotide în macromolecula de ADN; - Substituţia uneia sau a mai multor nucleotide în macromolecula de ADN; - Inversia unei secvenţe de nucleotide din macromolecula de ADN. Toate aceste modificări ale informaţiei genetice conţinute în macromolecula de ADN se pot manifesta sub formă de mutaţii. Sub influenţa diverşilor factori mutageni se produc erori în procesul de replicaţie a acizilor nucleici, care duc la apariţia de mutaţii, ca efect a înlocuirii unei baze purinice în macromolecula de ADN cu o altă bază purinică sau a unei baze pirimidinice cu o lată bază pirimidinică.

129

CAPITOLUL X POLIPLOIDIA (INGINERIA CROMOZOMALĂ) 10. Importanţa şi inducerea poliploidiei Poliploidia reprezintă un fenomen deosebit de interesant sub aspect genetic şi economic. Considerată ca o mutaţie de genom, poliploidia se datoreşte unei schimbări a numărului de bază de cromozomi (x). Unii autori consideră că în cazul poliploidiei schimbarea constă în adăugarea uneia sau mai multor garnituri cromozomale întregi (autopoliploizi), sau înjumătăţirea numărului de cromozomi (haploizi şi monoploizi). Poliploidia apare prin multiplicarea seturilor proprii de cromozomi, a seturilor cromozomale ale hibrizilor interspecifici sau intergenerici, sau prin hibridarea unor specii poliploide. În primul caz avem de a face cu autopoliploidie, iar în al doilea caz se obţin organisme alopoliploide, amfidiploide sau amfiploide. Poliploizii care au un număr par de seturi cromozomale se numesc artioploizi, iar cei cu seturi impare perisoploizi. Se pot distinge următoarele tipuri de poliploizi: triploizi (2n → 3n), tetraploizi (2n → 4n), pentaploizi (2n → 5n), hexaploizi (2n → 6n) etc. şi haploizi sau monoploizi (2x → x). Poliploidia a jucat un rol important în evoluţia plantelor. Determinând apariţia unor plante mai viguroase, datorită creşterii volumului celular în urma multiplicării garniturii cromozomale şi favorizând fixarea unor hibrizi interspecifici sub formă de amfiploizi, poliploidia a dat naştere la noi specii care s-au extins dincolo de arealul de existenţă a speciilor diploide.

130

Speciile angiosperme sunt poliploide în proporţie de 30-35%, iar dintre cele 652 de genuri care constituie 80% din flora Europei Centrale, 233 genuri (cu 421 specii) sunt diploide şi 419 genuri (cu 1803 specii) sunt poliploide, adică 64,2% din total (STEBBINS, după STĂNESCU, 1982). Numărul speciilor poliploide este mai mare în regiunile cu climat aspru, cum ar fi cele nordice, de altitudine mare, sau zonele deşertice, ca şi consecinţă a vitalităţii lor sporite şi a rezistenţei mai mari faţă de stresurile climatice. La plantele lemnoase printre primii poliploizi semnalaţi sunt tetraploizii Alnus glutinosa şi A. japonica. NILSON-EHLE descoperă în Suedia plopul tremurător triploid, Populus tremula f. gigans, cu creştere mult mai viguroasă decât a formei diploide. La răşinoase speciile poliploide sunt foarte puţine (4,6% din total), putându-se semnala Sequoia sempervirens (6n=66 cromozomi), Pseudolarix amabiils (4n=44 cromozomi), Juniperus chinensis f. phitzeriana (4n=44). La foioase, există numeroase specii şi biotipuri poliploide la genurile Alnus, Betula, Salix, Acacia, Acer, Tilia, Fraxinus ş.a. Odată cu descoperirea factorilor poliploidizanţi, ameliorarea plantelor a putu să utilizeze avantajele pe care le poate oferi multiplicarea numărului de cromozomi. Inducerea artificială a poliploizilor se realizează uşor şi sigur prin utilizarea tratamentelor cu soluţie apoasă de colchicină. Colchicina este un alcaloid obţinut din brânduşa de toamnă (Colchicum autumnale). În stare pură are formula brută C 22H25O6N şi se prezintă sub formă de cristale fine, ce se dizolvă în alcool, cloroform sau apă rece. Sub influenţa luminii şi a căldurii se degradează uşor. Metoda colchicinizării s-a răspândit rapid deoarece se aplică uşor, iar soluţia are o bună capacitate de difuziune în celule. S-a constatat că tratamentul apexului vegetativ al plantelor, sau imersarea seminţelor în colchicină, sau alte substanţe chimice poliploidizante, duce la dublarea numărului de cromozomi în celulele somatice. Colchicina împiedică formarea fusului de diviziune în mitoză, cromozomii nu se deplasează spre placa ecuatorială ci se dispersează în celulă. După diviziunea centromerilor, cromozomii se divid, nu se deplasează spre polii opuşi ai celulei, rămânând într-o singură celulă. O asemenea celulă va avea un număr dublu de cromozomi (2n=4n), în loc de numărul diploid (2n=2x), iar în diviziunile mitotice se vor forma celule cu 2n=4x cromozomi. Inhibarea prin colchicină a formării fusului nuclear şi menţinerea ulterioară a ciclului cromozomial normal, reprezintă bazele poliploidizării prin utilizarea acestei substanţe.

131

Pentru a obţine plante tetraploide se tratează cu colchicină diferite organe ca: seminţe, plăntuţe în primele stadii de dezvoltare, inflorescenţe şi muguri axiliari, la începutul dezvoltării ş.a. Metodica de aplicare a tratamentului cu colchicină este condiţionată, în general, de natura organului tratat şi de specia utilizată. Tehnica tratamentelor cu colchicină a părţilor vegetative ale plantelor sau a seminţelor, este simplă. Pentru tratarea apexului vegetativ se utilizează o soluţie de 0,25-0,50% colchicină care se picură pe apex sau se aplică tampoane de vată îmbibată cu soluţie, timp de 1/2 - 1oră. Se mai poate plasa apexul vegetativ pe un substrat de agar impregnat cu soluţie de colchicină 1% timp de câtevă ore. În cazul imersării seminţelor negerminate, îmbibate sau neîmbibate în prealabil în apă, se foloseşte o soluţie apoasă de colchicină cu o concentraţie de 0,5-1,0-2,0%. Imersarea poate dura 24-48 ore, sau poate fi accelerată prin efectuarea tratamentelor în vid (PANFIL şi colab., 1972; SALONTAI şi SAVATTI jr., 1993, SAVATTI jr., 1997). La diferenţierea primelor frunze, sau a celor cotiledonale, se fac determinări microscopice, pentru a se stabili gradul de ploidie prin metode indirecte şi care vizează: - numărul de cloroplaste în celulele stomatice; - lungimea diametrului mare a celulelor stomatice; - numărul de celule stomatice în câmpul microscopic. Metodele indirecte de determinare a gradului de ploidie se bazează pe existenţa unor corelaţii între gradul de ploidie şi diferitele caractere macroscopice şi microscopice ale plantelor şi permit o triere rapidă a plantelor potenţial poliploide (RAICU şi colab., 1969). Acestea sunt completate ulterior cu analize citologice ce sunt determinante în cunoaşterea cu exactitate a gradului de poliploidie. Cele mai bune rezultate se pot obţine prin efectuarea analizelor citologice pe radicele recoltate la orele 7-8 dimineaţa, prefixarea lor în colchicină 0,5%, timp de 3 ore, urmată de fixarea în soluţie Carnoy, îmbăierea în pectinază 5% timp de 5 ore şi în final colorarea cu orceină acetică. Principala metodă de obţinere a alopoliploizilor este hibridarea între specii diferite, compatibile. Hibridarea nu realizează în mod direct poliploizi, apărând necesitatea tratamentului cu colchicină a hibrizilor, pentru dublarea numărului de cromozomi. Succesul utilizării poliploidiei este condiţionat de următoarele: - să se lucreze cu specii caracterizate prin număr mic de cromozomi; - să se realizeze mai degrabă la plante alogame decât la cele autogame;

132

-

să se utilizeze specii cultivate mai ales pentru organe vegetative şi mai puţin pentru sămânţă.

10.1. Efectele poliploidiei În procesul de ameliorare a plantelor, poliploidia poate constitui premizele unor obiective majore dintre care menţionăm: Obţinerea unor dimensiuni mai mari ale diferitelor părţi ale plantei poate constitui un cert avantaj la speciile de la care se utilizează diferitele organe vegetative, sau la plantele decorative. De exemplu, poliploidia este utilizată în ameliorarea sfeclei de zahăr şi furajere, a trifoiului roşu, a secarei., a diferitelor specii floricole (narcise, zambile) ş.a. La speciile care se cultivă pentru sămânţă avantajele conferite de dimensiunile mai mari ale acesteia sunt adesea anulate de fertilitatea mai scăzută a poliploizilor. Sporirea productivităţii şi a calităţii constituie obiective majore în ameliorarea poliploizilor deoarece utilizarea lor, imediat după obţinere, nu prezintă o eficienţă economică deosebită. În cazul trifoiului roşu s-au obţinut sporuri de producţie cu 20-30% de masă furajeră, comparativ cu formele diploide. La aceeaşi specie, conţinutul în proteină a crescut cu 2-3% la formele 4n comparativ cu cele 2n. Acelaşi lucru este semnalat şi în cazul raigrasului tetraploid (SAVATTI, 1998). Obţinerea unor însuşiri noi, ce nu se manifestă la formele diploide este realizabilă prin poliploidizare. Sfecla poliploidă este mai rezistentă la cercosporioză, comparativ cu formele diploide din care provine. Secara, trifoiul roşu, raigrasul tetraploid manifestă o mai bună rezistenţă la factorii stresanţi de mediu, având calităţi biochimice superioare celor diploide. În cazul ultimelor două specii se observă o creştere a perenităţii. Favorizarea polenizării este un efect al poliploidiei, fiind utilizat cu succes în ameliorarea sfeclei de zahăr. S-a constat că polenul haploid de la plantele diploide germinează şi realizează o fecundare mai rapidă decât polenul diploid produs de plantele tetraploide. Datorită acestui fapt, prin cultivarea alternativă a unei forme diploide (2n) şi a unei tetraploide (4n) de sfeclă, sau în amestec de 3:1 în favoarea formei tetraploide, pe genitorul tetraploid se formează un procent ridicat de sămânţă triploidă hibridă (3n), utilizată în producţie. Sămânţa triploidă de sfeclă îmbină avantajele poliploidiei cu prezenţa heterozisului, ceea ce permite realizarea unor sporuri substanţiale de producţie, comparativ cu soiurile diploide sau tetraploide. Sterilitatea poliploizilor cu număr impar de garnituri cromozomale reprezintă un avantaj economic la unele plante agricole. La pepenele verde, prin încrucişarea formei diploide cu cea tetraploidă, hibrizii triploizi nu

133

formează sămânţă. Asemănător, bananierul cultivat este un triploid la care nu se formează seminţe. Se poate spune că există unele culturi la care autotriploidia poate constitui un obiectiv în sine. Acestea sunt hameiul, speciile de citrice şi pyrethrum. Propagarea clonală este implicată în aceste cazuri. Sterilitatea este atractivă pentru primele două culturi. La Pyrethrum sterilitatea contează mai puţin deoarece floarea şi nu fructul constituie rezultatul culturii. Îmbinarea genomurilor de la specii diferite. Prin poliploidizare s-a reuşit să se fixeze hibrizii interspecifici sub formă de amfiploizi, unii cu importanţă practică. Specia sintetică Triticale, care îmbină genomurile grâului cu cel al secării, prezintă avantaje, comparativ cu grâul, în zonele cu ierni foarte aspre, sau pe terenuri nisipoase. Amfiploizii pot fi utilizaţi ca forme intermediare pentru realizarea unor încrucişări îndepărtate. Elocvent în acest sens este soiul de grâu Transfer realizat de SEARS (GIOSAN şi SĂULESCU, 1972). Fixarea stării de heterozigoţie reprezintă una din direcţiile de perspectivă în utilizarea poliploidiei în ameliorare. Dublarea numărului de cromozomi permite ca fiecare gamet să posede doi cromozomi omologi, care pot fi diferiţi prin genele lor. Datorită acestui fapt, se poate stabiliza un înalt grad de heterozigoţie care rămâne neschimbată chiar şi în cazul autofecundării. Pe această cale se speră să se obţină fixarea heterozisului la porumb.  Autotetraploizii Autopoliploizii naturali se formează prin unirea gameţilor cu număr neredus de cromozomi (x=2x). Cei artificiali sunt obţinuţi, după cum s-a menţionat, prin tratamente cu diferite substanţe poliploidizante. Comparativ cu formele diploide, autotetraploizii au organele vegetative mai dezvoltate, manifestând fenomenul de gigantism. Utilizarea în procesul de ameliorare a unui astfel de material iniţial a permis realizarea de rezultate notabile la câteva plante de cultură. Trifoiul roşu tetraploid (2n=4x=28). Primele plante poliploide de trifoi roşu au fost create artificial, de către LEVAN în 1940, iar obţinerea primei varietăţi de trifoi roşu tetraploid s-a realizat în Suedia (JULÉN, 1959). După această dată, au fost create numeroase varietăţi tetraploide. Răspândirea lor a fost la început limitată de un conţinut mai scăzut de substanţă uscată, o sensibilitate la secetă şi mai ales de o producţie de sămânţă inferioară formelor diploide. Principalul dezavantaj a trifoiului roşu tetraploid, ca şi a altor culturi furajere poliploide, este o mai slabă legare a seminţelor comparativ cu formele diploide. Pe lângă unele neregularităţi ale meiozei, intervine şi faptul 134

că plantele tetraploide au flori mai mari şi mai puţine decât plantele diploide, fapt ce face ca polenizarea să se realizeze cu o oarecare dificultate de către polenizatori. Pe de altă parte, varietăţile tetraploide se evidenţiază printr-o perenitate evidentă, o bună rezistenţă la boli şi dăunători, conţinut ridicat în proteină şi glucide solubile, producţia ridicată de biomasă (SAVATTI, 1998). Raigrasul tetraploid. Euploidia şi aneuploidia constituie o sursă importantă de mărire a variabilităţii genetice, utilizată cu succes în genul Lolium, respectiv la L. perenne, L. multiflorum şi L. hybridum, ceea ce a permis crearea şi introducerea în cultură a soiurilor tetraploide. Primele soiuri tetraploide de raigras peren (L. perenne) şi raigras italian (L. multiflorum) au fost create în Olanda, prin tratarea seminţelor încolţite sau a plăntuţelor înfrăţite în diferite stadii, cu soluţie de colchicină 0,2% concentraţie, timp de 2-4 ore. Soiurile tetraploide cultivate au un MMB mai mare cu 72-82% decât soiurile diploide, un spor de producţie de masă verde de 8-18% comparativ cu soiurile diploide, dar aproximativ egală sub aspectul S.U. S-a constatat că deşi animalele preferă să pască plantele tetraploide, acestea nu prezintă rezistenţă la călcare, comparativ cu cele diploide (BOGOERT, 1975). În general, plantele tetraploide, comparativ cu cele diploide au culoarea verde închis, mai puţin lăstarii vegetativi, dar au frunze şi lăstari cu lăţimea, respectiv cu grosimea mai mare (SCHITEA, 1998). După MARIA SCHITEA (1998) selecţia plantelor tetraploide se face prin analiza mitozei, metodă ce a fost completată cu determinarea numărului şi măsurarea lungimii stomatelor, ceea ce permite o diferenţiere expeditivă a plantelor 2n de cele 4n, cu o mare marje de siguranţă. Soiurile tetraploide, de raigras aristat cât şi cel de raigras peren au fost create şi extinse în cultură fiind superioare formelor diploide, sub aspectul producţiei de masă verde şi a calităţii acesteia. Soiurile tetraploide sunt stabile din punct de vedere genetic, nu se încrucişează cu cele diploide. Cercetările recente, în domeniul utilizării euploidiei la raigras au vizat selecţia unor genotipuri cu conţinut ridicat de substanţă uscată pornindu-se de la un soi diploid valoros sub acest aspect (REHEUL şi BAERT, 1993; BAERT, 1994). Secara tetraploidă (2n=4n =28). Utilizarea şocurilor de temperatură iau permis lui DORSEY (1936) să obţină primul soi tetraploid de secară. Amplificarea lucrărilor s-a realizat după 1941, odată cu utilizarea curentă a colchicinei în lucrările de ameliorarea plantelor. Comparativ cu diploizii, autotetraploizii se caracterizează prin mărimea părţilor vegetative, rezultantă a unui număr mai mare de cromozomi şi a unui volum mai mare a celulelelor. Cultivarele tetraploide au paiul mai 135

tare şi mai înalt, frunze mai mari, spice mai lungi, iar seminţele sunt de aproape două ori mai grele decât în cazul diploizilor. Această ultimă modificare a adus schimbări în raportul dintre hidraţii de carbon şi proteine, secara tetraploidă având cu cca. 2% mai multă proteină şi de aici proprietăţi panificabile superioare. Un neajuns a secarei tetraploide este proporţia ridicată a sterilităţii, cu cca. 20% mai mare decât la secara diploidă, cultivată în condiţii de producţie. Sterilitatea rezultă din formarea trivalenţilor şi univalenţilor, ca şi a lipsei balansului necesar între cromozomi şi citoplasmă. Aceste cauze au făcut ca secara tetraploidă să fie timid acceptată de cultivatori. Un alt dezavantaj este acela că dacă este cultivată în vecinătatea unui lot cu secară diploidă incidenţa triploizilor va fi ridicată datorită polenizării libere, plantele triploide fiind complet sterile. Secara tetraploidă este adecvată a fi cultivată pentru furaj verde, având o dezvoltare luxuriantă a părţilor vegetative. Poliploidia deţine un loc important în ameliorarea arborilor. Astfel, creşterile viguroase şi producţia foarte ridicată de masă lemnoasă în cazul unor specii forestiere poliploide ca Sequoia sempervirens, Populus tremula f. gigans, Alnus glutinosa ş.a. sunt puse în valoare în practica silvică. Poliploizii induşi artificial la Angiosperme manifestă, în general, capacitate de acumulare de biomasă superioară diploizilor. La Gymnosperme, poliploidia, având efecte de reducere puternică a ritmului diviziunilor celulare, respectiv a creşterilor, este folosită pentru obţinerea de arbori pitici ornamentali(mai ales în Japonia). În silvicultură, însă, poliploidia este departe de a-şi fi dezvăluit marile sale resurse de ameliorare a arborilor, în vederea scurtării substanţiale a ciclurilor de producţie, a îmbunătăţirii calităţii lemnului, a creşterii conţinutului de celuloză şi colofoniu ş.a. Inducerea autotetraploidiei are o vechime mai mare de o jumătate de secol, obţinându-se rezultate remarcabile doar la un număr relativ mic de specii. Din cauza profundelor schimbări genetice şi a unei evidente lipse de balansare între nucleu şi citoplasmă, fac ca ciclul mitozei să fie mai lent, maturizându-se mai târziu comparativ cu diploizii. Totodată, numărul diviziunilor mitotice poate fi redus ceea ce face ca tetraploizii, în majoritatea cazurilor, să nu prezinte o creştere evidentă, în ciuda părţilor vegetative mai mari. Principalul neajuns al tetraploizilor artificiali este dată de sterilitatea parţială ce apare, în ciuda unui număr par de cromozomi. La tetraploizi există patru cromozomi omologi care favorizează un quadrivalent în stadiul de pachinem al meiozei. Dacă în anafaza I, o pereche de cromozomi migrează spre un pol şi cealaltă pereche spre celălalt pol, celulele sexuale vor conţine 136

acelaşi număr de cromozomi, fiind capabili de fecundare. În cazul neformării de quadrivalenţi, ci trivalenţi şi univalenţi, caz frecvent întâlnit la tetraploizii induşi, şi apreciat de CANDERON (1986), ca fiind în proporţie de 30-60%, apar gameţi cu număr inegal de cromozomi, incapabili de o fecundare normală. Dacă o genă este prezentă în patru doze în loc de două doze, ea poate interacţiona diferit cu alte gene, incluzând gene localizate în cloroplaste şi mitocondrii (MORRIS, 1983). Acest fapt poate genera, de asemenea, apariţia sterilităţii parţiale, care reduce valoarea practică a unor tetraploizi, exceptând pe cele care pot fi propagate vegetativ. Schimbarea din starea diploidă în cea tetraploidă cere o perioadă apreciabilă pentru realizarea unui balans biochimic şi genetic în cadrul celulelor şi părţilor vegetative, ca şi pentru adaptarea la mediu. Datorită acestui fapt, se recomandă lărgirea bazei genetice pentru inducerea autotetraploizilor şi acţiunea cu succes a presiunii de selecţie.  Autotriploizii Organismele la care în genomul complet fiecare cromozom este prezent de trei ori, se numesc triploizi (3x). Organismele triploide sunt mai viguroase decât echivalenţii lor diploizi sau chiar tetraploizi, utilizându-se cu succes în cultură (exemplu, sfecla de zahăr, sfecla furajeră ş.a.). Din cauza numărului impar de cromozomi meioza la triploizi este neregulată, rezultând organisme sterile. Acest fenomen prezintă un evident avantaj în cazul soiurilor comerciale triploide, neavând seminţe (struguri, pepene verde, banane ş.a.). La speciile cu multiplicare vegetativă cum ar fi ierburile, pomii fructiferi şi plantele decorative, triploizii sunt foarte frecvenţi. Ei pot să apară şi în cazul în care o ovulă cu un număr neredus de cromozomi (n=2x) este fecundată de polen cu număr redus de cromozomi (n=x). Obţinerea frecventă a triploizilor se realizează şi prin încrucişarea formelor tetraploide cu cele diploide. Sfecla de zahăr (2n=2x=18; 3x=27; 2n=4x=36), triploidă este un produs indiscutabil a ingineriei cromozomale. În 1938, SCHWANITZ a obţinut sfecla de zahăr tetraploidă, care prin încrucişarea cu sfecla diploidă a dus la crearea sfeclei triploide, mai productivă decât ambele forme parentale (după HENDRICKSEN, 1979). Crearea soiurilor poliploide de sfeclă necesită următoarele etape: - inducerea artificială a tetraploizilor şi selecţia acestora;

137

obţinerea formelor tetraploide valoroase, cu capacitate combinativă ridicată; - găsirea celor mai favorabile combinaţii hibride între formele tetraploide şi diploide. Soiurile poliploide conţin indivizi care aparţin la diferite grade de ploidie, de obicei di-, tri- şi tetraploizi, din care cauză au fost denumite anizoploide, spre deosebire de cele diploide şi tetraploide, care prezintă un singur grad de ploidie, fiind denumite izoploide. Componenţa soiurilor anizoploide este diferită, în sensul că proporţia triploizilor se ridică în general la peste 40%, de obicei 40-60%. La soiurile create pe bază de androsterilitate ea poate depăşi 90%. Proporţia diploizilor, care variază în limite mari, nu trebuie să depăşească 40%. În sensul strict al cuvântului, este considerat soi poliploid numai acela care este format din plante triploide şi tetraploide, iar soi triploid, în care predomină plantele triploide, având o proporţie redusă de plante cu alte grade de ploidie ale genomului. Componenţa soiurilor anizoploide este condiţionată de raportul dintre plantele soiurilor parentale, de gradul de fecundare selectivă a celor două forme parentale, de procedeul de recoltare, de sterilitatea polenului unuia dintre cele două soiuri componente ş.a. (STĂNESCU şi RIZESCU, 1976). Cel mai bun raport între formele parentale este de 1:3 sau 1:2, în favoarea formelor tetraploide, când se folosesc butaşi. Utilizarea butaşilor cu grad diferit de ploidie face ca plantarea să se facă alternând trei rânduri ale soiului tetraploid cu un rând a soiului diploid, sau 6:2. În cazul în care amestecul este format din sămânţă (bază), raportul poate fi de 1:5; 1:8, deoarece sămânţa tetraploidă are o germinaţie mai scăzută şi dimensiuni mai mari. S-a constatat că nu apar diferenţe marcante între proporţia tetraploizilor obţinuţi din sămânţa realizată de la semincerii plantaţi în rânduri alternative şi sămânţa rezultată din recoltarea în amestec a formelor parentale. Apar diferenţe evidente în cazul în care cele două forme parentale se plantează alternativ şi se recoltează sămânţa numai de la componentul tetraploid. Efectul heterozis ce se manifestă la formele poliploide de sfeclă de zahăr se datorează fenomenului de selectivitate în procesul fecundării. Încrucişarea liberă a formelor 4n şi 2n ar trebui teoretic, să ducă la realizarea unei seminţe hibride în proporţie de 50%. În realitate proporţia plantelor triploide poate fi de 60-80% în cazul utilizării -

138

soiului tetraploid ca mamă şi de 10-20% când soiul diploid este utilizat în această calitate. Avantajele oferite de sfecla de zahăr triploidă au fost evidenţiate mai ales după descoperirea fenomenului de androsteriltate de către OWEN în 1942. Aceasta, a făcut posibilă producerea pe scară largă, a hibrizilor triploizi monogermi. În acest scop se utilizează ca formă mamă linii androsterile, diploide sau tetraploide. FISCHER (după STĂNESCU şi colab., 1976), rezumând avantajele uneia sau altei forme materne, consideră ca neproductivă utilizarea formei tetraploide din cauza slabei capacităţi de germinare a seminţelor acestei forme. Pentru a crea soiuri comerciale triploide apare necesitatea, înaintea obţinerii hibrizilor, de a realiza o selecţie la nivelul liniilor androsterile diploide şi realizarea de sămânţă diploidă prin utilizarea liniei diploide menţinătoare. La nivel tetraploid apare necesitatea verificării gradului de ploidie şi capacitatea genitorului patern de a realiza un polen fertil. Pepenii verzi fără sămânţă (3x=33). Geneticianul KIHARA a obţinut în 1951 pepeni verzi fără sămânţă, prin încrucişarea pepenilor diploizi (2n=2x=22), cu cei tetraploizi (2n=4x=44). Din cauza meiozei complet neregulate, plantele triploide (3x=33) nu formează seminţe, situaţie ce avantajează comercializarea acestora. Viţa de vie triploidă şi tetraploidă (3x=57; 2n=4x=76). Soiurile triploide şi tetraploide de viţă de vie au fost realizate de asemenea, prin colchicinizare. Cele tetraploide au boabe mari şi un număr redus de seminţe, cu avantaje comerciale. Aspectele negative sunt condiţionate de producţia relativ scăzută. Soiurile triploide sunt complet lipsite de sămânţă fiind ideale pentru obţinerea stafidelor (soiuri apirene). La speciile forestiere din genurile Populus, Alnus, Betula, Robinia, stadiul triploid pare să reprezinte numărul optim de cromozomi, căruia îi corespunde potenţialul biologic maxim. Triploidul rezultat prin încrucişarea laricelui european cu laricele occidental (Larix occidentalis) s-a dovedit de asemenea, deosebit de viguros. Triploidul natural a plopului tremurător creşte mai viguros decât diploizii (tabelul 10.1) . Tabelul 10.1 Volumul tulpinilor la diploizi şi triploizi de plop treurător (diploizi=100%) (după Institut of Paperehemistry, din J.W.WRIGHT, 1964) 139

Părinţi

Diploizi (%)

Triploizi (%)

P. tremuloids × P. tremula

100

92

100

129

P. tremula × P. tremula

Mai repede decât diploizii cresc şi triploizii de Alnus glutinosa şi Ulmus glabra. În schimb, la Betula verrucosa şi B. verrucosa× B. mandshurica var. japonica, viteza de creştere a triploizilor este uşor diminuată.  Alopoliploidia Alopoliploizii sau amfiploizii rezultă în urma hibridării naturale sau artificiale a două sau mai multe specii sau genuri, urmate de dublarea sau multiplicarea seturilor de cromozomi. Duplicarea apare după fuzionarea a doi gameţi cu număr neredus de cromozomi. O metodă mai eficientă pentru obţinerea alopoliploizilor s-a dovedit tratarea generaţiei F1 cu colchicină. O altă cale este backcrosarea generaţiei F1 cu părintele ce posedă un număr mai mare de cromozomi. Alopoliploizii, datorită prezenţei în stare dublă a seturilor originare de cromozomi, fixează şi manifestă caracteristicile ambelor specii genitoare. Ei sunt fertili deoarece în meioză împerecherea cromozomilor este la fel de regulată ca şi la diploizii originari. Spre deosebire de autotetraploizi la care în meioză, din cauza homologiei cromozomilor se formează multivalenţi, în meioza alopoliploizilor (în lipsa homologiei dintre seturile de cromozomi) se formează numai bivalenţi. Datorită acestui fapt, în sporogeneză se vor forma gameţi normali. Pentru a înţelege procesul formării alopoliploizilor aceasta poate fi exemplificată prin intermediul unor specii sintetice, ca de exemplu, Triticale. În urma încrucişării între grâu şi secară apar plante F 1 cu 28 de cromozomi, a căror caractere sunt intermediare. Plantele F1 sunt complet sterile deoarece toţi cromozomii sunt univalenţi şi gametogeneza este neregulată. Când plantele F1 sunt backcrosate cu grâul, descendenţii rezultaţi posedă 42 de cromozomi derivaţi de la grâu şi 7 de la secară. Deoarece cromozomii de grâu formează bivalenţi în meioză, univalenţii de secară nu prezintă un efect negativ puternic asupra procesului meiotic a plantelor primului backcross, fiind parţial fertile. Gameţii diferiţi apar în cursul gametogenezei la plantele primului backcross. Cromozomii grâului fiind bivalenţi se distribuie regulat la polii celulei, câte 21 cromozomi la fiecare, în 140

timp ce cromozomii secarei fiind univalenţi se distribuie neregulat. Dacă un ovul va avea 21+7 cromozomi şi va fi fecundat de un grăuncior de polen cu 21+7 cromozomi, plantele rezultate vor avea cromozomii de la grâu şi de la secară, în total 56 cromozomi, constituind specia sintetică de tip octoploid denumită Triticale (genomul – AABBDDRR, 2n×8x=56) Acest tip de triticale a fost obţinut de către MUNTZING în Suedia şi PISAREV în Rusia, dar el nu s-a putut impune în producţia agricolă datorită producţiei de boabe relativ scăzută (SAVATTI, 1983). Pentru a corecta deficienţa semnalată, în ultimele decenii ale secolului trecut, s-au investit eforturi susţinute pentru a realiza Triticale hexaploide (AABBRR, 2n=6x=42), prin încrucişarea varietăţilor de grâu turgidum (2n=4x=28), cu secara (2n=2x=14) şi tratarea plantelor F1 cu colchicină (BOROJEVIĆ, 1990). Amploarea lucrărilor efectuate au dus la obţinerea unor soiuri valoroase de triticale, sub aspect cantitativ şi calitativ. În acest sens menţionăm soiurile Mapache, Beagle, Rohum ş.a. obţinute la CIMMYT în Mexic, Lasko, Grado, Bokro şi Malmo în Polonia, Vlădeasa, Ulpia, Silver Tebea ş.a. în România. Hibrizii între diferitele specii şi genuri oferă posibilităţi pentru creşterea potenţialului genetic a productivităţii. S-au creat aloploizi cu 42 de cromozomi între Elymus, care, posedă spice cu peste 100 spiculeţe şi grâu. MUJEEB-KASI şi colab., (1983) au menţionat astfel de realizări. Metodele moderne de inginerie cromozomală şi genetică pot duce la realizări noi în acest domeniu. Raigrasul hibrid este rezultanta încrucişării între Lolium perenne şi L. italicum, fiind considerat un amfiploid sintetic, de perspectivă. Are o creştere iniţială rapidă şi o valoare nutritivă ridicată moştenită de la raigrasul italian şi o rezistenţă ridicată la stresuri şi o bună fertilitate moştenite de la raigrasul peren. Rapiţa (Brassica napus, 2n×4x=36) este un sintetic realizat prin încrucişarea lui B. campestris (2n×2x=20) şi B. oleracea (2n×2x=16). Brassica napus a apărut în mod natural, dar se poate realiza şi pe cale artificială. Încrucişările între alotetraploizii naturali şi cei sintetici duc la o evidentă creştere a variabilităţii genetice, variabilitate care se foloseşte pentru ameliorarea noilor soiuri de rapiţă. Pe lângă alopoliploizii menţionaţi, au fost obţinuţi şi alţi alopoliploizi, dar aceştia se folosesc ca material experimental sau au o semnificaţie teoretică pentru studiile de genetică. Speciile forestiere. Anumite familii cu specii lemnoase, având numere de bază relativ mari: Fagaceae x=12, Aceraceae x=13, Betulaceae x=14, 141

Ulmaceae x=14, Juglandaceae x=16 par a fi provenit printr-un proces de alopoliploidie din trecutul îndepărtat de evoluţie a angiospermelor. În ceea ce priveşte formarea speciilor, de exemplu Aesculus carnea (4x) rezultă din încrucişarea speciilor A. hippocastanum (2n)×A. pavia (2x), fiind un alotetraploid fixat şi fertil. Triploidul A. plantierensis (2n=3x) a luat naştere prin încrucişarea dintre A. carnea (4x)×A. hippocastanum (2x), fiind steril. Fraxinus tomentosa (6x) pare să fie rezultanta încrucişării între F. americana (4x)×F. pennsylvanica (2x), iar Prunus domestica (2n=6x=48) este un amfiploid rezultat din încrucişarea P. spinosa (2n=4x=32)× P.cerasifera (2n=2x=16).  Aneuploizii Aneuploizii sunt organisme ce prezintă un număr mai mare sau mai mic de cromozomi individuali, comparativ cu disomicii (2n). În acest sens se pot menţiona: - monosomicii, 2n-1, organisme care au pierdut un cromozom; - nulisomicii, 2n-2, la care lipsesc ambii cromozomi ai unei perechi omoloage; - trisomicii, 2n+1, un cromozom fiind prezent de trei ori; - tetrasomicii, 2n+2, un cromozom este prezent de patru ori. Aneuploizii nu pot fi utilizaţi direct în producţie. Când se obţin serii monosomice şi trisomice, ele pot fi utilizate pentru substituirea sau adiţia cromozomilor individuali, la soiurile existente. Serii de monosomici şi trisomoci s-au obţinut la numeroase culturi agricole (tabelul 10.2), iar posibilităţile de utilizare a acestora au fost menţionate de către SEARS (1972), KHUSH (1973), RILEY şi LAW (1984). Tabelul 10.2. Linii monosomice şi trisomice la diferite specii agricole (după BOROJEVIĆ, 1990)

Grâu (T. aestivum) Ovăz (Avena sativa) Tutun N. tabacum) Tomate (Lycopersicum esculentum) Spanac (Spinacia oleracea) Secară (Secale cereale) Orez (Oryza sativa) Sorg (Sorghum vulgare)

2n = 42, cu 21 linii monosomice 2n = 42, cu 21 linii monosomice 2n = 48, cu 24 linii monosomice 2n = 24, cu 21 linii trisomice 2n = 12, cu 6 linii trisomice 2n = 14, cu 7 linii trisomice 142

Orz (Hordeum vulgare)

2n = 24, cu 12 linii trisomice 2n = 20, cu 10 linii trisomice 2n = 14, cu 7 linii trisomice

Prin utilizarea liniilor monosomice şi trisomice se poate evidenţia rolul anumitor cromozomi în expresia caracterelor şi a dezvoltării organismului întreg. Monosomicii permit localizarea poziţiei genelor pentru anumite caractere, pe cromozomi. Pentru a stabili care cromozom a unui soi este purtător a unei gene sau mai multor gene pentru o rezistenţă la un anumit patogen, se va încrucişa soiul respectiv cu monosomii altui soi. Dacă rezistenţa este diminuată şi controlată de o singură genă, se poate aştepta ca 75% din plantele F 2 să fie rezistente şi 25% susceptibile. Hibridarea care va da numai descendenţi rezistenţi indică că gena de rezistenţă este localizată pe cromozomul pentru care această plantă este monosomică. Maniera de lucru poate fi sumarizată la următoarele: A. – pentru localizarea cromozomului care poartă gena dominantă: a. – un genitor disomic posedând gena dominantă este încrucişat cu seriile monosomice ale altui genitor; b. – în generaţia F1, atât plantele monosomice cât şi cele disomice vor evidenţia un caracter dominant şi cromozomul purtător al genei de rezistenţă nu poate fi identificat; c. – în generaţia F2 plantele disomice segregă în dominante şi recesive în raport de 3:1. Descendenţii care nu segregă sunt monosomici şi posedă cromozomul care poartă gena dominantă. B. – pentru localizarea unui cromozom care poartă gena recesivă: În acest caz, localizarea cromozomului ce poartă gena recesivă se poate realiza în F1, pe baza următoarei scheme: a. – un genitor disomic posedând o genă recesivă este încrucişat cu seriile monosomice ale altui genitor; b. – în generaţia F1, planta cu caracterul recesiv este monosomică şi posedă cromozomul purtător a genei recesive. Pe baza celor menţionate, numeroase gene de pe cromozomii individuali au fost localizaţi cu ajutorul seriilor monosomice. Menţionăm că gena Lr9 pentru rezistenţa la rugina frunzelor de grâu este localizată pe braţul lung al cromozomului 6B, gena Hg pentru glume păroase, pe braţul scurt al cromozomului 1AS (SEARS, 1966).

143

În cazul speciilor forestiere, la genul Tiletia (x=41=6×7-1), cei mai apropiaţi părinţi au 7 cromozomi, aşa că originea sa se explică prin multiplicarea seturilor iniţiale şi prin aneuploidie (WRIGHT, 1950). 10.2. Adiţia şi substituţia de cromozomi Pe lângă importanţa deosebită ce o prezintă pentru studiile genetice, aneuploidia stă şi la baza unor metode de ameliorare cum sunt: adiţia de cromozomi, substituţia de cromozomi şi transferul de gene. Prin intermediul lor s-au obţinut rezultate favorabile sub aspectul ameliorării rezistenţei grâului la boli. Utilizarea seriilor monosomice a permis substituirea cromozomilor individuali dintr-un soi, cu cromozomii din alt soi. În cazul încrucişării a doi genitori, există şanse reduse ca descendenţa să aibă toţi cromozomii unui părinte şi numai un cromozom de la celălalt părinte, a cărui caracter se intenţionează a fi transferat. Aceasta a fost posibil prin obţinerea şi utilizarea seriilor monosomice. SEARS (1956) a transferat rezistenţa la rugina frunzelor, de la Aegilops umbellulata la grâul comun. Pentru reuşita hibridării a folosit o specie intermediară, Triticum dicoccoides, după schema: ♀ T. dicoccoides AABB × ♂ Ae. umbellulata UU F1 × grâul comun (T. aestivum) AABBDD BC1F1 × grâul comun BC2F2 × grâul comun BC2F3 realizându-se o plantă cu 21" (grâu)+1' (Aeg) (simbolul ' reprezintă univa-lenţii, iar " bivalenţii). S-a obţinut o plantă rezistentă la rugina frunzelor cu 42 cromozomi de la grâu şi un bivalent de Aegilops. Hibridul obţinut prezenta unele deficienţe, ceea ce a pus problema separării din cromozomul de la Aegilops purtător a rezistenţei la rugină, de caracterele negative. Descendenţii plantelor primare au fost expuse iradierii cu raze X, iar polenul iradiat a fost utilizat pentru polenizare. Din cele 6.091 plante obţinute, 40 au prezentat partea dorită de la cromozomul de Aegilops, translocată cromozomului 6B al grâului comun. SEARS a denumit noul soi Transfer, care, timp de mulţi ani a servit, în programele de ameliorare, ca sursă de rezistenţă la rugina frunzelor şi tulpinilor (fig. 10.1.). 144

Un exemplu mai recent, îl constituie transferul rezistenţei la Pseudocercosporella herpotrichoides de la Aegilops ventricosa la Triticum aestivum prin intermediul T. turgidum subsp. carthlicum (CAUDERON, 1986). Soiul ROASARE prezintă gene de rezistenţă de la Ag. ventricosa pe cromozomul 7D, prezentând şi translocaţia 5B/7B. Adiţia de cromozomi a fost aplicată şi în obţinerea unor linii de adiţie prin încorporarea unui cromozom de la secară, într-un set cromozomal al grâului (O’MARA, 1951; EVANS şi JENKINS, 1960). Liniile de adiţie de secară, ovăz, grâu şi tutun obţinute până în prezent, nu au dus la crearea unor soiuri comerciale valoroase, deoarece genotipurile cu una sau mai multe perechi de cromozomi adiţionaţi de la alte specii sunt instabile şi cromozomul adiţionat se pierde în mod frecvent. Substituţia interspecifică şi intervarietală are o seminificaţie mult mai mare pentru ameliorarea plantelor decât adiţia de cromozomi. Dacă un soi, posedând o serie monosomică se utilizează ca recurent şi se intenţionează încorporarea rezistenţei la rugina frunzelor (ex. Lr9) în acesta, se încrucişează cu un soi donator care posedă gena (ex. soiul Transfer). În generaţia F1 se realizează selecţia pentru plantele rezistente la rugina frunzelor şi se retroîncrucişează cu soiul recurent. După 4-6 backcrossuri şi autopolenizări, se obţin plante disomice care au majoritatea perechilor de cromozomi de la soiul recurent şi o pereche de cromozomi de la donator, purtătoare a genei pentru rezistenţă. Pentru substituţia cromozomilor intervariatali, o perioadă îndelungată de timp a fost utilizat soiul Chinese Spring, la care SEARS (1954), a creat o serie completă de monosomici, asigurând sămânţă tuturor amelioratorilor interesaţi. Soiul menţionat neavând valoare agronomică deosebită, liniile de substituţie au prezentat interes pentru studiile de genetică privind rolul cromozomilor individuali în controlul anumitor caractere.

145

Emmer (Triticum turgidum ssp. diccocoides)

Fig. 10.1. Substituţie de gene prin hibridare interspecifică

LAW şi colab. (1987) au obţinut linii de substituţie la un soi comercial valoros, Capelle Desprez şi la soiul semipitic Hobbit “Sib”.

146

Liniile de substituţie ale lui Capelle Desprez au fost folosite pentru studii genetice privind vernalizarea, talia plantelor, rezistenţa la boli, calităţile de panificaţie şi compenentele producţiei. Exemplele menţionate ilustrează substituţiile intervarietale, respectiv între două soiuri ale aceleaşi specii. Se pot realiza substituţii de cromozomi între diferite specii sau genuri. La grâu, în urma studiilor făcute de RILEY şi CHAPMAN (1958), RILEY (1968), s-au obţinut rezultate interesante. Ei au demonstrat că împerecherea cromozomilor omologi este controlată de o genă dominantă (Ph) localizată pe braţul lung al cromozomului 5B. RILEY (1968), a transferat rezistenţa la Puccinia striiformis de la Aegilops comosa la grâul comun. Plantele rezulate au 42 de cromozomi de la grâul comun şi un bivalent – cromozomul 2M – de la Aegilops. Rezultatul acestei hibridări a fost soiul Compire. Acest soi are o meioză normală şi poate fi utilizată la transferul rezistenţei la P. striiformis fără a manifesta dificultăţile ce apar de regulă în cazul hibridărilor interspecifice. LAW şi colab. (1983) au reuşit ca prin substituirea cromozomului 2M de la Aeg. comosa cu unul dintre cromozomii 2A, 2B sau 2D de la grâul comun să ridice în mod semnificativ conţinutul în proteină la ultima specie. Substituirile de cromozomi între grâu şi secară au stat la baza obţinerii unor soiuri de grâu de mare valoare comercială. Cele mai interesante substitiţii şi translocaţii sunt cele ale cromozomului 18 de la grâu şi cromozomul 1R la secară. Soiul Zorba obţinut în Germania are un cromozom complet al secării 1R, substituind o pereche de cromozomi de la grâu, 1B. Această substituţie a dus la imprimarea rezistenţei faţă de unele rase de rugină, rugina tulpinilor (Sr31), rugina frunzelor (Lr26), rugina striată (Yr9) şi făinare (Pm8). Ca rezultat a încrucişărilor între varietăţi de grâu şi secară, braţul scurt al cromozomului de secară 1R a fost translocat la cromozomul de grâu 1B, formând translocaţia 1BL/1BS, în care sunt păstrate genele pentru rezistenţă la boli de la secară. Prin acceaşi metodă s-a obţinut şi soiul Salzmunder Bartweizen, cu translocaţia 1B/1R. De la acest soi au derivat numeroase soiuri cu substituţie, dintre care menţionăm soiul Neuzucht, utilizat de LUKYANENKO pentru obţinerea soiurilor Caucaz şi Aurora cu o bună rezistenţă la boli, o excelentă structură a spicului şi fertilitate. Deşi nu s-au răspândit în cultură în URSS, au contribuit la crearea a numeroase soiuri cu productivitate ridicată din multe ţări, cum sunt Lovrin10 în România, Anika, Istra şi Solaris în Cehoslovacia, Burgas, Balcan şi Zvesda în Iugoslavia ş.a. (BOROJEVIĆ, 1990). 147

Au fost realizate substituţii sau translaţii de cromozomi ai grâului, cu alţi cromozomi, de la secară (2R şi 7R), dar fără a se atinge succese notabile în ameliorare, comparativ cu cele menţionate anterior.

10.3. Haploidia Pe lângă fenomenul de poliploidie, în natură se întâlnesc şi cazuri de reducere la jumătate a numărului de cromozomi din celulele somatice, adică de la 2n la n, fenomen denumit haploidie (n fiind multiplul numărului de bază x). Cu alte cuvinte organismele haploide posedă în celulele somatice acelaşi număr de cromozomi (n) ca şi un gamet al aceleiaşi specii. Primii haploizi au fost detectaţi, şi studiaţi la Datura stramonium de către BLAKESLEE şi colab. în 1923 (după BOROJEVIĆ, 1990). Ulterior, s-au găsit haploizi la porumb, tutun, tomate, grâu, ş.a. O plantă haploidă se dezvoltă dintr-un ovul nefecundat (ginogeneză), din alte celule ale gametofitului (apogamic), dintr-un gamet mascul (androgeneză) sau prin poliembrionie, conţinând diferite forme genomice, în funcţie de nivelul de ploidie a speciilor din care provin (LACADEMA, 1974). Înjumătăţirea numărului de cromozomi din celulele somatice şi de apariţie a haploizilor şi-a găsit aplicare în ameliorarea plantelor. Astfel, la porumb, haploizii care apar în mod natural, cu o frecvenţă redusă, sunt utilizaţi prin redublarea numărului de cromozomi la obţinerea de linii absolut homozigote. Odată izolată secvenţa urmărită, se recurge la dublarea numărului de cromozomi prin colchicinizare, pentru a reveni la numărul normal de cromozomi. Frecvenţa haploizilor naturali este scăzută, de aproximativ 1/1.000 în cazul partenogenezei şi cca. 0,1/1.000 în cazul androgenezei. La plantele superioare, incidenţa haploidiei naturale este de 0,05% la Zea mays, 0,5% la Triticum monococcum, 0,025% la T. aestivum, 0,0250,037% la Gossypium barbadense etc. Ca o regulă generală, plantele haploide sunt mai scunde decât cele diploide, mai puţin viguroase, tardive şi complet sterile din cauza cromozomilor univalenţi. Pentru a se corecta aceste deficienţe, haploizii se dublează cu ajutorul colchicinei pentru a se obţine organisme diploide, aşa numiţii dihaploizi sau dubli haploizi. Oragnismele dihaploide sunt complet homozigote pentru toate genele alelice, situaţie ce nu se realizează în totalitate în cazul liniilor consangvinizate, sau a organismelor autogame. Importanţa lor pentru 148

studiile de genetică ca şi în ameliorare au dus la aprofundarea metodelor de obţinerea lor in vivo şi in vitro, cu o frecvenţă sporită.

10.3.1. Metode de inducere a haploizilor şi dublu haploizilor Deşi are o valoare teoretică şi potenţialităţi largi de aplicare, haploidia, până în ultimele decenii a ocupat un loc nesemnificativ în programele de cercetare genetică şi de ameliorare a plantelor de cultură. Aceasta s-a datorat incidenţei reduse a haploidiei spontane, dar mai ales lipsei unor metode experimentale eficiente pentru izolarea de haploizi cu frecvenţă ridicată şi de obţinerea de linii dublu haploide homozigote. Dintre metodele experimentale, actuale, de inducere a haploizilor, cele mai utilizate sunt: a. Poliembrionia, respectiv apariţia de embrioni gemeni sau mai mulţi embrioni, este destul de frecventă la plante. Embrionii gemeni pot avea o constituţie cromozomală identică: diploid-diploid, haploidhaploid sau diferită, diploid-haploid, diploid-tetraploid, haploidtriploid etc. Poliembrionia ca sursă de haploizi se utilizează frecvent la speciile de Linum usitatissimum, Caspicum annuum, Beta vulgaris ş.a. (NITZSCHE şi WENZEL, după SAVATTI, 1983). Frecvenţa poliembrioniei variază în funcţie de specie şi de genotip. Existenţa unui control genetic a acestui fenomen permite selecţia de genotipuri cu capacitate mărită de formare de poliembrioni, deşi între incidenţa poliembrioniei şi frecvenţa haploizilor nu s-a găsit nici o corelaţie stabilă. La ICCPT Fundulea s-a utilizat cu succes această metodă pentru obţinerea de haploizi şi linii dublu haploide homozigote la in (DOUCET, 1970). b. Hibridarea interspecifică şi interploidă, permite obţinerea haploizilor partenogenetici sau semigametici la speciile cultivate Solanum, Medicago, Brassica, Nicotiana, Gossypium ş.a. La Solanum tuberosum se obţin haploizi în procente relativ ridicate prin încrucişarea speciilor tetraploide (2n=4x=48), cu specii diploide (2n=2x=24). Această metodă a devenit extrem de folosită odată cu descoperirea polenizatorului diploid Solanum phureja de către HOUGAS şi PELAQUIN (1957). Prin selecţia riguroasă a genitorilor 149

s-a mărit frecvenţa haploizilor de 10-11 ori (PANFIL, ELENA MARIN, 1972-1974). În cazul lui Medicago sativa, autotetraploid, obţinerea de linii dihaploide se realizează prin hibridarea cu diploidul Medicago falcata (BINGHAM, 1969). Când un tetraploid şi un diploid sunt încrucişaţi, ca rezultat al partenocarpiei, se obţine un dihaploid care posedă embrion 2x şi endosperm 6x, în loc de 4x+6x. În cazul căpşunului, octoploid, încrucişarea se realizează cu tetraploidul Potentilla arsenina utilizat ca polenizator (JANICK şi HUGHES, 1974). Se întâlneşte adeseori şi fenomenul de semigamie când celula generativă a unui grăuncior de polen intră în sacul embrionar dar nu fuzionează cu ovula, rezultând o plantă haploidă himerică. Frecvenţa haploizilor poate fi influenţată pozitiv de polenizarea întârziată (CHASE, 1969), tratamente chimice (LACADENA, 1974), sau sub efectul citoplasmei străine (TSUNEWAKI şi colab., 1968). c. Selecţia de genotipuri stimulatoare şi a markerilor genetici pentru inducerea şi depistarea haploizilor, se utilizează cu succes în special la porumb (CHASE, 1974). Pentru izolarea de haploizi prin procedeul markerilor genetici, forma maternă cu gene recesive, este polenizată cu polen ce prezintă alele dominante marcatoare. Cea mai mare parte a descendenţei fiind de origine hibridă, va manifesta caracterele dominante marcatoare ale tatălui şi se va elimina. O mică parte a descendenţei (cca. 1/1.000) la care nu se manifestă caracterele dominante marcatoare ale genitorului patern, se presupune a fi haploidă (de origine partenogenetică) şi se va menţine pentru analiză citologică, în vederea confirmării stării haploide (BOTEZ, 1979). Încă din anul 1949, CHASE a obţinut la porumb linii homozigote de origine haploidă, prin utilizarea markerilor genetici de culoare. La început a utilizat markeri de culoare ai plăntuţei, apoi markeri de culoare ai embrionului şi seminţei. Paralel cu utilizarea markerilor genetici, CHASE a selecţionat şi folosit genotipuri valoroase ca sursă pentru haploizi. Varietăţile de porumb Stock 6, Golden Cross Bantam şi Stiff Stalk Sinthetic au indus o frecevnţă de 4/1.000 haploizi, iar hibrizii dubli de la aceşti haploizi au dat frecvenţe de 10/1.000 de indivizi. Selecţia de genotipuri din Stiff Stalk Sinthetic a mărit frecvenţa haploizilor de la 1,2 la 8,7/1.000. d. Cultura in vitro. Metoda culturii de antere a devenit cea mai importantă metodă in vitro de obţinere a haploizilor, din polen. S-au 150

obţinut haploizi, prin această metodă la peste 60 de specii, 90% din familiile Solanacee şi Gramineae (SUNDERLAND, 1983; JENSEN, 1986). Regenerarea cu succes a plantelor întregi din calusul anterelor a fost realizată numai la un număr limitat de specii de plante, tutun, cartof, varză, tomate, orez, grâu, petunia, porumb etc. (JENSEN, 1986). Perspectivele utilizării androgenezei – ale cărei potenţialităţi au fost insuficient valorificate – depinde de elucidarea unor aspecte de biologie celulară privind modificările ce au loc în antere în cursul meiozei şi diferenţierii polenului, ca şi de îmbunătăţirea metodologiei de lucru, la nivelul tuturor etapelor (SAVATTI, 1989). Deaorece haploizii pot apărea în mod natural dintr-un ovul nefecundat sau alte celule din ovar, s-a încercat obţinerea de haploizi din culturile in vitro din ovare şi ovule. În general, prin ginogeneză experimentală s-au obţinut unele succese la sfecla de zahăr şi gerbera, dar mai puţin spectaculoase la alte specii, ca de exemplu la grâu (BOROJEVIĆ, 1990). O metodă laborioasă a obţinerii de haploizi in vitro constă în eliminarea preferenţială a cromozomilor, metodă denumită bulbosum şi a fost elaborată de cercetătorii canadieni KASHA şi KAO (1970). Când orzul cultivat (Hordeum vulgare) este încrucişat cu orzul sălbatic (H. bulbosum) seminţele rezultate au endospermul nedezvoltat. Este posibilă obţinerea de plantule din astfel de seminţe, prin culturi de embrioni. Embrionii derivaţi din H. bulbosum sunt eliminaţi în stadiile timpurii de dezvoltare a plantulelor, iar cele care au supravieţuit sunt de fapt plante haploide de H. vulgare (SIMPSON şi SNAPE, 1981) (fig. 10.2.). În această încrucişare are loc în mod normal fecundarea, formându-se zigoţi în proporţie de 65%, iar în stadiul timpuriu al dezvoltării embrionare (12-14 zile după polenizare), are loc eliminarea preferenţială treptată a cromozomilor bulbosum. Plăntuţele formate din aceşti embrioni conţin numai genomul vulgare în stare haploidă. Eliminarea diferenţiată a cromozomilor are loc indiferent de specia folosită ca genitor femel sau mascul. Metoda a fost extinsă şi la grâu, polenizator fiind folosit porumbul. Tehnica culturilor in vitro a fost pusă la punct şi este folosită pe scară tot mai largă şi în cazul speciilor forestiere. Realizarea în masă, chiar în F1, a unor populaţii de linii complet homozigote la arbori, prin utilizarea metodei menţionate, deschide largi perspective în analiza genetică privind structura cromozomilor, localizarea mutaţiilor, transformarea genelor prin recombinare, ca şi în selecţie şi extinderea în cultură a genotipurilor superioare. Haploizii având o structură 151

genetică unitară, pun în evidenţă, pregnant, intensitatea de impact a mediului, în diferite condiţii ecologice de cultură forestieră comparată (STĂNESCU, 1982).

Fig. 10.2. Producerea de haploizi prin metoda bulbosum

10.4. Particularităţile citologice ale poliploizilor Autopoliploizii se formează prin dublarea genomurilor proprii, în meioză sau mitoză. Astfel, diviziuni meiotice anormale conduc la apariţia de celule sexuale nereduse, diploide (2x) şi după fecundarea acestora, la organisme tetraploide (4x). Diviziuni mitotice anormale ale celulelor zigotului, prin nesepararea şi nedeplasarea cromozomilor în anafază, cauzează, de asemenea, formare de organisme tetraploide (4x). 152

La plantele autotetraploide, meiozele relativ anormale cauzează scăderea fertilităţii şi apariţia de forme aneuploide, cu vitalitate diminuată (fig. 10.3). Se consideră, de aceea, că derivaţii autotetraploizi ai diploizilor fertili au tendinţa de a fi sterili, aşa cum se întâmplă în cazul autotetraploizilor de Larix europaea şi Cryptomeria japonica.

Fig. 10.3. Meioza normală (a) la diploizi şi anormală (b,c,d) la autotetraploizi, care care duce la formare de gameţi cu număr variat de cromozomi (după RAICU, 1980)

În natură există totuşi numeroase specii autotetraploide cu fertilitate normală, care, având însuşiri superioare diploizilor, probabil s-au menţinut la început prin înmulţire vegetativă, pentru ca, ulterior, prin selecţia naturală, să se elimine treptat formele cu meioză anormală, precum şi cele aneuploide, puţin viguroase. Alopoliploizii sunt adeseori sterili, deoarec pot rezulta fie prin încrucişarea unor genitori cu genomuri complet diferite şi, ca urmare, împerecherea cromozomilor proveniţi de la cei doi părinţi nu este posibilă, fie prin încrucişarea unor forme cu genomuri omoloage, caz în care în meioză apar tetravalenţi, trivalenţi şi univalenţi, cu aceleaşi efecte nefuncţio-nale ca la autopoliploizi. Alotetraploizii proveniţi din hibrizi diploizi sterili sunt însă susceptibili de a fi fertili şi fixaţi. Hibrizii diploizi, conţinând două serii diferite de cromozomi, de exemplu, A şi B, relevă aceleaşi 153

dezechilibre în repartizarea cromozomilor în gameţi, menţionate mai sus. Alotetraploizii şi amfiploizii derivaţi din aceştia include câte două seturi genomice de la cei doi părinţi (AABB), aşa încât, la formarea celulelor sexuale, în meioză, fiecare gamet primeşte în total 2n cromozomi, şi anume de la fiecare genitor câte n cromozomi. Ca urmare fertilitatea polenului se restaurează şi fructificaţia se normalizează.

CAPITOLUL XI Ingineria genetică (Transferul de gene) Metodele şi tehnicile discutate se încadrează în sens larg în domeniul ingineriei genetice, cu toate că ele nu au de-a face cu transferul genelor individuale, ci doar cu manipularea celulelor plantelor în care sunt încorporate genoame nucleare sau citoplasmatice, sau fuziunea acestora. Transferul unei gene particulare de la un organism la altul prin tehnicile ADN-ului recombinant, este considerată ca fiind domeniul ingineriei genetice pure. Cu alte cuvinte, ingineria genetică constă din manipularea directă a materialului genetic şi transferul genelor dorite, de la un organism la altul ca şi transferul unor gene obţinute prin sinteză chimică (DARBESHWAR ROY, 2000). Descoperirea enzimelor de restricţie a permis segmentarea moleculelor de ADN în anumite puncte, fiecare fragment fiind în majoritatea cazurilor o genă individuală şi recombinarea acestor fragmente într-un nou lanţ de ADN recombinant (WATSON şi colab., 1983). Ingineria genetică implică următoarele proceduri : - selecţia unui donor pentru o genă dorită ; - selecţia unui vector sau a unei tehnici de transfer a genei la un receptor (sau recurent) ; - selecţia unui receptor în care gena transferată va funcţiona normal. Tehnicile ADN recombinant s-au dovedit de mare succes la nivelul procariotelor în producerea unor medicamente, cum ar fi insulina şi interferonul (WATSON şi colab., 1983). Aplicarea ingineriei genetice la plante nu s-a dovedit atât de fastă, de la început. Una din încercările de pionierat a fost transferul genelor de nitrificare (nif) de la Rhizobium la plante care nu trăiesc în simbioză cu aceste bacterii (porumbul, grâul, alte monocotiledonate). S-au făcut încercări de transfer al genelor nif de la Rhizobium, prin intermediul unui bacteriofag ca vector, la specia Trema canalina. 154

Studiile au evidenţiat că transferul genelor nif nu este suficient pentru a realiza obiectivul propus şi că pe lângă ele trebuiesc transferate gene promotoare şi că există în planta gazdă gene specifice care afectează genele nif (VERMA şi LONG, 1983). O reuşită viitoare a transferului genelor nif, care să controleze fixarea azotului atmosferic la plantele neleguminoase va diminua substanţial utilizarea fertilizanţilor cu azot. Pe lângă virusurile utilizate ca vectori pentru transferul unei gene dorite în receptor, sunt utilizate şi plasmidele, în special plasmidul Ti (plasmid inductor de tumoare), izolat din Agrobacterium tumefaciens. Plasmidele sunt molecule circulare de ADN care se comportă ca microcromozomi. Ele se regăsesc în aproape toate microorganismele. Plasmidul se poate secţiona prin enzimele de restricţie şi genele dorite se pot introduce în el. După aceea, plasmidul este refăcut, enzimatic, formând un plasmid himer. Acesta se încorporează din nou în bacteria care este folosită apoi pentru infecţia organismului recipient. Dacă ADN-ul plasmidial este integrat în genomul receptorului şi genele transferate se manifestă, se consideră că s-a obţinut pe această cale un organism transformat sau transgenic (fig.11.1.) Manipularea genetică la plante se desfăşoară în mai multe etape care în principiu include transferul unei gene străine în alt organism. Gena utilizată este o genă himerică, constituită din trei părţi : (1) o genă bacteriană care codează secvenţele pentru fosfotransferaza de neomicină, sau NPT, care conferă rezistenţă la antibioticul kanamicină, (2) un promotor şi (3) un terminator al lui T-ADN din Agrobacterium ; ultimele două permit funcţionarea genei transferate în noul mediu. (A) Gena este introdusă în plasmidul Ti (care nu poartă genele care cauzează boala tumorală) şi încorporată în Agrobacterium. (B) cu Agrobacterium se infectează protoplaştii plantelor de tutun. După câteva săptămâni, protoplaştii formează calus (D) din care se regenerează plante întregi (E). Testarea rezistenţei plantelor regenerate la kanamicină se face prin semănarea seminţelor lor într-un mediu care conţine kanamicină (F). Plantele care rămân verzi şi se dezvoltă, posedă gena bacterială ce stimulează existenţa enzimei NPT, capabilă să detoxifice kanamicina. Cele lipsite de gena bacterială rămân albe, deoarece kanamicina distruge cloroplastele (după TEMPE şi SCHELL, 1987) (fig. 11.2). Cea mai simplă metodă de transformare a plantelor prin intermediul plasmidului Ti este metoda discului (HORSCH şi colab., 1985). Discurile foliare, cu un diametru de 6 mm, se infectează cu Agrobacterium tumefaciens care conţine un plasmid himeric cu gena

155

dorită. Prin această metodă s-a reuşit să se transfere gene rezistente la antibiotice, kanamicină şi carbamicină (HORSCH şi colab., 1985). Transferul de gene prin încorporarea directă a unui plasmid Ti în protoplast apare ca o posibilitate eficientă în cazul petuniei şi a altor dicotiledonate (COCKING şi DAVEY, 1987). Primele rezultate ale transferului direct de gene pentru rezistenţa la kanamicină au fost obţinute cu protoplaşti de Triticum monoccum şi Lolium multiflorum (POTRYCUS şi colab., 1985). Microinjectarea de ADN în nucleii protoplaştilor sau în inflorescenţe constituie o metodă nouă de transfer a genelor (SCHELL, 1987), demonstrată cu imprimarea rezistenţei la kanamicină şi încorporarea genelor de rezistenţă în mugurii floriferi de secară.

156

157 Fig. 11.1. Obţinerea de plante transgenice prin utilizarea de ADN-T de la Agrobacterium tumefaciens şi A. rhizogenes

Fig 11.2. Obţinerea ADN-recombinant. Inserţia genei pentru rezistenţă la kanamicină kanr din plasmidul pSC102 în plasmidul pSC101 şi introducerea ADNrec într-o celulă de Escherichia coli (după G. ZUBAY, 1992).

Transferul de gene pentru rezistenţa la antibiotice în plante se utilizează numai ca marker pentru alte transferuri folositoare în ameliorarea plantelor. Un exemplu îl constituie transferul genelor pentru rezistenţă la ierbicide, realizare deosebit de importantă pentru agricultură. Ierbicidul glyphosphat este un inhibitor al enzimei 5enolpiruvilshikimate-3-fosfatază (EPSP) sintetizată de plantă. COMAI şi colab. (1985) au izolat gena mutantă aro A pentru EPSP din bacteria Salmonella typhirium şi l-au transferat în plasmidul Ti la A. tumefaciens cu care au infectat plante de tutun. Plantele transformate au manifestat o anumită rezistenţă la ierbicide. SHAH şi colab. (1986) au izolat o clonă de ADN complementară care cuprinde sinteze de EPSP dintr-o linie de petunia, tolerantă la glyphosphat. O genă himeră EPSP a fost realizată cu ajutorul 158

virusului conopidei 35 S, în calitate de promotor, indusă în celulele de petunia. Plantele transformate au arătat toleranţă la ierbicid. Unele ierbicide comerciale conţin fosfinotricină (PPT) care este un inhibitor al glutaminei şi al sintezei acestuia în plante, fiind utilizat ca un ierbicid neselectiv. DE BLOCK şi colab. (1987) au folosit gena bar care conferă rezistenţă la Streptomyces hygroscopicus la bialaphos (o tripeptidă care conţine PPT) şi include fosfinotricinacetiltransferaza (PAT) capabil să convertească PPT-ul într-o acetilată netoxică. Prin intermediul vectorului Agrobacterium, s-a reuşit transferul genei bar în tutun, tomate şi cartofi. Plantele transgenice au manifestat o creştere a enzimei PAT, fiind complet rezistente la dozele ridicate din produsele comerciale de fosfinotricină şi bialaphos. Exemplul reprezintă un succes în obţinerea plantelor rezistente la ierbicide. POWEL-ABEL şi colab. (1986) au evidenţiat posibilitatea obţinerii de plante transgenice pentru bolile virotice. O genă himerică având un ADN clonat pentru proteina protectoare (CP) şi gena acestuia la virusul mozaicului tutunului (TMV) a fost încorporată în celule de tutun prin intermediul unui plasmid TI. Plantele regenerate au manifestat rezistenţă la TMV ca pe un caracter nuclear. Tehnica ADN recombinant oferă multe alte posibilităţi. JAMES şi colab. (1986) au urmărit să îmbunătăţească compoziţia proteică a plantelor. Ei au sintetizat un fragment de ADN care codifică conţinutul ridicat de aminoacizi esenţiali. Fragmentul denumit genă de introducere a acizilor esenţiali (HEAAE-gene) a fost clonată şi introdusă într-o bacterie. În acest fel gena a fost introdusă în cartof prin intermediul lui Agrobacterium rhizogenes (plasmid Ri), obţinându-se plante transformate. Un rezultat interesant l-a obţinut OW şi colab. (1986) care au reuşit transferul genei luciferaza de la licurici (Photinus pyralis), prin intermediul virusului mozaicului conopidei 35 S în protoplaştii de Daucus carota prin electroporaţie şi la Nicotiana tabacum prin folosirea plasmidului Ti de la A. tumefaciens. Deşi fără importanţă practică deosebită, realizarea menţionată poate fi de larg interes pentru unele plante horticole, dar poate servi şi la realizarea de markeri pentru manipularea altor gene. Utilizarea lui Agrobacterium în procesul de transformare genetică a plantelor este destul de complicată. Datorită acestui fapt au fost încercate şi alte metode. Una dintre acestea este un transfer direct de gene în celulele plantelor cultivate in vitro. Metoda injectării de ADN a ridicat câteva probleme legate de dificultăţile de penetrare a peretelui celular, daune produse celulelor injectate (SCHWEIGER şi 159

colab., 1987). Injectarea directă în plante, seminţe, embrioni sau polen nu au dovedit că gena introdusă este integrată şi moştenită stabil (SCHELL, 1987). De dată mai recentă s-a demonstrat reuşita transformării prin injecţie directă, a ADN-ului plasmidial în mugurii florali de secară, reuşindu-se obţinerea a trei plante transgenice de secară (BOROJEVIĆ, 1990). Tehnica ADN recombinant este fără îndoială o realizare fascinantă a gândirii umane, dar de la care nu trebuieşte să se aştepte miracole. Trebuiesc aprofundate în continuare procesele metabolice la nivel molecular, procese de diferenţiere celulară şi organogeneză, bariarele de integrare şi funcţionare a genelor străine transferate şi nu în ultimul rând dacă plantele transgenice nu pot fi dăunătoare regnului animal. O plantă transformată genetic pentru rezistenţă la un ierbicid sau o boală poate să-şi piardă rezistenţa ca rezultat al apariţiei de noi rase patogene sau noi ierbicide, în mod asemănător ca şi în cazul genelor încorporate prin metodele convenţionale de recombinare. Transferul uneia sau mai multor gene de la un organism la altul este numai o parte a procesului de ameliorare, unde recombinările genetice pentru caractere multiple rămân absolut necesare. Obţinerea de noi genotipuri valoroase trebuie considerată ca un sistem integrat bazat pe legi genetice, selecţie naturală şi artificială şi diferite metode de creare şi utilizare a variabilităţii genetice obţinută prin recombinare genetică, mutaţii şi transfer. Metodele neconvenţionale biotehnologice, trebuiesc considerate ca o parte integrantă a sistemului de ameliorare şi nicidecum un înlocuitor a ameliorării convenţionale.

CAPITOLUL XII Elemente de genetică a populaţiilor 12.1. Frecvenţa genelor şi a genotipurilor Populaţiile alogame, datorită sistemului lor de reproducere sunt conduse de legi diferite, comparativ cu plantele autogame. Sistemul polenizării libere se bazează pe încrucişări întâmplătoare care oferă posibilităţi constante de unire a gameţilor genetic diferiţi. Alogamia este cel mai frecvent mod de reproducere şi cel mai apropiat de panmixie (sistem de împerechiere întâmplătoare, liberă şi nediscriminatorie între indivizii unei populaţii alogame). În acest fel, la 160

reproducerea prin panmixie se menţine neschimbată frecvenţa genelor şi structura populaţiei (PANFIL, 1974). În cadrul unei populaţii formate din numeroase biotipuri şi când nu intervin restricţii în procesul polenizării şi fecundării (cazuri de selectivitate în procesul fecundării sau de incompatibilitate), plantele alogame sunt heterozigote pentru aproape toate genele care le conţin. Sistemul polenizării libere menţine în mod constant heterozigoţia, pe când prin autopolenizare, odată cu creşterea numărului de generaţii se ajunge la o homozigoţie completă. Datorită acestui fapt, efectul selecţiei în populaţiile cu polenizare liberă este diferit de cel pe care-l are asupra unei populaţii cu autopolenizare, motiv pentru care şi metodele de ameliorare vor diferi inevitabil. O populaţie a unei specii alogame, conţine genotipuri homozigote (AA şi aa) şi genotipuri heterozigote (Aa). Proporţia dintre genotipuri se poate schimba depinzând de frecvenţa lui A şi a. Datorită acestui fapt, populaţiile alogame prezintă o anumită frecvenţă de genotipuri şi gene. HARDY (1908) în Anglia şi WEINBERG (1908) în Germania au descoperit că în populaţiile mari se atinge un echilibru între gene şi genotipuri, fapt cunoscut sub denumirea de legea Hardy-Weinberg. Echilibrul poate fi menţinut de la o generaţie la alta în condiţii de încrucişare liberă şi fertilitate constantă a tuturor genotipurilor prezente în populaţie. Frecvenţa genotipurilor într-o populaţie depinde de frecvenţa genelor din generaţia precedentă. După prima generaţie de polenizare liberă, frecvenţa genotipurilor se stabilizează, se atinge un echilibru pentru orice frecvenţă iniţială de gene, în cazul unui singur locus. Echilibrul este menţinut până când se schimbă frecvenţa genelor în populaţie. Menţinerea neschimbată a frecvenţei genelor într-o populaţie panmictică diploidă, nelimitată, este determinată de legea hazardului şi poate fi uşor exemplificată, considerând o pereche de alele Aa, A cu frecvenţa iniţială p şi a cu frecvenţă iniţială q, astfel încât p+q=1. Prin unirea gameţilor care cuprind genele A şi a, gameţii ce se întâlnesc la ambele sexe din populaţie, în frecvenţele menţionate p şi q, vor da următoarele genotipuri:

Gameţi masculi adică:

♀Gameţi femeli ♂ A/(p) a/(q) A/(p) AA/(p2) Aa/(pq) a/(q) Aa/(pq) aa/(q2)

Frecvenţa genotipului

- genotipuri homozigote AA cu frecvenţa p2 - genotipuri homozigote aa cu frecvenţa q2 - genotipuri heterozigote Aa cu frecvenţa 2pq 161

În generaţiile următoare, genele ce conţin gena A sau a se vor forma în aceeaşi proporţie p şi q, deoarece: - gena A va fi prezentă în toţi gameţii formaţi pe organismele heterozigote Aa deci: p2+p2pq/2=p2+p(1-p)=p2+p-p2=p - gena a va fi prezentă în toţi gameţii formaţi pe organismele heterozigote Aa, deci: p2+q2pq/2=q2+q(1-q)=q2+q-q2=q Gameţii purtători ai genei A sau a, se formează în aceeaşi populaţie se vor menţine şi ele în generaţiile următoare în acelaşi raport de: p2(AA):2pq(Aa):q2(aa) ca şi în generaţiile anterioare După cum se observă, legea Hardy-Weinberg acţionează numai în condiţii strict delimitate, ce se găsesc greu în realitate, în cadrul unei populaţii naturale. Dacă frecvenţa genotipurilor diferă de cea a populaţiei iniţiale este evident că noua populaţie nu se va afla în echilibru genetic. În sistemul încrucişărilor randomizate, dacă nu se schimbă frecvenţa genelor se realizează un echilibru a frecvenţei genotipurilor, asemănătoare cu cea a formelor parentale. Există factori care pot modifica echilibrul genetic a unei populaţii, producând schimbarea genotipurilor şi a genelor din cadrul populaţiei respective. 10.2. Schimbări în frecvenţa genelor Cu toate că o populaţie alogamă mare este relativ stabilă, starea de echilibru constituie mai mult o excepţie decât o regulă, deoarece factorii ce tind să dezechilibreze structura genetică a unei populaţii acţionează continuu. Factorii cei mai importanţi care tind să schimbe frecvenţa genelor şi a genotipurilor sunt migraţia, mutaţia şi selecţia ş.a. Acţiunea lor poate fi individuală, cu toate că de cele mai multe ori este combinată. a. Abaterile de la panmixie se întâlnesc, în principal, la plantele la care se manifestă mai mult sau mai puţin predominant autogamia. În prezenţa autogamiei, frecvenţa genotipurilor din populaţie nu mai rămâne constantă, 162

apărând tendinţa de eliminare treptată a genotipurilor heterozigote. De exemplu, dacă în urma unei încrucişări apare un organism heterozigot pentru o pereche de gene, prin autopolenizare timp de câteva generaţii procentul heterozigoţilor se reduce foarte mult. Acelaşi efect de creştere a homozigoţiei se manifestă şi în cazul în care apare o tendinţă de încrucişare preferenţială între organisme asemănătoare. De exemplu, într-o populaţie alogamă de porumb poate să se manifeste o fecundare preferenţială între plantele care înfloresc concomitent, fapt ce poate duce la sporirea procentului de homozigoţie pentru genele precocităţii, peste valoarea prevăzută de legea Hardy-Weinberg. Ceea ce apare ca important este că abaterile de la panmixie modifică frecvenţa diferitelor genotipuri, fără a afecta frecvenţa genelor din populaţie, care rămâne în continuare neschimbată de la o generaţie la alta. b. Migraţia duce la modificarea frecvenţei genelor într-o populaţie, în urma contactului cu altă populaţie în care frecvenţa aceloraşi gene este diferită. Migraţia poate modifica în mod evident echilibrul genetic al unei populaţii şi anume: cu atât mai puternic cu cât populaţia indivizilor introduşi din altă populaţie este mai mare şi cu cât diferenţa în frecvenţa genelor între cele două populaţii este mai accentuată. c. Mutaţiile determinând modificarea unei gene prin transformarea într-una din alelele ei, provoacă schimbarea frecvenţei genelor şi deci a echilibrului populaţiei. Din acest punct de vedere, interesează îndeosebi mutaţiile care se repetă cu o anumită frecvenţă în populaţie, mutaţii denumite recurente (mutaţie care apare repetat, cu o anumită frecvenţă, în interiorul unei populaţii, modificând starea de echilibru genic a acesteia). Presupunând că gena A se transformă prin mutaţie în alela sa a cu o rată a mutaţiei de n, iar mutaţia inversă de la a la A se produce cu rata de mutaţie v, frecvenţa celor două gene se va modifica treptat, până va ajunge la o nouă stare de n echilibru în care gena a va avea frecvenţa q = . Dacă mutaţia inversă nu n+v se produce (v = 0), atunci echilibrul populaţiei nu se realizează decât după eliminarea totală a genei A. Răspândirea noilor mutaţii în genofondul unei populaţii depinde de acţiunea lor asupra viabilităţii şi fecundităţii individului, de penetra-bilitatea şi expresivitatea lor, de caracterul dominant sau recesiv precum şi de valoarea lor selectivă. Răspândirea mutaţiilor depinde şi de mărimea populaţiei (PANFIL, 1974). d. Selecţia face ca, datorită diferenţelor de viabilitate sau fertilitate, care se manifestă între diferitele genotipuri ale populaţiei, acestea să participe inegal la producerea de descendenţi. Este evident că în acest mod selecţia 163

poate schimba considerabil frecvenţa genelor, modificând astfel echilibrul populaţiei. Efectul selecţiei depinde în mod substanţial de felul genotipului asupra căruia acţionează. Dacă selecţia este îndreptată împotriva unei gene dominante, toate organismele care prezintă aceste gene sunt împiedicate de a se reproduce; în acest caz gena poate fi eliminată în cursul unei singure generaţii. În mod contrar, selecţia împotriva unei gene recesive are un efect mult mai lent. Astfel, presupunând că selecţia îndepărtează în fiecare generaţie toţi indivizii homozigoţi, datorită păstrării genei recesive în indivizii heterozigoţi, după n generaţii de selecţie frecvenţa acestei gene va q0 scădea de la q0 la qn = în care: q0 este frecvenţa genei înainte de 1 + nq 0 selecţie, iar n reprezintă numărul generaţiilor. Alături de apariţia continuă de noi mutaţii, selecţia ca şi fenomenul de superioritate adaptativă a heterozigoţilor faţă de oricare dintre homozigoţi, favorizează menţinerea în populaţii a unor gene recesive, cu influenţă evident dăunătoare asupra organismelor, în condiţiile respective de mediu. Oricât ar părea de curioasă această „încărcătură” de gene nefavorabile, prezintă o importanţă deosebită pentru capacitatea populaţiilor de a evolua, adaptânduse la condiţiile schimbate de mediu. Genele cu efect nefavorabil în condiţii normale de mediu pot să fie uneori esenţiale pentru adaptarea la noile condiţii, iar menţinerea lor în interiorul populaţiei asigură acesteia posibilităţi sporite de a supravieţui unor schimbări radicale ale mediului. Interacţiunea proceselor de mutaţie şi selecţie asigură, aşadar, populaţiilor nu numai o stare de echilibru optim pentru adaptare la condiţiile de mediu existente, dar şi menţinerea unei variabilităţi care să permită adaptarea la condiţii schimbate. e. Numărul redus de indivizi dintr-o populaţie face să apară fluctuaţii întâmplătoare în frecvenţa genelor şi a genotipurilor, dând naştere la fenomenul denumit drift genetic. Este uşor de înţeles că dacă într-o populaţie mare toate combinaţiile de gameţi au şanse egale de realizare, într-o populaţie redusă anumite combinaţii de gameţi se pot realiza întâmplător mai frecvent decât altele. Asemenea modificări întâmplătoare ale frecvenţei genelor, alături de izolarea unor grupări mici de biotipuri, pot duce la apariţia unor diferenţieri considerabile la populaţia de aceeaşi provenienţă. Efectele nefavorabile ale driftului genetic se înlătură prin alegerea unui număr suficient de plante elite, plante care să reprezinte, pe cât posibil, întregul fond genetic al populaţiei.

164