Biochimie Médicale Marqueurs Actuels Et Perspectives (Jean-Louis Beaudeux (Editor) Etc.) [PDF]

Zitiervorschau

Les chapitres de la deuxième partie déterminent la place des marqueurs dans des contextes pathologiques donnés. Chaque marqueur est décrit selon ses caractéristiques fondamentales (origines, métabolisme, méthodes de dosages, valeurs de référence, intérêt réel en pratique bioclinique). Pour chaque chapitre, une approche prospective envisage l'arrivée de marqueurs potentiels et de nouvelles stratégies d'exploration plus informatives des pathologies étudiées. Seul titre de biochimie médicale rédigé à ce jour en français, la deuxième édition de cet ouvrage didactique et de consultation aisée est conçu pour tous les praticiens : • biologistes médicaux en exercice qui, en fondant leur approche diagnostique sur la notion de marqueurs, pourront les hiérarchiser, proposer une orientation diagnostique et/ou suggérer des examens complémentaires • cliniciens pour qui cet ouvrage sera une aide au quotidien les renseignant sur les données actuelles des marqueurs biochimiques disponibles et orientant leur choix vers la stratégie d'exploration biochimique la plus rationnelle et pertinente • internes en médecine et en pharmacie qui souhaitent renforcer leurs connaissances. Les étudiants en formation médicale et pharmaceutique, ou paramédicale (infirmières, sages-femmes…) le consulteront avec profit.

9:HSMCPH=WUY\WV:

978-2-257-20472-1

20472-Beaudeux.indd 1

é

Les premiers chapitres sont essentiellement de nature méthodologique et décrivent les différents outils spécialisés et innovants à la disposition du biologiste qui souhaite : • connaître le principe et les performances de la ou des méthodologies analytiques disponibles • mettre au point le dosage d'une nouvelle molécule lorsqu'il dispose d'un système ouvert.

coordonnateurs

Association des enseignants de biochimie et biologie moléculaire des facultés de pharmacie

n o i t di

2e

Ils ont associé leur compétence pour coordonner le travail de soixante-quatre auteurs. La plupart enseignent la biochimie dans chacune des vingt- quatre facultés françaises de pharmacie et/ou exercent la biochimie médicale en milieu hospitalier. La diversité de leur formation initiale (médecins, pharmaciens, scientifiques) et de leur expérience de praticien en biochimie médicale apporte une complémentarité de points de vue garantissant la cohérence scientifique de l’ouvrage.

Directement orienté vers les pathologies ou les dysfonctionnements d’organes à cibler, Biochimie médicale : marqueurs actuels et perspectives – 2e édition est un véritable guide pratique des marqueurs biochimiques organisé en deux parties.

Marqueurs actuels et perspectives

Geneviève Durand est professeur émérite de biochimie à la faculté de pharmacie de ChâtenayMalabry (université d’Orsay Paris 11) et biologiste médicale dans le GH hospitalo-universitaire Paris-Val de Seine, AP-HP.

La deuxième édition de Biochimie médicale : marqueurs actuels et perspectives paraît trois ans seulement après la première, mais cette démarche des auteurs et coordonnateurs est pleinement justifiée. Dans ce domaine en effet, il convient d’être actuel et le plus complet possible. C’est pourquoi cette deuxième édition est à la fois actualisée des connaissances acquises en 2011 et enrichie de 7 nouveaux chapitres afin de compléter le panorama des marqueurs biochimiques de la première édition.

Jean-Louis Beaudeux Geneviève Durand

est PUPH, professeur de biochimie à la faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques de l’université Paris Descartes (Paris 5) et chef du service de biochimie-hématologie gériatrique de l’hôpital Charles Foix (GH PitiéSalpêtrière-Charles Foix, AP-HP).

Biochimie médicale

Jean-Louis Beaudeux

Jean-Louis Beaudeux Geneviève Durand coordonnateurs

2e édition

Médecine Sciences Publications

Les coordonnateurs

Médecine Sciences Publications

1/08/11 13:40:57

4557_2_.book Page I Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Deuxième édition revue et augmentée

4557_2_.book Page II Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4557_2_.book Page III Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Deuxième édition revue et augmentée

http://www.medecine.lavoisier.fr

4557_2_.book Page IV Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Chez le même éditeur La petite encyclopédie médicale Hamburger LEPORRIER M., 20e éd. 2011

La cytométrie en flux RONOT X., GRUNWALD D., MAYOL J.-F., BOUTONNAT J., 2006

Atlas de poche de biochimie humaine KOOLMAN J., ROHM K.H., 4e éd. 2011

Radicaux libres et stress oxydant Aspects biologiques et pathologiques DELATTRE J., BEAUDEUX J.-L., BONNEFONT-ROUSSELOT D., 2005

Biologie moléculaire de la cellule – livre de cours ALBERTS B., JOHNSON A., LEWIS J., RAFF M., ROBERTS K., WALTER P., avec CD-Rom, 5e éd. 2011 Biologie moléculaire de la cellule – livre d’exercices WILSON J., HUNT T., 5e éd. 2011

Atlas de poche de biotechnologie et de génie génétique SCHMID R. D., 2005 L’essentiel de la biologie cellulaire : introduction à la biologie moléculaire de la cellule ALBERTS B., BRAY D., HOPKIN K., JOHNSON A., LEWIS J., RAFF M., ROBERTS K., WALTER P., 2e éd. 2005

Cycle cellulaire et cytométrie en flux GRUNWALD D., MAYOL J.-F., RONOT X., 2010 Manuel de poche de biologie cellulaire PLATTNER H., HENTSCHEL J., 2009

Biochimie humaine HORN F., LINDENMEIER G., GRILLHÖSL C., MOC I., BERGHOLD S., SCHNEIDER N., MÜNSTER B., 2005

Aide-mémoire de biochimie et de biologie moléculaire LAVOINNE A., BEKRI S., 6e éd. 2008 Biochimie STRYER L., BERG J., TYMOCZKO J., 6e éd. 2008

Communications et signalisations cellulaires Hormones, neuromédiateurs, cytokines, facteurs de croissance COMBARNOUS Y., 3e éd. 2004

Atlas de poche de physiologie SILBERNAGL S., DESPOPOULOS A., 4e éd. 2008

Aide-mémoire de biochimie et de biologie moléculaire WIDMER F., BEFFA R., 3e éd. 2004

Atlas de poche de génétique PASSARGE E., 3e éd. 2008

Biochimie et biologie moléculaire KAMOUN P., LAVOINNE A., De VERNEUIL H., 2003

Biologie moléculaire et médecine KAPLAN J.-C., DELPECH M., 3e éd. 2007

Biochimie pathologique – Aspects moléculaires et cellulaires DELATTRE J., DURAND G., JARDILLIER J.-C., 2003

La brevetabilité des innovations biotechnologiques appliquées à l’Homme CHEMTOB-CONCÉ M.-C., 3e éd. 2006

Nutrigénétique du risque cardiovasculaire Terrains génétiques et nutrition JUNIEN C., 2003

Direction éditoriale : Emmanuel Leclerc Édition : Chantal Arpino Couverture : Isabelle Godenèche Composition : STDI, Lassay-lès-Châteaux Impression : Sepec, Peronnas

© Lavoisier SAS ISBN : 978-2-257-20472-1 ISBN : 978-2-7430-1064-5 (1re édition 2008)

Médecine Sciences Publications Lavoisier 11, rue Lavoisier, 75008 Paris Pour être informé(s) de nos parutions, consultez le site : www.medecine.lavoisier.fr

4557_2_.book Page V Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Avant-propos

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

de la deuxième édition

La biologie médicale évolue en ce moment à tous les niveaux : structure et fonctionnement du laboratoire, automatisation/robotisation des phases préanalytiques et analytiques, assurance/management de la qualité, responsabilité du biologiste au sein de l’équipe médicale… Il en est de même pour notre cœur de métier : l’exploration biologique des états physiopathologiques chez l’Homme, qui s’enrichit d’année en année de la découverte de mécanismes biologiques jusqu’alors méconnus (apoptose, régulation redox intracellulaire, marquage moléculaire endogène…). Simultanément, les outils analytiques nouveaux facilitent l’accès à la recherche ou au dosage de biomolécules auparavant inaccessibles, dont la fonction de biomarqueurs est en cours de validation. C’est ainsi que la spectrométrie de masse sera prochainement présente dans tous les laboratoires de biologie médicale. Cette deuxième édition, traitant des marqueurs biologiques actuels et de leurs perspectives, est un document à la fois actualisé et enrichi (7 chapitres nouveaux) de la version initiale parue il y a seulement trois ans. L’objectif de cette réédition est effectivement de mettre à jour les données concernant les marqueurs biologiques récents afin de mieux encore les utiliser dans la pratique quotidienne de la biologie médicale, et de compléter l’ouvrage en abordant de nouvelles thématiques (marqueurs tumoraux, exploration du statut vitaminique…) et des domaines innovants de la biologie médicale (protéomique et métabolomique, marqueurs de réponse et de toxicité des traitements pharmacologiques…). Comme dans la première édition, il s’agit de présenter les données théoriques et expérimentales des marqueurs biochimiques, et leur intérêt dans la stratégie de soin ou de prévention des pathologies. Il s’agit aussi d’aborder les marqueurs biochimiques validés, pertinents et utiles, tout en présentant l’intérêt potentiel de nouvelles molécules qui pourront être proposées aux biologistes et aux cliniciens dans un proche avenir. Bien sûr, l’esprit du livre est resté le même, tel qu’impulsé initialement et concrétisé au sein de l’Association des enseignants de biochimie et biologie moléculaire (AE2BM) des facultés de Pharmacie. Cet ouvrage confirme, s’il en était besoin, le dynamisme des équipes universitaires et hospitalo-universitaires de biochimie des facultés de Pharmacie, qui, avec l’appui de collègues hospitaliers, se sont à nouveau mobilisées pour sa réédition, ont mis leur compétence et leur savoir-faire en commun pour renforcer sa qualité didactique, et ainsi fournir un outil scientifique et médical dédié à l’exercice au quotidien de la biochimie médicale. Que tous les auteurs soient chaleureusement remerciés pour leur contribution ! Jean-Louis BEAUDEUX – Geneviève DURAND

V

4557_2_.book Page VI Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4557_2_.book Page VII Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Liste des auteurs

Véronique Annaix Laboratoire de biochimie Faculté de Pharmacie 16, boulevard Daviers 49045 Angers cedex [email protected] Michèle Artur Laboratoire de pharmacologie-toxicologie Plateau technologique de biologie Centre Hospitalier Universitaire 2, rue Angélique Ducoudray 21070 Dijon cedex [email protected]

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Yves Artur UMR CNRS 6265 : INRA1324/Université de Bourgogne Faculté de Pharmacie 7, boulevard Jeanne d’Arc, BP 87900 21079 Dijon cedex [email protected] Christian Aussel EA 4466 Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques Université Paris Descartes 4, avenue de l’Observatoire 75006 Paris Unité de nutrition PUI GH Henri Mondor 51, avenue du Maréchal de Tassigny 94000 Créteil [email protected]

Malika Balduyck Université Droit Santé Lille 2 CHRU de Lille Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques 3, rue du Professeur Laguesse BP 83 59006 Lille cedex [email protected]

Jean-Marie Bard EA2160 et Centre de recherche en nutrition humaine Faculté de pharmacie 1, rue Gaston Veil 44035 Nantes cedex Institut de cancérologie de l’Ouest René Gauducheau Boulevard Jacques Monod 44805 Saint-Herblain [email protected]

Bruno Baudin Service de biochimie et biologie cellulaire/EA4530 Faculté de Pharmacie Paris-11 Sud 5, avenue Jean-Baptiste Clément 92296 Châtenay-Malabry cedex Service de biochimie A Hôpital Saint-Antoine, APHP 184, rue du faubourg Saint-Antoine 75571 Paris cedex 12 [email protected]

VII

4557_2_.book Page VIII Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Jean-Louis Beaudeux Unité pédagogique de biochimie/EA 4466 Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques Paris Descartes 4, avenue de l’Observatoire 75270 Paris cedex 06

Laboratoire de biochimie endocrinienne et oncologique Pôle de biologie CHU Nantes 9, quai Moncousu 44093 Nantes cedex

Service de biochimie-hématologie Hôpital universitaire Charles Foix, APHP 7, avenue de la République 94200 Ivry sur seine [email protected]

Daniel Biou Service de biochimie cellulaire et moléculaire UFR de Pharmacie Paris XI Rue Jean Baptiste Clément 92290 Chatenay-Malabry [email protected]

Jean-Louis Beneytout Laboratoire de biochimie Faculté de Pharmacie 2, rue du Docteur Marcland 87025 Limoges cedex [email protected]

Jean-François Benoist Service de biochimie-hormonologie Hôpital Robert Debré, APHP 48, boulevard Sérurier 75019 Paris [email protected]

Mette M. Berger Service de médecine intensive adulte et brûlés CHUV – BH08.612 Rue du Bugnon 1011-Lausanne, Suisse [email protected]

Maguy Bernard Unité pédagogique de biochimie Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques Paris Descartes 4, avenue de l’observatoire 75006 Paris Service de biochimie endocrinienne et oncologique Groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière, AP-HP 47-83, boulevard de l’Hôpital 75013 Paris [email protected]

Edith Bigot-Corbel Inserm U892-CRCNA-IRT Laboratoire de biochimie Faculté de Pharmacie 1, rue Gaston Veil 44035 Nantes cedex [email protected]

VIII

Christine Bobin-Dubigeon EA2160 et Centre de recherche en nutrition humaine Faculté de pharmacie 1, rue Gaston Veil 44035 Nantes cedex Institut de cancérologie de l’Ouest René Gauducheau Boulevard Jacques Monod 44805 Saint-Herblain [email protected]

Dominique Bonnefont-Rousselot Unité pédagogique de biochimie/EA 4466 Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques Paris Descartes 4, avenue de l’Observatoire 75270 Paris cedex 06 Service de biochimie métabolique Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière, APHP 47-83, boulevard de l’Hôpital 75651 Paris cedex 13 [email protected]

Michèle Bordas-Fonfrede Service de biochimie métabolique Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière, APHP 47-83, boulevard de l’Hôpital 75013 Paris [email protected]

Jean-Christophe Boyer Unité fonctionnelle de toxicologie Laboratoire de biochimie CHU Nîmes Place du Pr Robert Debré 30209 Nîmes cedex 9 [email protected]

4557_2_.book Page IX Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Liste des auteurs

Michel Brazier INSERM ERI 12 Faculté de pharmacie Université de Picardie Jules-Verne 1, rue des louvels 80037 Amiens cedex 1 Laboratoire de biologie endocrinienne et osseuse CHU Amiens 2, place Victor Pauchet 80080 Amiens [email protected] Jean-Paul Brouillet Laboratoire de biochimie CHU de Nîmes Place du Pr Robert Debré 30029 Nîmes cedex 9 [email protected] Département de biochimie métabolique et clinique UFR des Sciences Pharmaceutiques 15, avenue Charles Flahault – BP 14491 34093 Montpellier cedex 5 [email protected] Institut de génomique fonctionnelle Département d’oncologie UMR CNRS 5203, INSERM 4661, UM1, UM2 141, rue de la cardonille 34094 Montpellier cedex 5 Thierry Brousseau Université Droit Santé Lille 2 Faculté de sciences pharmaceutiques et biologiques 3, rue du Professeur Laguesse BP 83 59006 Lille cedex

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

CHRU de Lille Pôle de biologie Pathologie Génétique 59037 Lille cedex [email protected] Eric Canivet Association Régionale pour la Promotion de la Dialyse à Domicile (ARPDD) 12, rue Fernand Brunet 51726 Reims cedex [email protected] Murielle Cazaubiel Biofortis Clinical A Mérieux Nutrisciences Company Bio Ouest Ile de Nantes 21, rue La Noue Bras de Fer 44200 Nantes [email protected]

Philippe Charpiot Laboratoire de biochimie Faculté de Pharmacie 27, boulevard Jean Moulin 13385 Marseille cedex 05 [email protected]

Maryline Chauffert Laboratoire de biologie Groupe Hospitalier Paris Saint-Joseph 185, rue Raymond Losserand 75014 Paris [email protected]

Didier Chevenne Service de biochimie-hormonologie Hôpital Robert Debré, APHP 48, boulevard Sérurier 75019 Paris [email protected]

Luc Cynober Unité pédagogique de nutrition/EA 4466 Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques Université Paris Descartes 4, avenue de l’Observatoire 75006 Paris Service de biochimie, Cochin – Hôtel-Dieu, APHP 1, place du Parvis Notre Dame 75181 Paris [email protected]

Monique Dehoux Laboratoire de biochimie Hôpital Bichat-Claude Bernard, APHP 46, rue Henri Huchard 75018 Paris [email protected]

Philippe Derache Laboratoire de biochimie Faculté de Pharmacie 146, rue Léo-Saignat 33076 Bordeaux cedex [email protected]

Geneviève Durand Service de biochimie cellulaire et moléculaire UFR de Pharmacie Paris XI Rue Jean Baptiste Clément 92290 Chatenay-Malabry

IX

4557_2_.book Page X Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Laboratoire de biochimie métabolique et cellulaire Hôpital Bichat-Claude Bernard, APHP 46, rue Henri Huchard 75018 Paris [email protected]

Service de biochimie Hôpital Saint-louis, APHP 1, avenue Claude Vellefaux 75010 Paris [email protected]

Alexandre Evrard Laboratoire de biochimie Place du Pr Robert Debré 30209 Nîmes cedex 9

Roselyne Garnotel Biochimie médicale et biologie moléculaire, CNRS UMR 6237 Faculté de Médecine 51, rue Cognacq-Jay 51095 Reims cedex

Laboratoire de toxicologie UFR des sciences pharmaceutiques 15, avenue Charles Flahault BP 14491 34093 Montpellier cedex 5 [email protected]

Patrice Faure Laboratoire de physiopathologie de l’hypoxie/HP2 INSERM U1042 Faculté de Médecine et Pharmacie 38042 Grenoble cedex Département de biologie, toxicologie et pharmacologie Unité de biochimie hormonale et nutritionnelle CHU Grenoble BP 217 38043 Grenoble cedex 09 [email protected]

Alain Favier Les Marechale 38190 Bernin [email protected]

Adeline Filliâtre Biofortis Clinical A Mérieux Nutrisciences Company Bio Ouest Ile de Nantes 21, rue La Noue Bras de Fer 44200 Nantes [email protected]

Marie-Madeleine Galteau 107, rue Charles III 54000 Nancy

Jean-Pierre Garnier Unité pédagogique de biochimie/EA 4466 Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques Université Paris Descartes 4, avenue de l’Observatoire 75270 Paris cedex 06

X

Laboratoire de biologie et de recherche pédiatriques American Memorial Hospital, CHU Reims 47, rue Cognacq Jay 51092 Reims cedex [email protected] Philippe Gervois Laboratoire de biochimie – EA Griiot – 4481 Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques 3, rue du Professeur Laguesse 59006 Lille cedex, France [email protected] Jean-Pierre Goullé Laboratoire de pharmacocinétique et de toxicologie cliniques G.H. Le Havre BP24 76083 Le Havre cedex [email protected] Jean-Claude Guilland Laboratoire de biochimie spécialisée Plateau technique de biologie CHU Dijon 2, rue Angélique Ducoudray 21070 Dijon cedex [email protected] Bernard Herberth Laboratoire de biochimie et biologie moléculaire Hôpital de Brabois Avenue de Bourgogne 54500 Vandœuvre-lès-Nancy [email protected]

Saïd Kamel Service de biochimie/INSERM ERI 12 Faculté de Pharmacie Université de Picardie Jules Verne 1, rue des louvels 80037 Amiens cedex 1

4557_2_.book Page XI Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Liste des auteurs

Laboratoire de biochimie CHU Amiens 2, place Victor Pauchet 80080 Amiens [email protected]

Service de biochimie/Inserm U1004 Hôpital Paul Brousse, APHP 14, avenue Paul Vaillant Couturier 94805 Villejuif [email protected]

Nathalie Kapel Unité pédagogique de parasitologie, EA 4065 Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques Paris Descartes 4, avenue de l’Observatoire 75270 Paris cedex 06

Jean-Marc Lessinger UMR CNRS 7213 Faculté de Pharmacie Université de Strasbourg 74, route du Rhin 67401 Illkirch cedex

Service de coprologie fonctionnelle Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière, APHP 47-83, boulevard de l’hôpital 75013 Paris [email protected]

Laboratoire de biochimie et de biologie moléculaire Plateau technique de biologie Nouvel hôpital civil 1, place de l’hôpital 67091 Strasbourg cedex [email protected]

Gisèle Le Moël 17, rue Maurice Lachâtre 93120 La Courneuve [email protected]

Michel Lhermitte UDSL Université Lille Nord de France 3, rue du Professeur Laguesse 59006 Lille cedex [email protected]

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Guillaume Lefèvre Service de biochimie et hormonologie Hôpital Tenon, APHP 4, rue de la Chine 75020 Paris [email protected]

Bertrand Liagre Laboratoire de biochimie Faculté de Pharmacie 2, rue du Docteur Marcland 87025 Limoges cedex [email protected]

Alain Legrand Unité pédagogique de biochimie Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques 4, avenue de l’Observatoire 75270 Paris cedex 06 [email protected]

Sophie Mary Département de biochimie métabolique et clinique IBBM, UMR 5247 CNRS UM1-UM2 Faculté de Pharmacie 15, avenue Charles Flahault – BP 14491 34093 Montpellier cedex 5 [email protected]

Sylvain Lehmann Biochimie-protéomique clinique Hôpital Saint-Eloi - IRB 80, avenue A. Fliche 34295 Montpellier cedex 5 [email protected]

Laurent Metzinger INSERM ERI12 UFR de Pharmacie 1, rue des Louvels 800037 Amiens cedex [email protected]

Antoinette Lemoine Service de biochimie et biologie cellulaire UFR de Pharmacie Paris-11 Sud 5, avenue Jean-Baptiste Clément 92296 Châtenay-Malabry cedex

Françoise Muller Université Versailles – Saint Quentin en Yvelines Laboratoire de biochimie hormonologie Hôpital Robert Debré, AP-HP 48, boulevard Sérurier 75019-Paris [email protected]

XI

4557_2_.book Page XII Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Jacqueline Peynet Unité pédagogique de biochimie Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques 4, avenue de l’Observatoire 75270 Paris cedex 06 Ivan Philip Service d’Anesthésie Institut Mutualiste de Montsouris 42, boulevard Jourdan 75014 Paris [email protected] Anne Polge Laboratoire de biochimie CHU de Nîmes Place du Pr Robert Debré 30029 Nîmes cedex 9 [email protected]

Jean-Claude Souberbielle Laboratoire d’exploration fonctionnelle G.H. Necker-Enfants malades, APHP 149, rue de Sèvres 75743 Paris Cedex 15 [email protected] Patrice Thérond Unité pédagogique de biochimie/EA 4466 Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques Paris Descartes 4, avenue de l’Observatoire 75270 Paris cedex 06 Service de Biochimie Hôpital de Bicêtre 74, rue du général Leclerc 94275 Le Kremlin-Bicêtre [email protected]

Dominique Porquet Service de biochimie hormonologie UFR de Pharmacie Paris XI Rue Jean Baptiste Clément 92290 Chatenay-Malabry

Claire Tournois-Hirzel Service de biochimie U.F.R de Pharmacie 51, rue Cognacq-Jay 51096 Reims cedex [email protected]

Service de biochimie-hormonologie Hôpital Robert Debré, APHP 48, boulevard Sérurier 75019 Paris [email protected]

François Trivin 9 bis rue Michel-Ange 75017 Paris [email protected]

Eric Raynaud de Mauverger Département de biochimie métabolique et clinique Faculté de Pharmacie 15, avenue Charles Flahault, BP 14491 34093 Montpellier cedex 5 Unité d’Exploration Métabolique – CERAMM INSERM U1046 Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier Hôpital Lapeyronie 34295 Montpellier cedex 5 [email protected] Michel Sève Plateforme de protéomique Prométhée Institut de biologie et de pathologie CHU Grenoble BP 217 38043 Grenoble cedex 09 [email protected]

XII

Pascale Vergne-Salle Service de rhumatologie CHRU Dupuytren Avenue Martin Luther King 87042 LIMOGES cedex [email protected] Frédéric Ziegler Groupe ADEN – Appareil digestif, environnement et nutrition EA 4311, IFR 23 Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université de Rouen 22, boulevard Gambetta 76183 Rouen cedex 01 Laboratoire de biochimie médicale Institut de biologie clinique CHU de Rouen 1, rue de Germont 76031 Rouen cedex [email protected]

4557_2_.book Page XIII Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Table des matières

Avant-propos de la deuxième édition –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

V

Liste des auteurs ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

VII

Liste des abréviations–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– XXVII Chapitre 1

Les marqueurs biologiques, définitions et concept ––––––––––––––––––––––––––––––

1

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Michel Sève, Alain Favier

Chapitre 2

1 ■■ Qu’est-ce qu’un marqueur biologique ? ...................................................................................................... 2 ■■ Comment un paramètre biochimique devient un marqueur ? ..................................................................... 3 ■■ Les différentes catégories de marqueurs..................................................................................................... 3.1. Les marqueurs de risque ..................................................................................................................... 3.2. Les marqueurs d’exposition ................................................................................................................ 3.3. Les marqueurs des systèmes de défense ........................................................................................... 3.4. Les marqueurs de statut nutritionnel ................................................................................................... 3.5. Les marqueurs de polymorphisme génétique ..................................................................................... 3.6. Les marqueurs prédictifs ..................................................................................................................... 3.7. Les marqueurs diagnostiques ............................................................................................................. 3.8. Les marqueurs de suivi thérapeutique ................................................................................................ 3.9. Les marqueurs de pronostic ................................................................................................................ 4 ■■ Les critères et l’évaluation d’un marqueur biologique ................................................................................. 5 ■■ Les limitations des marqueurs biologiques.................................................................................................. 6 ■■ La recherche de nouveaux marqueurs ........................................................................................................

3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 7

Dosage des marqueurs biologiques par immunoanalyse ––––––––––––––––––––––––

9

Jean François Benoist, Daniel Biou, Didier Chevenne 1 ■■ Un bref historique des développements de l’immunoanalyse ..................................................................... 1.1. Période initiale (~ 1860-1935) .............................................................................................................. 1.2. Quelques mots sur la réaction Ag/Ac en milieu liquide : courbe de précipitation d’Heidelberger ...... 1.3. Immunoprécipitation en milieu gélifié (~ 1860-1935)........................................................................... 1.4. Immunoprécipitation en milieu liquide (~ 1930-2011).......................................................................... 1.5. Immunoanalyses avec marqueur (1959-2011).....................................................................................

11 11 11 12 12 12

XIII

4557_2_.book Page XIV Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Chapitre 3

2 ■■ Immunoprécipitation en milieu liquide et détection par néphélométrie (IN) ou turbidimétrie (IT) ................ 2.1. Principe ................................................................................................................................................ 2.2. Paramètres modulant les critères de performance d’un dosage en IT/IN........................................... 2.3. Avantages et inconvénients des techniques par IT/IN ........................................................................ 2.4. Marqueurs en biochimie clinique dosés par IN ou IT .......................................................................... 3 ■■ Immunoanalyses avec Ag ou Ac marqués ................................................................................................... 3.1. Immunoanalyses en phase hétérogène ............................................................................................... 3.2. Immunoanalyses en phase homogène ................................................................................................ 4 ■■ Génération du signal et systèmes de détection........................................................................................... 4.1. Limites de détection des immunoanalyses ......................................................................................... 4.2. Marqueurs radioactifs .......................................................................................................................... 4.3. Marqueurs enzymatiques : « enzyme immunoassay : EIA » ................................................................ 4.4. Marqueurs directement fluorescents ................................................................................................... 4.5. Marqueurs directement chimiluminescents......................................................................................... 4.6. Marquage amplifié par le système streptavidine/avidine-biotine ........................................................ 4.7. Marquage par la protéine A ................................................................................................................. 5 ■■ Interférences dans les immunodosages ...................................................................................................... 5.1. La réaction croisée .............................................................................................................................. 5.2. Interférences par des Ac...................................................................................................................... 5.3. Interférence par excès d’Ag : effet crochet « hook effect » ................................................................. 5.4. Autres types d’interférences (liste non exhaustive) ............................................................................. 5.5. Problèmes liés à la standardisation ..................................................................................................... 6 ■■ Automatisation de l’immunoanalyse ............................................................................................................ 7 ■■ Principaux biomarqueurs actuellement dosés par immunoanalyse ............................................................ 8 ■■ Évolutions récentes et futures de l’immunoanalyse.....................................................................................

12 12 13 13 14 14 15 17 19 19 19 20 22 24 26 26 27 27 30 32 33 35 35 36 36

Enzymologie clinique –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

39

Jean-Marc Lessinger

Chapitre 4

1 ■■ Considérations générales sur l’enzymologie clinique .................................................................................. 1.1. Les origines et causes de variations des enzymes dans le plasma .................................................... 1.2. Sélection d’une enzyme comme marqueur ......................................................................................... 1.3. Approches analytiques pour la détermination d’une enzyme ............................................................. 1.4. Mesure d’une activité enzymatique ..................................................................................................... 1.5. Expression de la concentration d’activité enzymatique ...................................................................... 1.6. Mesure d’isoenzymes .......................................................................................................................... 1.7. Standardisation en enzymologie clinique ............................................................................................ 1.8. Facteurs pouvant affecter l’interprétation des résultats ...................................................................... 1.9. Macroenzymes .................................................................................................................................... 2 ■■ Exemples d’activités enzymatiques fréquemment déterminées en pratique courante ............................... 2.1. Aminotransférases ............................................................................................................................... 2.2. Créatine kinase .................................................................................................................................... 2.3. Lactate déshydrogénase ..................................................................................................................... 2.4. Phosphatase alcaline ........................................................................................................................... 2.5. γ-Glutamyltransférase .......................................................................................................................... 2.6. α-Amylase et lipase .............................................................................................................................

41 41 42 42 42 45 46 46 48 49 49 49 50 51 52 53 54

Biologie et essais cliniques––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

59

Jean-Marie Bard, Murielle Cazaubiel, Adeline Filliâtre 1 ■■ Définitions .................................................................................................................................................... 2 ■■ L’environnement normatif et réglementaire des essais cliniques ................................................................ 2.1. Les Bonnes Pratiques Cliniques .......................................................................................................... 2.2. Les autres normes de qualité .............................................................................................................. 2.3. Les textes réglementaires français ......................................................................................................

XIV

61 61 61 63 65

4557_2_.book Page XV Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Table des matières

Chapitre 5

3 ■■ Le rôle et les engagements du biologiste dans le cadre des essais cliniques ............................................ 3.1. Place du laboratoire dans les essais cliniques .................................................................................... 3.2. Le choix d’un référentiel de qualité...................................................................................................... 3.3. Le choix des marqueurs ...................................................................................................................... 3.4. Les engagements du biologiste........................................................................................................... 3.5. Le suivi des essais ............................................................................................................................... 3.6. La question des collections d’échantillons biologiques ......................................................................

67 67 67 68 69 69 70

Méthodologies innovantes d’analyse des gènes et des génomes–––––––––––––––––

71

Antoinette Lemoine, Laurent Metzinger

Chapitre 6

1 ■■ Le matériel génétique................................................................................................................................... 1.1. ADN génomique................................................................................................................................... 1.2. ARNm et ARN régulateurs ................................................................................................................... 2 ■■ Les méthodes « classiques » d’analyse des gènes ..................................................................................... 2.1. ADN : Southern blot, PCR, séquençage et clonage ............................................................................ 2.2. ARN : RT-PCR ..................................................................................................................................... 3 ■■ Les méthodes innovantes d’analyse des gènes .......................................................................................... 3.1. Séquençage à haut débit..................................................................................................................... 3.2. Automatisation, puces à ADN.............................................................................................................. 4 ■■ Les applications basées sur les technologies des puces à ADN................................................................. 4.1. Génomique .......................................................................................................................................... 4.2. Transcriptomique, puces à ADNc........................................................................................................

73 73 73 74 74 75 75 75 75 77 77 77

Protéomique et métabolomique –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

83

Bruno Baudin, Jean-François Benoist

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Chapitre 7

1 ■■ Protéomique................................................................................................................................................. 1.1. Introduction.......................................................................................................................................... 1.2. Les méthodes d’étude ......................................................................................................................... 1.3. Les applications actuelles et nouvelles technologies .......................................................................... 2 ■■ Métabolomique ............................................................................................................................................ 2.1. Introduction.......................................................................................................................................... 2.2. Les méthodes d’étude ......................................................................................................................... 2.3. Deux approches complémentaires sont utilisées dans l’étude du métabolome .................................

85 85 86 88 91 91 92 94

Les marqueurs biochimiques de l’inflammation –––––––––––––––––––––––––––––––––

99

Jean-Louis Beneytout, Pascale Vergne-Salle, Bertrand Liagre 1 ■■ Physiopathologie de la réaction inflammatoire ............................................................................................ 2 ■■ Les marqueurs biochimiques de la réaction inflammatoire ......................................................................... 2.1. Critères d’un bon marqueur biochimique de l’inflammation ............................................................... 2.2. La vitesse de sédimentation ................................................................................................................ 2.3. Les protéines de l’inflammation........................................................................................................... 2.4. Électrophorèse des protéines .............................................................................................................. 3 ■■ Examens complémentaires, recommandations et perspectives ................................................................. 3.1. Dépistage d’un syndrome inflammatoire ............................................................................................. 3.2. Diagnostic d’une pathologie associée ................................................................................................. 3.3. Suivi thérapeutique de maladies inflammatoires ou infectieuses ........................................................ 3.4. Variations divergentes de certaines protéines de l’inflammation ........................................................ 3.5. Actualités et perspectives....................................................................................................................

101 101 102 102 103 107 108 108 108 109 109 109

XV

4557_2_.book Page XVI Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Chapitre 8

4 ■■ Principales étiologies à l’origine du syndrome inflammatoire ...................................................................... 4.1. Pathologies infectieuses ...................................................................................................................... 4.2. Les maladies systémiques................................................................................................................... 4.3. Les pathologies néoplasiques ............................................................................................................. 4.4. Les autres causes ................................................................................................................................

111 111 111 111 111

Marqueurs d’oxydation des biomolécules et systèmes de défense antioxydants ––

113

Dominique Bonnefont-Rousselot, Jean-Louis Beaudeux, Patrice Thérond

Chapitre 9

1 ■■ Rappels physiologiques et physiopathologiques ........................................................................................ 2 ■■ Marqueurs biochimiques de l’oxydation des lipides, des protéines et des acides nucléiques ................... 2.1. Schéma général ................................................................................................................................... 2.2. Marqueurs de l’oxydation des lipides .................................................................................................. 2.3. Marqueurs de l’oxydation des protéines ............................................................................................. 2.4. Marqueurs de l’oxydation des acides nucléiques ............................................................................... 3 ■■ Systèmes de défense antioxydants ............................................................................................................. 3.1. Systèmes enzymatiques ...................................................................................................................... 3.2. Systèmes non enzymatiques ............................................................................................................... 4 ■■ Stratégie d’utilisation des biomarqueurs ..................................................................................................... 5 ■■ Biomarqueurs en prospective ......................................................................................................................

115 115 115 115 123 126 127 127 128 132 133

Mise en évidence et exploration des dyslipoprotéinémies –––––––––––––––––––––––

139

Dominique Bonnefont-Rousselot, Alain Legrand 1 ■■ Rappels sur la composition, le métabolisme et le rôle des lipoprotéines.................................................... 1.1. Structure des lipoprotéines ................................................................................................................. 1.2. Métabolisme des lipoprotéines............................................................................................................ 2 ■■ Exploration usuelle des dyslipoprotéinémies............................................................................................... 2.1. Aspect du sérum.................................................................................................................................. 2.2. Dosage du cholestérol total et des triglycérides ................................................................................. 2.3. Dosage du cholestérol-HDL et du cholestérol-LDL............................................................................. 2.4. Dosage des apolipoprotéines A-I et B................................................................................................. 2.5. Analyses complémentaires du bilan d’exploration usuelle .................................................................. 3 ■■ Exploration spécialisée des dyslipoprotéinémies ........................................................................................ 3.1. Analyse des lipoprotéines.................................................................................................................... 3.2. Caractérisation et analyse des causes des dyslipoprotéinémies ........................................................

141 141 142 144 144 146 147 149 151 152 152 154

Chapitre 10 Maladies cardiovasculaires : marqueurs de l’athérosclérose, de la maladie coronarienne et de l’accident vasculaire cérébral –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 165 Philippe Gervois, Malika Balduyck, Thierry Brousseau 1 ■■ Physiopathologie de l’athérosclérose .......................................................................................................... 1.1. Structure de la paroi artérielle saine .................................................................................................... 1.2. Dysfonction endothéliale : initiation de la lésion d’athérosclérose ...................................................... 1.3. Mécanisme de l’athérogenèse : composantes lipidiques et cellulaires .............................................. 1.4. Phase aiguë de l’inflammation et paroi artérielle ................................................................................. 1.5. Phase aiguë de thrombose .................................................................................................................. 2 ■■ Marqueurs du risque cardiovasculaire et modalités de prise en charge ..................................................... 2.1. Notion de risque cardiovasculaire global ............................................................................................ 2.2. Facteurs de risque cardiovasculaire modifiables et recommandations .............................................. 3 ■■ Marqueurs innovants du risque coronarien ................................................................................................. 3.1. Protéine C-réactive .............................................................................................................................. 3.2. Myéloperoxydase ................................................................................................................................

XVI

167 167 167 168 168 169 171 171 171 174 174 175

4557_2_.book Page XVII Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Table des matières

3.3. Molécules d’adhérence ....................................................................................................................... 3.4. Interleukine-6 ....................................................................................................................................... 3.5. Métalloprotéases ................................................................................................................................. 3.6. Endothélines ........................................................................................................................................ 3.7. Adiponectine........................................................................................................................................ 3.8. Phospholipase A2 ................................................................................................................................ 4 ■■ Rationnel pour l’évaluation des marqueurs non lipidiques .......................................................................... 5 ■■ Marqueurs de l’accident vasculaire cerebral ............................................................................................... 5.1. Marqueurs diagnostiques de l’accident vasculaire cérébral ............................................................... 5.2. Marqueurs innovants du risque d’AVC d’origine ischémique ............................................................. 5.3. Marqueurs innovants du risque d’AVC d’origine hémorragique..........................................................

Chapitre 11 Marqueurs de dysfonctionnement cardiaque –––––––––––––––––––––––––––––––––––

175 176 176 177 177 177 178 178 178 179 180

183

Jacqueline Peynet, Monique Dehoux, Guillaume Lefèvre, Ivan Philip 1 ■■ L’insuffisance cardiaque .............................................................................................................................. 1.1. Définition et classification de l’insuffisance cardiaque ........................................................................ 1.2. Physiopathologie de l’insuffisance cardiaque ..................................................................................... 1.3. Biomarqueurs de l’insuffisance cardiaque .......................................................................................... 1.4. Les peptides natriurétiques : le Brain Natriuretic Peptide ................................................................... 2 ■■ Syndromes coronariens aigus...................................................................................................................... 2.1. Définitions et rappels physiopathologiques......................................................................................... 2.2. Marqueurs d’ischémie et de nécrose .................................................................................................. 3 ■■ Stratégie « multimarqueurs » des syndromes coronariens aigus ................................................................ 3.1. Marqueurs de nécrose......................................................................................................................... 3.2. Marqueurs d’ischémie ......................................................................................................................... 3.3. Marqueurs hémodynamiques .............................................................................................................. 3.4. Marqueurs d’inflammation ................................................................................................................... 3.5. Marqueur de stress : la copeptine .......................................................................................................

Chapitre 12 Le diabète sucré––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

185 185 185 186 186 194 194 195 203 204 204 204 205 206

211

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Didier Chevenne, Michèle Bordas-Fondrède, Maryline Chauffert, François Trivin, Dominique Porquet 1 ■■ Les diabètes sucrés et leur physiopathologie.............................................................................................. 1.1. Le diabète sucré .................................................................................................................................. 1.2. Glucose et nutriments intracellulaires.................................................................................................. 1.3. L’homéostasie du glucose................................................................................................................... 1.4. Le diabète sucré et l’insuline ............................................................................................................... 1.5. Mécanismes et conditions de la sécrétion pancréatique de l’insuline ................................................ 1.6. Le diabète sucré de type 1 (DT1)......................................................................................................... 1.7. Le diabète sucré de type 2 (DT2)......................................................................................................... 1.8. Les diabètes monogéniques................................................................................................................ 1.9. Les complications chroniques du diabète sucré ................................................................................. 1.10. Diabète sucré gestationnel .................................................................................................................. 2 ■■ Marqueurs de diagnostic de diabète ........................................................................................................... 2.1. Glucose................................................................................................................................................ 2.2. Insuline................................................................................................................................................. 2.3. Le C-peptide ........................................................................................................................................ 2.4. Les proinsulines ................................................................................................................................... 2.5. Corps cétoniques ................................................................................................................................ 3 ■■ Marqueurs de l’autoimmunité des diabètes : les auto-anticorps................................................................. 3.1. Anti-îlots de Langerhans (Islet Cell Autoantibodies : ICA) ................................................................... 3.2. Anticorps anti-GAD.............................................................................................................................. 3.3. Anticorps anti-IA-2...............................................................................................................................

213 213 214 214 214 214 215 216 216 216 217 218 218 220 222 224 225 225 226 226 227

XVII

4557_2_.book Page XVIII Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

3.4. Anticorps anti-insuline ......................................................................................................................... 3.5. Anticorps anti-ZnT8 ............................................................................................................................. 3.6. Les auto-anticorps dans le cadre d’un dépistage du risque de développer un DT1 .......................... 4 ■■ Marqueurs génétiques ................................................................................................................................. 4.1. Association du DT1 avec les gènes du CMH ...................................................................................... 4.2. Association du diabète de type I aux gènes non HLA......................................................................... 4.3. Les diabètes monogéniques................................................................................................................ 4.4. DT2 ...................................................................................................................................................... 5 ■■ Marqueurs de suivi des diabètes ................................................................................................................. 5.1. HbA1c ................................................................................................................................................... 5.2. Fructosamines ..................................................................................................................................... 5.3. Microalbuminurie .................................................................................................................................

Chapitre 13 Le syndrome métabolique–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

227 229 229 230 230 231 231 231 231 231 236 237

243

Éric Raynaud de Mauverger, Patrice Faure 1 ■■ Physiopathologie du syndrome métabolique............................................................................................... 1.1. Rôle clé de l’insulinorésistance ........................................................................................................... 1.2. Troubles de la glycorégulation............................................................................................................. 2 ■■ Données épidémiologiques et de prévalence .............................................................................................. 3 ■■ Marqueurs biochimiques et cliniques .......................................................................................................... 3.1. Les différents marqueurs selon les définitions .................................................................................... 3.2. Techniques de référence à appliquer pour les critères diagnostiques ................................................ 3.3. Indications : les apports de la biologie et de la clinique ...................................................................... 4 ■■ Perspectives thérapeutiques........................................................................................................................ 4.1. Diététique et activité physique............................................................................................................. 4.2. Possibilités médicamenteuses ............................................................................................................

Chapitre 14 Marqueurs de la dénutrition protéino-énergétique ––––––––––––––––––––––––––––––

245 245 246 247 248 248 248 248 249 249 249

251

Frédéric Ziegler, Mette Berger, Christian Aussel, Luc Cynober 1 ■■ Protéines sériques........................................................................................................................................ 1.1. Albumine .............................................................................................................................................. 1.2. Transthyrétine (TTR)............................................................................................................................. 1.3. Protéine vectrice du rétinol (RBP) ........................................................................................................ 1.4. Les protéines de la réaction inflammatoire.......................................................................................... 1.5. Méthodes usuelles de dosage des protéines ...................................................................................... 2 ■■ Acides aminés plasmatiques et urinaires..................................................................................................... 2.1. Place en nutrition clinique.................................................................................................................... 2.2. Méthodes de dosage des acides aminés dans les liquides biologiques............................................. 3 ■■ Le bilan d’azote ............................................................................................................................................ 3.1. Place en nutrition clinique.................................................................................................................... 3.2. Calcul du bilan azoté ........................................................................................................................... 3.3. Interprétation des résultats .................................................................................................................. 3.4. Méthodes usuelles de dosage de l’azote ............................................................................................ 4 ■■ Formules composites comportant des marqueurs biochimiques ............................................................... 4.1. Index Pronostic Nutritionnel et Inflammatoire (PINI)............................................................................ 4.2. Index de Buzby (ou Nutritional Risk Index : NRI)................................................................................. 4.3. Geriatric Nutritional Risk Index : GNRI ................................................................................................ 5 ■■ Micronutriments chez le patient en situation d’agression (réanimation) ...................................................... 5.1. Généralités sur les micronutriments .................................................................................................... 5.2. Le patient de réanimation .................................................................................................................... 5.3. Supplémentation et substitution.......................................................................................................... 5.4. Évaluation biologique en pratique courante ........................................................................................

XVIII

254 254 255 255 256 256 257 257 258 258 258 259 259 259 260 260 260 261 261 261 261 262 262

4557_2_.book Page XIX Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Table des matières

Chapitre 15 Les vitamines : exploration du statut et interprétation –––––––––––––––––––––––––––

271

Jean-Claude Guilland, Bernard Herbeth, Gisèle Le Moël et les membres du groupe de travail de la Société Francophone Vitamines et Biofacteurs : Émilie Blond, Patrick Borel, Marie-Josèphe Cals, Charlotte Cuerq, Agnès Dauvergne, Jocelyne Drai, Fathi Driss, Henri Faure, Isabelle Gastin, Edmond Rock 1 ■■ Rappels sur le métabolisme et les rôles des vitamines ............................................................................... 1.1. Structure chimique et propriétés physicochimiques ........................................................................... 1.2. Métabolisme ........................................................................................................................................ 1.3. Rôles physiologiques........................................................................................................................... 1.4. Carence ............................................................................................................................................... 2 ■■ Exploration du statut vitaminique................................................................................................................. 2.1. Vitamine A............................................................................................................................................ 2.2. Caroténoïdes ....................................................................................................................................... 2.3. Vitamine D............................................................................................................................................ 2.4. Vitamine E ............................................................................................................................................ 2.5. Vitamine K............................................................................................................................................ 2.6. Thiamine .............................................................................................................................................. 2.7. Riboflavine ........................................................................................................................................... 2.8. Vitamine PP ......................................................................................................................................... 2.9. Vitamine B6 .......................................................................................................................................... 2.10. Vitamine B9 .......................................................................................................................................... 2.11. Vitamine B12 ........................................................................................................................................ 2.12. Vitamine C............................................................................................................................................ 2.13. Assurance qualité ................................................................................................................................

273 273 274 276 278 279 279 281 281 284 284 285 286 286 287 287 288 289 289

Chapitre 16 Les marqueurs en pathologie hépatique––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

291

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Philippe Derache, Véronique Annaix, Philippe Charpiot 1 ■■ Organisation anatomique et fonctionnelle du foie ....................................................................................... 1.1. Le foie, carrefour anatomique.............................................................................................................. 1.2. Le lobule hépatique, organisation et types cellulaires......................................................................... 2 ■■ Les grandes fonctions hépatiques ............................................................................................................... 2.1. Métabolisme énergétique .................................................................................................................... 2.2. Fonctions de synthèse......................................................................................................................... 2.3. Fonctions d’épuration .......................................................................................................................... 2.4. Fonction biliaire.................................................................................................................................... 3 ■■ Exploration biologique du foie ..................................................................................................................... 3.1. Les syndromes biologiques des hépatopathies .................................................................................. 3.2. Les marqueurs de cytolyse hépatocytaire ........................................................................................... 3.3. Les marqueurs d’insuffisance hépatocellulaire ................................................................................... 3.4. Les marqueurs de cholestase.............................................................................................................. 3.5. Les marqueurs de l’inflammation ........................................................................................................ 3.6. Les marqueurs de la fibrose hépatique ............................................................................................... 4 ■■ L’exploration biochimique du foie : interprétation étiologique..................................................................... 4.1. Conduite à tenir devant une hypertransaminasémie ........................................................................... 4.2. Conduite à tenir devant un bilan enzymatique hépatique anormal ..................................................... 4.3. Conduite à tenir devant un ictère ........................................................................................................ 4.4. Diagnostic biologique de la stéatose................................................................................................... 4.5. Diagnostic biologique d’une cirrhose .................................................................................................. 4.6. Dépistage des carcinomes hépatocellulaires ...................................................................................... 5 ■■ Foie et grossesse ......................................................................................................................................... 6 ■■ Foie et variabilité individuelle aux xénobiotiques ......................................................................................... 7 ■■ Les traitements des pathologies hépatiques et leur suivi ............................................................................ 8 ■■ La greffe de foie ...........................................................................................................................................

293 293 293 294 296 296 296 297 297 297 299 301 302 304 304 306 306 306 306 306 306 309 309 309 310 310

XIX

4557_2_.book Page XX Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Chapitre 17 Métabolisme du fer : marqueurs de surcharge et de carence ––––––––––––––––––––

313

Véronique Annaix, Édith Bigot-Corbel 1 ■■ Métabolisme du fer ...................................................................................................................................... 1.1. Répartition du fer dans l’organisme..................................................................................................... 1.2. Cycle du fer.......................................................................................................................................... 1.3. Besoins en fer de l’organisme ............................................................................................................. 1.4. Absorption intestinale du fer................................................................................................................ 1.5. Transport plasmatique du fer et captation cellulaire ........................................................................... 1.6. Métabolisme intracellulaire du fer ........................................................................................................ 2 ■■ Maintien de l’homéostasie du fer ................................................................................................................. 2.1. La protéine HFE ................................................................................................................................... 2.2. L’hepcidine .......................................................................................................................................... 3 ■■ Exploration du métabolisme du fer .............................................................................................................. 3.1. Dosage du fer sérique.......................................................................................................................... 3.2. Dosage de la transferrinémie, calcul de la CTF et du CS .................................................................... 3.3. Dosage de la ferritinémie ..................................................................................................................... 3.4. Autres dosages .................................................................................................................................... 3.5. Exploration dynamique ........................................................................................................................ 4 ■■ Interprétation du métabolisme pathologique du fer..................................................................................... 4.1. Les surcharges en fer : hémochromatoses héréditaires et autres hypersidérémies ........................... 4.2. Les carences martiales ........................................................................................................................ 4.3. Cas des anémies inflammatoires......................................................................................................... 4.4. Les anomalies rares, de transport, d’utilisation du fer ou de régulation .............................................

Chapitre 18 Apport des biomarqueurs fécaux au diagnostic en gastroentérologie (hors cancérologie) –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

315 315 315 316 316 318 319 320 320 320 321 321 322 323 323 324 324 324 326 327 327

329

Nathalie Kapel 1 ■■ Biomarqueurs de la fonction pancréatique exocrine ................................................................................... 1.1. Activité chymotrypsique fécale............................................................................................................ 1.2. Élastase 1 pancréatique ...................................................................................................................... 2 ■■ L’α1 antitrypsine, un biomarqueur des entéropathies exsudatives ............................................................. 2.1. α1 antitrypsine ..................................................................................................................................... 3 ■■ Biomarqueurs de la réponse inflammatoire intestinale ................................................................................ 3.1. TNF-α ................................................................................................................................................................... 3.2. La lactoferrine ...................................................................................................................................... 3.3. La calprotectine ................................................................................................................................... 3.4. Perspectives ........................................................................................................................................

Chapitre 19 Marqueurs de l’insuffisance rénale et prise en charge des patients en insuffisance rénale chronique, dialysés et transplantés––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

331 331 332 333 333 334 335 335 335 339

343

Claire Tournois-Hirzel, Éric Canivet 1 ■■ Marqueurs de l’insuffisance rénale chronique ............................................................................................. 1.1. Créatinine plasmatique ........................................................................................................................ 1.2. Mesure ou estimation du débit de filtration glomérulaire .................................................................... 1.3. Protéines urinaires et anomalies du sédiment urinaire ........................................................................ 1.4. Cystatine C .......................................................................................................................................... 2 ■■ Définition et classification de la maladie rénale chronique .......................................................................... 3 ■■ Prise en charge de l’insuffisance rénale chronique non terminale............................................................... 3.1. Épidémiologie ...................................................................................................................................... 3.2. Prise en charge thérapeutique, notion de néphroprotection ...............................................................

XX

345 345 349 353 355 356 357 357 357

4557_2_.book Page XXI Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Table des matières

4 ■■ Prise en charge de l’insuffisance rénale chronique terminale ...................................................................... 4.1. Épidémiologie ...................................................................................................................................... 4.2. Contexte économique ......................................................................................................................... 4.3. La dialyse ............................................................................................................................................. 4.4. La transplantation rénale ..................................................................................................................... 5 ■■ Marqueurs de l’insuffisance rénale aiguë.....................................................................................................

360 360 362 362 368 370

Chapitre 20 Le métabolisme phosphocalcique : mécanismes de régulation, exploration biochimique et principaux déséquilibres pathologiques ––––––––––––––

375

Saïd Kamel, Michel Brazier, Jean-Claude Souberbielle 1 ■■ Le métabolisme du calcium et sa régulation ............................................................................................... 1.1. Distribution du calcium dans l’organisme ........................................................................................... 1.2. Échanges calciques dans l’organisme ................................................................................................ 1.3. Régulation hormonale de la calcémie.................................................................................................. 2 ■■ Le métabolisme du phosphore et sa régulation........................................................................................... 2.1. Distribution du phosphore dans l’organisme....................................................................................... 2.2. Échanges de phosphore dans l’organisme ......................................................................................... 2.3. Régulation de la phosphatémie : rôle central du FGF 23 .................................................................... 2.4. Régulation de la phosphatémie : rôle de la PTH ................................................................................. 3 ■■ Principaux paramètres biochimiques nécessaires à l’exploration du métabolisme phosphocalcique en pratique clinique...................................................................................................................................... 3.1. Quels paramètres mesurer ? ............................................................................................................... 3.2. Aspects analytiques et postanalytiques des dosages les plus courants ............................................ 4 ■■ Principaux désordres pathologiques du métabolisme phosphocalcique .................................................... 4.1. Pathologies parathyroïdiennes ............................................................................................................ 4.2. Pathologies de la vitamine D ............................................................................................................... 4.3. Hyperparathyroïdie secondaire due à l’insuffisance rénale chronique ................................................ 4.4. Troubles de la réabsorption rénale du phosphate : les diabètes phosphatés .................................... 4.5. Pathologies tumorales ......................................................................................................................... 5 ■■ Principes généraux d’interprétation du bilan phosphocalcique...................................................................

Chapitre 21 Marqueurs biochimiques du remodelage osseux : intérêt dans l’évaluation des pathologies osseuses –––––––––––––––––––––––––––––

377 377 377 380 383 383 384 384 386 386 386 387 390 390 391 393 395 396 396

399

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Saïd Kamel 1 ■■ Physiologie et biologie normale du tissu osseux ......................................................................................... 1.1. Remodelage osseux et régulation du métabolisme phosphocalcique................................................ 1.2. Les différentes séquences du remodelage osseux ............................................................................. 1.3. Composition du tissu osseux .............................................................................................................. 1.4. Contrôle du remodelage osseux.......................................................................................................... 2 ■■ Principales pathologies osseuses ................................................................................................................ 2.1. Remodelage osseux, masse osseuse et ostéoporose ........................................................................ 2.2. Physiopathologie des ostéoporoses ................................................................................................... 3 ■■ Marqueurs biochimiques de la résorption osseuse ..................................................................................... 3.1. Les produits de dégradation du collagène .......................................................................................... 3.2. Les marqueurs reflétant le nombre d’ostéoclastes actifs et l’activité des ostéoclastes ..................... 4 ■■ Principaux marqueurs biochimiques de la formation osseuse .................................................................... 4.1. La phosphatase alcaline totale et son isoenzyme osseuse................................................................. 4.2. L’ostéocalcine sérique ......................................................................................................................... 4.3. Les peptides d’extension du collagène de type I ................................................................................ 5 ■■ Principales sources de variabilité des marqueurs du remodelage osseux et valeurs de référence ............ 5.1. Facteurs de variabilité contrôlables ..................................................................................................... 5.2. Facteurs de variabilité non contrôlables .............................................................................................. 5.3. Établissement des valeurs de référence ..............................................................................................

401 401 402 402 406 407 407 409 410 410 412 413 413 414 415 415 415 416 417

XXI

4557_2_.book Page XXII Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

6 ■■ Utilité clinique des marqueurs du remodelage osseux dans l’ostéoporose ................................................ 6.1. Diagnostic de l’ostéoporose ................................................................................................................ 6.2. Estimation du risque fracturaire et aide à la décision thérapeutique .................................................. 6.3. Suivi des traitements anti-ostéoporotiques ......................................................................................... 6.4. Utilité clinique des marqueurs du remodelage osseux dans d’autres affections du squelette ...........

Chapitre 22 Biomarqueurs tumoraux circulants et tissulaires––––––––––––––––––––––––––––––––

417 417 417 419 420

423

Jean-Paul Brouillet, Jean-Christophe Boyer, Christine Bobin-Dubigeon, Jean-Marie Bard 1 ■■ Marqueurs tumoraux circulants ................................................................................................................... 1.1. Marqueurs oncofœtaux ....................................................................................................................... 1.2. Cytokératines....................................................................................................................................... 1.3. Enzymes .............................................................................................................................................. 1.4. Hormones ............................................................................................................................................ 1.5. Autres marqueurs tumoraux ................................................................................................................ 1.6. Marqueurs non tumoraux associés au suivi des tumeurs ................................................................... 2 ■■ Recommandations d’utilisation des marqueurs tumoraux circulants .......................................................... 2.1. Marqueurs utiles au dépistage et/ou au diagnostic ............................................................................ 2.2. Marqueurs utiles au suivi et à la surveillance ...................................................................................... 2.3. Recommandations pour la réalisation du dosage des marqueurs tumoraux circulants ..................... 2.4. Conclusion sur les marqueurs circulants............................................................................................. 3 ■■ Marqueurs tumoraux tissulaires ................................................................................................................... 3.1. Techniques utilisées ............................................................................................................................ 3.2. Tumeurs mammaires ........................................................................................................................... 3.3. Tumeurs digestives.............................................................................................................................. 3.4. Tumeurs bronchopulmonaires ............................................................................................................. 3.5. Neuroblastome ....................................................................................................................................

Chapitre 23 Marqueurs de l’axe hypothalamo-hypophysaire–––––––––––––––––––––––––––––––––

425 425 427 428 429 430 430 431 431 432 433 433 434 434 434 435 438 438

443

Sophie Mary, Patrice Faure 1 ■■ Physiopathologie de l’axe hypothalamo-hypophysaire (HH) ....................................................................... 1.1. Rappels anatomiques et physiologiques de l’appareil HH .................................................................. 1.2. Marqueurs de l’hypothalamus et de l’hypophyse : aspects fonctionnels et moléculaires .................. 1.3. Contrôle de l’axe de régulation : le système intégratif ........................................................................ 1.4. Pathologies de l’appareil hypothalamo-hypophysaire ........................................................................ 2 ■■ Exploration (hypothalamo-antéhypophysaire) de l’axe gonadotrope .......................................................... 2.1. Dosages statiques des gonadotrophines plasmatiques...................................................................... 2.2. Épreuves dynamiques ......................................................................................................................... 3 ■■ Exploration hypothalamo-antéhypophysaire de l’axe thyréotrope .............................................................. 3.1. Dosages statiques des hormones thyroïdiennes................................................................................. 3.2. Épreuves dynamiques ......................................................................................................................... 4 ■■ Exploration de l’axe corticotrope ................................................................................................................. 5 ■■ Exploration de l’axe lactotrope .................................................................................................................... 5.1. Dosage(s) statique(s) ........................................................................................................................... 5.2. Test de stimulation de l’axe lactotrope................................................................................................ 5.3. Test de freinage ................................................................................................................................... 6 ■■ Exploration de l’axe somatotrope ................................................................................................................ 6.1. Dosages statiques ............................................................................................................................... 6.2. Épreuves de stimulation : exploration des déficits en GH................................................................... 6.3. Épreuves de freinage ........................................................................................................................... 7 ■■ Explorations fonctionnelles des pathologies de l’axe hypothalamo-posthypophysaire .............................. 7.1. Un dosage statique relevant : la vasopressine (AVP) (ou ADH) ........................................................... 7.2. Exploration biochimique des diabètes insipides ................................................................................. 7.3. Exploration biochimique des SIADH....................................................................................................

XXII

445 445 446 448 448 449 449 449 450 450 450 450 450 450 450 450 450 450 451 453 455 455 455 457

4557_2_.book Page XXIII Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Table des matières

Chapitre 24 Exploration biologique de la thyroïde–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

459

Véronique Annaix, Philippe Charpiot 1 ■■ Rappels anatomiques et physiologiques ..................................................................................................... 2 ■■ Les hormones iodées thyroïdiennes ............................................................................................................ 2.1. Apport alimentaire ............................................................................................................................... 2.2. Biosynthèse au niveau de la thyroïde .................................................................................................. 2.3. Régulation de la biosynthèse............................................................................................................... 2.4. Transport sanguin des hormones thyroïdiennes ................................................................................. 2.5. Transformation de T4 en T3................................................................................................................. 2.6. Mode d’action des hormones thyroïdiennes ....................................................................................... 2.7. Catabolisme périphérique.................................................................................................................... 3 ■■ Évaluation de la fonction thyroïdienne et place de la biologie..................................................................... 3.1. Dosages hormonaux............................................................................................................................ 3.2. Dosage des auto-anticorps ................................................................................................................. 3.3. Test au TRH ......................................................................................................................................... 3.4. Surveillance biologique des traitements .............................................................................................. 3.5. Bilan complémentaire dans le diagnostic et le suivi des cancers thyroïdiens..................................... 4 ■■ Imagerie médicale ........................................................................................................................................ 5 ■■ Les pathologies thyroïdiennes ..................................................................................................................... 5.1. Démarche diagnostique devant une anomalie morphologique ........................................................... 5.2. Démarche diagnostique devant des anomalies fonctionnelles ........................................................... 6 ■■ Pièges dans l’interprétation des résultats .................................................................................................... 6.1. Les variations physiologiques.............................................................................................................. 6.2. Les perturbations d’origine extrathyroïdienne ..................................................................................... 6.3. Les interférences médicamenteuses sur l’interprétation des résultats ...............................................

Chapitre 25 Marqueurs de la corticosurrénale ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

461 461 461 462 463 463 464 464 464 464 464 465 465 465 466 466 466 467 468 470 470 470 470

473

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Sophie Mary, Jean-Paul Brouillet 1 ■■ La corticosurrénale : une glande endocrine indispensable à la vie ............................................................. 1.1. Rappels anatomiques et physiologiques ............................................................................................. 1.2. Biosynthèse des hormones corticosurrénaliennes .............................................................................. 1.3. Pathologies associées aux fonctions corticosurrénaliennes ............................................................... 2 ■■ Marqueurs des fonctions corticosurrénaliennes .......................................................................................... 2.1. L’ACTH, marqueur hypophysaire ........................................................................................................ 2.2. Les glucocorticoïdes : le cortisol ......................................................................................................... 2.3. Les minéralocorticoïdes : l’aldostérone ............................................................................................... 2.4. Les androgènes surrénaliens ............................................................................................................... 2.5. Marqueurs du métabolisme intermédiaire des stéroïdes surrénaliens ................................................ 3 ■■ Utilisation des marqueurs dans l’exploration des désordres surrénaliens .................................................. 3.1. Marqueurs des hyperfonctionnements surrénaliens ........................................................................... 3.2. Marqueurs des hypocorticismes : insuffisances surrénaliennes ......................................................... 3.3. Synthèse ..............................................................................................................................................

Chapitre 26 Marqueurs médullosurrénaliens –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

475 475 475 476 477 477 477 478 479 481 481 481 486 487

489

Jean-Pierre Garnier 1 ■■ Rappels physiologiques sur la médullosurrénale......................................................................................... 1.1. Anatomie-physiologie .......................................................................................................................... 1.2. Embryologie ......................................................................................................................................... 1.3. Histologie ............................................................................................................................................. 2 ■■ Présentation des catécholamines ................................................................................................................ 2.1. Les catécholamines ............................................................................................................................. 2.2. Les métanéphrines ..............................................................................................................................

491 491 491 491 491 491 491

XXIII

4557_2_.book Page XXIV Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

2.3. Catabolites acides ............................................................................................................................... 2.4. Biosynthèse ......................................................................................................................................... 2.5. Catabolisme......................................................................................................................................... 2.6. Origine tissulaire, stockage.................................................................................................................. 3 ■■ Les techniques usuelles de dosage ............................................................................................................. 3.1. Prélèvement ......................................................................................................................................... 3.2. Chromatographie liquide haute pression (CLHP) des catécholamines sanguines et urinaires ........... 3.3. CLHP des métanéphrines urinaires ..................................................................................................... 3.4. VMA – HVA .......................................................................................................................................... 4 ■■ Interprétation : variations physiologiques et pathologiques ........................................................................ 4.1. Catécholamines plasmatiques............................................................................................................. 4.2. Catécholamines urinaires libres........................................................................................................... 4.3. Catécholamines urinaires totales......................................................................................................... 4.4. Conversion anciennes unités – nouvelles unités ................................................................................. 4.5. Métanéphrines urinaires ...................................................................................................................... 4.6. VMA – HVA .......................................................................................................................................... 4.7. Variations pathologiques ..................................................................................................................... 5 ■■ Indications biocliniques : Tumeurs Neuro-Endocrines : phéochromocytome, neuroblastome ................... 5.1. Phéochromocytomes........................................................................................................................... 5.2. Neuroblastomes................................................................................................................................... 5.3. Psychiatrie ...........................................................................................................................................

Chapitre 27 Fertilité, reproduction, grossesse ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

491 491 491 492 492 492 493 493 493 494 494 494 494 494 495 495 496 496 496 496 497

501

Jean-Paul Brouillet, Anne Polge 1 ■■ La fertilité : une histoire de couple ............................................................................................................... 1.1. Rappels de la physiologie ovarienne ................................................................................................... 1.2. Rappels de la physiologie testiculaire ................................................................................................. 1.3. L’infertilité, parfois une histoire d’hormones ....................................................................................... 2 ■■ Fécondation naturelle et Assistance Médicale à la Procréation (AMP)........................................................ 2.1. Rappels sur les mécanismes de la fécondation naturelle ................................................................... 2.2. Principe des techniques d’assistance médicale à la procréation (AMP) ............................................. 3 ■■ Marqueurs de fertilité/infertilité et du suivi d’AMP ....................................................................................... 3.1. Marqueurs de l’axe hypophyso-gonadique ......................................................................................... 3.2. Autres marqueurs utiles au diagnostic étiologique.............................................................................. 3.3. Marqueurs de fertilité/infertilité chez la femme.................................................................................... 3.4. Marqueurs de fertilité/infertilité chez l’homme .................................................................................... 3.5. Marqueurs de la réserve ovarienne ..................................................................................................... 3.6. Marqueurs du monitorage de l’ovulation ............................................................................................. 4 ■■ Grossesse .................................................................................................................................................... 4.1. L’hCG, marqueur biologique de la grossesse ..................................................................................... 4.2. Dépistage et suivi des avortements spontanés et des grossesses ectopiques .................................. 4.3. Dépistage et diagnostic des maladies trophoblastiques gestationnelles............................................

Chapitre 28 Dépistage de la trisomie 21 fœtale par les marqueurs sériques maternels ––––––––

503 503 504 504 504 504 505 505 505 510 510 511 512 512 512 512 514 515

517

Maguy Bernard, Françoise Muller 1 ■■ Principe du dépistage biologique ................................................................................................................ 1.1. Bases mathématiques du calcul du risque de trisomie 21.................................................................. 1.2. Facteurs influençant la distribution des marqueurs sériques maternels ............................................. 1.3. Facteurs influençant le calcul de risque .............................................................................................. 1.4. Aspects physiopathologiques des marqueurs sériques maternels .....................................................

XXIV

519 519 521 522 522

4557_2_.book Page XXV Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Table des matières

2 ■■ Organisation du dépistage en France .......................................................................................................... 2.1. Dispositions réglementaires................................................................................................................. 2.2. Les stratégies de dépistage................................................................................................................. 2.3. Marqueurs sériques et dépistage d’autres anomalies ......................................................................... 3 ■■ Les performances du dépistage ..................................................................................................................

522 522 523 524 524

Chapitre 29 Dépistage néonatal de maladies génétiques ––––––––––––––––––––––––––––––––––––

527

Roselyne Garnotel, Patrice Thérond

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

1 ■■ Le prélèvement : le test de Guthrie .............................................................................................................. 2 ■■ La mucoviscidose ........................................................................................................................................ 2.1. Physiopathologie ................................................................................................................................. 2.2. Manifestations cliniques ...................................................................................................................... 2.3. Dépistage néonatal .............................................................................................................................. 2.4. Recherche de mutations...................................................................................................................... 3 ■■ L’hypothyroïdie congénitale permanente..................................................................................................... 3.1. Physiopathologie ................................................................................................................................. 3.2. Dépistage biochimique et évaluation diagnostique ............................................................................. 3.3. Traitement............................................................................................................................................ 4 ■■ L’hyperplasie congénitale des surrénales .................................................................................................... 4.1. Physiopathologie ................................................................................................................................. 4.2. Diagnostic néonatal ............................................................................................................................. 4.3. Traitement............................................................................................................................................ 5 ■■ La drépanocytose ........................................................................................................................................ 5.1. Physiopathologie ................................................................................................................................. 5.2. Incidence ............................................................................................................................................. 5.3. Diagnostic néonatal ............................................................................................................................. 5.4. Traitement............................................................................................................................................ 6 ■■ La phénylcétonurie....................................................................................................................................... 6.1. Physiopathologie ................................................................................................................................. 6.2. Prévalence ........................................................................................................................................... 6.3. Tests biologiques................................................................................................................................. 6.4. Traitement............................................................................................................................................ 7 ■■ L’innovation technologique au service de maladies génétiques : la spectrométrie de masse pour le dépistage du déficit de l’acyl-CoA déshydrogénase des acides gras à chaîne moyenne (MCAD) . 7.1. Aspects analytiques............................................................................................................................. 7.2. Le déficit en acyl-CoA déshydrogénase des acides gras à chaîne moyenne ..................................... 8 ■■ Acquis et perspectives .................................................................................................................................

Chapitre 30 Évaluation biochimique des lésions neurodégénératives et des lésions cérébrales aiguës –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

529 530 530 531 531 532 534 535 535 535 535 535 536 536 537 537 537 537 538 538 538 538 539 539 540 540 540 541

545

Sylvain Lehmann, Jean-Louis Beaudeux 1 ■■ Biomarqueurs de lésions neurodégénératives ............................................................................................. 1.1. Le peptide amyloïde Aβ..................................................................................................................................... 1.2. La protéine Tau .................................................................................................................................... 1.3. La protéine 14-3-3 ............................................................................................................................... 1.4. Perspectives ........................................................................................................................................ 2 ■■ Biomarqueurs de lésions cérébrales aiguës ................................................................................................ 2.1. La protéine S100B ............................................................................................................................... 2.2. La Neuron Specific Enolase (NSE)....................................................................................................... 2.3. La protéine gliale fibrillaire acide (GFAP : Glial Acidic Fibrillary Protein) ............................................. 2.4. Perspectives ........................................................................................................................................

547 547 548 550 551 552 553 556 557 557

XXV

4557_2_.book Page XXVI Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Chapitre 31 Biomarqueurs phénotypiques et génotypiques de la réponse thérapeutique et toxique aux médicaments–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

561

Christine Bobin-Dubigeon, Jean-Pierre Goullé, Michel Lhermitte, Jean-Marie Bard, Alexandre Evrard 1 ■■ Biomarqueurs prédictifs de réponse ou de toxicité ..................................................................................... 1.1. Applications en oncopharmacologie ................................................................................................... 1.2. Applications aux médicaments antithrombotiques ............................................................................. 1.3. Application aux médicaments antirétroviraux ..................................................................................... 2 ■■ Toxicologie et biologie clinique ....................................................................................................................

563 563 566 567 567

Chapitre 32 Marqueurs en addictologie et toxicomanies : actualité et prospective ––––––––––––

575

Michèle Artur, Marie-Madeleine Galteau, Yves Artur

Index

XXVI

1 ■■ Marqueurs de la consommation d’alcool..................................................................................................... 1.1. Données épidémiologiques et aspects physiopathologiques ............................................................. 1.2. Métabolisme de l’alcool ....................................................................................................................... 1.3. Les marqueurs biochimiques d’utilisation courante ............................................................................ 1.4. Les tests anciens ou non adaptés au dépistage dans une population générale ................................ 1.5. Les marqueurs émergents ................................................................................................................... 1.6. Les marqueurs génétiques de l’alcoolisme ......................................................................................... 1.7. Les paramètres biologiques perturbés par la consommation d’alcool ............................................... 2 ■■ Marqueurs du tabagisme ............................................................................................................................. 2.1. Données épidémiologiques/santé publique ........................................................................................ 2.2. Dépendance au tabagisme et facteurs génétiques ............................................................................. 2.3. Composition de la fumée de tabac...................................................................................................... 2.4. Marqueurs du tabagisme..................................................................................................................... 2.5. Sensibilité et spécificité ....................................................................................................................... 2.6. Les marqueurs génétiques du tabagisme (marqueurs de dépendance) ............................................. 3 ■■ Marqueurs de la consommation de drogues illicites (stupéfiants) ou d’un usage détourné des médicaments......................................................................................................................................... 3.1. La pharmacodépendance : systèmes réglementaires d’évaluation et de lutte contre l’abus de substances psychoactives ............................................................................................................. 3.2. Épidémiologie de la pharmacodépendance ........................................................................................ 3.3. Stupéfiants (drogues illicites) ............................................................................................................... 3.4. Médicaments détournés de leur usage ...............................................................................................

577 577 578 579 582 583 584 584 586 586 586 586 587 591 591

–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

601

592 592 593 593 598

4557_2_.book Page XXVII Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Liste des abréviations

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

17 OHP 2-DE 3HB 3-MH 5-HTOL 5'-NT αFP αGST γGT AAs AAT ABM ABTS Ac anti-HBc totaux Ac anti-HBs Ac AcAc ACAT ACR ACTH ADA ADAG ADN ADNc AdoCbl ADP AE AER AFDPHE AFSSAPS Ag HBs

17 hydroxyprogestérone Électrophorèse bidimensionnelle 3β-hydroxybutyrate 3-méthylhistidine 5-hydroxytryptophol 5'-nucléotidase Alpha-fœtoprotéine Alpha-glutathion S-transférase Gamma glutamyl transférase Acides aminés Alpha1 antitrypsine Agence de la biomédecine 2,2‘-azino-bis(éthylbenzothiazoline-6-sulphonate) Anticorps (IgG et IgM) dirigés contre la nucléocapside HBc du virus de l’hépatite B Anticorps dirigés contre l’antigène de surface HBs du virus de l’hépatite B Anticorps Acéto-acétate Acylcoenzyme A cholestérol acyl-transférase Albumin Creatinine ratio Corticotropine (adrenocorticotropic hormone) American Diabetes Association A1C-derived average glucose Acide désoxyribonucléique ADN complémentaire 5'-désoxyadénosylcobalamine Adénosine diphosphate Activité enzymatique Albumin Excretion ratio Association française pour le dépistage et la prévention des handicaps de l’enfant Agence française de sécurité sanitaire et des produits de santé Antigène de surface HBs du virus de l’hépatite B

AGE AINS ALB ALDH ALE ALT AMM AMPc AMPPD AN ANAES ANCA APP ARA2 ARC ARH ARN ARNm ARPDD

ASAT ASE AST ASTm ATP ATS AURA

AVC AVED

Produits de glycation avancée Anti-inflammatoire non stéroïdien Albumine Aldéhyde déshydrogénase Produits de lipoxydation avancée Alanine aminotransférase (anciennement TGP ou ALAT) Acide méthylmalonique Adénosine monophosphate cyclique Adamentyl 1,2-dioxetane arylphosphate Acide nicotinique Agence nationale d’accréditation et d’évaluation en santé devenue HAS Anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires neutrophiles Amyloid Precursor Protein Antagonistes de l’angiotensine II ou Sartans Attaché de recherche clinique Agence régionale d’hospitalisation Acide ribonucléique ARN messager Association régionale pour la promotion de la dialyse à domicile (établissement de santé privé à but non lucratif de Champagne Ardenne) Aspartate aminotransférase Agents stimulants de l’érythropoïèse Aspartate aminotransférase (anciennement TGO ou ASAT) Aspartate aminotransférase mitochondriale Adénosine triphosphate Antithyroïdiens de synthèse Association pour l’utilisation du rein artificiel (établissement de santé privé à but non lucratif d’Île-de-France) Accident vasculaire cérébral Ataxie avec déficience isolée en vitamine E

XXVII

4557_2_.book Page XXVIII Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

AVK AVP BCR BH4 BHT BK virus BPC BPF BPL BSP C3 C4 CAP CBG Cbl CCK-PZ CD36 CDAI CDT

Antivitamine K Arginine vasopressine ou ADH (antidiuretic hormone) Bureau communautaire de référence Tétrahydrobioptérine Butylhydroxytoluène Polyomavirus à ADN Bonnes pratiques cliniques Bonnes pratiques de fabrication Bonnes pratiques de laboratoire Bromosulfonephtaléine Fraction C3 du complément Fraction C4 du complément College of American Pathologists Cortisol Binding Globulin Cobalamines Cholécystokinine-pancréozymine Cluster of differentiation 36 Crohn’s disease activity index Transferrine désialylée (« carbohydrate-deficient transferrin ») CEBH Collection d’échantillons biologiques humains CEBPA CCAAT/enhancer-binding protein alpha CEDIA Cloned enzyme donor immunoassay CEIP Centre d’évaluation et d’information sur la pharmacodépendance CETP Protéine de transfert des esters de cholestérol CFTR Cystic fibrosis transmembrane condutance regulator CgA Chromogranine A CGH-array Comparative genomic hybridization array CH50 Fraction hémolytique 50 % du complément CHC Carcinome hépatocellulaire CK Créatine kinase CLAT Clairance de l’alpha1 antitrypsine CLBP Chromatographie liquide basse pression CLF Capacité latente de fixation CLHP Chromatographie liquide haute pression (haute performance) CLHP-SM Chromatographie liquide haute performance – spectrométrie de masse CLHP-SM-SM Chromatographie liquide haute performance – spectrométrie de masse en tandem CLIA Chimiluminescent-immunoassay CLU Cortisol libre urinaire CM Chylomicron CMH Complexe majeur d’histocompatibilité CMIA Chemiluminescent magnetic microparticle immunoassay CMV Cytomegalovirus CN Clarté nucale CNAMTS Caisse national d’assurance maladie des travailleurs salariés CNIL Commission nationale informatique et libertés CNSP Commission nationale des stupéfiants et des psychotropes (appartient à l’Afssaps) COFRAC Comité français d’accréditation CPG Chromatographie en phase gazeuse

XXVIII

CPG-SM CPP CPY2E1 CR CRCM CRF CRH CRISTAL

CRP CS CS-Tf CT CTF CV Cx CYP2A6 CYP2A6 DA DAP DBP DC DCCT DCP DEAE DFG DG DHEA DIC DIN DIT DMOS DMT1 DNN DNPH DOC DoE DP DPA DPCA DPD DPPP DT1 DT2 DTP DXM EALT EAST EBPG EBV ECBU ECG

Chromatographie gazeuse – spectrométrie de masse Comité de protection des personnes Cytochrome P-450 2E1 (protéine) Cross-réactant ou molécule interférente dans une réaction croisée Centre de ressources et de compétences de la mucoviscidose Corticotropin releasing factor Hormone de libération de l’ACTH (corticolibérine) Registre national des patients greffés rénaux et de patients en attente de greffe, en relation avec l’agence biomédecine C-reactive protein (protéine C-réactive) Coefficient de saturation Coefficient de saturation de la transferrine Cholestérol total Capacité totale de fixation du fer par la transferrine Coefficient de variation Carnitine substituée avec un acide gras dont le nombre de carbones est x Cytochrome P-450 2A6 (gène) Cytochrome P-450 2A6 (protéine) Dopamine DMT1 Associated Protein Vitamin D binding protein Acide dicarboxylique Diabetes Control and Complications Trial Décarboxyprothrombine Diéthylaminoéthyl Débit de filtration glomérulaire Diabète gestationnel Déhydroépiandrostérone Diabète insipide central Diabète insipide néphrogénique Di-iodotyrosyl Diverses mesures d’ordre social Divalent Metal Transporter 1 Dépistage néonatal Dinitrophénylhydrazine Désoxycorticostérone Degré d’extrême Dialyse péritonéale Dialyse péritonéale automatisée Dialyse péritonéale continue ambulatoire Dihydropyrimidine déshydrogénase Diphénylpyrénylphosphine Diabète de Type 1 Diabète de Type 2 Thiamine diphosphate Dexaméthasone Activité alanine aminotransférase érythrocytaire Activité aspartate aminotransférase érythrocytaire European Best Practice Guidelines Epstein Barr Virus Examen cytobactériologique des urines Electrocardiogramme

4557_2_.book Page XXIX Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Liste des abréviations

EDTA EE EER EGF EGR EIA ELISA ELU EMA EMCDDA EMIT EPO ERBP ERN ERO ESI EtG ETK EtS FAD FAEEs FAV FDA FGF FI FIA FITC FLU FMN FMOC FSH FT-ICR FTIR G6PDH GABA GAD Gas GBEA

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

GCK GC-MS GFAP GGT GHB GHBP GHD GHR GH-RH GLDH GLP1 GLUT

Acide éthylène diamine tétra-acétique Entéropathie exsudative Épuration extra rénale Epidermal growth factor Activité glutathion réductase érythrocytaire Enzyme-immunoassay Enzyme linked immunosorbent assay Substance E (cortisone) libre urinaire Agence européenne du médicament (European Medicine Agency) European Monitoring Centre for drugs and drugs addiction Enzyme-multiplied immunoassay technique Erythropoïétine European Renal Best Practice Espèces réactives de l’azote Espèces réactives de l’oxygène Electrospray ionization Glucuronide d’éthyle Activité transcétolasique érythrocytaire Sulfate d’éthyle Flavine adénine dinucléotide Esters éthyliques d’acides gras Fistule artérioveineuse Food and Drug administration Fibroblast growth factor Facteur intrinsèque Fluoro-immunoassay Isothiocyanate de fluorescéine Substance F (cortisol) libre urinaire Flavine mononucléotide 9-fluorénylmethyloxycarbonyl Hormone folliculostimulante Fourier transform – ionic cyclotronic resonance Fourier transform Infrared spectroscopy Glucose 6-phosphate déshydrogénase Acide gamma aminobutyrique Glutamic acid decarboxylase Growth arrest-specific protein Guide de bonne exécution des analyses de biologie médicale Glucokinase Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse Glial Fibrillary Acidic Protein Gamma-glutamyltransférase Gamma hydroxybutyrate Protéine de liaison à la GH : Growth Hormone Binding Protein) Déficit en GH Récepteur de la GH Hormone de libération de la GH (somatolibérine ; somatocrinine) Glutamate déshydrogénase (EC 1.4.1.3) Glucagon-like peptide-1 Glucose transporter

GnRH GNRI GO GPX GSH GSSG HAMA HAMP HAP HAS HbA1c HbCO HBD-2 HbS HC HC hCG hCGβ HCP1 HCS Hcy HD HDL HGF h-GH HGPIV HGPO HH HHS HIC HL HLA HMG-CoA réductase HNE HNF HODE HOMA HPLC HPODE HSP HSV HTA IA-2 IAA IADPSG IATA IC IC95 % ICA ICG ICH IDL

LH-RH, hormone de libération des gonadotrophines (gonadolibérine ou lulibérine) Geriatric Nutritional Risk Index Glucose oxydase Glutathion peroxydase Glutathion réduit Glutathion oxydé Human anti-mouse antibody Hepcidine Antimicrobial Peptide Hyperaldostéronisme primaire Haute autorité de santé Hémoglobine A1 glyquée Carboxyhémoglobine β-défensine 2 Hémoglobine S Haptocorrine Hypothyroïdie congénitale Hormone gonadotrophine chorionique Sous-unité β libre de l’hCG Heme Carrier Protein 1 Hyperplasie congénitale des surrénales Homocystéine Hémodialyse High Density Lipoprotein – Lipoprotéines de haute densité Hepatocyte Growth Factor Hormone de croissance (humaine) ou STH (somatotropine) Hyperglycémie provoquée par voie intraveineuse Hyperglycémie provoquée par voie orale Hypothalamo-hypophysaire Hypothalamo-hypophyso-surrénalien Hémorragie intracrânienne Hydroperoxyde lipidique Human Leukocyte Antigen Hydroxyméthyl-glutaryl-coenzyme A réductase Hydroxynonénal Hepatic nuclear factor Acide hydroxyoctadécadiénoïque Homeostasis model assessment High Pressure Liquid Chromatography Acide hydroperoxyoctadécadiènoïque Heat shock protein Herpes simplex virus Hypertension artérielle Insulinoma associated protein Insulin auto-antibody International Association of Diabetes and Pregnancy Study Groups International Air Transport Association Immuncomplexe Intervalle de confiance 95 % Islet cell antibodies Vert d’indocyanine International Conference of Harmonization Lipoprotéines de densité intermédiaire

XXIX

4557_2_.book Page XXX Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

ID-MS IEC IEF IFCC IGF IHC IL IL-1 IL-1Ra IMAO IMC INR IPE IPF IPG IRA IRC IRCT IRE IRE-BP IRM IRMA IRMM IRP IRS IS IS ISO ITT IUB IUPAC IV JDF K/DOQI kDa KDIGO KGDH LADA LAP LBA LBM LC LC/MS LC/MS-MS LCAT LCC LDH LDL LH LOCI

XXX

Isotype dilution-mass spectrometry Inhibiteur de l’enzyme de conversion Isoélectrofocalisation International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine Facteur de croissance analogue à l’insuline (IGF-1 : somatomédine C) Insuffisance hépatocellulaire Interleukine Interleukine-1 Récepteur antagoniste à l’IL-1 Inhibiteur de la monoamine oxydase Indice de masse corporelle International Normalised Ratio Insuffisance pancréatique exocrine Insulin promoter factor Immobilized pH gradient Insuffisance rénale aiguë Insuffisance rénale chronique Insuffisance rénale chronique terminale Iron Responsive Element IRE – Binding Protein Imagerie structurale par résonance magnétique Dosage radioimmunométrique Institute for Reference Materials and Measurements Iron Regulatory Protein Insulin receptor substrate Immunsérum International standard International Organization for Standardization Test d’hypoglycémie provoquée par l’insuline (Insulin Tolerance Test) International Union of Biochemistry International Union of Pure and Applied Chemistry Intraveineuse Juvenile Diabetes Fundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiatives Kilodalton Kidney Disease Improving Global Outcomes α-cétoglutarate déshydrogénase Latent autoimmune diabetes in adults Leucine aminopeptidase Liquide broncho-alvéolaire Laboratoire de biologie médicale Liquid chromatography Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse Chromatographie liquide couplée à une spectrométrie de masse en tandem Lécithine cholestérol acyl transférase Longueur crânio-caudale Lactate déshydrogénase Lipoprotéines de basse densité – Low Density Lipoprotein Hormone lutéinisante Luminescent oxygen channeling immunoassay

Lp(a) LPH LPL Lp-PLA2 LSD LT MA MALDI MAO-A et MAO-B MBDB MBP MC MCJ MDA MDA MDEA MDMA MDRD MEC MeCbl MEGX MEOS Met MGP miARN MICI MILDT MIT MMP MODY MoM MRC MS MS/MS MUP NAD NADP NAFLD NAM NASH NGAL NGSP NIST NKDEP NKF NMN NO nPNA NRI NSE NTP OCT OEDT

Lipoprotéine (a) β-lipotropin Lipoprotéine lipase Phospholipase A2 associée aux lipoprotéines Diéthylamide de l’acide lysergique Leucotriène Maladie d’Alzheimer Matrix-assisted laser desorption/ionization Mono amino oxydases A et B Méthylbenzodioxyazolylbutanamine Myelin Basic Protein Maladie de Crohn Maladie de Creutzfeldt-Jakob Malondialdéhyde Méthylènedioxyamphétamine Méthylènedioxyéthamphétamine Méthylènedioxyméthamphétamine Modification of the Diet in Renal Disease Matrice extracellulaire Méthylcobalamine Monoéthylglycinexylidide Système microsomal d’oxydation de l’alcool (« Microsomal Ethanol Oxidizing System ») Méthionine Matrix Gla-protein MicroARN Maladie inflammatoire chronique de l’intestin Mission interministérielle de lutte contre la drogue et la toxicomanie Mono-iodotyrosyl Métalloprotéase matricielle Maturity-onset diabetes of the young Multiple de la médiane Maladie rénale chronique Mass spectrometry Spectrométrie de masse en tandem 4-méthylombelliferyl phosphate Nicotinamide adénine dinucléotide Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate Non Alcoholic Fatty Liver Disease Nicotinamide Non alcoholic steatohepatitis Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin National Glycohemoglobin Standardisation Program National Institute of Standards and Technology National Kidney Disease Education Program National Kidney Foundation N1-méthylnicotinamide Monoxyde d’azote Index de catabolisme protéique corrigé par le poids Nutritional Risk Index Enolase non spécifique Neural Thread Protein Ornithine carbamyltransférase Observatoire européen des drogues et toxicomanies

4557_2_.book Page XXXI Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Liste des abréviations

OFDT OMS OPA OPD Oroso OT PAC PAGE PAGE-SDS

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

PAL PAPP-A PBH PC PCOOH Pcr PCR PCT PCU PDGF PDH PEG PENIA PET test PEth PETIA PGF2 PIF PIIINP PINI PITC PIVKA PKC PLP PLTP PMF pmh PNPP POD POMC PP PP ppm PR PRGP PRI PRL PSA PSPH PTH PTHi PTP QUICKI RA

Observatoire français des drogues et des toxicomanies Organisation mondiale de la santé Orthophtaldialdéhyde Ortho-phénylènediamine Orosomucoïde Ocytocine Phosphatase acide Électrophorèse en gel de polyacrylamide Électrophorèse en gel de polyacrylamide – dodécylsulfate de sodium Phosphatase alcaline Protéine plasmatique A associée à la grossesse (pregnancy-associated plasma protein A) Ponction biopsie hépatique Phosphatidylcholine Hydroperoxyde de la phosphatidylcholine Créatinine plasmatique ou créatininémie Polymerase Chain Reaction Procalcitonine Phénylcétonurie Platelet-derived growth factor Pyruvate déshydrogénase Polyéthylène glycol Particle enhanced nephelometric immunoassay Peritoneal equilibration test Phosphatidyléthanol Particle enhanced turbidimetric immunoassay Prostaglandine F2 Prolactostatine (prolactin inhibitory factor) Peptide amino-terminal du procollagène de type III Pronostic Inflammatory and Nutritional Index Phénylisothiocyanate Protein induced vitamin K absence or antagonist Protein kinase C Pyridoxal 5'-phosphate Protéine de transfert des phospholipides Peptide mass fingerprinting Patients par million d’habitants Paranitrophénylphosphate Peroxydase Pro-opiomélanocortine Phosphate de pyridoxal Polydipsie primaire Partie par million Polyarthrite rhumatoïde Proline-rich Gla protein Protéines de la réaction inflammatoire Prolactine Antigène prostatique spécifique Hôpitaux privés sans brut lucratif participant au service public hospitalier Parathormone Parathormone intacte 1-84 Pancreatic Thread Protein Quantitative Insulin-sensitivity Check Index Récepteur des androgènes

RAR RAR RB RBP RCH RCPG RDPLF REIN RG rHu-EPO RI RIA RIA RM RMN RPA Rs-Tf RT-PCR RXR SA SAA SAL SAU SC SDS SELDI® SFAR SFBC SFTA SHBG SIADH SII SIJ SI-RH SNP SOP SPP SR-BI SRDA SRH SRM SVCT T T3 et T4 T3 T3L ou FT3 T3r T4 T4L ou FT4 TBA

Ratio aldostéronémie/activité rénine Retinoic acid receptor Riboflavine Retinol Binding Protein (protéine vectrice du rétinol) – Retinol binding protein Rectocolite hémorragique Récepteur couplé aux protéines G Registre de dialyse péritonéale de langue française Réseau épidémiologique et information en néphrologie Récepteur des glucocorticoïdes Erythropoïétine recombinante humaine Réaction inflammatoire Dosage radioimmunologique Radio-immunoanalyse Récepteur des minéralocorticoïdes Résonance magnétique nucléaire Activité rénine plasmatique Récepteur soluble de la transferrine Reverse transcription PCR Retinoid X receptor Semaine d’aménorrhée Serum amyloïde A Sérum antilymphocytaire Service d’accueil des urgences Surface corporelle Dodécylsulfate de sodium Surface-enhanced laser desorption/ionization Société française d’anesthésie-réanimation Société française de biologie clinique Société française de toxicologie analytique Sex hormone binding globulin Syndrome de sécrétion inappropriée d’hormone antidiurétique Syndrome de l’intestin irritable Index de sialylation de l’apolipoprotéine J plasmatique Somatostatine ou SRIF (somatotropin release inhibiting factor) Single Nucleotide Polymorphism Standard Operating Procedure Syndrome polyuropolydipsique Scavenger receptor class B type I Syndrome de détresse respiratoire aiguë Système réticulo-histiocytiare Standard Reference Material Sodium vitamin C transporter Thiamine Hormones thyroïdiennes (T3 : triiodothyronine et T4 : thyroxine) Tri-iodothyronine T3 libre T3 reverse Tétraiodothyronine ou thyroxine T4 libre Acide thiobarbiturique

XXXI

4557_2_.book Page XXXII Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

TBAb TBARS TBG TBPA TC TC TCA TCMH TDP Tf TfR Tg TG TGF TGLH THA THC THF ThTR TIMP TIR TK TMB TMG TMO-MRC TMP TNF TNFα TOF TP

XXXII

Thyroid Blocking Antibody Substances réagissant avec l’acide thiobarbiturique – Thiobarbituric acid-reactive substances Thyroxin-Binding Globulin Thyroxin-Binding PreAlbumine Transcobalamine Traumatisme crânien Temps de céphaline activée Teneur Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine Thiamine diphosphate Transferrine Récepteur de la transferrine Thyroglobuline Triglycérides Transforming growth factor Triglycéride lipase hépatique Tétrahydro-aldostérone Tétrahydrocannabinol Tétrahydrofolate Thiamine transporter Inhibiteur tissulaire des métalloprotéinases Trypsine immunoréactive Transcétolase 3,3‘,5,5‘-tétraméthylbenzidine Transmembrane Gla protein Troubles du métabolisme minéral et osseux associés aux maladies rénales chroniques Thiamine monophosphate Tumor necrosis factor Tumor Necrosis Factor type α Time of flight Taux de prothrombine

TPI TPMT TPO TPP TRACE TRF TRH TSAb TSH TTP TTR ucMGP ucOS UCP Ucr uE3 UKPDS UNICEF UOsm VDR VEGF VGM VHDL VIH VIP VLDL VNTR VPN VPP VS ZnT

Triose phosphate isomérase Thiopurine méthyltransférase Thyroperoxydase Thiamine pyrophosphate Time Resolved Amplified Cryptate Emission Transferrine Thyrotropin-Releasing Hormone ou thyrolibérine Thyroïd Stimulation Antibody Thyréostimuline (thyroid-stimulating hormone) Thiamine triphosphate Transthyrétine Uncarboxylated matrix Gla protein Uncarboxylated osteocalcine Uncoupling protein Créatinine urinaire Oestriol non conjugué United Kingdom Prospective Diabetes Study United Nations International Children’s Emergency Fund Osmolalité (ou osmolarité) urinaire Vitamin D receptor Vascular endothelial growth factor Volume globulaire moyen Lipoprotéines de très haute densité Virus de l’immunodéficience humaine Peptide vasoactif intestinal Lipoprotéine de très basse densité Variable-number tandem repeat Valeur prédictive négative Valeur prédictive positive Vitesse de sédimentation Transporteur de zinc

4557_2_.book Page 1 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

1 Les marqueurs biologiques, définitions et concept Michel Sève, Alain Favier

1 ■■ QU’EST-CE QU’UN MARQUEUR BIOLOGIQUE ? 2 ■■ COMMENT UN PARAMÈTRE BIOCHIMIQUE DEVIENT UN MARQUEUR ? 3 ■■ LES DIFFÉRENTES CATÉGORIES DE MARQUEURS 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8. 3.9.

Les marqueurs de risque Les marqueurs d’exposition Les marqueurs des systèmes de défense Les marqueurs de statut nutritionnel Les marqueurs de polymorphisme génétique Les marqueurs prédictifs Les marqueurs diagnostiques Les marqueurs de suivi thérapeutique Les marqueurs de pronostic

4 ■■ LES CRITÈRES ET L’ÉVALUATION D’UN MARQUEUR BIOLOGIQUE 5 ■■ LES LIMITATIONS DES MARQUEURS BIOLOGIQUES

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

6 ■■ LA RECHERCHE DE NOUVEAUX MARQUEURS Références bibliographiques

1

4557_2_.book Page 2 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4557_2_.book Page 3 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Les marqueurs biologiques, définitions et concept

a médecine moderne, afin d’améliorer le diagnostic des maladies ou leur traitement et dans un souci d’efficacité comme de sécurité, fait de plus en plus appel à l’analyse de paramètres biologiques du malade. Ces paramètres constituent des indicateurs biologiques de l’état du sujet, appelés marqueurs biologiques. La discipline consistant à étudier les marqueurs biochimiques est la Biochimie clinique dite Chimie clinique pour les Anglo-Saxons. Cette discipline dynamique est complémentaire de la biochimie pathologique qui étudie les aspects cellulaires et moléculaires des maladies (Delattre et al., 2003). La biochimie clinique connaît depuis des années un développement considérable, portée par les progrès des connaissances fondamentales des mécanismes des maladies et des méthodes de chimie analytique. L’utilisation de ces marqueurs sort du cadre de l’homme malade pour s’intéresser à l’homme sain, soit pour définir son état physiologique ou sa prédisposition aux maladies, soit pour des études d’impact de l’environnement.

L

Nombre de sujets Faux négatifs

Seuil ou « cut off »

Population saine

Faux positifs

Population malade

Valeur du paramètre biologique

Figure 1

■ Un marqueur biologique permet de différencier statistiquement une population saine d’une population malade avec toutefois fréquemment la présence de faux positifs et de faux négatifs.

1 ■■ QU’EST-CE QU’UN MARQUEUR BIOLOGIQUE ?

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Un marqueur d’une maladie devrait être un composé présent dans les fluides biologiques des malades mais absent de ceux des sujets sains. Toutefois cette définition s’avère un leurre utopiste. Entre une cellule normale et une cellule malade il ne peut exister que des différences quantitatives, mais qui parfois sont suffisamment énormes pour ne permettre la détection de ce composé, par des méthodes classiques, que chez les seuls sujets malades. Un marqueur sera donc un composé biochimique dont les teneurs chez un ensemble homogène de malades, sont statistiquement très éloignées de celles d’un ensemble de sujets sains, donnant un caractère discriminant à sa mesure. Toutefois il faut garder à l’esprit qu’il ne s’agit que d’une différence statistique et que la présence de faux positifs et de faux négatifs ne peut pas la plupart du temps être évitée (figure 1). La nature de ces marqueurs est extrêmement variable et reflète toutes les catégories de molécules biologiques existantes, toutefois les protéines étant les plus nombreuses de ces molécules, la majorité des marqueurs biologiques se recruteront en leur sein.

2 ■■ COMMENT UN PARAMÈTRE BIOCHIMIQUE DEVIENT UN MARQUEUR

?

Il existe de nombreux mécanismes qui peuvent faire varier une constante biologique lors d’une maladie et permettre son utilisation comme marqueur. Pour les métabolites en dehors des excès de synthèse ou de catabolisme, il peut s’agir d’une anomalie d’un transporteur membranaire empêchant son entrée dans les tissus et donc son accumulation dans le plasma. C’est le cas du glucose augmentant lors du diabète par manque d’insuline activant les transporteurs. Un cas général est celui des barrages métaboli-

ques dus à des baisses importantes d’activités enzymatiques acquises ou héréditaires qui entraînent une accumulation tissulaire et périphérique du métabolite non utilisé. Il passe alors par des voies mineures du métabolisme qui, devenant prépondérantes, produisent des quantités inhabituelles de métabolites rares. Les teneurs en protéines peuvent varier aussi pour de multiples raisons (figure 2) : anomalies de synthèse par dérégulation de l’expression de leur gène, anomalies de maturation, modifications sous l’action d’un excès de métabolites réactifs comme lors de la glycation, accélération de leur destruction par le protéasome. Généralement ces anomalies sont intracellulaires et ne seront aisément détectées dans le sang que pour les protéines de sécrétion. Un mécanisme général aboutissant à une augmentation plasmatique du taux de certaines protéines est la cytolyse, mécanisme au cours duquel la membrane cellulaire laisse sortir les protéines et parfois éclate. Le dosage d’une protéine, souvent une enzyme, particulièrement abondante dans un tissu particulier, permettra alors un diagnostic spécifique du tissu atteint. Une attaque par des protéases activées lors d’un processus pathologique pourra aussi libérer dans la circulation des protéines ancrées dans les membranes. Par contre, il faut se méfier des changements d’hydratation importants entraînant une augmentation générale des concentrations apparentes de tous les constituants du plasma sanguin en cas de déshydratation ou une dilution en cas d’hyperhydratation. Les variations des constituants du sang se retrouveront souvent dans l’urine qui constitue aussi un liquide analysé à la recherche de marqueurs de maladies. Le passage dans l’urine n’est pas passif, mais régulé par le néphron qui constitue une barrière pour les protéines et réabsorbe une grande partie des métabolites. L’analyse de ces paramètres permettra ainsi d’avoir une idée de l’intégrité du rein.

3

4557_2_.book Page 4 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Liquides biologiques

Protéases extracellulaires Anomalie d’un transporteur Anomalie de synthèse

Sécrétion

Enzyme

Barrage métabolique

Dérégulation d’adaptation des gènes

Souffrance cellulaire

A

Figure 2

B ■

DE MARQUEURS

Les marqueurs de risque

Les variations de ces marqueurs biologiques ne sont pas les conséquences des perturbations dues à une maladie, mais font souvent partie des mécanismes initiaux créant la maladie. Ils sont très importants lors d’étude sur les causes des maladies, pour démontrer le lien réel avec le mécanisme biologique mis en évidence par des questionnaires ou enquêtes statistiques. C’est pourquoi ces marqueurs sont de plus en plus utilisés lors des études épidémiologiques, car ils pourront être prélevés dès le début des études plusieurs dizaines d’années avant l’apparition des symptômes.

3.2.

Les marqueurs d’exposition

La biologie peut permettre de mesurer l’exposition d’un individu à un agent toxique apporté par le comportement (tabac, alcool), l’environnement ou le travail. Le plus souvent, on mesurera directement la teneur du composé dans les fluides biologiques (benzène dans le sang), mais il est aussi possible de mesurer des métabolites (cotidine pour l’imprégnation tabagique) ou des enzymes spécifiquement induits par ce toxique (gamma glutamyl transférase pour l’imprégnation alcoolique).

3.3.

Les marqueurs des systèmes de défense

Les capacités d’un sujet à se défendre contre les agents infectieux, mais aussi à éliminer un agent toxique ou à en réparer les

4

Surexpression

Quelques-uns des mécanismes pouvant expliquer la variation d’un marqueur de type métabolite (A) ou protéine (B).

3 ■■ LES DIFFÉRENTES CATÉGORIES 3.1.

Mort cellulaire

dégâts, lui permettront de présenter un plus ou moins grand risque de développer des maladies au cours de sa vie. Dans l’analyse des facteurs de risque on pourra donc utiliser la mesure de l’immunité non spécifique ou spécifique (souvent en réponse à une vaccination), comme les capacités de détoxification (cytochromes, glutathion transférases…), ou les capacités de réparation (capacités de réparation de l’ADN par exemple).

3.4.

Les marqueurs de statut nutritionnel

Le statut est censé être la teneur globale du corps en un composé, souvent un nutriment, dont la mesure reflétera le statut carencé, normal ou excédentaire. Ces mesures qui permettent de calculer un risque biologique de carence sont souvent comparées aux apports alimentaires qui permettent de calculer un risque diététique. On distinguera les marqueurs directs de statut consistant à doser le nutriment dans le sang, des marqueurs indirects consistant à doser des métabolites ou activités enzymatiques dépendant étroitement du taux de ce nutriment. On pourra aussi étudier des conséquences plus globales du comportement alimentaire comme la mesure des taux de glucose ou de cholestérol qui font partie des marqueurs des risques nutritionnels, comme la mesure de protéines à vie courte (Protéine C-réactive ou CRP, préalbumine) comme reflet d’un apport protéique insuffisant.

3.5.

Les marqueurs de polymorphisme génétique

Les progrès de la biologie moléculaire et de la génétique permettent de définir des variantes d’un gène retrouvées lus fréquemment dans certaines maladies. L’analyse de ces polymorphismes

4557_2_.book Page 5 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Les marqueurs biologiques, définitions et concept

génétiques à risque, risque plus ou moins fort selon la pénétrance du gène, se développe très vite en médecine. Ces polymorphismes sont souvent des mutations ponctuelles sur une position d’un nucléotide du gène et il faudra distinguer les deux sortes d’homozygotes, des hétérozygotes. Mais il peut aussi s’agir de délétion ou de répétition. Toutefois ces analyses génétiques sont actuellement réservées à des familles à risque de maladies héréditaires et réalisées sur la demande d’un généticien. La recherche de la fréquence de ces polymorphismes dans les maladies est par contre une voie de recherche actuelle très forte particulièrement pour l’industrie pharmaceutique à la recherche de nouvelles cibles de médicaments.

3.6.

Teneurs sériques relatives

Haptoglobine

Les marqueurs prédictifs SAA

La mesure de ces paramètres est censée indiquer le risque de maladie, qui souvent se traduira par un taux relatif d’augmentation de ce risque par rapport à l’ensemble de la population (Odd ratio, RR). Souvent on utilisera un score calculé par la mesure d’un ensemble de paramètres, faisant souvent partie des facteurs de risque. Par contre ces marqueurs ne possèdent un caractère prédictif fiable que lorsqu’ils sont utilisés sur un grand nombre de sujets et ne doivent donc être appliqué à prédire le risque pour un seul individu qu’avec beaucoup de prudence, malgré la pression de la médecine dite prédictive vers une telle utilisation. En effet beaucoup de ces maladies ne relèvent hélas pas d’un traitement possible et de plus un type génétique n’est qu’un facteur insuffisant à lui seul pour déclencher le processus pathogène qui dépendra aussi d’autres gènes, du mode de vie, de la nutrition et des infections (De Bouvet et al., 2006).

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

3.7.

Les marqueurs diagnostiques

Ce sont les plus souvent mesurées des constantes biologiques, ceci dans le but d’aider le clinicien à établir son diagnostic, de la même manière que les images obtenues par diverses sources de rayonnements et que les examens électrophysiologiques. Il faudra garder à l’esprit que de nombreux phénomènes perturbant les constantes biochimiques, telle l’inflammation, se retrouvent dans des maladies diverses ; on aura alors un marqueur de syndrome et non pas de maladie. Les marqueurs de diagnostiques se répartiront aussi en marqueurs rapides, perturbés très tôt dès le début des signes cliniques mais souvent de façon fugace, et en marqueurs lents dont l’anormalité persistera plusieurs semaines après le début de la maladie. L’analyse simultanée de plusieurs de ces marqueurs permettra de préciser l’évolution de la maladie (voir exemple figure 3).

3.8.

Les marqueurs de suivi thérapeutique

Il est parfois utile de suivre l’efficacité d’un traitement par des mesures de constantes biologiques pour en moduler la dose et la durée. Ce suivi peut être obtenu soit en mesurant des paramètres biochimiques reliés au mécanisme d’action du médicament ou à l’intensité de la maladie, soit en dosant le médicament ou ses métabolites dans les milieux biologiques.

0

1

2

CRP 3

4

Céruloplasmine 5

6

7

8

9

Jours

Figure 3

■ Évolution relative des marqueurs après une inflammation aiguë (SAA : Sérum Amyloïde A ; CRP : C-Reactive protein).

3.9.

Les marqueurs de pronostic

Ces paramètres biologiques permettent d’établir un score de gravité et de prédire la rapidité d’évolution et les chances de guérison ou de survie du malade. Ils seront très utiles au clinicien pour choisir l’acte thérapeutique en pesant le rapport bénéfice/risque.

4 ■■ LES CRITÈRES ET L’ÉVALUATION D’UN MARQUEUR BIOLOGIQUE Un marqueur de qualité doit non seulement varier au cours des maladies, mais le faire de manière rapide, spécifique et sensible. Mais ces qualités biologiques ne seront exploitables en clinique que si les méthodes de mesure de ce marqueur s’avèrent ellesmêmes dotées de qualités analytiques suffisantes. Les qualités analytiques ont fait l’objet de protocoles recommandés par des sociétés savantes comme la Société Française de Biologie Clinique (SFBC), telle la méthode d’évaluation Valtec (Vassault et al., 1986). Les points clés d’une méthode seront sa sensibilité, sa précision, sa reproductibilité intra ou inter laboratoires, sa fiabilité. La précision ou fidélité mesure la dispersion des résultats des mesures d’un paramètre dans des conditions déterminées. La précision est exprimée par le coefficient de variation CV qui est égal à l’écart type en pourcentage de la valeur moyenne. Il serait souhaitable de mesurer ces critères pour des teneurs basses et des teneurs hautes en marqueur. Selon les conditions, on distinguera la répétabilité ou reproductibilité intrasérielle, dans laquelle l’analyse est reproduite au moins 30 fois consécutive au sein d’une même série (même expérimentateur, même réglage d’appareil, mêmes réactifs), la reproductibilité intersérielle, ou de jour en jour, dans laquelle le même échantillon est analysé chaque jour dans

5

4557_2_.book Page 6 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

une série de dosages différents et enfin la reproductibilité interlaboratoire dans laquelle un même échantillon est analysé dans plusieurs laboratoires par la même méthode. La justesse de la méthode ou exactitude mesure la différence entre la valeur trouvée et la valeur « réelle » théorique. La moyenne des mesures d’un échantillon certifié est comparée à la valeur indiquée par l’organisme publique ou privé ayant fourni l’échantillon de référence ou comparée à la moyenne des valeurs du même échantillon mesuré par une méthode dite de référence et exprimée par le coefficient de récupération. En effet, à défaut d’échantillon ou de méthode de référence, il est possible de rajouter à un échantillon biologique une quantité connue du marqueur et d’en mesurer la récupération. La limite de détection (ou quantité minimale détectable non quantifiable) égale par convention à trois fois la valeur du bruit de fond et la limite de quantification, proche de la limite de linéarité, seront déterminées afin de préciser les limites d’utilisation de l’analyse. La connaissance des autres pathologies ou des traitements entraînant des faux positifs ou des faux négatifs devra être recherchée pour préciser la sensibilité et la spécificité, tout comme l’absence d’interaction pharmacologique ou analytique avec les traitements les plus courants. Ces méthodes tendent à être standardisées par des commissions ou des sociétés savantes aboutissant à des méthodes recommandées dont la bonne réalisation peut être établie par l’assurance qualité, vérifiée par des étalons de référence et suivie par un contrôle de qualité volontaire mais aussi obligatoire réalisé sous le contrôle de l’AFSSAPS et dans une démarche qualité décrite dans un Guide de Bonne Exécution des Analyses de biologie médicale (GBEA, 1999). Afin d’assurer une biologie de qualité, les instruments et réactifs destinés à l’analyse des milieux biologiques humains doivent disposer d’un agrément Européen, figuré par le marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro). Enfin la méthode doit être pratique, si possible automatisable, et de plus en plus d’un coût raisonnable. En effet l’évaluation du coût de la biologie est de plus en plus surveillée aussi bien dans les hôpitaux publics que dans le privé. Les problèmes de coût sont rendus plus aigus par le fait que l’introduction d’un nouveau marqueur plus performant ne supprime hélas pas assez souvent la prescription des marqueurs préexistants et ne fait qu’alourdir la composition des bilans biologiques. Les biologistes doivent donc s’investir de plus en plus dans la formation des jeunes cliniciens et l’obtention de consensus de prescription. L’interprétation par le clinicien de la concentration d’un marqueur biologique nécessite de connaître les variations physiologiques de ce paramètre qui vont dépendre de l’âge, du sexe, de rythmes biologique (heure, période), de l’état de jeun ou postprandial, des états de grossesse et parfois du mode de vie (tabac, alcool, altitude…) (tableau 1) (Métais et al., 1997). On essaiera aussi de limiter le nombre de ces variables par exemple en prélevant tous les sujets le matin à jeun pour éviter l’effet du rythme nycthéméral et des repas. Le nombre de paramètres influençant les constantes biologiques est tellement élevé qu’il est difficile de définir un sujet sain, et qu’il faudrait un nombre de catégories considérables. C’est pourquoi pour évaluer un marqueur biologique on le comparera non pas à des valeurs dites « normales »

6

Tableau 1

■

Facteurs de variation d’un marqueur biologique.

variations pré-analytiques

conservation du prélèvement, anticoagulant

variations analytiques

variations pré instrumentales : prise d’échantillon, de réactifs, température variations instrumentales : longueur d’onde, détecteur… précision intra-sérielle, inter-sérielle, inter-laboratoire

variations biologiques

variations intra-individuelles : repas, rythmes nycthéméraux, stress, exercice variations inter-individuelles : taille, poids, sexe, âge, grossesse environnement, habitudes (tabac, alcool…)

mais à des valeurs dites « usuelles ». Lorsque ces valeurs sont établies sur une population particulièrement sélectionnée pour éviter toute anomalie on parlera alors de valeurs de « référence » de la constante biologique. Plusieurs ouvrages recensent ces valeurs de référence, soit par marqueurs biochimiques (Kamoun et Frejaville, 2002), soit par pathologie (Doré, 1994). Ces valeurs usuelles dépendront fortement de la méthode d’analyse utilisée et il sera donc capital de comparer les valeurs mesurées chez le malade à des valeurs usuelles obtenues par la même technique.

5 ■■ LES LIMITATIONS DES MARQUEURS BIOLOGIQUES De nombreux facteurs limitent l’utilisation des marqueurs biologiques en médecine. Il s’agit de facteurs liés à la méthode utilisée, comme un manque de sensibilité ou de spécificité, mais surtout de facteurs biologiques, telle la difficulté d’accès aux variations du compartiment intracellulaire au sein duquel se produisent pourtant l’essentiel des modifications biochimiques pathogènes. L’accès aux tissus est très difficile ou réduit à des biopsies de quelques microgrammes, rendant impossible les dosages. De plus, les tissus sont composés de nombreux types cellulaires et la biopsie peut aussi bien ramener un tissu noble, que des vaisseaux ou un tissu fibreux de remplacement. Or de nombreuses anomalies sont limitées à une partie d’un tissu. Parfois il serait même utile d’avoir accès aux teneurs dans un compartiment de la cellule (noyau, mitochondrie, lysosome), car la maladie est due soit à des anomalies au sein de ces organites, soit à des anomalies de translocation entre le cytosol et ces organites. On peut espérer que les nanotechniques analytiques qui apparaissent permettront rapidement ce type de mesure sur de petits échantillons. Enfin il existe de grandes variabilités biochimiques entre les individus et pour une même maladie un grand nombre de variantes qui n’entraînent pas les mêmes perturbations biochimiques.

4557_2_.book Page 7 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Les marqueurs biologiques, définitions et concept

6 ■■ LA RECHERCHE DE NOUVEAUX MARQUEURS La miniaturisation des méthodes chromatographiques, les progrès de l’électronique appliqués à la spectrométrie de masse et ceux de l’informatique ont permis le développement de nouvelles technologies d’analyse biologiques permettant la mesure globale d’un ensemble de constituants biologiques : gène (génome), ARN (transcriptome), protéines (protéome), lipides (lipidome), métabolites (métabolome). Même si cette mode de nouvelle dénomination est parfois irritante, et si ces techniques sont utilisées parfois comme une arme absolue sans grands discernements ni compé-

tences biologiques, elles constituent un progrès considérable de la biologie. Ces méthodes apportant pour un même sujet des milliers et bientôt des millions d’informations biologiques permettent de rechercher non seulement de nouveaux marqueurs isolés mais aussi de nouvelles méthodes globales d’appréhender les variations des biomolécules par l’application des techniques de biostatistiques (clusterisation, analyses en composantes principales…). Les nouveaux paramètres issus de ces techniques globales doivent être validés par une logique mécanistique. Ceci est rendu possible par les progrès considérables dans la connaissance des mécanismes moléculaires des maladies humaines (Ameziane et al., 2006) que réciproquement la biologie clinique contribue aussi à enrichir.

Références bibliographiques Ameziane N, Bagard M, Lamoril J (2006). Principes de biologie moléculaire en biologie clinique. Elsevier, Paris. Delattre J, Durand G, Jardillier J-C (2003). Biochimie pathologique. Médecine-Sciences Flammarion, Paris. De Bouvet A, Boitte P, Aiguier G (2006). Questions éthiques en médecine prédictive. John Libbey Eurotext, Paris. Doré D (1994). Biochimie clinique, Maloine, Paris.

GBEA : Guide de Bonne Exécution des Analyses de biologie médicale (1999). Arrêté du 26 novembre 1999, publié au J.O. du 11 décembre 1999. Kamoun P et Frejaville J-P (2002). Guide des examens de laboratoires, 4e édition. Flammarion, Paris. Métais P, Agneray J, Férard G, Frichard J-C, Jardillier J-C, Revol A, Siest G, Stahl A (1997). Biochimie Clinique 2. Simep, Villeurbanne.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Vassault A, Grafmeyer D, Naudin C et les membres de la commission Validation de techniques de la SFBC (1986). Protocole de validation de techniques (Document B). Ann Biol Clin, 44 : 686-745.

7

4557_2_.book Page 8 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4557_2_.book Page 9 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

2 Dosage des marqueurs biologiques par immunoanalyse Jean François Benoist, Daniel Biou, Didier Chevenne

1 ■■ UN BREF HISTORIQUE DES DÉVELOPPEMENTS DE L’IMMUNOANALYSE 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5.

Période initiale (~ 1860-1935) Quelques mots sur la réaction Ag/Ac en milieu liquide : courbe de précipitation d’Heidelberger Immunoprécipitation en milieu gélifié (~ 1860-1935) Immunoprécipitation en milieu liquide (~ 1930-2011) Immunoanalyses avec marqueur (1959-2011)

2 ■■ IMMUNOPRÉCIPITATION EN MILIEU LIQUIDE ET DÉTECTION PAR NÉPHÉLOMÉTRIE OU TURBIDIMÉTRIE

2.1. 2.2. 2.3. 2.4.

Principe Paramètres modulant les critères de performance d’un dosage en IT/IN Avantages et inconvénients des techniques par IT/IN Marqueurs en biochimie clinique dosés par IN ou IT

3 ■■ IMMUNOANALYSES AVEC AG OU AC MARQUÉS 3.1. 3.2.

Immunoanalyses en phase hétérogène Immunoanalyses en phase homogène

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

4 ■■ GÉNÉRATION DU SIGNAL ET SYSTÈMES DE DÉTECTION 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7.

Limites de détection des immunoanalyses Marqueurs radioactifs Marqueurs enzymatiques : « enzyme immunoassay : EIA » Marqueurs directement fluorescents Marqueurs directement chimiluminescents Marquage amplifié par le système streptavidine/avidine-biotine Marquage par la protéine A

5 ■■ INTERFÉRENCES DANS LES IMMUNODOSAGES 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5.

La réaction croisée Interférences par des Ac Interférence par excès d’Ag : effet crochet « hook effect » Autres types d’interférences (liste non exhaustive) Problèmes liés à la standardisation

9

4557_2_.book Page 10 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

6 ■■ AUTOMATISATION DE L’IMMUNOANALYSE 7 ■■ PRINCIPAUX BIOMARQUEURS ACTUELLEMENT DOSÉS PAR IMMUNOANALYSE 8 ■■ ÉVOLUTIONS RÉCENTES ET FUTURES DE L’IMMUNOANALYSE Références bibliographiques

10

4557_2_.book Page 11 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Dosage des marqueurs biologiques par immunoanalyse

n marqueur biologique est une molécule ou un paramètre physiologique qui témoigne d’un éventuel dysfonctionnement biologique. Il est choisi, compte tenu de ses qualités de sensibilité et spécificité vis-à-vis d’un processus pathologique donné, pour ses performances aux différents stades de l’investigation : diagnostic, suivi thérapeutique ou pronostic. Idéalement et en l’absence de prescription redondante tous les paramètres d’un bilan biologiques peuvent être considérés comme des marqueurs biologiques, même les plus classiques comme une simple natrémie. Il ne saurait être question dans ce bref exposé de revisiter toute la biochimie analytique. En pratique, l’appellation marqueurs recouvre un ensemble très hétérogène de molécules de tailles variables, e.g. stéroïdes, protéines… Parmi leurs nombreuses propriétés physicochimiques et biologiques utiles pour leur analyse, ces marqueurs possèdent en commun le caractère antigénique. Cette propriété à la fois universelle et spécifique à chaque marqueur explique le succès de l’immunoanalyse (IA), pour l’investigation à la fois qualitative et quantitative de ces marqueurs. L’IA se caractérise par la très grande diversité de son ingénierie et de ses domaines d’applications, e.g. biologie humaine, biologie animale, sciences de l’environnement… Ce bref chapitre, qui ne peut être exhaustif, se propose de présenter les principaux concepts de l’IA et leurs applications aux automates actuels d’IA équipant les laboratoires de biologie. Le paragraphe 5 est consacré aux principaux pièges que l’on peut rencontrer dans l’interprétation des résultats. Le paragraphe 6 est consacré au marché de l’IA. Il présente une brève description des critères constitutifs du cahier des charges d’un automate. Le paragraphe 7 liste les principaux biomarqueurs actuellement dosés dans le domaine de la biochimie clinique. N’ont pas été traitées dans ce chapitre : – les analyses qualitatives des marqueurs en milieu gélifié qui, à de rares exceptions, ne sont pratiquement plus d’actualité ; – les techniques manuelles ou semi-automatiques proposées pour les investigations au lit du malade ou chez soi. Ces techniques, notamment celles concernant la biochimie délocalisée ont certainement un fort potentiel d’avenir pour le biologiste, mais pour l’instant la panoplie des marqueurs proposés et leurs installations sur automates sont assez restreintes. Nous invitons vivement le lecteur qui souhaiterait approfondir les nombreuses facettes du vaste domaine de l’IA à consulter les dernières éditions de trois ouvrages très complets (Price et Newman, 1997, Wild, 2005, Tietz, 2006).

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

U

l’animal (immunsérum : IS) de protéines dénommées anticorps (Ac) reconnaissant l’Ag. • L’IS peut floculer le milieu de culture contenant la substance étrangère et produire ainsi une turbidité ou un précipité. • La réaction de l’Ag avec l’Ac en milieu gélifié, produit un précipité stable.

1.2.

Quelques mots sur la réaction Ag/Ac en milieu liquide : courbe de précipitation d’Heidelberger

Les nombreux déterminants antigéniques ou épitopes d’une protéine peuvent en solution s’associer avec les paratopes correspondants d’Ac spécifiques pour former des agrégats (IC) de taille variable. Ces IC pourront être détectés/dosés par leur propriété de diffusion (néphélométrie) ou d’atténuation (turbidimétrie) d’une lumière incidente. La taille et la masse des IC formés dépendront des concentrations relatives en Ag et en Ac. Ainsi pour une concentration fixée en Ac et pour des concentrations croissantes en Ag on distingue 3 zones en fonction de la taille des IC (figure 1). 1) Zone I : grand excès d’Ac → (Ac) >> (Ag). Dans la partie ascendante de la courbe les molécules d’Ag ajoutées sont rapidement saturées par les molécules d’Ac en excès. Les IC sont en moyenne de petites tailles, e.g. Ag-(Ac)n et isolés (pas ou peu de ponts Ac entre les molécules d’Ag). On note la présence de molécules d’Ac libres. Avec l’ajout d’Ag, la taille des IC augmente par établissement progressif de ponts Ac entre les molécules d’Ag et ce jusqu’à épuisement des molécules d’Ac libres. 2) Zone II : zone d’équivalence ou d’excès modéré d’un des partenaires par rapport à l’autre.

Signal mesuré (témoin de la précipitation) I

II

III Ag Ac

[Ag]

1 ■■ UN BREF HISTORIQUE DES DÉVELOPPEMENTS DE L’IMMUNOANALYSE

1.1.

Période initiale (~ 1860-1935)

Au cours de cette période il a été établi que : • L’injection chez un animal (immunisation) d’une entité étrangère dénommée antigène (Ag) induit la production dans le sérum de

Figure 1

■

Courbe de précipitation du complexe Ag-Ac.

Zone I : zone d’excès relatif en Ac par rapport à l’Ag. Les épitopes de l’Ag sont saturés par les paratopes de l’Ac. L’immun-complexe (IC) est de faible taille et précipite peu. Zone II : zone d’équivalence. La proportion en épitopes et en paratopes est optimale pour former un réseau tridimensionnel. L’IC est de grande taille et précipite. Zone III : zone d’excès relatif en Ag par rapport à l’Ac. Les paratopes de l’Ac sont saturés par les épitopes de l’Ag. L’immun-complexe (IC) est de faible taille et précipite peu.

11

4557_2_.book Page 12 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Dans cette zone les IC forment des réseaux ou agrégats qui atteignent une taille et une masse maximale lorsque les concentrations en Ag et en Ac sont dans un rapport d’équivalence. NB : au point d’équivalence l’IC précipitant peut être emprisonné dans les mailles d’un gel et ainsi être visualisé. C’est le principe de l’immunochimie en milieu gélifié. 3) Zone III : grand excès d’Ag → (Ac) STDI FrameMaker Couleur

Dosage des marqueurs biologiques par immunoanalyse

En IN, on mesure l’intensité de la lumière diffusée par les particules en suspension (ici les IC) dans un certain angle par rapport au rayon incident (e.g. de 70° à 5°) et à une longueur d’onde définie. L’intensité de la lumière diffusée dépend entre autres facteurs de la longueur d’onde, de la taille des particules, de leur concentration… En IT, on mesure la diminution (par réflexion, diffusion ou absorption par les particules en suspension) de la lumière transmise dans l’axe du rayon incident (i.e. 180°). Le terme absorbance, bien qu’inapproprié, est souvent utilisé car la démarche est analogue à la mesure d’une absorbance mais le phénomène physique est ici complètement différent de l’absorption moléculaire. Le choix de la longueur d’onde tient compte des interférences par la bilirubine et les porphyrines.

2.2.1. Concentration en Ac

Interférences possibles : par d’autres particules en solution (poussières, lipoprotéines, macro protéines, agrégats non spécifiques : donc opérer si possible en solution diluée) ou par le bruit de fond des instruments.

Le domaine de mesure des concentrations en Ag doit être le plus large possible compte tenu des variations physiopathologiques.

Choix entre IN et IT ? La néphélométrie est en principe plus sensible que la turbidimétrie donc mieux adaptée à la mesure de faibles concentrations en Ag mais la méthodologie est plus onéreuse (source laser) et plus délicate à mettre en œuvre. La plupart des automates d’analyse multiparamétriques de biochimie sont équipés de spectrophotomètres et sont donc capables de réaliser des mesures en turbidimétrie. L’optimisation est simple et le principal souci est d’obtenir un rapport signal/bruit de fond optimal (e.g. bruit de fond < 0,0002 unité d’absorbance).

2.2. Signal mesuré

Paramètres modulant les critères de performance d’un dosage en IT/IN

2.2.2. Concentration en Ag

2.2.3. Ajout de polymères L’addition de polymères non ioniques, e.g. PEG 6000, diminue par un phénomène d’exclusion le volume de solvant disponible pour solvater les macromolécules. On observe dans le volume réactionnel résiduel une augmentation des concentrations en Ag et en Ac et donc du matériel immunoprécipité. Inconvénients : le PEG diminue aussi la solubilité d’autres protéines de l’échantillon augmentant ainsi la valeur du blanc échantillon (qui peut parfois représenter plus de 50 % du signal).

2.2.4. Cinétique de la réaction La lecture du matériel précipité peut se faire selon les automates en mode cinétique (lecture plus rapide) ou en mode point final.

2.2.5. Nature de l’immunsérum L’IS est de préférence polyclonal, de titre et d’avidité élevés en Ac. Le titre conditionne la dilution de travail tandis que l’avidité conditionne la rapidité du dosage. L’utilisation d’Ac monoclonaux n’est envisageable (si l’on souhaite une bonne agrégation) que sous forme de mélange d’Ac monoclonaux bien défini, donc finalement en reconstituant un mélange polyclonal. Dans ce cas l’avantage serait dans une amélioration substantielle de la qualité du dosage par une définition très précise et reproductible de l’IS.

1/10

1/20

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

La plage des concentrations en Ag directement accessibles au dosage est étroitement dépendante de la concentration en Ac (figure 2). En situation d’excès d’Ac on constate que lorsque la concentration en Ac augmente : – le signal généré par l’IC augmente ; – la 1re partie de la courbe devient de plus en plus linéaire ; – la concentration en Ag correspondant au point d’équivalence augmente. Il résulte de ces 3 observations que la précision et la plage de lecture du dosage augmentent avec la concentration en Ac.

2.3.

Avantages et inconvénients des techniques par IT/IN

2.3.1. Avantages 1/30 1/40

[Ag]

Figure 2

■ Effet de la dilution en Ac sur la qualité du signal mesuré en IT ou en IN.

Lorsque la concentration en Ac augmente : • le signal mesuré augmente ; • la zone d’équivalence se déplace vers des concentrations en Ag plus élevées ; – il en résulte une plage de lecture plus étendue, – l’effet de zone par excès d’Ag est bien visible sur les 3 courbes correspondant aux plus fortes dilutions en Ac.

– Coût relativement faible comparé aux IA utilisant des partenaires marqués. – Rapidité. – Nombreux protocoles en ligne (ou facile à installer) sur les automates de biochimie générale.

2.3.2. Inconvénients a) Risque de faux négatif par excès d’Ag Le signal dans ce cas émane d’un point situé dans la zone III de la courbe de précipitation (figure 1) mais est lu dans la zone I. On observe un biais important par défaut.

13

4557_2_.book Page 14 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Exemple : au cours de syndrome néphrotique, certaines albuminuries dosées sur urines non diluées peuvent être rendues par l’automate < seuil de détection 3 mg/L !!! Une réanalyse sur dilution convenable permet d’obtenir la vraie valeur (souvent > 2 000 mg/L).

Il convient donc d’être particulièrement vigilant pour les analytes présentant de fortes variations physiopathologiques, e.g. marqueurs tumoraux, étalées sur plusieurs ordres de magnitude. Quelles sont les parades possibles ? – Doser systématiquement sur 2 dilutions différentes (mais augmentation du coût). – Choisir une configuration de dosage telle que le plateau correspondant à la zone d’équivalence (zone II de la figure 1) soit déplacé vers la droite. Cet objectif peut être atteint en choisissant un IS de titre et d’avidité élevés (e.g. dosage de l’albuminurie par la trousse Diasys®). – Être vigilant lors de la validation (historique, renseignements cliniques…). b) Effets de matrice Par les particules et macromolécules de l’échantillon, e.g. lipoprotéines, IC endogènes, agrégats d’Ig (particulièrement après plusieurs cycles de congélation/décongélation de l’échantillon). Ces interférences augmentent la valeur du blanc échantillon diminuant ainsi la sensibilité du dosage. Quelles sont les parades possibles ? – Opérer si possible sur des prélèvements à jeun et dilués. – Délipider préalablement (e.g. traité par LipoclearR). – Filtrer les réactifs pour éliminer les poussières. – Faire des lectures en mode cinétique et/ou en bi-chromatisme. c) Sensibilité insuffisante pour beaucoup de biomarqueurs présents à faible concentration. Quelles sont les parades possibles ? – Améliorer la qualité de l’IS (titre et avidité). – Utiliser la néphélométrie. – Utiliser des polymères ou des particules (latex) recouvertes d’Ac. Actuellement la sensibilité optimale est de l’ordre de 0,2 mg/L. Ce seuil annoncé pour le dosage ultrasensible de la CRP correspond pour cette protéine à une concentration d’environ 1,4 nM.

2.4.

Marqueurs en biochimie clinique dosés par IN ou IT

2.4.1. Protéines La condition nécessaire pour une protéine candidate est d’être suffisamment concentrée dans l’échantillon, e.g. > 1 mg/L. Ainsi sont classiquement dosés : des marqueurs de la réponse inflammatoire, du statut nutritionnel, du statut martial, de l’immunité humorale, de l’hémostase, des composés du complément, des marqueurs tumoraux, des marqueurs de la fonction glomérulaire, de la fonction tubulaire, etc.

14

2.4.2. Haptènes La formation d’agrégats précipitant à partir d’haptènes, pas ou peu polyvalents, e.g. stéroïdes, médicaments, est théoriquement difficile. Cette formation est néanmoins rendue possible en couplant préalablement l’haptène pur à une macromolécule ou une particule de latex pour former un haptène traceur, puis en agglutinant les particules de traceur par l’Ac. En présence d’haptène libre à doser, on observe une inhibition d’agglutination des particules de traceur et un signal inversement proportionnel à la concentration en Ag à doser. Le principe est donc ici différent d’une immunoprécipitation classique.

L’IN et l’IT sont encore très utilisées pour doser certaines protéines classiques présentes dans le plasma, les urines ou le liquide céphalorachidien. De nombreux protocoles sont installés sur la plupart des automates de biochimie générale. Ils concernent des protéines possédant le statut de biomarqueur et en concentration suffisante dans leur échantillon biologique (> mg/L) pour être détectable par ce type de technique. Lorsque la concentration est insuffisante, des techniques plus sensibles faisant appel à des partenaires marqués, sont proposées (voir paragraphe 3).

3 ■■ IMMUNOANALYSES AVEC AG OU AC MARQUÉS Le marché actuel des immunodosages est dominé par des méthodes conçues à partir d’Ag ou d’Ac marqués. Le marqueur peut être un atome ou une molécule plus ou moins complexe, e.g. enzyme. Pour éviter toute confusion avec le concept de « marqueur » biologique nous avons choisi les termes traceur ou encore les symboles Ag* ou Ac* pour désigner un Ag ou un Ac marqué. Les traceurs radioactifs (RIA ou IRMA) ont dans un premier temps largement dominé le marché des immunodosages mais les contraintes liées à l’utilisation des radioéléments conduisent progressivement à leur remplacement par des traceurs non radioactifs : activité enzymatique (EIA), fluorescence (FIA), chimiluminescence (CLIA)… Malgré tout, les dosages par RIA restent encore utilisés (pour des raisons de coût et de simplicité, en technique manuelle ou semi-manuelle) pour le dosage d’analytes peu prescrits ou récemment proposés et pour lesquels il n’existe pas d’alternative par d’autres méthodes. Les très nombreux schémas réactionnels proposés en IA sont le plus souvent classés : – en fonction du mode d’interaction entre l’analyte à doser et l’Ac : dosages de type compétitif (Ac en défaut) versus type non compétitif (Ac en excès) ; – en fonction du mode de différenciation des formes libres et liées du traceur : dosages en phase hétérogène (séparation obligatoire des formes libres et liés du traceur) versus dosages en phase homogène (pas de séparation nécessaire).

4557_2_.book Page 15 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Dosage des marqueurs biologiques par immunoanalyse

3.1.

Immunoanalyses en phase hétérogène

Ag à doser lié

Ag à doser libre

3.1.1. Mode compétitif En mode compétitif l’analyte à doser (en général un Ag de masse moléculaire < 3 000 Da) entre en compétition avec le traceur (i.e. Ag*) pour se fixer sur l’Ac (le plus souvent en quantité limitée par rapport au traceur : Ac < Ag*). Après atteinte de l’équilibre, la quantité de traceur lié à l’Ac est inversement proportionnelle à la concentration en analyte à doser (figure 3). Lorsque les formes libres et liées du traceur (Ag* et Ag*-Ac) présentent la même activité ou émettent le même signal, une étape de séparation de ces deux formes est indispensable pour ne mesurer que le signal émis par la forme liée. Dans ce cas la technique d’immunoanalyse se déroule en phase dite hétérogène, la forme liée du traceur étant insolubilisée. NB : lorsque les activités des formes libres et liées du traceur sont très différentes leur séparation n’est pas nécessaire. Dans ce cas la technique d’immunoanalyse se déroule en phase dite homogène (voir paragraphe 3.2.). • Pour l’addition des réactifs il y a 2 façons de procéder : 1) Addition simultanée de l’ensemble des réactifs, e.g. Ag* + Ac + Ag à doser. L’analyte à doser (Ag) et le traceur (Ag*) sont en compétition pour la fixation sur l’Ac en défaut.

Ag* Ac ⇔ Ag* + Ac + Ag ⇔ Ag Ac 2) Addition séquentielle : l’Ac est en excès par rapport à l’analyte à doser mais en défaut par rapport au traceur e.g. Ag < Ac < Ag*. Ce procédé, qui augmente la sensibilité du dosage d’un facteur 2 à 4, est particulièrement indiqué pour doser de faibles concentrations d’Ag. – l’analyte à doser est d’abord ajouté à l’Ac en excès :

Ag + Acexcès ⇔ Ag Ac + Ac – après atteinte de l’équilibre le traceur est ajouté :

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Ag* +Ac ⇔ Ag* Ac • Après insolubilisation des formes liées de l’Ag (Ag Ac et Ag* Ac), la quantité de traceur lié est mesurée par le signal émis par la marque* (radio-activité, activité enzymatique, fluorescence, chimiluminescence…). • La concentration en analyte (inversement proportionnelle à la quantité de traceur lié) est ensuite calculée en se reportant à une courbe d’étalonnage reliant le signal mesuré à des concentrations connues de l’analyte. • Applications : le mode compétitif en phase hétérogène est par-

ticulièrement indiqué pour le dosage de petits Ag ou haptènes de masse moléculaire < 3 000 Da disposant de peu d’épitopes. Pour des molécules plus grosses, e.g. protéines, possédant de nombreux épitopes ce mode est avantageusement remplacé par le mode non compétitif plus sensible et plus spécifique.

Ag marqué

Ag marqué lié Signal mesuré B*/B0*

Ac de capture [Ag]

Figure 3

■

Principe du dosage compétitif en phase hétérogène.

L’Ac de capture est le plus souvent en défaut par rapport à l’Ag traceur et à l’Ag à doser. F* (free : fraction libre) : signal émis par la concentration en traceur libre. B* (bound : fraction liée) : signal émis par le traceur lié à l’Ac de capture. B0* : signal émis par le traceur lié à l’Ac de capture en absence d’Ag à doser. Dans cet exemple 12 molécules d’Ag à doser sont en compétition avec 4 molécules d’Ag* traceur. Le rapport B*/F* du traceur est donc de 1 : 3.

3.1.2. Mode non compétitif : méthode dite sandwich ou immunométrique • L’analyte à doser (Ag) est pris en sandwich entre deux réactifs spécifiques introduits en excès : un Ac de capture et un Ac* traceur (ces deux Ac ont en général des spécificités différentes) (figure 4) : – l’Ac de capture est introduit d’emblée en phase hétérogène par adsorption ou fixation covalente sur un support solide (microcuvettes, billes de polymère, particules aimantées…) ; – l’Ag à doser, totalement fixé par l’Ac de capture en excès, est aussi d’emblée insolubilisé ; – l’Ac* traceur (ajouté en excès), va se fixer sur un épitope libre de l’Ag insolubilisé et former en principe autant de sandwich que de molécules d’Ag à doser ; – la séparation des formes libre et liée du traceur est obtenue par simple lavage puisque la forme liée est déjà insolubilisée sur le « sandwich » ; – après révélation de l’activité du traceur lié, le signal mesuré est directement proportionnel à la concentration en Ag à doser. • Quelle est la condition nécessaire pour ce type de dosage ? L’Ag doit posséder au moins 2 épitopes indépendants et suffisamment éloignés pour éviter les phénomènes d’encombrement stérique. Pour une meilleure spécificité il est conseillé de cibler des épitopes structurellement différents, mais ce n’est pas une obligation. • Comment fixer l’Ac de capture ? La méthode la plus simple est une fixation directe de l’Ac sur la phase solide ; mais ce procédé peut entraîner une diminution de

15

4557_2_.book Page 16 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

classiquement désigné par le terme effet crochet ou « hook effect » (voir paragraphe 5.3. et figure 14). En pratique ce type de comportement s’observe pour les protéines caractérisées par de fortes variations physiopathologiques, e.g. albumine urinaire, hCG, AFP, ferritine…

Ac de capture fixé sur la phase solide Ac marqué lié

Ac marqué libre

Signal mesuré

Ag bivalent

Figure 4

■

Log[Ag]

Principe du dosage non compétitif en phase hétérogène.

Les Ac de capture et Ac traceur sont en principe en excès par rapport à l’Ag à doser.

la capacité de liaison par encombrement stérique ou par fixation de l’Ac via son fragment Fab. Pour optimiser cette capacité de liaison, des modes de fixation indirects ont été proposés en recouvrant successivement la phase solide : – par un Ac anti-Fc de l’espèce produisant l’Ac de capture puis par l’Ac de capture ; – ou par un Ac anti-FITC (isothiocyanate de fluorescéine) puis par l’Ac de capture couplé à FITC ; – ou par une ancre protéine-streptavidine puis par l’Ac de capture couplé à de la biotine ; – ou par des récepteurs bactériens du fragment Fc de l’Ac de capture, e.g. protéine A ou protéine G. • Choix des Ac : Les Ac de capture et les Ac traceurs peuvent être polyclonaux ou monoclonaux, de spécificité identique ou différente. La tendance actuelle est à l’utilisation d’Ac monoclonaux de souris de spécificité bien définie, de qualité constante et de plus en plus « humanisés » pour éviter les interférences par les éventuels Ac anti-Ig animales du patient (voir paragraphe 5.2.) • Ordre d’addition des réactifs : mode simultané ou séquentiel ? Avec deux Ac monoclonaux de spécificités différentes, il est possible d’opérer en 1 étape (addition simultanée de l’échantillon, de l’Ac de capture et de l’Ac* traceur) ce qui simplifie le protocole sur automate. Cependant pour des concentrations en analyte très élevées (dépassant les capacités des Ac, pourtant introduits en excès) les paratopes des Ac de capture et des Ac traceurs peuvent être occupés par des molécules d’Ag différentes donc sans formation de sandwiches. Dans ces conditions une fraction de l’Ag lié à l’Ac traceur n’est pas fixée par l’Ac de capture. Cette fraction est éliminée lors du lavage ce qui entraîne une sous-évaluation plus ou moins importante de la concentration en Ag du patient. Ce comportement que l’on peut comparer au phénomène de zone observé par excès d’Ag en IN ou IT (zone III, figure 1) est

16

Le concept du sandwich peut aussi s’appliquer au dosage ou à la caractérisation d’un Ac témoin d’une infection ou d’un processus auto-immun. Dans ce cas le système de capture peut être différent de celui impliqué dans un sandwich classique. Des pseudo-sandwichs sont ainsi formés avec pour la capture : – Soit l’Ag ayant induit la réponse humorale (e.g. un antigène de surface d’un microorganisme, tel que l’antigène HBS). L’Ac à caractériser est ainsi pris en sandwich entre l’Ag de l’agent infectieux fixé en excès sur la phase solide et l’Ac* traceur dirigé contre un isotype du fragment Fc de l’Ac de la réponse humorale (figure 5). – Soit de la protéine A (ou G) insolubilisée. Dans ce cas l’Ac à caractériser est pris en sandwich entre la protéine A et l’Ag* marqué contre lequel est dirigé l’Ac. Exemple : caractérisation au cours du diabète des auto-Ac anti-GAD et anti-insuline (IAA).

Ac marqué en excès et anti-isotype de l’Ac à doser

Ac à doser

Ag en excès

Figure 5

■

Dosage d’un Ac par une méthode de type sandwich.

3.1.3. Techniques de séparation des formes libres et liées du traceur Elles se répartissent en deux principaux groupes : 1) Adsorption ou fixation covalente sur un support solide (démarche la plus courante) L’Ac de capture est d’emblée fixé sur un support solide : – soit la surface intérieure de tubes en plastique ou de puits de plaques de microtitration (dans ce cas le traceur libre est éliminé par une étape de lavage) ;

4557_2_.book Page 17 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Dosage des marqueurs biologiques par immunoanalyse

– soit sur la surface extérieure de billes de latex ou aimantées (dans ce cas le traceur libre est éliminé par une étape de centrifugation ou de séparation magnétique des billes). 2) Techniques de précipitation La précipitation plus ou moins sélective de l’IC Ag*-Ac peut être obtenue par : a) Ajout d’un 2e Ac dirigé contre le 1er Ac. Par exemple si l’Ac1 de capture est constitué d’IgG de souris on peut choisir pour l’Ac 2 des Ig de chèvre anti-IgG de souris. Avantages : un même Ac2 peut cibler tous les Ac1 d’une même espèce quelle que soit leur spécificité. b) Ajout d’un polymère tel que du polyethylène glycol (PEG 6000). NB : pour plus d’efficacité les options a) et b), i.e. ajout d’un 2e Ac dirigé contre le 1er Ac et ajout de PEG, sont souvent associées. Exemple : pour le dosage de l’adiponectine par RIA, le réactif de précipitation du traceur lié contient des Ac de chèvre anti-Ig de lapin et du PEG à 3 %. c) Ajout de protéine A ou G insolubilisée reconnaissant le fragment Fc de l’Ac de capture (se renseigner au préalable sur les spécificités d’espèce et d’isotypes de ces récepteurs bactériens).

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

3.2.

Immunoanalyses en phase homogène

Dans ce type de dosage, l’émission du signal par le traceur, Ag* ou Ac*, est modulée par son éventuelle liaison à l’Ac de capture (liaison directe de l’Ag* dans le mode compétitif, liaison indirecte de l’Ac* dans le mode sandwich). Il n’est donc plus nécessaire de séparer les formes libres et liées du traceur puisqu’elles se différencient par le signal émis. Il en résulte un dosage : – réalisable en une étape, donc plus rapide car il suffit de mélanger l’échantillon et les réactifs, et en principe plus sensible du fait de la suppression des étapes de lavage et de séparation génératrices de pertes ; – facilement automatisable ; – mais aussi plus susceptible aux interférences par la matrice de l’échantillon. L’IA en phase homogène peut selon les formats s’appliquer : – au dosage des haptènes ou des macromolécules ; – en mode compétitif ou non compétitif. Le choix entre ces options dépend i) de la nature du traceur (e.g. isotope radioactif, enzyme, fluorophore…) ii) de la nature du signal émis par ce traceur (e.g. absorbance, fluorescence, luminescence…). Ces différents aspects sont abordés succinctement au paragraphe suivant.

3.2.1. Immunoanalyses en phase homogène avec marque enzymatique ■ Technique EMIT® (enzyme-multiplied immunoassay technique)

Les IA en phase homogène furent décrites pour la 1 re fois en 1972 et des applications au dosage de médicaments dans les urines furent commercialisées dès 1973 sous le sigle EMIT ®. La technique EMIT est surtout appliquée au dosage des petites molécules, e.g. hormones de faible masse moléculaire, médicaments, toxiques…

Le format du dosage est de type compétitif : l’Ag (ou haptène) à doser entre en compétition avec le traceur Ag-enzyme* pour se fixer sur l’Ac de capture. L’activité enzymatique (AE) du traceur est modulée (inhibée ou activée par sa liaison à l’Ac). Par exemple : supposons que l’AE du traceur libre soit inhibée par sa liaison à l’Ac.

Ag − Enzinactif − Ac ⇔ Ag − Enz actif + Ac + Ag ⇔ Ag AC En absence d’Ag à doser le nombre de molécules de traceur fixées à l’Ac est maximal et donc l’AE est minimale. En conséquence l’AE du milieu augmentera avec le nombre de molécules d’Ag à doser par déplacement du traceur fixé à l’Ac. Le 1er enzyme sélectionné fut le lysozyme car son macro-substrat (paroi bactérienne) peut difficilement accéder au site actif de l’enzyme lorsque le traceur est lié à l’Ac. Le mécanisme d’inhibition de l’AE du traceur par la liaison à l’Ac peut être pluricausal e.g. encombrement stérique pour la fixation du substrat (cas du lysozyme) ou changement conformationnel du site actif. Dans le cas du lysozyme l’AE est lue à 450 nm par la cinétique de diminution de la turbidité d’une suspension bactérienne. Cependant cette mesure n’étant pas très sensible d’autres enzymes ont été sélectionnées, e.g. glucose 6-phosphate déshydrogénase (G6PDH). • Critères de sélection d’une enzyme :

– l’enzyme ne doit pas être présent dans l’échantillon ; – l’enzyme ne doit pas être sensible aux effets de matrice ; – l’AE doit être conservée après couplage à l’haptène mais doit pouvoir être inhibée par la liaison de l’haptène à l’Ac. Pour se conformer à ces critères, la plupart des techniques EMIT actuelles utilisent la G6PDH modifiée génétiquement. La G6PDH native ne possédant pas de cystéine, un résidu cystéine est inséré par génie génétique pour permettre un couplage sélectif de l’haptène à l’enzyme. Le site d’insertion de la cystéine (donc de l’haptène) dans la G6PDH est ciblé pour optimiser les variations d’AE du traceur entre les formes libres et liées à l’Ac. • Inconvénients des techniques EMIT : les applications concernent

principalement les haptènes car au-delà d’une certaine taille pour l’analyte à doser, le contrôle précis de la modulation de l’AE est moins évident. ■ Technique par confinement de deux activités enzymatiques complémentaires (enzyme channeling)

C’est une technique sandwich classique mais ici conçue en phase homogène. Par rapport à la technique EMIT elle présente le gros avantage de pouvoir aussi s’appliquer au dosage des Ag de grosse taille (e.g. protéines). Dans ce montage (figure 6) : • des billes d’agarose doublement marquées par un Ac 1 de capture et par de la glucose oxydase (GO) vont, en présence de glucose, générer du peroxyde d’hydrogène (H 2O2) dans l’environnement immédiat des billes ; • le signal généré par l’AE du traceur Ac 2-peroxydase* dépend de la concentration en H2O2 à proximité de la peroxydase (POD) :

17

4557_2_.book Page 18 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

GO

GO Ac2

Ac 1 GO

POD

GO

Glucose

Peu active car [H2O2] ~ 0

Ac − Ag* − ED + Einactif ⇔ Ag* − ED + Einactif + Ac + Ag A A

S P incolore coloré

H2O2

⇔ Ag Ac + Ag* − ED − E actif A

+ Ag

GO

GO

GO

Ac 1

Glucose

Figure 6

H2O2

Ag

Ac2

POD

Très active car [H2O2]

↑

GO

+

rer l’AE. En revanche quand le traceur est lié à l’Ac, le complexe [Ac-Ag-ED*] ne peut plus se réassocier avec le fragment E A pour restaurer l’AE.

S P incolore coloré

IA par confinement de deux activités enzymatiques : glucose oxydase (GO) et peroxydase (POD). ■

Ac1 : Ac de capture fixé sur des billes d’agarose. GO : glucose oxydase. Elle est fixée en excès sur des billes d’agarose et génère le substrat H2O2 pour le traceur Ac2-POD*. Ac2-POD* : Ac traceur couplé à la peroxydase. En absence d’Ag l’AE du traceur est faible car la POD demeure dans un environnement éloigné de la GO donc à faible concentration en substrat H2O2.

L’Ag à doser entre en compétition avec l’Ag du traceur Ag-E D* pour la fixation sur l’Ac. Le fragment accepteur et le substrat de l’enzyme sont ensuite ajoutés en excès. En absence d’Ag à doser le traceur Ag-ED* est fixé sur l’Ac et n’est pas disponible pour s’associer avec le fragment accepteur. L’AE est donc minimale. En présence d’Ag à doser, la libération par compétition du traceur Ag-ED* de sa combinaison à l’Ac va permettre son association avec le fragment EA et la restauration concomitante de l’AE.

Applications : principalement dosages d’haptènes en mode compétitif. L’haptène à doser déplace le traceur haptène-ED de sa combinaison à l’Ac ce qui permet de reformer l’holoenzyme actif. Le signal, mesuré par la vitesse d’hydrolyse par l’enzyme d’un substrat chromogène, est donc proportionnel à la concentration en haptène à doser.

3.2.2. Immunoanalyse en phase homogène avec marque fluorescente

– en présence d’Ag un sandwich se forme entre l’Ac 1 de capture et le traceur Ac2-POD*. La POD est très active car elle est confinée dans l’environnement immédiat des billes d’agarose, riche en H2O2, – en absence d’Ag le sandwich ne se forme pas, la POD est peu active car, étant physiquement éloignée de la GO, elle demeure dans un environnement à très faible concentration en H 2O2.

Pour ne pas être redondants nous avons choisi de traiter les deux applications industrielles de cette technique au paragraphe 4 consacré à la génération du signal par le traceur : – immunoanalyse par polarisation de fluorescence (paragraphe 4.4.1.) ; – immunoanalyse par fluorescence en temps retardé (paragraphe 4.4.2.).

■ Technique par modulation de l’activité enzymatique par un effecteur

3.2.3. Immunoanalyse en phase homogène avec marque electrochimiluminescente (ECL)

Dans ce dosage de type compétitif en phase homogène, l’AE est modulée (i.e. activée/inhibée) par mise au contact d’un effecteur (e.g. substrat, inhibiteur, coenzyme, fragment d’enzyme). Nous ne décrirons que le dernier cas (complémentation de l’AE par des fragments d’enzyme) breveté sous le terme CEDIA ® (cloned enzyme donor immunoassay) par Roche Diagnostic Systems en 1995 et commercialisé sous forme de kits pour automates de biochimie générale. • Principe du dosage par complémentation de l’AE

Certaines enzymes peuvent être dissociées en fragments inactifs susceptibles de redevenir pleinement actifs après reconstitution de l’holoenzyme original. Dans le modèle CEDIA l’enzyme est constitué de deux fragments inactifs : un fragment donneur ED et un fragment accepteur EA. Le fragment donneur ED est génétiquement modifié pour pouvoir former avec l’Ag un traceur Ag-E D* qui peut se réassocier avec le fragment accepteur E A pour restau-

18

L’Ag à doser entre en compétition avec l’Ag du traceur (Ag combiné à du ruthénium réduit : Ag-Ru2+) pour la fixation sur l’Ac1 de capture : – Le traceur Ag-Ru2+ dans sa forme non liée à l’Ac et de la tripropyle amine sont simultanément oxydés par l’anode d’une électrode. – Les produits d’oxydation (Ag-Ru3+ et un radical tripropyleamine °) réagissent ensuite entre eux pour générer du Ru 2+* dans l’état excité qui émet de la lumière pour revenir à son état basal. – La liaison préalable du traceur Ag*-Ru 2+ à l’Ac supprime la possibilité d’oxydation du Ru2+ par l’anode. – La luminescence augmente donc avec la concentration en Ag à doser. NB : la détection par électrochimiluminescence mais en phase hétérogène est aussi disponible sur certains automates (voir paragraphe 4.5.2.).

4557_2_.book Page 19 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Dosage des marqueurs biologiques par immunoanalyse

4 ■■ GÉNÉRATION DU SIGNAL ET SYSTÈMES DE DÉTECTION

4.1.

Limites de détection des immunoanalyses

La limite de détection théorique des IA est principalement définie par 2 paramètres : – l’affinité de l’Ac ; – la nature et l’activité du traceur. Le tableau 1 rapporte quelques limites théoriques de détection pour des marqueurs isotopiques et non isotopiques. On constate que : – les techniques de détection par isotope radioactif ne sont pas systématiquement les plus sensibles ; – la sensibilité des techniques isotopiques dépend de la nature de l’isotope, e.g. 103 zmoles (10–21 moles) pour 125I et 106 zmoles pour 3H ; Tableau 1 ■ Quelques limites de détection en IA en fonction du marqueur et du système de détection (Kricka et al., 2006).

Marqueur

Limite de détection en zeptomoles (10–21 moles)

Méthode

50 000 100-300 10 1

Absorbance Fluorescence Couplage d’AE Chimiluminescence

10 000

Fluorescence

1 000 000

Radioactivité β

1 000

Radioactivité γ

1

Chimiluminescence

Phosphatase alcaline Chélate d’Europium 3

H

125

I

peroxydase

Tableau 2

■

– pour une même marque enzymatique, e.g. phosphatase alcaline, la sensibilité dépend étroitement de la nature physique du signal émis par les substrats/produits de la réaction enzymatique. Ainsi en exprimant toutes les limites de détection en zeptomoles la meilleure sensibilité serait obtenue pour la chimiluminescence avec 1 zmole, suivie par l’amplification enzymatique (10 zmoles), la fluorescence (100 zmoles), la fluorescence en temps retardé (300 zmoles) et la photométrie (50.103 zmoles). NB : des marqueurs indirects peuvent aussi être utilisés pour amplifier le signal. Il en est ainsi du couple avidine-biotine de constante d’affinité très élevée (10 15 L/mol). En pratique, la limite de détection réelle est beaucoup moins performante que celle annoncée dans le tableau 1, e.g. # 1 pmole/ L en moyenne. Ainsi les limites de détection habituellement mesurées pour 3 dosages en RIA sont d’environ 6 pM pour la 1,25 dihydroxy-D3, de 5 pM pour l’estradiol et de 1 pM pour l’insuline. Parmi les très nombreux facteurs qui peuvent intervenir dans cet écart entre la théorie et la pratique citons : le bruit de fond très variable selon les techniques et les échantillons, la fixation non spécifique du traceur, les contraintes liées aux instruments de lecture du signal, le choix de l’algorithme de traitement de la courbe de calibration, etc. Les principaux systèmes de marquage et de révélation de la marque en usage actuellement sur les automates sont classés dans le tableau 2.

4.2.

Marqueurs radioactifs

Les dosages radio immunologiques par compétition (RIA) ou à deux sites (IRMA) ne sont plus guère utilisés que pour quelques molécules (stéroïdes…) pour lesquelles il n’existe pas encore d’alternatives non isotopiques. Le marqueur le plus fréquemment utilisé reste l’iode-125 (125I, demi-vie 60 jours). Le tritium (3H, demi-vie 12,26 ans) n’est plus guère utilisé en IA. Outre la radioactivité et la réglementation contraignante qui l’accompagne, les inconvénients de l’iode-125 sont son instabilité et la dégradation possible du traceur par radiolyse.

Principaux systèmes de marquage et de révélation en immunoanalyse.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Marqueurs et systèmes de révélation Radioactif

Enzymatique

3

Fluorescent IMx® (Abbott)

H (compteur β) C (compteur β) 125 I (compteur γ) 57 Co (compteur γ) 14

Galactosidase : CEDIA ; photométrie Glucose 6-Phosphate Deshydrogénase : EMIT (Vitros®Microtip, OrthoClinical Diagnostics) ; photométrie

Peroxydase : Photométrie : Vitros® Immuno-Rate, OrthoClinical Diagnostics Chimiluminescence : Vitros® ECi, OrthoClinical Diagnostics

Chemiluminescent ACS 180® SE (Siemens) Elecsys® (Roche) ADVIA Centaur®(Siemens) Architect® i2000 et i200SR (Abbott)

Phosphatase alcaline : Photométrie : ELISA Fluorescence : IMx® (Abbott) AxSYM® (Abbott) Chimiluminescence : IMMULITE® (DPC)

19

4557_2_.book Page 20 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

4.2.1. Mesure de la radioactivité La radiation ionisante est détectée par un scintillant qui émet des flashes de lumière convertis en impulsions par un photomultiplicateur. Ce scintillant est soit ajouté au milieu réactionnel pour les radiations à faible énergie (3H) absorbées par les parois du récipient soit directement inclus dans la cellule de comptage pour les radiations non absorbées (125I). La radioactivité s’exprime par le nombre de désintégrations par minute (dpm) mais en pratique ce sont les impulsions ou coups par minute (cpm) qui sont mesurées car le rendement du compteur est inférieur à 100 % (~ 80 % pour 125 I). La déviation standard variant comme la racine carrée du nombre de coups, un nombre suffisant doit être compté (10 000 coups pour une erreur relative de 1 %). Dans un objectif de standardisation, il faut, pour les compteurs multi-puits, vérifier pour chaque puits le bruit de fond (qui doit être minimum) ainsi que le rendement du compteur. La sensibilité des dosages par RIA est limitée par la demi-vie de la radioactivité et par le fait que chaque atome ne libère son énergie qu’une seule fois. Ainsi 7,5.10 6 atomes d’125I n’émettent qu’une seule désintégration par seconde.

4.2.2. Préparation du traceur La conception du traceur est très délicate et nécessite beaucoup d’habilité et d’expérience. Le plus fréquemment l’isotope est introduit non par substitution avec un atome de même nature mais par substitution avec un atome d’hydrogène, e.g. pour 125I sur les noyaux des tyrosines. Or l’iode est un gros atome, comparable en taille au noyau benzène. L’analyte marqué peut être structuralement très différent de l’analyte à doser, particulièrement dans la région du marquage. La position de la marque par rapport au site de liaison de l’Ac sera donc déterminante pour l’affinité de ce dernier. Il en résulte toute une stratégie pour l’élaboration des Ac qui devront reconnaître des épitopes accessibles non affectés par le marquage (voir paragraphe 5.1.3.). Lorsque la fixation directe de l’iode-125 sur l’Ag (haptène) est impossible le marquage est effectué sur un transporteur qui est ensuite couplé à l’Ag. La fixation de l’haptène au transporteur par l’intermédiaire d’un bras d’espacement améliore l’accessibilité des Ac. Cependant, il faut éviter de choisir un même bras d’espacement pour construire l’immunogène et le traceur, car dans ce cas on obtient des Ac anti-bras reconnaissant plus fortement l’haptène du traceur que l’haptène libre à doser avec pour conséquences un dosage peu sensible. En moyenne 1 seul atome d’125I est fixé par molécule de traceur. Un marquage plus important augmente la sensibilité mais entraîne un risque accru de radiolyse.

4.3.

Marqueurs enzymatiques : « enzyme immunoassay : EIA »

Les enzymes sont actuellement les marqueurs les plus utilisés en IA. Différentes abréviations sont proposées pour désigner les IA avec marque enzymatique. L’abréviation EIA (enzyme immunoassay) est un terme général qui ne donne pas d’indications sur le format du dosage. Par exemple :

20

– le terme ELISA (« enzyme-linked immunosorbent assay ») désigne littéralement des IA en phase hétérogène en mode compétitif ou non et avec marque enzymatique. En pratique courante cette abréviation est le plus souvent abusivement utilisée comme substantif pour désigner l’ensemble des IA avec enzyme voire sans enzyme !!! ; – le terme EMIT® (« enzyme-multiplied immunoassay technique ») également très usité désigne une catégorie d’IA en phase homogène avec traceur enzymatique. Après une période de position dominante sur le marché des IA en phase homogène, la technique EMIT a été progressivement remplacée par d’autres concepts avec traceur enzymatique et non enzymatique, s’appliquant toujours en phase homogène mais plus performants (voir paragraphes 3.2.).

4.3.1. Avantages et inconvénients de la marque enzymatique • Avantages : – très bonne sensibilité du fait de l’activité catalytique de l’enzyme qui permet d’amplifier le signal, e.g. 106 événements catalytiques par seconde pour chaque molécule d’enzyme ; – le signal généré peut être mesuré selon les cas par absorbance, fluorescence ou luminescence ; – l’activité enzymatique est en général plus stable que la radioactivité de l’iode-125. Il en résulte pour les trousses commercialisées, des durées de conservation plus importantes et des étalonnages moins fréquents. • Inconvénients : – les conditions de génération du signal doivent être parfaitement définies (concentrations en substrats, pH, température, cofacteurs…) et préservées des interférences possibles par l’échantillon (inhibiteurs…).

4.3.2. Nature des enzymes La phosphatase alcaline (PAL) et la peroxydase (POD) sont les deux enzymes les plus couramment sélectionnées en IA. Les autres marqueurs enzymatiques à usage commercial sont la β-D-galactosidase, la glucose 6-phosphate déshydrogénase (G6PDH), et la glucose oxydase (GO). • La PAL possède de nombreux substrats et de nombreux sites de conjugaison. Son activité enzymatique, zinc dépendante, est inhibée par les phosphates et les chélateurs de zinc (borates, carbonates). Son pH optimal est compris entre 9,5 et 10,5. • La POD possède six sites de conjugaison sans perte d’activité enzymatique. Elle utilise de nombreux donneurs d’hydrogène pour réduire le peroxyde d’hydrogène produisant selon les cas des dérivés colorés, fluorescents ou luminescents. Son pH optimal est compris entre 4 et 8. Selon la configuration du dosage, l’enzyme est couplé soit à l’Ag soit à l’Ac. La technique de couplage doit conserver les conformations actives des différents partenaires de l’IA, i.e. site actif de l’enzyme, épitopes de l’Ag, paratopes de l’Ac. Le traceur peut aussi être produit par des techniques de biologie moléculaire sous forme de protéine de fusion à partir de gènes codant pour une enzyme et pour un des partenaires de la réaction Ag/Ac (e.g. PAL-proinsuline) ou à partir de gènes codant pour une

4557_2_.book Page 21 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Dosage des marqueurs biologiques par immunoanalyse

enzyme et pour un récepteur de fragment Fc d’Ac (e.g. luciféraseprotéine A).

4.3.3. Mesure de l’activité enzymatique ■ Par colorimétrie

La coloration est le signal le plus simple à mesurer. La marque enzymatique est incubée avec le substrat dans des conditions bien définies. Le signal peut être lu à un temps prédéfini ou bien en mode cinétique. Les dosages colorimétriques restent cependant limités par l’amplitude, relativement faible, de la plage de lecture des spectrophotomètres (en moyenne jusqu’à 2 unités d’absorbance). Les substrats classiques pour la colorimétrie sont : – pour la PAL : le PNPP (para-nitrophenyl phosphate) ; – pour la POD : l’ABTS® [2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6sulphonate)], l’OPD (ortho-phénylenediamine), le TMB (3,3’,5,5’tétraméthylbenzidine). Chacun de ces substrats requiert la présence de peroxyde d’hydrogène. Le TMB donne le signal le plus élevé et en outre n’est pas mutagène comme l’OPD. Les dosages colorimétriques par la POD sont plus sensibles que ceux par la PAL (intensité du signal environ 10 fois plus forte). ■ Par fluorimétrie

Les IA avec détection par fluorimétrie ont une sensibilité supérieure de plusieurs ordres de magnitude à la détection par colorimétrie. Ceci est dû au fait que l’excitation du fluorophore peut être répétée un grand nombre de fois dans un court laps de temps. Le signal fluorescent peut être généré :

– soit d’emblée par le traceur Ag ou Ac marqué par un fluorophore (dans ce cas pas d’intermédiaire enzymatique, voir paragraphe 4.4.) ; – soit par formation de novo du fluorophore à partir d’un substrat transformé par l’activité enzymatique. Les sensibilités atteintes avec la POD et la PAL sont équivalentes.

Un bref rappel sur la fluorimétrie : un fluorophore excité par une radiation incidente retourne à son état basal par l’émission d’une radiation (fluorescence) à une longueur d’onde supérieure à celle de la radiation incidente. La différence entre les longueurs d’onde d’émission et d’excitation est appelée « déplacement de Stockes » et la proportion d’énergie émise le « rendement quantique ». Fort logiquement, l’interférence de la lumière incidente est d’autant plus faible que le déplacement de Stockes est plus grand. De même la sensibilité sera d’autant plus élevée que le rendement quantique sera plus proche de 1. Le 4-MOP (4-méthylombelliferyl phosphate) est le substrat le plus utilisé par la PAL dans le cadre des EIA avec détection par fluorimétrie. L’intensité de la fluorescence dépend de la température, du pH, de la polarité du solvant et du contenu en oxygène dissout. Interférences : – par diffusion de la lumière par les particules ; – par le bruit de fond de fluorescence émis par les protéines, le NADH, la bilirubine… ; – par atténuation (quenching) de la longueur d’onde absorbée ou émise, par des molécules de l’échantillon.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Traceur enzymatique et détection par fluorescence ; exemple d’application sur automate : La technologie MEIA installée sur l’AxSYM® (Abbott), automate d’IA avec accès des échantillons continu ou aléatoire (continuous-and random-access) et réactifs en vrac Les dosages par MEIA (microparticle capture enzyme-immunoassay) sont réalisés en phase hétérogène, en mode compétitif et non compétitif. La phase solide constituée de microparticules est recouverte le plus souvent par l’Ac et parfois par l’Ag de capture, e.g. pour le dosage d’Ac. • Procédé pour les dosages d’haptènes en mode compétitif : – les microparticules recouvertes d’Ac de capture sont incubées avec l’échantillon et le traceur haptène-enzyme ; – après lavage, l’activité enzymatique (PAL) du traceur lié est mesurée par incubation avec du 4-MOP. La fluorescence du produit libéré (4-MO) est lue à 448 nm. • Procédé pour les dosages de macromolécules en mode non compétitif : – les microparticules recouvertes d’Ac1 de capture sont incubées avec l’échantillon ; – après l’étape de lavage, le traceur Ac2-enzyme (PAL) est introduit en excès ; – le traceur permet la formation du sandwich (Ac1-Ag-Ac2-enzyme) dont l’activité enzymatique est mesurée comme ci-dessus.

21

4557_2_.book Page 22 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Ces interférences sont en principe éliminées par les étapes de lavage. ■ Par chimiluminescence

En fluorimétrie la sensibilité de la détection peut être affectée par les interférences mentionnées ci-dessus. En chimiluminescence le signal provient des seuls composés luminescents néoformés qui émettent une lumière au terme d’une réaction chimique spécifique. Il n’y pas de lumière incidente et le bruit de fond est minimal. Contrairement à la désintégration radioactive tous les photons libérés peuvent être détectés en un très court laps de temps. Il en résulte pour les dosages en chimiluminescence, une sensibilité accrue de plusieurs ordres de magnitude par rapport à la détection par fluorimétrie ou par radioactivité. – Comme pour la fluorimétrie le signal luminescent peut être généré d’emblée (voir paragraphe 4.5.) ou après réaction enzymatique comme dans le cas présent. Les EIA par chimiluminescence sont classiquement réalisés en point final. Des substrats sont commercialisés pour toutes les enzymes classiques : pour la PAL et avec l’AMPPD (adamentyl 1,2-dioxetane arylphosphate) comme substrat la limite de détection théorique est de l’ordre de la zeptomole soit 602 molécules !!!. – Pour la POD différents substrats chimiluminescents dérivés du Lumigen® sont proposés. • Chimiluminescence amplifiée

La luminescence produite par les réactions enzymatiques est parfois faible et de faible durée. L’addition de certaines molécules (« enhancer ») permet d’amplifier la lumière émise. Ainsi pour la POD la lumière émise par l’oxydation du luminol peut être amplifiée d’un facteur 1 000 par l’ajout de phénols ou de naphtols substitués. La lumière émise sous forme de rougeoiement est stable plusieurs heures ce qui apporte un grand confort de lecture.

4.4.

Marqueurs directement fluorescents

Nous avons vu ci-dessus que le signal fluorescent ou chimiluminescent était généré par l’activité de la marque enzymatique. Comme pour un marquage isotopique, ces signaux peuvent aussi être directement émis par l’Ag ou l’Ac préalablement marqués. En pratique le signal fluorescent émis peut être lu selon différents modes, e.g. polarisé, amplifié, atténué, retardé. Nous ne décrivons que les lectures en modes polarisé et retardé qui connaissent des applications sur les automates de biochimie.

4.4.1. La polarisation de fluorescence : FPIA (fluorescence polarization immunoassay) Le dosage par FPIA est une technique en phase homogène dédiée principalement au dosage des haptènes. L’haptène à doser entre en compétition avec le traceur (haptène-fluorescéine*) pour la fixation sur l’Ac de capture. L’émission polarisée de fluorescence après excitation polarisée de la fluorescéine dépend des contraintes liées à son environnement macromoléculaire : – quand le traceur est libre la dépolarisation, par rotation moléculaire, après excitation est très rapide. La fluorescence polarisée émise est donc très atténuée ; – quand le traceur est lié à l’Ac, la dépolarisation est ralentie par l’encombrement stérique exercé par l’Ac. Il en résulte une émission de fluorescence polarisée beaucoup plus intense. Comme le traceur lié à l’Ac émet une forte fluorescence polarisée contrairement au traceur libre, il n’est pas nécessaire de séparer les formes libres et liées pour la lecture du signal fluorescent qui, dans ce format compétitif, est inversement proportionnel à la concentration en haptène à doser.

Traceur enzymatique et détection par chimiluminescence : exemple d’application sur automates : la famille IMMULITE® 1 000 (introduit en 2001), 2000 et 2500 (introduits en 2004) fabriquée par Siemens, automate d’IA avec accès des échantillons continu ou aléatoire et réactifs à l’unité – Les dosages se déroulent en phase hétérogène, en mode compétitif pour les haptènes et en mode non compétitif pour les macromolécules. – La phase solide, constituée de billes de polystyrène recouvertes d’Ag ou d’Ac, est contenue dans un tube unitaire dédié à chaque dosage. – L’échantillon et le traceur* marqué par la PAL sont ajoutés dans le tube unitaire idoine et le tout est incubé. – Le tube unitaire est amené à la station de lavage pour l’élimination des molécules non fixées, e.g. le traceur libre. – Dans le luminomètre le substrat de la PAL (AMPPD) est ajouté et le tout incubé pendant 5 min. Le produit de l’action de la PAL est un anion instable qui se décompose avec émission d’un rougeoiement prolongé de lumière.

22

4557_2_.book Page 23 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Dosage des marqueurs biologiques par immunoanalyse

Traceur enzymatique et détection par chimiluminescence amplifiée : exemple d’application sur automate : Vitros® Eci (OrthoClinical Diagnostics), automate d’IA avec en accès des échantillons continu ou aléatoire et réactifs en vrac

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

– Les dosages se déroulent en phase hétérogène, en mode compétitif pour les haptènes et en mode non compétitif pour les macromolécules. – La plupart des IA sont quantitatives à l’exception des IA pour la caractérisation de marqueurs de maladies infectieuses. – La phase solide est constituée de micro-puits en polystyrène recouverts par un réactif de capture généraliste, e.g. souvent streptavidine, parfois Ac anti-Ig de mouton produit chez l’âne ou autres protéines pour des tests particuliers. Ce système permet d’amarrer l’Ac de capture anti-analyte (souvent conjugué à de la biotine) sur la phase solide par l’intermédiaire de son fragment Fc. Il en résulte une optimisation de l’orientation et de la conformation des paratopes de l’Ac. – Le traceur est marqué par de la peroxydase (POD) pour tous les dosages, i.e. AcPOD* ou Ag-POD*. – Le traceur lié est dosé par mesure de l’activité enzymatique de la POD. Le réactif de révélation génère à partir d’un peracide des ions peroxydes. Ces derniers en présence de POD oxydent un réactif d’amplification qui à son tour oxyde du luminol. Le luminol oxydé se décompose en 3-amino-phtalate avec émission prolongée de lumière.

Cependant la fluorescence endogène émise par certaines molécules présentes dans les échantillons biologiques, e.g. bilirubine, NADH, protéines…, limite la sensibilité des dosages. La parade consiste à utiliser un fluorophore présentant une fluorescence décalée et prolongée par rapport à la fluorescence des composés interférents de l’échantillon. C’est le principe de la fluorescence en temps retardé.

– Un réactif d’amplification est ensuite ajouté : ce réactif contient d’une part un ligand β-dicétone fluorée, avec lequel l’ion Eu 3+ libre va former un nouveau chélate hautement fluorescent, et d’autre part un protecteur lipophile du chélate néoformé. Le fluorimètre délivre 1 000 impulsions de lumière par seconde. La fluorescence est mesurée après chaque impulsion dans un intervalle compris entre 400 et 800 microsecondes.

4.4.2. Fluorescence en temps retardé et dosages en phase hétérogène

4.4.3. Fluorescence en temps retardé et dosages en phase homogène

Certains lanthanides comme l’ion europium Eu 3+ sont en solution aqueuse très peu fluorescents. En revanche la fluorescence est fortement amplifiée après exclusion des molécules d’eau environnantes par des ligands organiques qui forment alors des chélates à fluorescence forte et prolongée (> 500 nanosecondes) et avec un déplacement de Stokes important (> 200 nm). Ces propriétés permettent de minimiser les interférences par les molécules fluorescentes de l’échantillon et par diffusion de la lumière par les colloïdes et protéines. Le principe de ces dosages très sensibles a été breveté en 1985 sous le terme DELFIA® (Wallac/Perkin Elmer) : « dissociationenhanced lanthanide fluorescence immunoassay ». – La méthode DELFIA utilise un traceur Ac* ou Ag* marqué en milieu alcalin par un chélate hydrophile d’Eu 3+ stable mais peu fluorescent. – Après l’étape de séparation du traceur lié à l’immun-complexe de la phase solide et du traceur libre, l’ion europium Eu 3+ est dissocié du chélate par passage en milieu acide.

Ici la fluorescence en temps retardé est obtenue par transfert non radiatif de l’énergie d’excitation d’un fluorophore donneur vers un fluorophore accepteur. La condition nécessaire pour ce transfert est le rapprochement des deux fluorophores lors de la formation de l’IC. Le signal n’est donc émis que lorsque le traceur est lié (directement ou indirectement) à l’Ac de capture. En conséquence il n’est pas utile de séparer les formes libres et liées du traceur et le dosage est réalisable en phase homogène. Ce concept est breveté sous le terme TRACE ® (« Time Resolved Amplified Cryptate Emission »). En bref : la technologie TRACE installée sur le Kryptor ® permet de doser en phase homogène des marqueurs protéiques en mode non compétitif et des haptènes en mode compétitif. L’excitation du cryptate est obtenue par une impulsion laser (20 fois/ seconde). Le rendement de transfert de l’énergie d’excitation vers le traceur accepteur est de ~ 50 % pour une distance de 5 nm (distance classique pour un IC). La lecture est effectuée dans l’intervalle 50-400 μsec après chaque impulsion laser.

23

4557_2_.book Page 24 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Fluorescence en temps retardé en phase hétérogène : exemples de protocoles d’IA disponibles dans le système DELFIA Dosages de type sandwich pour les macromolécules : réalisables au choix en une ou deux étapes. L’option en deux étapes est conseillée pour les protéines et les états physiopathologiques associés à un risque élevé d’effet crochet par excès d’Ag, e.g. HCG, AFP… Dosages de type compétitif pour les haptènes, e.g. stéroïdes, médicaments… : 1) soit classiquement par compétition, entre l’haptène à doser et le traceur (haptène-Eu3+), pour la fixation sur l’Ac de capture insolubilisé, 2) soit par compétition entre l’haptène à doser et un complexe haptène-protéine insolubilisé, pour la fixation sur le traceur (Ac de capture-Eu3+) en solution.

Fluorescence en temps retardé en phase homogène : exemple d’application du concept TRACE sur automate : Kryptor® (B.R.A.H.M.S/Thermo Scientific) • Le transfert énergétique s’effectue entre deux molécules : un fluorophore donneur (cryptate d’europium) et un fluorophore accepteur (allophycocyanine). • Le donneur est toujours fixé sur l’Ac1 de capture anti-analyte. • L’accepteur (qui fait aussi office de traceur) est fixé selon le format du dosage : – soit sur un Ac2 anti-analyte (format de type non compétitif ou sandwich) pour doser les Ag de grosse taille, e.g. marqueurs protéiques ; – soit sur l’analyte à doser (format de type compétitif pour doser les haptènes). • Le donneur libre émet après excitation à 337 nm, un long signal fluorescent à 620 nm. • L’accepteur libre après excitation à 620 nm par le donneur émet un bref signal fluorescent à 665 nm. • Quand il y a rapprochement physique entre le donneur et l’accepteur (i.e. entre l’Ac1 de capture et le traceur après formation de l’immun-complexe) il y a transfert de l’énergie d’excitation du donneur vers l’accepteur qui émet à 665 nm un signal fluorescent, amplifié, prolongé et retardé.

4.5.

Marqueurs directement chimiluminescents

Les avantages de la chimiluminescence appliquée aux EIA ont été brièvement évoqués ci-dessus (voir paragraphe 4.3.3.3.). Comme pour les traceurs radioactifs et fluorescents, la marque peut être directement fixée sur un Ag ou un Ac.

4.5.1. Signal chimiluminescent Le signal est généré par une réaction chimique, e.g. oxydation d’un ester d’acridinium ou de sulfonamide, suivie de l’émission d’un flash de lumière. Le signal maximum est obtenu 0,4 sec après la réaction et sa demi-vie est de 0,9 sec.

24

NB : Les immunoanalyses installées sur les automates de Beckman Coulter (Access®, Access 2, UniCel™ DxI 800) et de DiaSorin (Liaison®) sont aussi conçues selon une technologie de détection par chimiluminescence et de séparation du traceur lié par des billes magnétiques. • Chimiluminescence couplée à l’excitation de l’oxygène : « luminescent oxygen channeling immunoassay (LOCI) »

La photo-excitation de particules de latex sensibilisatrices produit de l’oxygène singulet qui, en conditions favorables, peut être transféré à d’autres particules de latex potentiellement chimiluminescentes. La présence de l’Ag analyte permet la réalisation de ces conditions favorables en rendant possible la formation de sandwichs entre les deux types de particules (préalablement

4557_2_.book Page 25 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Dosage des marqueurs biologiques par immunoanalyse

Chimiluminescence : exemple d’application sur automate : ADVIA Centaur® Siemens (1998), automate d’IA avec accès des échantillons en série ou aléatoires et réactifs en vrac Les protocoles stockés en mémoire sont de types compétitifs ou non compétitifs et se déroulent en phase hétérogène. L’Ac de capture est fixé sur des particules paramagnétiques. Le traceur lié (directement ou indirectement) à l’Ac de capture est insolubilisé par application d’un champ magnétique. L’ester d’acridinium du traceur lié est oxydé en milieu acide et un ajustement du pH permet d’émettre le signal lumineux qui est mesuré pendant 5 sec.

Chimiluminescence exemple d’application sur automate : la famille Architect® i Abott

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Ce sont des automates modulaires d’IA qui ont en commun une technologie de détection par chimiluminescence brevetée : la CMIA (chemiluminescent magnetic microparticle immunoassay). • Les dosages non compétitifs sont réalisés en deux étapes : – 1re étape : extraction de l’analyte de l’échantillon par l’Ac1 de capture fixé sur des microparticules paramagnétiques (quelques dosages sont conçus à partir d’Ag, ou autres protéines, que l’on fixe sur les microparticules, pour la capture de l’analyte à doser). Incubation et lavage. – 2e étape : ajout du traceur (Ac*2 ou haptène* marqué par un dérivé d’acridinium potentiellement chimiluminescent). Incubation et lavage pour éliminer le traceur non lié en excès. – NB : le protocole en deux étapes permet d’éliminer ou de diminuer les éventuelles interférences, e.g. par des Ac anti-Ig animales (HAMA) ou par effet crochet (voir paragraphe 5.). • Génération du signal dans la cuve réactionnelle : – le traceur marqué par le dérivé d’acridinium est libéré de la phase solide par ajout d’un réactif dissociant ; – un champ magnétique est appliqué pour fixer les microbilles de la phase solide sur la paroi de la cuve réactionnelle, le traceur libéré restant en solution ; – l’ajout d’un réactif de révélation contenant une base permet d’émettre en solution le signal chimiluminescent.

recouvertes par des Ac anti-analyte). Ainsi la formation du sandwich va rendre physiquement possible, l’activation de la particule potentiellement chimiluminescente par l’oxygène singulet libéré. Il en résulte une chimiluminescence retardée proportionnelle à la concentration en Ag à doser. En absence d’Ag le sandwich ne se forme pas et la particule chimiluminescente n’est pas excitée. Ce dosage en phase homogène est au moins aussi sensible que les dosages les plus performants en phase hétérogène. Ainsi pour la TSH avec deux Ac anti-TSH différents fixés sur chaque

type de particule, le seuil de détection est de 0,001 mUI/L soit 4,1 fmol/L ou # 120 000 molécules dans 50 μL de sérum. Ce dosage peut aussi se pratiquer sur le mode compétitif : l’Ac de capture est toujours fixé sur la particule de latex sensibilisatrice mais le traceur est ici constitué par l’Ag fixé sur la particule de latex potentiellement chimiluminescente (Ag*-latex). La fixation du traceur Ag*-latex sur l’Ac de capture permet le transfert de l’excitation de l’oxygène singulet à la particule chimiluminescente et donc la formation du signal.

25

4557_2_.book Page 26 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

4.5.2. Signal électro-chimiluminescent (ECL) L’émission de lumière peut aussi être obtenue à partir de marqueurs électro-chimiluminescents : certains cations tels que le ruthénium Ru2+ peuvent être excités par une réaction électrochimique et émettre ainsi de la lumière. Le signal émis est mesuré en flux continu dans une cellule électrochimique.

4.6.

Marquage amplifié par le système streptavidine/avidine-biotine

L’avidine est une protéine du blanc d’œuf qui possède 4 sites de liaison à affinité très élevée pour la biotine (K A = 1015 M–1). En IA on utilise plutôt la streptavidine qui présente moins de liaisons non spécifiques et permet donc d’améliorer la sensibilité du dosage. Le marquage est habituellement réalisé par la biotine, sans modification sensible de l’activité biologique du fait de sa petite taille. À la fin du dosage, la streptavidine couplée à une molécule génératrice de signal est introduite e.g. streptavidineenzyme (PAL, POD), streptavidine-fluorophore (fluorescéine, rhodamine). Dans le cadre d’un dosage immunométrique le signal peut être très amplifié par le fait qu’une molécule d’Ac 2 peut accepter de

nombreuses molécules de biotine pour le marquage et que le traceur « streptavidine-enzyme » peut aussi accepter plusieurs molécules d’enzyme. De même la streptavidine peut être couplée à des macromolécules contenant plusieurs chélates d’europium, amplifiant ainsi le signal plusieurs milliers de fois. Le couple streptavidine-enzyme peut constituer un réactif révélateur universel pour un ensemble de dosages utilisant une même marque biotinylée (sur Ac2 ou l’Ag). NB : Le couple streptavidine/biotine peut aussi constituer un réactif de capture universel, e.g. la phase solide est recouverte de streptavidine tandis que l’Ac de capture est biotinylé.

4.7.

Marquage par la protéine A

Ce récepteur de la paroi de Staphylococcus aureus possède une affinité élevée pour le fragment Fc des IgG. Toutefois cette affinité dépend de la sous-classe des IgG et de l’espèce productrice d’IgG. La protéine A peut être couplée à une enzyme (POD) ou à un fluorophore et ainsi servir de traceur universel pour des techniques d’immunométrie, d’immunoempreinte et d’immunocytochimie. La protéine A ou son homologue la protéine G peuvent aussi servir de système universel de capture d’IC.

Électrochimiluminescence en phase hétérogène ; exemple d’application sur automate : Elecsys®, e411, Cobas 6000 Roche Diagnostics (~ 1996), automate d’IA avec accès aléatoire des échantillons et réactifs Les protocoles installés sont conçus pour doser en phase hétérogène, des haptènes (en mode compétitif), des protéines (en mode non compétitif), des Ac (par une technique de pontage dénommée « bridge assay ») et des sondes ADN ou ARN. La détection est assurée par électrochimiluminescence (ECL). • En fonction de l’analyte à doser, le système de capture (Ac ou Ag ou sonde nucléique) couplé à la biotine est incubé avec l’échantillon et avec le traceur marqué par du ruthénium2+. • L’IC formé est capturé par des microbilles paramagnétiques recouvertes de streptavidine. • Les microbilles recouvertes d’IC sont uniformément déposées sur l’électrode de la cellule de mesure par l’application d’un champ magnétique. • Le traceur non lié est éliminé par lavage • Un potentiel électrique appliqué à l’électrode permet d’émettre le signal luminescent dans la cellule de mesure : – le traceur (marqué par du ruthénium réduit Ru2+) et de la tripropyle amine (TPA) sont simultanément oxydés à la surface de l’électrode ; – les produits d’oxydation (Ru3+ et le radical tripropyle amine TPA+) réagissent ensuite entre eux pour former du Ru2+* excité qui revient à son état basal Ru2+ en émettant une lumière. • En fin de réaction les particules paramagnétiques sont détachées de l’électrode et éliminées. La surface de l’électrode de la cellule de mesure est ensuite nettoyée pour le dosage suivant.

26

4557_2_.book Page 27 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Dosage des marqueurs biologiques par immunoanalyse

5 ■■ INTERFÉRENCES DANS LES IMMUNODOSAGES Malgré l’emploi de réactifs par définition hautement spécifiques, le résultat des IA peut être faussé par des interférences dans la réaction Ag/Ac. Ces interférences correspondent le plus souvent, mais pas exclusivement, à un défaut de spécificité des Ac (réaction croisée) ou à la présence dans l’échantillon d’Ac dirigées contre l’analyte à doser (auto-Ac) ou contre les Ac du kit de dosage (Ac antiimmunoglobuline : Ac anti-Ig). (Selby, 1999, Beaudonnet et Cohen, 1995, Bjerner et al., 2002, Lepage, 2005).

5.1.

La réaction croisée

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

La spécificité analytique d’une IA dépend en grande partie de celle de l’Ac de capture pour l’analyte à doser. Cependant, dans bien des cas la spécificité de l’Ac marqué est également critique. La RC correspond à un vrai défaut de spécificité de l’Ac de capture qui peut aussi reconnaître un épitope porté par une autre molécule que l’analyte à doser. La molécule interférente ou crossréactant (CR) est en général une molécule apparentée à l’analyte mais ce n’est pas obligatoire car il suffit en théorie que deux entités moléculaires différentes possèdent au minimum un épitope en commun. La RC est en principe plus fréquente pour les dosages de type compétitifs que pour les dosages de type non compétitif car : – pour les dosages de type compétitif le CR doit posséder au minimum un épitope commun avec l’analyte. De plus l’Ac de capture étant introduit en défaut, la RC se manifestera pour des concentrations en CR relativement faibles ; – pour les dosages de type non compétitif le CR doit posséder au minimum les deux épitopes de l’analyte reconnaissant l’Ac de capture et/ou l’Ac* traceur. De plus ces Ac étant introduits en excès, la RC ne se manifestera le plus souvent que pour des concentrations en CR relativement plus fortes. Les conséquences analytiques de la RC vers un résultat faussement positif ou faussement négatif dépendront surtout : – de la configuration du dosage, e.g. compétitif versus non compétitif ; – du rapport des concentrations entre l’analyte et le CR ; – de la nature monoclonale ou polyclonale des réactifs Ac.

Exemples – Après corticothérapie : interférence dans le dosage du cortisol, de certains principes actifs (prednisolone). – RC de la proinsuline dans le dosage de l’insuline. – RC de la déhydrotestostérone (DHT) dans le dosage de la testostérone.

5.1.2. Conséquences de la RC dans les dosages de type non compétitif • Si le CR reconnaît un des deux Ac de la trousse de dosage, et s’il est abondant, il peut neutraliser l’Ac en excès et empêcher la formation du sandwich entraînant une erreur par défaut avec un pseudo effet crochet (figures 7 b et c). Ces interférences sont assez rares, car dans les kits de dosage les réactifs Ac sont introduits en excès par rapport à l’analyte à doser. Néanmoins elles sont observées lorsque le CR est une molécule pouvant évoluer dans un large spectre de concentrations (figure 7b, c, d). • Si le CR possède en commun avec l’analyte deux épitopes suffisamment éloignés reconnus par chacun des réactifs Ac, il peut former des sandwichs surnuméraires et induire un biais par excès (figures 7 d). • Quelle est la nature des molécules interférentes ? Les CR sont le plus souvent : – des protéines ou leurs isoformes (résultant de modifications post-traductionnelles) ou leurs produits de dégradation et de taille suffisante pour posséder au moins deux épitopes différents ;

a

Ag* marqué

b

Ac marqué

c

CR

5.1.1. Conséquences de la RC dans les dosages de type compétitif • On observe des résultats faussement augmentés, par diminution de la fraction en Ag* traceur fixé sur l’Ac de capture (figure 7a). • Quelle est la nature des molécules interférentes ? Les CR sont le plus souvent des haptènes de structures voisines (i.e. médicaments, stéroïdes ou leurs métabolites). La réaction croisée peut aussi s’observer entre petites protéines possédant des épitopes communs : précurseurs de synthèse, produits de dégradation.

d

Figure 7

Ag à doser

■

Réaction croisée

(a) : Dosage de type compétitif : le CR est en compétition avec l’Ag* traceur pour la fixation sur l’Ac de capture ⇒ biais par excès. (b) : Dosage de type non compétitif : le CR reconnaît l’Ac* traceur ⇒ biais par défaut. (c) : Dosage de type non compétitif : le CR reconnaît l’Ac de capture ⇒ biais par défaut. (d) : Dosage de type non compétitif : le CR reconnaît les 2 Ac réactifs ⇒ biais par excès.

27

4557_2_.book Page 28 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

– des protéines oligomères possédant des sous-unités communes avec l’analyte à doser, e.g. interférence, dans le dosage de l’hCG, de la sous-unité commune α (de la TSH de la FSH et de la LH) lorsque l’Ac de capture est dirigé contre cette sousunité ; – des agrégats protéiques, e.g. interférences dans le dosage du monomère de prolactine des dimères ou trimères (big prolactine) ou d’IC (big-big prolactine).

5.1.3. Stratégie de couplage des haptènes à une protéine porteuse et spécificité des Ac produits – Pour rendre un haptène immunogène il faut le coupler à une protéine dite « porteuse ». La spécificité des Ac produits pour les différents épitopes de l’haptène est étroitement dépendante du choix du site de couplage sur la protéine porteuse (figure 8). – Compte tenu des faibles différences structurales entre haptènes de la même famille (e.g. stéroïdes), la spécificité totale d’un Ac pour un haptène défini demeure un idéal. Les Ac anti-haptène produits sont a priori dirigés vers les épitopes du complexe immunogène les plus accessibles au système immunitaire, i.e. les plus éloignés du site de couplage à la protéine porteuse. Inversement des RC sont à prévoir entre des épitopes proches du site de couplage.

Exemple (figure 8 A). Dosage de la testostérone et réactions croisées avec deux analogues structuraux : la progestérone et la 5-dihydrotestostérone (Franek, 1987) : • Dans le cas de la progestérone la modification structurale par rapport à la testostérone porte sur le carbone C17. On constate que l’Ac anti-testostérone qui croise le plus avec la progestérone (i.e. le moins discriminant) est obtenu quand le C17 est choisi comme site de couplage à la protéine porteuse (RC = 55 %). En revanche les RC sont négligeables quand le site de couplage est suffisamment éloigné du site structuralement modifié, e.g., RC < 0,01 % quand le couplage est effectué sur les C3 ou C7. • Dans le cas de la 5-dihydrotestostérone la modification structurale porte sur les C4 et C5. Fort logiquement les RC les plus élevées sont observées pour des couplages de la protéine porteuse proches des C4 et C5, e.g. RC = 47 % et 2,2 % pour des couplages effectués respectivement sur les C6 et C15 de la testostérone. • D’une façon générale le CR croise d’autant plus que les sites affectés par les modifications structurales et ceux choisis pour le couplage sont plus proches.

On définit ainsi une véritable stratégie de couplage en fonction des RC que l’on souhaite éviter ou au contraire que l’on souhaite renforcer, e.g. pour le dosage de l’ensemble des métabolites actifs d’un haptène voir exemple suivant.

5.1.4. Évaluation de la réaction croisée C’est souvent la première étape dans l’évaluation des Ac d’un kit de dosage. Parmi les méthodes proposées aucune n’est parfaite.

28

Exemple (figure 8 B). Dosage de la digoxine (Thong et al., 1985) : • La digoxine est un hétéroside cardiotonique présent dans le sang sous formes de nombreux métabolites plus ou moins actifs. L’activité suppose l’intégrité du noyau lactone H. • Les métabolites issus de la déglycosylation partielle ou totale des cycles A, B ou C par coupure des liaisons osidyles (flèches 1, 2 ou 3) conservent leur activité. Les métabolites issus des carbones marqués C* du noyau lactone perdent leur activité. • En pharmacologie clinique il importe de doser l’ensemble de la digoxine et de ses métabolites actifs. Le couplage à la protéine porteuse sur le cycle glycosylé A induit des Ac principalement dirigés vers le cycle H portant la fonction lactone. Ces Ac, qui ne font pas, ou peu, la différence entre la digoxine et ses métabolites déglycosylés, sont indiqués pour le suivi in vivo de l’activité totale de la digoxine. En revanche les Ac issus d’un couplage sur la fonction lactone ne présentent pas d’intérêt car d’une part ils ne dosent pas les métabolites actifs de déglycosylation et d’autre part ils dosent (par RC) les métabolites inactifs du cycle H.

La méthode idéale devrait permettre de calculer le biais en fonction des concentrations relatives en analyte et en CR in vivo mais aussi en fonction de l’identité du ou des CR. Or en pratique ces données sont le plus souvent inaccessibles. ■ Dosages de type compétitif : méthode d’Abraham

Cette méthode, la plus connue, permet au mieux une estimation du biais dans un dosage (figure 9). Des concentrations connues de CR sont ajoutées à une matrice d’échantillon dépourvue de l’analyte à doser. Les concentrations en CR sont calculées pour obtenir un déplacement du traceur Ag* en tout ou partie. Puis on trace la courbe de déplacement du traceur (B/Bo) % = f (CR) que l’on compare à la courbe de déplacement obtenue pour l’échantillon contenant cette fois-ci des concentrations croissantes d’analyte mais sans CR. Le plus souvent les CR ont moins d’affinité pour l’Ac que l’analyte à doser mais des exceptions ont été observées. • Inconvénients de la méthode d’Abraham. – Les évolutions des 2 courbes sont rarement « parallèles », ce qui signifie que l’estimation de la réaction croisée dépendra du choix de la position du curseur B/Bo sur l’axe des ordonnées. Pire, le déplacement par le CR peut ne pas être total, indiquant dans ce cas la présence de sous-populations d’Ac non reconnues par le CR (figure 9 b). – Cette méthode ne permet pas de préjuger des comportements de l’analyte et du CR lorsqu’ils sont simultanément présents dans l’échantillon et de plus dans des rapports de concentrations très variables selon les cas in vivo. – Enfin des courbes de déplacement doivent être construites pour chaque CR putatif ce qui est long et coûteux. • Avantages de la méthode d’Abraham. – Elle est relativement simple. – Elle permet d’évaluer in vitro la puissance d’une substance interférente et de comparer, pour différentes trousses de dosage, la spécificité de l’Ac de capture (figure 9 b).

4557_2_.book Page 29 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Dosage des marqueurs biologiques par immunoanalyse

CH3

OH

OH C

Testostérone

O

5DHT

Progestérone

17

17 19

19

15

15 3 O

6

3

7

6

O

Dihydrotestostérone

O

Site de couplage sur la protéine porteuse

C3

100

C6 C7

7

< 0,1

46

100

0,01

47

100

< 0,01

42

C15

100

1,5

2,2

C17

100

55

18

C19

100

0,01

10

8A O

b

*

O H

HO

* *

CH3 F

CH3 1

2

CH3

CH3 O

A HO

O

B

O

E

OH

H

C

O OH

D

CH3

O

G

3

O OH

OH

a

8B

Figure 8

■

Spécificité de l’Ac de capture anti-haptène en fonction des positions de couplage de l’haptène à la protéine porteuse.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

8 A – Dosage de la testostérone et réactions croisées de la progestérone et de la 5-dihydrotestostérone (5-DHT). – Les principaux sites de couplage à la protéine porteuse sont situés sur les carbone 1, 3, 6, 7, 11, 15, 17, 19 du noyau stéroïde. – Les carbones modifiés par rapport à la testostérone sont le C17 pour la progestérone et les C4 et C5 pour la 5-DHT. – La valeur de la RC pour chaque Ac est fixée à 100 % pour la testostérone. 8 B – Dosage de la digoxine – L’hydrolyse des liaisons osidyles entre les cycles A, B et C (flèches 1, 2 et 3) maintient l’activité de la digoxine. – La métabolisation des carbones C* du cycle H inactive la digoxine. – Les principaux sites de couplage à la protéine porteuse sont situés sur le cycle glycosylé A et sur la fonction lactone (flèches a et b).

■ Dosages de type non compétitif

L’estimation de la RC est dans cette situation plus complexe car le CR peut théoriquement, soit croiser avec les deux Ac de la trousse de dosage (résultat faussement augmenté), soit avec un seul des Ac réactifs (résultat faussement diminué). Un dosage séquentiel en deux étapes permet, par le lavage intermédiaire, d’éliminer les éventuels CR croisant seulement avec l’Ac conjugué au traceur.

Pour les biais négatifs, il est essentiel pour démontrer la RC, de mettre simultanément en présence l’analyte et le CR. En effet en absence d’analyte, donc de formation de sandwichs, il ne sera pas possible de mettre en évidence un éventuel biais par défaut (e.g. saturation d’un des deux réactifs Ac par le CR en excès). Lorsque la RC est caractérisée, elle peut être évaluée arbitrairement à n fois, e.g. # 2 fois, la limite supérieure de la concentration en CR supposée présente dans l’échantillon.

29

4557_2_.book Page 30 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

B/B0

B/B0

100

Réaction croiséé = [X/Y] × 100 80 Déplacement par l’Ag Déplacement par le CR 50

50

20 0 X

Y

0

Log [Ag ou CR]

Y80 X50

Y50

Log [stéroïde]

B

A

Figure 9

X80

■

Évaluation de la réaction croisée par la méthode d’Abraham.

9A – La réaction croisée est évaluée (%) à partir du rapport des concentrations en analyte et en CR qui réduisent de 50 % le signal Bo (obtenu sans analyte ni CR). L’exemple choisi est le cas le plus simple : on constate un déplacement total du traceur* par le CR et les 2 courbes ont une évolution « parallèle ». 9B – Évaluation de la spécificité d’un IS anti-testostérone par la mesure de la réaction croisée avec la 5-dihydrotestostérone. – Pour B*/B0 = 80 % la RC = 49 %. – Pour B*/B0 = 50 % la RC = 25 %. – Pour B*/B0 = 20 % la RC est impossible à calculer car le déplacement par la 5-DHT n’est pas total.

5.2.

Interférences par des Ac

La réaction Ag/Ac dans une IA peut être perturbée par certains Ac présents dans l’échantillon : – dirigés contre l’analyte : auto-Ac ; – dirigés contre les Ig animales du kit de dosage : Ac anti-Ig animales (Kricka, 1999). Ces Ac sont souvent décrits dans la littérature sous le terme discutable d’Ac hétérophiles. Dans la littérature on regroupe souvent dans la famille des Ac hétérophiles : – les Ac humains anti-animaux : ce sont des Ac, généralement a forte affinité, spécifiquement dirigés contre les épitopes de protéines animales, e.g. immunoglobuline, suite à une exposition professionnelle ou iatrogène ; – le facteur rhumatoïde et les Ac anti-idiotype (du réseau idiotypique) : ce sont des Ac humains naturels généralement de faible affinité. Ils ne sont pas spécifiques d’une Ig ou d’une espèce et à ce titre leur interférence sera plus difficile à supprimer en ajoutant des Ig animales non immunes au milieu réactionnel. NB : il ne faut pas confondre les Ac humains anti-idiotype, naturels et non spécifiques, avec les Ac humains véritablement dirigés contre des Ig animales, qui, selon l’épitope spécifiquement reconnu sur l’Ig, peuvent être des anti-isotypes ou aussi des antiidiotypes (et seront désignés comme tel dans la suite de ce chapitre). Du fait de la grande fréquence d’utilisation des Ac monoclonaux de souris pour des investigations in vivo chez l’Homme, une littérature abondante est consacrée aux interférences produites

30

par des Ac humains anti-Ig de souris, classiquement désignés par le terme HAMA (human anti-mouse antibody). Le biais analytique observé en présence de ces Ac dépendra, comme pour la réaction croisée, de la configuration du dosage.

5.2.1. Dosages de type compétitif ■ Interférences par des auto-Ac dirigés contre l’analyte

Ces auto-Ac peuvent être d’origine auto-immune ou d’origine iatrogène : – origine auto-immune : auto-Ac anti-(thyroglobuline, T3, T4, insuline…) ; – origine iatrogène : Ac anti-(insuline, GH, leptine…). Mécanisme de l’interférence : l’auto-Ac (quelle que soit la concentration en analyte à doser) va piéger une partie du traceur Ag* libre. Il en résultera, selon la loi d’action de masse appliquée au schéma ci-dessous :

Ag* Ac ⇔ Ag* + Ac + Ag ⇔ Ag Ac – une diminution du traceur Ag* lié par l’Ac de capture puisque globalement le traceur libre est en équilibre avec une quantité supérieure d’Ac ; – une augmentation du traceur Ag* lié par la totalité des Ac (i.e. Ac de capture + Ac anti-analyte). Au final le sens du biais dans le dosage dépendra de la technique retenue pour séparer les formes libres et liées du traceur : – si la technique de séparation n’est pas spécifique de l’Ac de capture, e.g. précipitation par le PEG, le sulfate d’ammonium, la quantité totale de traceur lié aux Ac est augmentée et le résultat final sera faussement abaissé ;

4557_2_.book Page 31 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Dosage des marqueurs biologiques par immunoanalyse

– si la technique de séparation est spécifique de l’Ac de capture, e.g. ELISA, précipitation par un Ac anti-Ac de capture, la quantité de traceur liée à l’Ac de capture est diminuée et le résultat final sera faussement augmenté. ■ Interférences par des Ac anti-Ig animales

Ce sont des Ac humains dirigés contre les Ig animales du kit de dosage. Si la fixation de l’Ac humain anti-Ig animale est proche du paratope de l’Ac de capture la capacité de liaison du traceur Ag* peut être abaissée par l’encombrement stérique exercé. Il en résultera un biais par excès (figure 10) qui peut être très important du fait du principe même du dosage compétitif (défaut en Ac de capture). Ac1

Ag* marqué Ag à doser

Ac2 = IgM anti-idiotype

Figure 10

■ Interférence par des Ac humains anti-Ig animales dans un dosage de type compétitif.

Ac1 : Ig animale de capture de l’Ag. Ac2 : Ig humaine anti-Ig animale (ici IgM anti-idiotype de l’Ac1).

5.2.2. Dosages de type non compétitif ■ Interférences par des auto-Ac dirigés contre l’analyte

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

L’interférence dépendra des affinités et spécificités respectives des auto-Ac et de ceux du kit de dosage pour l’analyte. Même si l’affinité de l’auto-Ac est inférieure à celles des Ac du dosage le résultat final pour le dosage de la fraction libre de l’analyte sera faussement augmenté par le déplacement d’une partie de l’analyte lié à l’autoAc (figure 11). NB : un résultat par excès est aussi théoriquement possible si les épitopes de la protéine reconnus par les Ac du kit de dosage sont indépendants de ceux reconnus par les auto-Ac. Cette hypothèse est peu probable pour une petite protéine comme l’insuline.

Exemple : dosage de l’insuline libre par différentes techniques sur une population de 31 échantillons sériques contenant des auto-Ac anti-insuline (Sapin, 1997). L’insuline est dosée par deux techniques : • une technique classique par RIA : en mode compétitif avec pour la capture un Ac polyclonal de cobaye. La spécificité est peu satisfaisante : 40 % de réaction croisée avec la pro-insuline ; • une technique immunométrique non compétitive (IMx Abbott). L’utilisation de deux Ac monoclonaux pour la capture et le marquage (par la PAL) améliore nettement la spécificité (pas de réaction croisée avec la pro-insuline). (Les auto-Ac anti-insuline des patients sont spécifiquement dosés après combinaison à de l’insuline* radio-marqué, précipitation de l’IC* et comptage). Les résultats sont comparés à ceux obtenus pour le dosage de l’insuline dite libre (non liée aux auto-Ac et biologiquement active) qui est dosée par RIA après précipitation sélective des IC insuline-auto-Ac du patient par du PEG 6000. Par rapport à l’insulinémie libre les résultats obtenus par les deux techniques RIA et immunométriques sont toujours faussement surévalués et la surévaluation est corrélée avec le taux d’auto-Ac. Explications : • pour le dosage par RIA : l’insuline* marquée est en équilibre avec deux Ac différents (l’Ac exogène de cobaye pour la capture et l’auto-Ac). En conséquence la quantité totale de traceur fixé aux deux Ac augmente mais celle fixée à l’Ac de capture diminue. Après lavage la radioactivité mesurée sur la phase solide est plus faible induisant une lecture par excès ; • pour le dosage de type sandwich : l’insuline liée aux autoAc serait déplacée (partiellement ou totalement) par l’affinité supérieure des Ac du kit et dosée comme de l’insuline libre. Cette hypothèse implique que la surévaluation est dépendante de l’affinité des Ac inclus dans le coffret de dosage.

■ Interférences par des Ac anti-Ig animales

Le sens du biais analytique dépendra de la spécificité des Ac antiIg animales de l’échantillon, i.e. anti-isotypes ou anti-idiotypes, et des caractéristiques des réactifs Ac du coffret de dosage. • Ac anti-isotypes, e.g. anticorps anti-Fc hétérologue. – Si les deux Ac du coffret de dosage proviennent de la même espèce, e.g. Ac monoclonal de souris, le résultat final sera faussement augmenté par formation de sandwichs surnuméraires (figure 12). Dans ce cas les deux paratopes de l’Ac interférant établissent un pont entre des isotypes (par définition identiques) portés par les deux Ac du coffret de dosage. – Si les Ac du coffret de dosage proviennent de deux espèces différentes la fixation de l’Ac interférant sur un seul des deux Ac

+

Insuline

Auto-Ac anti-insuline

Figure 11

■ Déplacement de l’insuline liée à son auto-Ac par fixation de l’insuline libre par les réactifs Ac du kit.

31

4557_2_.book Page 32 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

•

Ac interférant anti-isotype

•

– – – Figure 12

■ Formation de sandwichs surnuméraires par des Ac anti-isotypes.

Ces sandwichs peuvent théoriquement se former lorsque les deux réactifs Ac du kit proviennent de la même espèce (e.g. deux Ac monoclonaux de souris) et ce, quelle que soit leur spécificité. NB : ces sandwichs peuvent aussi théoriquement se former avec des Ac interférents anti-idiotypes. Dans ce cas les deux réactifs Ac du coffret sont strictement identiques, i.e. AMC d’une même espèce et même spécificité (voir exemple ci-après pour le dosage de l’OC 125).

réactifs peut, par encombrement stérique, diminuer la fixation de l’analyte et entraîner un résultat final faussement diminué. • Ac anti-idiotypes : selon la conception des coffrets de dosage, l’Ac interférent peut reconnaître un seul ou les deux Ac impliqués dans le sandwich. – Si l’Ac interférent ne reconnaît que les idiotopes d’un seul Ac du coffret (cas ou le kit est composé de deux Ac monoclonaux différents) et si l’Ac interférant est en excès relatif par rapport à l’Ac du coffret, on observera un biais par défaut par neutralisation d’un des Ac du coffret. – Si les deux Ac monoclonaux du coffret sont identiques (cas ou l’analyte à doser possède 2 épitopes identiques et à distance), on observera un biais par excès par formation de sandwichs surnuméraires non spécifiques de l’Ag.

Exemple : dosage du CA125 avec l’Ac monoclonal OC125 : l’Ac humain anti-idiotype de souris se comporte comme une molécule de CA125 possédant 2 épitopes identiques. L’interférence disparaît, si l’on change la spécificité de l’un des Ac monoclonaux du coffret.

5.2.3. Mise en évidence et élimination des interférences par les Ac Ces interférences sont d’une façon générale révélées par l’observation de discordances entre le résultat attendu et les signes cliniques ou encore par des tests anormaux de dilution ou de surcharge de l’échantillon (ce qui suppose que l’on soit déjà alerté). ■ Dans le cas d’Ac antianalyte

• La présence d’auto-Ac peut être démontrée par l’addition de l’analyte* marqué, puis précipitation du l’IC [auto-Ac-analyte*],

32

soit par du PEG 6000 ou par du sulfate d’ammonium, soit par un 2e Ac anti-Ig humaine ou par de la protéine A. La mesure de la radioactivité du traceur précipité démontre l’interférence. La suppression de l’interférence peut être obtenue par élimination préalable des IC du sérum du patient (e.g. élimination des complexes insuline-(anti-insuline) pour le dosage de l’insuline libre). Dans les dosages de type compétitif, pour éviter la capture du traceur par l’auto-Ac, on peut opérer en mode séquentiel, e.g. pour le dosage de l’insuline : 1 : incubation de l’échantillon avec l’Ac de capture ; 2 : lavage pour éliminer les auto-Ac de l’échantillon ; 3 : ajout du traceur.

■ Dans le cas d’Ac anti-Ig animales

• La présence de ces Ac est démontrée par comparaison des résultats avant et après élimination des Ig de l’échantillon. Mais cette démarche n’est pas envisageable en première intention. • La suppression de l’interférence est obtenue : – pour les dosages de type compétitifs en changeant d’espèce pour l’Ac de capture ; – pour les dosages de type non compétitifs cette solution est quasi inenvisageable, car les Ac monoclonaux sont en majorité produits chez la souris. Dans ce cas, et seulement lorsque les Ac interférents sont des anti-idiotypes, il est conseillé de changer la spécificité des réactifs Ac du coffret ; – il est aussi conseillé de ne pas utiliser le même Ac monoclonal pour un diagnostic ou un traitement in vivo et pour le dosage in vitro ; – pour limiter la production de ces Ac interférents beaucoup d’espoirs sont fondés sur la production d’Ac chimériques Homme-Souris et d’Ac humanisés, pour un usage aussi bien in vivo qu’in vitro. Mais des interférences sont encore possibles en présence d’Ac anti-idiotypes (voir l’encadré ci-dessous) ; – pour neutraliser ces Ac la plupart des kits actuels contiennent des Ig « non immunes », de préférence de la même espèce que les Ac inclus dans le coffret (figure 13) ou encore, d’espèce différente, car il existe des RC inter espèces pour les Ac anti-Ig animales.

5.3.

Interférence par excès d’Ag : effet crochet « hook effect »

Cette interférence, qui peut induire une sous-évaluation de la concentration en analyte de plusieurs puissances de 10, est consécutive à un large excès d’Ag par rapport aux Ac du coffret de dosage. Elle est observée, surtout pour les dosages de type sandwich en une étape (addition simultanée de l’échantillon et des réactifs) et pour des analytes susceptibles de varier dans un large intervalle de concentration (AFP, hCG, PSA, CA125, ferritine, PRL, TSH…). L’excès d’Ag à doser sature chacun des Ac réactifs empêchant ainsi la formation du sandwich (figure 14 et tableau 3). Le passage à un dosage en deux étapes devrait théoriquement supprimer le crochet, et faire évoluer l’aspect de la courbe vers une hyperbole. En pratique cet objectif n’est pas toujours atteint.

4557_2_.book Page 33 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Dosage des marqueurs biologiques par immunoanalyse

Un cas de TSH faussement augmentée dans un dosage de type sandwich conçu avec un Ac chimérique

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Une patiente de 51 ans atteinte d’hypothyroïdie primitive est traitée au long cours par de la T4. Le traitement semble équilibré comme le confirme l’état cliniquement euthyroïdien de la patiente et la valeur de la T4 libre à 20,5 pmol/L comprise dans l’intervalle de référence de la technique (12,2-23,2 pmol/L). Mais la valeur de la TSH à 5,4 mUI/L (intervalle de référence : 0,4-4 mUI/L) mesurée par une technique sandwich sur l’Elecsys 2010 (Roche) et confirmée sur d’autres prélèvements est paradoxalement trop élevée. Devant ce résultat inattendu, la TSH est contrôlée par deux autres techniques sandwich installées sur l’Advia Centaur (Bayer) et l’Architect (Abbott). Les résultats rendus par les deux automates à 0,51 et 0,27 mUI/L confirment le bon état clinique et biologique de la patiente. À l’origine des valeurs trop élevées de TSH on peut évoquer la présence d’auto-Ac antiTSH, mais un test de précipitation par de la TSH* marquée en présence de PEG s’avère négatif. La seconde hypothèse serait la présence chez la patiente d’Ac anti-Ig de souris ou d’Ac hétérophiles. Le dosage sandwich sur l’Elecsys, réalisé en une étape, utilise pour la capture un Ac monoclonal de souris biotinylé et pour la révélation un Ac chimérique (Fc humain et Fab monoclonal de souris) marqué par du ruthénium complexé. Les dosages sandwich sur les deux automates de contrôle se font en une ou deux étapes à partir d’Ac polyclonal de chèvre ou monoclonal de souris pour la capture et monoclonaux de souris pour le marquage. Compte tenu de la composition du coffret, l’hypothèse la plus probable à l’origine du biais positif serait la présence chez la patiente d’Ac anti-Fab de souris (anti-idiotype ?) réagissant avec des idiotopes présents uniquement sur les Ac de souris du coffret Elecsys. Cette hypothèse est confirmée par la suppression de l’interférence après incubation (selon les recommandations du fabricant) avec un réactif neutralisant contenant des Ig de souris non spécifiques. La valeur obtenue pour la TSH après ce traitement est de 0,62 mUI/L à comparer à 5,4 mUI/L avant traitement…

Ce phénomène serait dû à la fixation non spécifique, par des liaisons de faible affinité, de l’Ag en excès sur l’Ac de capture ou sur la phase solide. Il en résulte au cours de la 2 e étape une séquestration non spécifique du traceur qui est suivie de son élimination au cours du deuxième lavage. • Comment limiter cet effet crochet ?

• Doser l’analyte selon un schéma séquentiel en deux étapes : 1) ajout de l’échantillon, puis lavage (pour éliminer l’éventuel excès d’analyte non fixé à l’Ac de capture) ; 2) ajout du traceur. Ainsi l’effet crochet de la courbe de calibration est remplacé par une courbe tendant vers un maximum lorsque l’Ac de capture est saturé par l’analyte. Mais ce protocole en deux étapes complique la mise au point pour les automates. • Doser sur plusieurs dilutions pour les prélèvements à risque. • Diminuer le volume d’échantillon ou augmenter la pré-dilution, mais cela diminue également la sensibilité du dosage.

• Redoser systématiquement les échantillons dont le signal, supérieur à une certaine valeur, se situe dans la zone à risque d’effet crochet sur la courbe de calibration, e.g. dont le premier résultat est situé entre les points n et n-i de la gamme étalon. • Augmenter la plage des concentrations dosables sans effet crochet en augmentant les quantités en réactifs Ac et en sélectionnant des Ac monoclonaux à forte affinité.

5.4.

Autres types d’interférences (liste non exhaustive)

Les interférences qui viennent d’être décrites sont les plus classiques mais elles sont loin d’être exhaustives. En IA, de nombreuses autres interférences sont susceptibles de se produire, en pratique à toutes les étapes du processus analytique, e.g. la réaction Ag/Ac, la formation du signal, la quantification du signal… Voici quelques exemples brièvement commentés.

33

4557_2_.book Page 34 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Tableau 3

[ACE] μg/L

■

Quelques exemples d’effet crochet (Selby, 1999).

Type de dosage

Valeur lue (effet crochet)

Valeur vraie (lue après dilution)

Type de dosage

PSA (ACS : 180™)

200 µg/L

33 000 μg/L

Sandwich en une étape

hCG (ACS : 180™)

600 UI/L

2 500 000 UI/L

Sandwich en une étape

CA 125 (CIS ELISA™)

375 kU/L

3 520 kU/L

Sandwich en une étape

300

200

100

0 0

Figure 13

1 2 3 Log [IgG de souris non spécifique, μg] ■

4

Dosage de l’ACE.

Diminution et suppression du biais par excès, exercé par des Ac humains anti-Ig de souris (HAMA), en fonction d’ajouts croissant d’Ig de souris non spécifiques.

5.4.1. Interférences par certaines protéines endogènes • Facteur rhumatoïde : ce sont des auto-Ac habituellement de classe IgM, dirigés contre le fragment Fc des IgG, qui sont présents dans le sérum de patients atteints de diverses pathologies auto-immunes et à plus faible concentration dans le sérum d’environ 5 % des individus sains.

• Quelles en sont les conséquences ? – Pour les dosages de type compétitif : risque de résultat par excès par moindre fixation de l’Ag* traceur du fait de l’encombrement stérique. – Pour les dosages de type sandwich : risque de résultat par excès par établissement de ponts entre les deux Ac du coffret. – Pour diminuer ce type d’interférences il est conseillé d’utiliser pour les Ac du coffret, des fragments Fab plutôt que la molécule complète d’Ig. • Albumine : elle peut interférer par sa forte concentration et/ou ses capacités de liaison de nombreux haptènes (médicaments, hormones…). • Complément : ce système de protéines peut se fixer sur le fragment Fc des IgG de manière analogue au facteur rhumatoïde.

Signal mesuré (2)

(1) Log [Ag]

A

Figure 14

■

B

Effet crochet.

14A courbe (1) – L’aspect en cloche de la courbe représente un effet crochet classiquement observé pour les dosages non compétitifs en une étape (mise en contact simultanée de l’échantillon et des deux réactifs Ac). En excès d’Ag (partie décroissante de la courbe) les sites des Ac de capture et des Ac traceurs sont occupés par des molécules d’Ag différentes (14 B). Il en résulte une diminution des sandwichs formés et donc du signal. 14A courbe (2) – Au cours d’un dosage en deux étapes l’Ag libre en excès par rapport à l’Ac de capture est éliminé au cours de l’étape de lavage. Il ne peut donc pas théoriquement empêcher la formation des sandwichs avec l’Ac traceur qui est ensuite introduit. La courbe tend vers un plateau traduisant la saturation par l’Ag, des paratopes de l’Ac de capture.

34

4557_2_.book Page 35 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Dosage des marqueurs biologiques par immunoanalyse

5.4.2. Interférences par anomalies quantitatives des protéines de liaison Ce type d’interférences concerne principalement les dosages d’hormones et autres haptènes qui, dans le plasma, sont en équilibre entre une fraction libre biologiquement active et une fraction liée à leur protéine de liaison. Toute variation, quantitative et primitive, de la protéine de liaison d’un haptène induira selon la loi d’action de masse une variation secondaire des formes libres et liées de cet haptène. Parmi les principales protéines concernées par ce comportement on peut citer : l’albumine, la préalbumine, et les nombreuses protéines de liaison d’hormones et autres messagers, e.g. « thyroxine binding globulin » (TBG)… Les problèmes rencontrés dépendront de la finalité du dosage : dosage de l’hormone libre ou de l’hormone totale. • Dosage de l’hormone libre. La mesure de l’hormone libre permet d’évaluer le véritable statut. Parmi les impératifs expérimentaux à respecter on peut noter que : – Les conditions opératoires doivent respecter l’équilibre in vivo entre les formes libres et liées. – Le traceur ne doit pas se fixer sur la protéine de liaison donc doit posséder plus d’affinité pour l’Ac de capture que pour la protéine de liaison (par exemple des variations en TBG peuvent induire un biais dans le dosage de la T 4 par affinité différentielle du traceur T4* entre l’Ac de capture et la TBG). En pratique ces deux objectifs sont plus ou moins atteints. – Enfin certaines molécules peuvent déplacer l’analyte de sa protéine de liaison et induire ainsi une augmentation apparente de la fraction libre, e.g. déplacement de la thyroxine (T4) fixée sur l’albumine par les acides gras libres. • Dosage de l’hormone totale. Il faut au préalable déplacer l’hormone de sa protéine de liaison et empêcher le traceur de s’y fixer.

5.4.3. Interférences par anomalies qualitatives des protéines de liaison

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Celles-ci peuvent modifier la concentration en hormone totale, à la hausse ou à la baisse, en fonction des variations de leur constante d’affinité, e.g. hyperthyroxinémie par augmentation de la constante d’affinité de certaines isoformes de l’albumine pour la thyroxine.

5.5.

Problèmes liés à la standardisation

• Le but d’une bonne standardisation est d’obtenir pour un même échantillon des résultats comparables dans le temps (reproductibilité intra-laboratoire) et dans l’espace (reproductibilité inter-laboratoires). • Pour tendre vers cet objectif il faut harmoniser les méthodes et les réactifs et en outre mettre en œuvre d’un contrôle de qualité intra- et inter-laboratoire (aux niveaux national et international). La très grande diversité des procédures et réactifs pour un même analyte à doser rend l’atteinte de cet objectif quasiment utopique. On peut toutefois s’en approcher par la définition d’un étalon international (IS).

• Prérequis pour un étalon idéal

• Identité structurale entre l’analyte à doser et l’étalon. – Cet objectif est facilement atteint pour les haptènes et analytes de structure parfaitement définie, e.g. hormones stéroïdiennes et thyroïdiennes. La masse molaire de l’étalon étant parfaitement définie les concentrations seront exprimées en unités molaires. – En revanche pour les macromolécules, e.g. glycoprotéines, qui sont hétérogènes au plan structural, cet objectif est en pratique impossible à atteindre. La composition de l’analyte à doser est ici mal définie et en outre susceptible de varier en fonction des situations physiopathologiques. La définition de l’étalon est donc forcément arbitraire avec pour conséquence une grande variabilité des résultats inter-laboratoires en fonction du choix effectué mais aussi de la spécificité des réactifs Ac. Pour les dosages les plus fréquents la préparation des étalons est confiée à des organismes internationaux (« National Institute for Biological Standards and Controls : NIBSC ») ; la décision finale étant le fruit d’un consensus entre les nombreux groupes de travail qui collaborent avec cet organisme comme le démontre l’exemple de l’HCG (Stenman, 2004). On distingue plusieurs types de préparations internationales : – « International Standard » (IS) : ce sont des préparations plus ou moins purifiées (destinées à l’origine aux dosages biologiques), dosées par un large éventail de méthodes dans les laboratoires du groupe de travail. Ces étalons sont calibrés en unités internationales (UI) : une UI correspond à la masse d’IS contenant une activité biologique définie. – « International Reference Preparation » (IRP) : par rapport à un IS, l’IRP est une préparation purifiée destinée aux IA. – Étalons secondaires : ces préparations, conçues par les fabricants des coffrets de dosage, sont elles-mêmes étalonnées par rapport aux étalons de référence IS ou IRP. • Identité des propriétés physico-chimiques de la matrice de l’échantillon et de celle de l’étalon. La cinétique de la réaction antigène-anticorps dépend fortement des caractéristiques physicochimiques de l’échantillon. Il convient d’être donc particulièrement vigilant en cas de dilution ou de changement de milieu biologique. Si tous les coffrets de dosage possédaient la même spécificité, i.e. les mêmes Ac monoclonaux et le même étalon, la concordance des résultats inter- et intra-laboratoires pour un même échantillon serait satisfaisante. La réalité est malheureusement différente et des écarts importants sont observés en fonction de la composition des coffrets.

6 ■■ AUTOMATISATION DE L’IMMUNOANALYSE Les marqueurs biologiques sont le plus souvent dosés sur des automates, qui au fil des années et compte tenu de l’évolution permanente des techniques, doivent répondre à un nombre croissant de critères (Gruson 1998) : – un grand choix pour les analyses en ligne avec un débit élevé ; – interface conviviale et compatibilité avec l’informatique du laboratoire ;

35

4557_2_.book Page 36 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

– accès libre (en continu) des analyses ; – prélèvement sur tubes primaires avec identification par code à barres, bonnes sensibilités et précision ; – micro-prélèvements et faible consommation de réactifs ; – limite de détection faible et bonne précision ; – pas de contamination inter-tubes ; – détection des caillots et des bulles ; – stabilité de la calibration au cours du temps et contrôle de qualité intégré ; – grande capacité de stockage des réactifs et échantillons et stockage dans une aire réfrigérée ; – traçabilité : identification et gestion automatisée des réactifs ; – redilution automatique si nécessaire. Ces exigences sont globalement satisfaites par les automates actuels de biochimie générale. Cependant pour les automates dédiés spécifiquement aux IA, des critères additionnels sont requis : – optimiser la conservation avant, pendant et après l’analyse car l’analyte est souvent instable ; – diminuer la consommation des réactifs du fait de leur coût ; – optimiser la stabilité de la courbe de calibration au cours du temps, donc optimiser tous les matériels et réactifs qui participent à cette stabilité, e.g. phase solide, Ac de capture et traceurs, enzymes marqueurs, étalons, réactifs de révélation du traceur ; – vérifier automatiquement la qualité optique de l’échantillon (hémolyse, turbidité…) surtout pour les dosages en phase homogène ; – éviter les contaminations inter-tubes du fait des grandes variations physiopathologiques de certains marqueurs ; – pouvoir passer des analyses en urgence, e.g. tests stat ; – effectuer des tests réflexes pour d’autres analytes en fonction des algorithmes de traitement des résultats ; – vérifier la compatibilité avec l’automatisation et l’informatique générale du laboratoire.

7 ■■ PRINCIPAUX BIOMARQUEURS ACTUELLEMENT DOSÉS PAR IMMUNOANALYSE Pour information nous avons listé ci-dessous les principaux marqueurs pathognomoniques des grandes fonctions et syndromes explorés en biochimie clinique. Cette liste (tableau 4) ne saurait être exhaustive car : • d’une part elle est en évolution permanente ; • d’autre part nous avons volontairement omis : – la longue liste des marqueurs tumoraux qui en soi peut faire l’objet d’un chapitre, – les biomarqueurs dosés dans des disciplines biologiques autres que la biochimie clinique, e.g., hématologie, bactériologie, virologie, immunologie, pharmacie et toxicologie, environnement… Enfin rappelons que la spécificité de certains marqueurs n’est pas totale et qu’à ce titre ils peuvent participer à l’exploration de processus physiopathologiques différents.

36

8 ■■ ÉVOLUTIONS RÉCENTES ET FUTURES DE L’IMMUNOANALYSE Les IA par leur spécificité et sensibilité ont jusqu’à présent occupé une place essentielle dans le marché du diagnostic médical in vitro. Les progrès réalisés dans l’automatisation des IA ont permis à partir des années 1980 une large diffusion de cette technologie vers des laboratoires non spécialisés. Cependant rien n’est jamais définitivement acquis, des évolutions futures sont perceptibles, alimentées par de nouvelles offres technologiques et de nouveaux besoins dans les domaines du diagnostic et de l’économie de la santé. Malgré ses atouts et sa position dominante actuelle, l’IA doit et devra s’adapter pour rester concurrentielle face aux techniques alternatives émergentes. La liste ci-dessous résume les principales tendances qui se dégagent de la littérature pour le futur. • Au niveau du marché : – croissance maintenue pour les tests par IA sur automate, – croissance importante pour les tests au lit du malade, – croissance limitée pour les tests à domicile, – croissance ralentie pour les tests de routine en laboratoire. • Au niveau du choix d’un test : – diminution du coût, – évolution vers des protocoles plus rapides, plus robustes et plus simples, – réalisable de préférence sur sang total et urines, – sensibilité et spécificité accrues (au sens analytique et clinique), – suppression des tests à faible utilité clinique, – orientation vers de nouveaux tests plus performants cliniquement, – automatisation croissante. • Au niveau des fabricants : – concentration du marché, – nouveaux entrants pour la biologie délocalisée, – nouveaux prestataires de service pour des domaines cliniques bien définis. • Au niveau des laboratoires : – concentration en plateformes pluridisciplinaires, – développement des tests en phase homogènes (pas d’étape de séparation), – développement des tests sandwichs applicables aux petites molécules. • Au niveau des méthodes et réactifs : – utilisation croissante en routine de protéines recombinantes, d’Ac monoclonaux et des techniques d’ingénierie d’Ac monoclonaux : – Ac chimériques (substitution des domaines constants murins par les domaines constants humains correspondants), – Ac humanisés (seules les boucles hypervariables murines ont été conservées), – Fragments variables d’Ac, obtenus par génie génétique sous la forme de protéines de fusion. Ces fragments vis-à-vis de l’Ag peuvent être mono- ou multivalents, mono- ou multispécifiques, – Ac conjugués recombinants, associant dans une protéine de fusion le domaine variable d’un Ac et par exemple une enzyme,

4557_2_.book Page 37 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Dosage des marqueurs biologiques par immunoanalyse

Tableau 4

■

Une liste non exhaustive des biomarqueurs actuellement dosés en immunoanalyse.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Fonctions explorées

Paramètres dosés

Fonction thyroïdienne

– Thyréostimuline (TSH) – Tri-iodothyronine et thyroxine (T3 et T4 fraction libre et totale) – Thyroxin-binding globuline (TBG) – Thyroglobuline – Ac anti-récepteur de la TSH – Ac anti-thyroperoxydase – Ac anti-thyroglobuline…

Axe cortico-surrénalien

– Cortisol – Hormone corticotrope ou corticostimuline (ACTH) – Aldostérone – 17-hydroxyprogestérone – Androgènes surrénaliens (ex. : SDHA sulfate de dehydroépiandrostérone)

Métabolisme osseux • Métabolisme phospho-calcique • Remodelage osseux – Formation de l’os – Résorption osseuse

– Métabolites de la vitamine D (25-hydroxy vitamine D, 1,25-dihydroxy vitamine D) – Hormone parathyroïdienne (PTH) – PTH related protein ou PTH-RP – Ostéocalcine – Propeptides C et N terminaux du collagène de type I (PICP et PINP) – Phosphatases alcalines osseuse – Pyridinoline (PYD) et désoxypyridinoline (DPD) libres et totales – Télopeptides N- (NTX) et C- (CTX) terminaux du collagène de type I

Axe gonadotrope et stérilité

– Lutéotropine (LH) – Folliculotropine (FSH) – Prolactine – Inhibine B – Hormone anti-Müllérienne (AMH) – Estradiol – Progestérone – Testostérone (libre et totale) – Dihydrotestostérone – Globuline de liaison des hormones sexuelles SHBG – Δ4-Androstènedione

Grossesse et dépistage trisomie 21

– Alpha fœto-protéine (AFP) – Choriogonadotropine (hCG) – Estriol – Protéine-A plasmatique associée à la grossesse (PAPP-A)

Croissance et déficits de croissance

– Hormone de croissance (GH) – IGF I (insulin-like growth factor I ou somatomédine C) – Protéines de liaison de l’IGF (IGFBP3, …)

Diabète sucré

– Insuline – Pro-insuline – Peptide C – Auto-Ac (anti-insuline, anti-cellules d’ilots de Langerhans, anti-IA2, anti-glutamate décarboxylase) – Adipocytokines (leptine, adiponectine)

Fonction cardiaque

– Isoenzyme de la CK (CKMB) – Troponine (Ic et T) – Isoenzyme III de l’anhydrase carbonique – Apoliproprotéine AI, AII, B, lipoprotéine (a) – Protéine C-réactive ultrasensible (CRP) – Homocystéine totale – Peptide natriurétique du cerveau (BNP) – Fragment N-terminal du pro-BNP (Nt-pro-BNP) – Activateurs et inhibiteurs du plasminogène…

Inflammation/infection

– Protéines de la réponse aiguë de l’inflammation (CRP, orosomucoïde, haptoglobine…) – Procalcitonine (PCT) – Cytokines (interleukine 6, tumor necrosis factor α (TNF-α…)) – Immunoglobulines – Facteurs du complément… Voir suite page suivante.

37

4557_2_05_C02.fm Page 38 Vendredi, 19. août 2011 4:25 16

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Tableau 4

■

Une liste non exhaustive des biomarqueurs actuellement dosés en immunoanalyse (suite).

Fonctions explorées

Paramètres dosés

Bilan nutritionnel

– « Rétinol binding protéine » (RBP) – Préalbumine (transthyrétine)

Bilan martial

– Transferrine (Trf) – Récepteur soluble de la transferrine (rTrf) – Ferritine

– – – – –

– présentation de fragments d’Ac à la surface de phages filamenteux, i.e., phage display. Cette technique vise à obtenir, pour un Ag donné, les fragments d’Ac les plus performants par leur affinité ou leur spécificité, – optimisation de la spécificité et/ou de l’affinité des fragments variables des Ac par des techniques de mutagenèse dirigée in vitro ou in vivo, simplification des protocoles de calibration ; amélioration de la standardisation des coffrets par les fabricants ; utilisation accrue de standards communs pour les fabricants et les utilisateurs ; amélioration de la standardisation de l’ensemble de la démarche analytique ; dosage en parallèle (ou en multiplexe) d’un panel de protéines considérées comme des marqueurs de pathologies diverses. Ces dosages, réalisés sur des biopuces, supposent une miniaturisation des automates faisant appel aux nanotechnologies, à la micro-fluidique et à un traitement bioinformatique pour l’interprétation des nombreuses données obtenues. Le principe réactionnel n’est pas très différent de ceux décrits ci-dessus à propos des méthodes ELISA : l’Ag ou l’Ac de capture fixé sur

– – – – – • – – –

un support capte l’analyte à doser. Après lavage l’immuncomplexe adsorbé est révélé par la fixation d’un conjugué (Ag ou Ac marqué). Les contraintes de la technique multiplexe sont plutôt liées à la définition et au mode de fixation des ligands de capture, à la calibration, aux interférences entre les différents réactifs (Ac, Ag et diluants) et à la compatibilité des différentes limites de détection (Ellington et al., 2010) ; miniaturisation des tests pour économiser les échantillons et réactifs et réduire les déchets ; utilisation accrue des dosages de séquences d’acides nucléiques ; utilisation accrue des dosages sur biocapteurs ; remplacement (quand c’est possible) des IA par des méthodes non invasives ; développement des tests à visée préventive. Au niveau de l’interprétation des résultats : affiner les intervalles de référence (en fonction des souspopulations) ; disposer d’algorithmes pour l’interprétation et de logiciels de calcul de probabilités pour évaluer le risque lié au diagnostic ; mise à disposition par le fabricant d’informations sur Internet.

Références bibliographiques Ellington AA, Kullo IJ, Bailey KR, Klee GK (2010). Antibody-based protein multiplex platforms : technical and operational challenges. Clin Chem, 56 : 186-193. Beaudonnet A, Cohen R (1995). Pièges et problèmes en immunoanalyse. In : Cahier de formation en biologie médicale, (2) : Immunoanalyse : hormones et marqueurs tumoraux. Bioforma, Paris, 15-25. Bjerner J, Nustad K, Norum LF, Olsen KH, Børmer OP (2002). Immunometric Assay Interference : Incidence and Prevention. Clin Chem, 48 : 613-621. Franek M (1987). Structural aspects of steroid-antibody specificity. J Steroid Biochem, 28 : 95-108. Kricka LJ (1999). Human anti-animal antibody interferences in immunological assays. Clin Chem, 45 : 942-56. Kricka LJ, Phil D, Chem C, Path FRC (2006). Principles of immunochemical techniques. In : Tietz Textbook of clinical chemistry and molecular diagnostics. Elsevier Saunders, St Louis, 219-243. Gruson A (1998). Descriptif standardisé des analyseurs de biologie. Version Automate d’Immunoanalyse. Ann. biol. clin, 56 : numéro spécial.

38

Lepage R (2005). Les problèmes de réactivité croisée et d’interférences hétérophiles dans les tests immunologiques. Ann Biol Clin Qué, 42 : 21-29. Price CP, Newman DJ (1997). Principles and practice of immunoassays, Stockton Press, New York. Sapin R (1997). Anti-insulin antibodies in insulin immunometric assays : a still possible pitfall. Eur J Clin Chem Clin Biochem, 35 : 365-7. Selbi C (1999). Interference in immunoassay. Ann Clin Biochem, 36 : 704-721. Stenman UH (2004). Standardization of Assays for Human Chorionic Gonadotropin. Clin. Chem, 50 : 798-800. Thong B, Soldin SJ, Lingwood CA (1985). Lack of specificity of current anti-digoxin antibodies, and preparation of a new, specific polyclonal antibody that recognizes the carbohydrate moiety of digoxin. Clin Chem, 31 : 1625-1631. Wild D (third edition, 2005). The immunoassay handbook, Elsevier, Londres.

4557_2_.book Page 39 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

3 Enzymologie clinique Jean-Marc Lessinger

1 ■■ CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES SUR L’ENZYMOLOGIE CLINIQUE 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7. 1.8. 1.9.

Les origines et causes de variations des enzymes dans le plasma Sélection d’une enzyme comme marqueur Approches analytiques pour la détermination d’une enzyme Mesure d’une activité enzymatique Expression de la concentration d’activité enzymatique Mesure d’isoenzymes Standardisation en enzymologie clinique Facteurs pouvant affecter l’interprétation des résultats Macroenzymes

2 ■■ EXEMPLES D’ACTIVITÉS ENZYMATIQUES FRÉQUEMMENT DÉTERMINÉES EN PRATIQUE COURANTE

2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 2.6.

Aminotransférases Créatine kinase Lactate déshydrogénase Phosphatase alcaline g-Glutamyltransférase a-Amylase et lipase

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Références bibliographiques

39

4557_2_.book Page 40 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4557_2_.book Page 41 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Enzymologie clinique

es enzymes sont des molécules biologiques qui possèdent une activité catalytique, c’est-à-dire qu’elles augmentent des vitesses réactionnelles, aussi bien in vivo qu’in vitro, alors que celles-ci se dérouleraient lentement en l’absence d’enzyme. Dans l’organisme, si certaines enzymes sont activement sécrétées dans la circulation générale où elles assurent leurs fonctions physiologiques, la plupart d’entre elles ont une localisation intracellulaire et assurent leurs fonctions métaboliques dans différents compartiments subcellulaires et dans différents tissus, certaines réactions pouvant être catalysées, en fonction de leur localisation, par des isoformes différentes d’une même enzyme. Au fil des années, la détermination d’un certain nombre d’activités enzymatiques a pris de l’importance pour améliorer le diagnostic ou suivre l’évolution de nombreuses pathologies, le but étant de définir des changements spécifiques d’un état pathologique ou d’un dommage tissulaire particulier. Au courant des années 50, des augmentations d’activités enzymatiques dans la circulation générale ont été décrites dans de nombreuses pathologies, en particulier cardiaques, musculaires, pulmonaires, hépatiques, pancréatiques, osseuses, hématologiques et cancéreuses (Wolf, 2006). Dans les années qui suivirent, l’enzymologie clinique connut une évolution considérable, tant sur le plan analytique que sur le plan de l’intérêt des enzymes comme marqueurs d’états pathologiques (Reij, 1998). Ainsi, la détermination d’une ou plusieurs enzymes dans le plasma peut donner une indication du tissu ou du type cellulaire dont elles proviennent et les nombreuses évolutions qui ont eu lieu depuis les débuts de l’enzymologie clinique font que les mesures d’activités enzymatiques sont d’un intérêt large en biochimie clinique pour le diagnostic et le suivi évolutif de nombreuses pathologies.

L

1 ■■ CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES SUR L’ENZYMOLOGIE CLINIQUE

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

1.1.

Les origines et causes de variations des enzymes dans le plasma

Les enzymes retrouvées dans le plasma font partie de deux groupes différents : celles qui sont spécifiquement plasmatiques et celles qui ne le sont pas. Les enzymes spécifiquement plasmatiques ont une fonction dans le plasma qui est leur lieu d’action normal. Il s’agit par exemple des enzymes de la coagulation, de la rénine, de la lipoprotéine lipase, qui sont libérées physiologiquement dans le plasma pour y assurer leurs rôles. À l’inverse, les enzymes non plasmatiques n’y ont pas de rôle physiologique et leur concentration y est bien plus faible qu’au sein des tissus où elles exercent leur activité. Leur présence en faible concentration dans la circulation générale résulte du renouvellement cellulaire normal, mais la concentration plasmatique de certaines d’entre elles est susceptible d’augmenter dans certaines circonstances pathologiques. Ce sont ces activités enzymatiques dont la mesure présente un intérêt en enzymologie clinique. Ce groupe d’enzyme peut être divisé en deux

sous-groupes : les enzymes de sécrétion et les enzymes du métabolisme intermédiaire. Les enzymes de sécrétion proviennent de glandes exocrines et peuvent avoir un intérêt clinique lorsque leur concentration plasmatique augmente ou diminue. Des activités enzymatiques élevées sont retrouvées lorsque leur mode d’excrétion usuel est bloqué ou lorsque la quantité d’enzyme produite est augmentée. Des diminutions de ces enzymes sont retrouvées lorsque les tissus qui les produisent présentent des diminutions d’aptitude fonctionnelle. L’amylase et la lipase pancréatiques font par exemple parti de ce premier sous-groupe. Les enzymes du métabolisme cellulaire présentent de fortes concentrations intratissulaires, plusieurs centaines voire plusieurs milliers de fois plus élevées que celles retrouvées dans la circulation générale. Des dommages cellulaires résultant d’une altération de la perméabilité membranaire (cytolyse) ou d’une nécrose entraînent un changement brutal de leurs concentrations dans le plasma. Des exemples d’activités enzymatiques fréquemment déterminées en pratique courante sont la créatine kinase (CK), la lactate déshydogénase (LDH), l’alanine aminotransférase (ALT) et l’aspartate aminotransférase (AST). Du fait de la très forte concentration intracellulaire en enzymes et de la possibilité d’en détecter de faibles quantités par leur activité catalytique, l’augmentation d’une activité enzymatique dans le plasma est un indicateur très sensible, même de dommages cellulaires minimes. Elle est à mettre en rapport avec une rupture de l’intégrité de la membrane cellulaire qui peut avoir de nombreuses causes, telles que par exemple une hypoxie tissulaire, une infection ou une inflammation. La vitesse et l’importance de l’augmentation d’une enzyme dans la circulation générale dépendent d’un certain nombre de facteurs, dont l’importance du gradient de concentration entre le milieu intracellulaire et le milieu extracellulaire. La localisation intracellulaire de l’enzyme affecte également sa vitesse d’apparition dans la circulation générale. Ainsi, une enzyme localisée au niveau de la membrane plasmique ou dans le cytosol est un indicateur plus sensible de dommages cellulaires qu’une enzyme localisée dans un compartiment sub-cellulaire comme la mitochondrie, qui sera libérée plus tardivement. Cependant, la présence dans le plasma d’enzymes d’origine mitochondriale est le reflet de lésions cellulaires plus importantes. L’augmentation d’une enzyme dans le plasma peut également être la conséquence d’une augmentation de la prolifération et de l’activité de cellules qui la synthétise. À titre d’exemple, une augmentation du nombre et de l’activité des ostéoblastes est responsable d’une augmentation de la concentration d’activité phosphatase alcaline d’origine osseuse, observée en période de croissance osseuse physiologique ou lors de pathologies affectant le remodelage osseux. De même, vers la fin de la grossesse, le placenta constitue une nouvelle source de phosphatase alcaline qui contribue à une augmentation de l’activité phosphatase alcaline totale dans la circulation maternelle. Concernant toujours cette même activité enzymatique, une obstruction biliaire stimule sa production par le foie et est à l’origine d’une augmentation de l’activité phosphatase alcaline dans de nombreuses pathologies hépatobiliaires. Un autre exemple d’induction enzymatique est celui de la γ-glutamyltransférase, dont une activité

41

4557_2_.book Page 42 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

plasmatique élevée peut résulter de la prise de médicaments tels que le phénobarbital ou la phénytoïne, ou d’une consommation excessive d’éthanol. Il est à noter que certaines activités enzymatiques peuvent être élaborées par des cellules tumorales et être ainsi relarguées dans le plasma en quantité importante (Schwartz, 1973). Même si le suivi de pathologies tumorales inclut la détermination de marqueurs tumoraux plus spécifiques de cancers (voir par ailleurs), certaines activités enzymatiques restent encore fréquemment déterminées de façon simultanée à ces marqueurs. Par ailleurs, la découverte d’une activité enzymatique augmentée dans le plasma peut parfois être une circonstance de découverte d’une pathologie maligne.

1.2.

Sélection d’une enzyme comme marqueur

Le choix d’un marqueur enzymatique à déterminer dans le plasma à des fins diagnostiques ou pronostiques dépend d’un certain nombre de facteurs. Un facteur important est la distribution d’une enzyme donnée dans des tissus différents. Par ailleurs, la masse que représente l’organe atteint, associée à l’importance du gradient de concentration entre les cellules et le plasma, influence de façon fondamentale le degré d’augmentation de l’enzyme dans la circulation générale. Cependant, un des désavantages majeurs de l’utilisation d’une enzyme pour le diagnostic d’un dommage tissulaire est bien souvent son manque de spécificité vis-à-vis d’un tissu ou d’un type cellulaire particulier. La majorité des enzymes sont effectivement présentes dans plusieurs tissus différents et il en résulte qu’une augmentation d’une enzyme donnée dans le plasma peut être le reflet d’un dommage de l’un quelconque de ces tissus. Ce problème peut être contourné de différentes façons. Des tissus différents peuvent contenir des enzymes identiques, mais dans des proportions variables. Ainsi par exemple, l’aspartate aminotransférase et l’alanine aminotransférase sont deux enzymes présentes en particulier dans le muscle cardiaque, le muscle squelettique et les hépatocytes. Cependant, l’alanine aminotransférase n’est présente qu’en faible quantité dans les cellules musculaires, au contraire des hépatocytes dont le cytosol contient une quantité plus élevée d’alanine aminotransférase. D’une façon générale, la différence de répartition des enzymes en fonction des tissus peut être mise à profit dans l’association de la détermination d’enzymes différentes, pour l’exploration biologique d’un organe particulier. Une autre approche pour améliorer la spécificité de l’enzymologie clinique est liée à l’existence de formes multiples d’enzyme et consiste à s’intéresser à des isoformes particulières d’une enzyme donnée, en fonction de leurs spécificités tissulaires. En effet, une activité catalytique donnée est fréquemment due à l’existence de plusieurs formes d’une même enzyme, plutôt qu’à un seul type de molécule d’enzyme. Ces différentes formes d’enzyme qui catalysent la même réaction peuvent présenter des différences de propriétés physicochimiques, mais également des différences de propriétés catalytiques. Si le terme « d’isoenzymes » est généralement réservé à des formes d’enzymes formées de sous-unités codées par des gènes différents, des isoformes d’une même enzyme peuvent également être dues à des modifications post-

42

traductionnelles. Toujours est-il que la présence de formes multiples d’enzymes dans les tissus, qu’elles soient d’origine génétique ou non, a d’importantes implications dans l’étude de pathologies différentes, du fait de spécificités d’organes permettant d’améliorer la sensibilité et la spécificité cliniques de la mesure d’enzymes. Ainsi, des changements d’activités enzymatiques sont suivis dans le plasma, car les enzymes sont des constituants primitivement intracellulaires et sont libérées après des dommages tissulaires ou des morts cellulaires spécifiques d’un organe ou d’un tissu. Ces changements qui surviennent lors de nombreuses pathologies peuvent être suivis par le dosage de différentes enzymes ou isoenzymes dans les heures ou les jours qui suivent. Cependant, il reste primordial de rappeler que le diagnostic d’une pathologie est basé sur l’association d’un examen clinique à d’autres examens complémentaires. Dans ce contexte, les résultats d’activités enzymatiques doivent être associés à ceux d’autres marqueurs biologiques pour leurs interprétations.

1.3.

Approches analytiques pour la détermination d’une enzyme

Toutes les enzymes sont des protéines qui ont la particularité de posséder une activité catalytique. Comme toute protéine, leur antigénicité est susceptible de donner lieu à la production d’anticorps spécifiques pour le développement de méthodes immunométriques pour leur détermination. Ces méthodes mesurent la concentration d’enzyme en tant que protéine (en concentration de masse) et non son activité catalytique. Des méthodes immunométriques permettent également la mesure d’isoenzymes par les différences structurales qu’elles présentent (voir paragraphe 1.6.). Cependant, la plupart des méthodes employées dans la pratique courante utilisent leur propriété de catalyseur biologique, un nombre donné de molécules d’une enzyme permettant la conversion d’un nombre considérable de molécules de substrat en produit réactionnel dans un intervalle de temps court. Ainsi, une augmentation de la quantité d’enzyme dans la circulation générale peut être détectée avec une grande sensibilité, même si la quantité de « protéine enzyme » libérée par les cellules correspond à une concentration plasmatique faible (de l’ordre du milligramme, voire du microgramme par litre).

1.4.

Mesure d’une activité enzymatique

1.4.1. Considérations générales La détermination d’une activité enzymatique consiste en la mesure d’une vitesse réactionnelle qui peut être suivie par la consommation de substrat par unité de temps (– dS/dt) ou par la vitesse d’apparition d’un produit de réaction (+ dP/dt). k

k

1 2 E + S ⎯⎯ ⎯ → ES ⎯ ⎯ ⎯ → E +P ←⎯ ⎯⎯

équation (1)

k −1

La quasi-totalité des méthodologies utilisées en enzymologie clinique permettent de suivre l’évolution de la cinétique réactionnelle par des mesures de signaux analytiques effectuées à des intervalles de temps définis. Ces mesures en cinétique sont

4557_2_.book Page 43 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Enzymologie clinique

possibles à chaque fois qu’un substrat ou qu’un produit de réaction présente une propriété analytique qui est mesurable dans les conditions de déroulement de la réaction. Elles sont réalisées le plus souvent en spectrophotométrie par un suivi de changement d’absorbance à une longueur d’onde caractéristique du constituant à mesurer. D’une façon générale, la vitesse réactionnelle, mesurée en excès de substrat, n’est pas constante en fonction du temps. Une phase de délai (ou « lag phase ») est fréquemment observée en début de cinétique réactionnelle, correspondant en spectrophotométrie à une variation d’absorbance par unité de temps plus faible lors du mélange des constituants du milieu réactionnel et du temps nécessaire pour atteindre l’équilibre thermique. Cette phase de délai peut être largement réduite par une incubation préalable des réactifs à la température de mesure. Elle est suivie d’une phase linéaire au cours de laquelle le changement d’absorbance par unité de temps est maximal et constant, puis, finalement, par une phase de déplétion de substrat au cours de laquelle on observe une décroissance du signal analytique. Ces trois phases sont représentées dans la figure 1. La mesure d’une activité enzymatique doit être réalisée pendant la phase linéaire, après la phase de délai et avant la phase de déplétion en substrat. Dans ces conditions, la vitesse réactionnelle (en spectrophotométrie, ΔA/Δt) est proportionnelle à la concentration en enzyme présente dans le milieu réactionnel (figure 2). Comme pour tout constituant, la relation entre le signal analytique mesuré (la vitesse réactionnelle) et la concentration en enzyme présente une limite supérieure de linéarité. Par ailleurs, il est important de souligner que si une enzyme se trouve en concentration trop élevée, le risque est d’atteindre de façon précoce la zone de déplétion en substrat, simulant une concentration

Quantité de produit formé

Quantité de produit formé

Phase de déplétion en substrat

Phase linéaire V = f([E])

Phase de délai

Temps

Figure 1

■

Cinétique d’une réaction enzymatique.

Pendant la phase linéaire qui suit une phase de délai, la vitesse réactionnelle (pente de la courbe) est maximale et est fonction de la concentration en enzyme présente.

d’activité enzymatique trop faible pendant la période de mesure de la variation du signal (figure 2). Pour éviter ce piège analytique, les automates de biochimie modernes comparent par exemple l’écart entre deux mesures d’absorbance précoces, avant la zone d’acquisition des mesures, pour détecter un risque d’excès de consommation de substrat. Face à une telle situation, deux solutions peuvent être adoptées : une prédilution du spécimen à analyser ou l’ajout d’une prise d’essai plus faible. Il est à noter que pour des concentrations d’activité enzymatique très fortement

Vitesse réactionnelle

5

4

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

4

3

3

2

2

1

1 A

Figure 2

Temps ■

B

Limite supérieure de linéarité Concentration en enzyme

Influence de la concentration en enzyme sur la vitesse réactionnelle.

A, Les courbes, numérotées de 1 à 4, correspondent à des concentrations croissantes en enzyme. Au fur et à mesure de l’augmentation de la concentration en enzyme, la durée de la phase de délai diminue, la pente de la phase linéaire augmente mais sa durée diminue et la phase de déplétion en substrat apparaît plus précocement. B, la pente de la phase linéaire est proportionnelle à la concentration en enzyme, jusqu’à une certaine valeur définissant la limite supérieure de linéarité. À noter qu’une concentration en enzyme très élevée (A, courbe n° 5) peut s’accompagner d’une variation de signal très faible dans la fenêtre de mesure d’un automate d’analyse (délimitée par les traits en pointillés), puisqu’elle correspond dans ce cas à la zone de déplétion en substrat, indiquant la nécessité de disposer d’alarmes basées sur des mesures précoces, avant la zone de mesure de l’activité enzymatique.

43

4557_2_.book Page 44 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

augmentées, la limite de linéarité de la dilution dans une solution saline peut être atteinte en raison d’une instabilité de l’enzyme. C’est le cas par exemple pour la lipase dosée dans du suc pancréatique, pour laquelle on peut être amené à réaliser des dilutions en milieu albumineux. Un certain nombre de réactions enzymatiques utilisées en enzymologie clinique s’accompagnent de la conversion de NAD(P)+ en NAD(P)H,H+, ou vice versa. Les formes oxydées ou réduites de ce coenzyme présentent des propriétés spectrales différentes. En particulier, le spectre d’absorption de la forme réduite montre un maximum d’absorbance à 339 nm, alors que la forme oxydée n’absorbe pas la lumière aux alentours de cette longueur d’onde. Ainsi, des schémas réactionnels aboutissant à la conversion d’une forme en l’autre forme peuvent être aisément suivis à cette longueur d’onde. Les réactions s’accompagnant de la formation de NAD(P)H,H+ seront suivies par une augmentation d’absorbance à 340 nm, alors que celles s’accompagnant d’une consommation de NAD(P)H,H+ seront suivies par une diminution d’absorbance à 340 nm. Dans certains cas, il peut être nécessaire de coupler la réaction catalysée par l’enzyme à mesurer à une deuxième réaction, catalysée par une autre enzyme (ajoutée en excès dans le milieu réactionnel) qui utilise le produit de la première réaction comme substrat. Lors de cette deuxième réaction, la consommation d’un cosubstrat (également présent en excès) ou l’apparition d’un produit est directement mesurable en spectrophotométrie. Cette deuxième réaction, appelée réaction indicatrice, permet par ailleurs de déplacer l’équilibre réactionnel de la première, en consommant son produit de réaction. Des réactions d’oxydo-réduction utilisant le système NAD+/NADH,H+ (ou NADP+/NADPH,H+) sont fréquemment utilisées comme réaction indicatrice selon le schéma : E1

A ⎯⎯→ B B + NAD(P)H,H+ ⎯ ⎯→ BH2 + NAD(P)+ E2

,

où : – E1 est l’enzyme à doser ; – A, NAD(P)H,H+ et E2 sont présents en excès dans le milieu réactionnel. La réaction indicatrice peut aller dans le sens de la consommation ou de la formation de NAD(P)H,H +. Il est à noter que certains principes réactionnels utilisés pour le dosage d’une enzyme font intervenir une réaction intermédiaire entre celle catalysée par l’enzyme à doser et la réaction indicatrice. Ainsi, les mesures d’activités enzymatiques telles que la lactate déshydrogénase, la créatine kinase, l’aspartate aminotransférase et l’alanine aminotransférase sont le plus souvent réalisées à 339 ou 340 nm grâce au système NAD(P)+/NAD(P)H,H+, des réactions couplées étant utilisées pour les trois dernières enzymes (voir plus loin). À côté de ces réactions d’oxydo-réduction, certaines enzymes catalysant une hydrolyse sont mesurées par le suivi de la libération de 4-nitrophénol (ou de dérivé du 4-nitrophénol) comme produit de réaction, dont le maximum d’absorbance se situe vers 405-410 nm. C’est le cas par exemple pour la phosphatase alcaline, la γ-glutamyltransférase et l’α-amylase.

44

1.4.2. Facteurs influençant la réaction L’activité catalytique d’une enzyme est une propriété mesurée par la vitesse d’une réaction dans des conditions définies. L’objectif analytique de l’enzymologie clinique est que la vitesse réactionnelle mesurée ne dépende que de la concentration en enzyme présente dans le milieu réactionnel, et que le signal mesuré ne varie finalement qu’en fonction de la concentration en enzyme présente dans le spécimen biologique où elle est déterminée. Plusieurs autres facteurs sont susceptibles d’influencer la vitesse de la réaction, tels que la nature et la concentration du substrat dans le milieu réactionnel, le pH de ce milieu ainsi que la nature du tampon, la présence et la concentration de coenzymes et d’autres effecteurs, et la température de déroulement de la réaction. Ainsi, la méthode de mesure d’une activité enzymatique en enzymologie clinique devra retenir des conditions optimales pour l’ensemble de ces facteurs. ■ Nature et concentration du substrat

La première exigence pour la détermination d’une concentration d’activité enzymatique est d’utiliser un substrat spécifique, qui ne soit transformé que par l’enzyme dont on veut mesurer l’activité. L’affinité de l’enzyme pour ce substrat devra être suffisante, de manière à ce que la vitesse réactionnelle mesurée soit rapide. Pour un substrat donné et dans des conditions réactionnelles définies, la vitesse réactionnelle observée est fonction de sa concentration selon l’équation de Michaelis-Menten :

v=

Vmax × [S] , K M + [S] ⎛ ⎝

où KM est le rapport des constantes d’équilibre ⎜ K M =

k –1 + k 2 ⎞ k1 ⎟⎠

de l’équation (1). KM traduit l’affinité de l’enzyme pour le substrat et correspond à la concentration de substrat pour laquelle on observe la moitié de la vitesse maximale. Comme le montre la représentation graphique de cette équation (figure 3), la vitesse réactionnelle (v) croît avec la concentration en substrat ([S]), pour tendre vers une vitesse maximale (Vmax) en présence d’un large excès de substrat.

Vitesse réactionnelle, v Vmax

1/2 Vmax

v=

KM

Figure 3

Vmax × [S] KM + [S]

Concentration en substrat, [S]

■ Influence de la concentration en substrat sur la vitesse réactionnelle (représentation graphique de l’équation de MichaelisMenten).

4557_2_.book Page 45 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Enzymologie clinique

À partir de l’équation de Michaelis-Menten, on peut ainsi calculer que : – pour [S] = KM, v = 50 % de la Vmax – pour [S] = 4 KM, v = 80 % de la Vmax – pour [S] = 10 KM, v = 91 % de la Vmax – pour [S] = 20 KM, v = 95 % de la Vmax – pour [S] = 50 KM, v = 98 % de la Vmax Une concentration trop faible de substrat (par exemple [S] = KM) limite la vitesse réactionnelle. De plus, comme le substrat est consommé lors de la réaction, sa baisse de concentration s’accompagne d’une diminution de la vitesse observée. C’est pourquoi, la mesure d’une concentration d’activité enzymatique doit être réalisée en présence d’un excès de substrat. Dans la pratique, on peut considérer que pour [S] > 10 KM, la vitesse est proche de Vmax et reste constante pendant la durée de la mesure. ■ Influence de la température

Deux phénomènes opposés et indépendants se produisent au fur et à mesure d’une augmentation de la température de mesure : la vitesse réactionnelle augmente, mais la protéine enzymatique subit progressivement une dénaturation thermique conduisant à une baisse de la cinétique réactionnelle. La température optimale d’activité est une propriété propre à chaque enzyme, mais pour des raisons évidentes de praticabilité, il n’est pas question de déterminer chaque activité enzymatique à sa propre température optimale. Ainsi, la standardisation en enzymologie clinique passe par un choix consensuel d’une température de mesure commune aux enzymes qui sont mesurées. Les nombreuses années pendant lesquelles les recommandations des sociétés savantes nationales ou internationales étaient discordantes, ont finalement abouti à une recommandation unique qui est de retenir la température de 37 °C pour la mesure d’une concentration d’activité enzymatique en enzymologie clinique (Siekmann et al., 2002).

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

■ Influence du pH

Pour une concentration donnée en enzyme, mesurée en présence d’un excès de substrat et à une température donnée, la vitesse de réaction varie en fonction du pH du milieu réactionnel et est optimale à un certain pH. Ce pH optimal varie selon les enzymes, avec une dépendance plus ou moins marquée en fonction des enzymes. Pour une enzyme donnée, il est susceptible de varier en fonction de l’ensemble des constituants présents dans le milieu réactionnel. Ainsi, la mesure d’une concentration d’activité enzymatique devra être réalisée au pH optimal de l’enzyme, en présence d’un tampon, dont la nature et la concentration devront avoir été préalablement étudiées. La nature du tampon est également susceptible d’intervenir dans le déplacement d’un équilibre réactionnel. C’est par exemple le cas des aminoalcools qui peuvent capter les ions phosphates libérés lors de la réaction catalysée par la phosphatase alcaline, ces ions phosphates étant par ailleurs inhibiteurs de l’activité enzymatique. ■ Cofacteurs et effecteurs influençant l’activité d’une enzyme

L’optimisation des conditions de mesure d’une activité enzymatique concerne également l’addition dans le milieu réactionnel de coenzymes et d’activateurs qui tiennent compte des proprié-

tés catalytiques de chaque enzyme. Des exemples classiques de coenzymes sont la colipase pour la détermination de la lipase pancréatique et le phosphate de pyridoxal dans le cas des aminotransférases. Des ions, en général des cations divalents peuvent être activateurs : Mg++ pour la créatine kinase, Zn ++ pour la phosphatase alcaline, mais aussi Cl – pour l’alpha-amylase. Dans certains cas, le maintien de la présence de groupements sulfhydryls est nécessaire au maintien de l’activité catalytique de l’enzyme. C’est par exemple le cas de la créatine kinase qui doit être déterminée en présence d’un réactivateur de groupements thiols.

1.5.

Expression de la concentration d’activité enzymatique

Une activité enzymatique correspond à une vitesse réactionnelle, c’est-à-dire à une quantité de substrat consommé ou de produit formé pendant un temps défini. En enzymologie clinique, les résultats seront exprimés en concentration d’activité enzymatique, c’est-à-dire rapportés au volume de spécimen biologique. Étant donné qu’une vitesse réactionnelle dépend des conditions expérimentales (nature du substrat, pH, tampon, force ionique, effecteurs, température…), celles-ci font partie de la définition de l’unité pour une enzyme donnée.

1.5.1. Unités En 1961, la commission enzyme de l’IUB a proposé une unité internationale pour exprimer les activités enzymatiques. Cette unité internationale (U) correspond à la quantité d’enzyme qui catalyse la transformation d’une micromole de substrat par minute dans des conditions opératoires définies et la concentration en enzyme contenue dans un spécimen biologique (concentration catalytique) s’exprime en U/L. En 1978, l’IUPAC et l’IUB recommandent une unité d’activité cohérente avec le système international (SI), le katal, correspondant à la transformation d’une mole de substrat par seconde. Ainsi, 1,0 nkat/L = 0,06 U/L et 1 U/L = 16,67 nkat/L. Cependant, le katal n’a pas été adopté dans la pratique courante en enzymologie clinique et les résultats de concentration d’activité enzymatique restent très largement exprimés en U/L.

1.5.2. Calcul Une activité enzymatique se détermine par la mesure d’une vitesse réactionnelle. Celle-ci correspond à la variation d’un signal analytique par unité de temps qui, en enzymologie clinique, est le plus souvent celle d’une absorbance (ΔA/min), correspondant soit à la disparition d’un substrat, soit à l’apparition d’un produit de réaction. Ainsi, de façon classique, le calcul d’une concentration d’activité enzymatique utilise la loi de Beer-Lambert et nécessite de connaître le coefficient d’absorbance linéique molaire (ε) du constituant mesuré (substrat, ou le plus souvent produit de réaction). Il est basé sur la définition de l’unité d’activité enzymatique, celle utilisée en pratique courante en enzymologie clinique étant l’« unité internationale » (U) correspondant au nombre de micromole de substrat dégradé par minute. De plus, le

45

4557_2_.book Page 46 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

calcul doit prendre en compte la dilution du spécimen dans le milieu réactionnel. Il en résulte que :

U/L =

ΔA / min Vt × × 106 ε×l Vs

où : – ε est le coefficient d’absorbance linéique molaire du constituant mesuré à une longueur d’onde donnée et est exprimé en L.mol–1.cm–1 ; – l est la longueur du trajet optique, exprimée en cm ; – le facteur de 106 permet de transformer les moles en micromoles ;

Vt corrige de la dilution du spécimen dans le milieu réactionVs nel (Vs : volume du spécimen ; Vt : volume réactionnel total). Ainsi, le facteur de conversion (F) fourni dans la documentation technique d’un fournisseur de réactifs pour le calcul d’une concentration d’activité enzymatique ( U / L = F × ΔA / min) correspond à : –

F=

1 Vt × × 106 ε × l Vs

Si la vitesse réactionnelle d’une réaction enzymatique (ΔA/min) est fortement dépendante des conditions retenues pour le dosage d’une enzyme donnée, la valeur du facteur F est réputée constante pour la détermination d’une concentration d’activité enzymatique dans des conditions définies. Néanmoins, il importe de préciser que, dans la pratique, elle est potentiellement sujette à des fluctuations liées aux qualités optiques de l’appareil de mesure, à l’exactitude du pipetage et à la qualité de la thermostatisation du milieu réactionnel.

Tableau 1

■

1.6.

Mesure d’isoenzymes

Un certain nombre de techniques ont été développées pour l’étude d’isoenzymes ou d’isoformes d’enzymes (Sanhai et Christenson, 2003). Elles incluent la séparation par électrophorèse ou par chromatographie, l’inactivation chimique et l’utilisation de différences de propriétés catalytiques. Ces méthodes tendent à être abandonnées au profit de méthodes immunochimiques qui sont le plus souvent employées (tableau 1). À titre d’exemples, l’isoamylase pancréatique peut être déterminée par l’utilisation d’anticorps anti-amylase salivaire (immunoinhibition) et la mesure de la phosphatase acide ostéoclastique (TRAP pour phosphatase acide tartrate résistante, par opposition à la forme tartrate labile, majoritairement d’origine prostatique) utilise un immunodosage.

1.7.

Standardisation en enzymologie clinique

1.7.1. Situation jusqu’au début des années 2000 L’enzymologie clinique utilise le plus souvent la mesure de l’activité catalytique d’enzymes au détriment de sa concentration massique. Cette approche présente de nombreux avantages, mais également certains inconvénients. Parmi les avantages, nous pouvons citer : – la spécificité analytique liée à la spécificité d’action des enzymes ; – une limite de détection basse liée au caractère amplificateur des enzymes : une molécule d’enzyme est capable de transformer de très nombreuses molécules de substrat ; – la rapidité des mesures, qui peuvent être réalisées en quelques minutes ;

Méthodes d’analyses de formes multiples d’enzymes.

Technique

Exemples d’isoenzymes ou d’isoformes d’enzymes

Principe

Électrophorèse

séparation en fonction de la charge à l’unité de masse (électrophorèse de zone) et révélation de l’activité catalytique

la plupart

Chromatographie par échange d’ions

séparation en fonction de la charge globale

CK, LDH

Thermostabilité

différenciation de formes selon leur activité catalytique à différentes températures

PAL

Inhibition chimique

utilisation d’inhibiteurs ayant des affinités différentes selon les isoformes

PAC, PAL, amylase

Spécificité de substrat

différenciation selon l’affinité pour le substrat

LDH

Immunoinhibition

utilisation d’un anticorps réagissant spécifiquement avec une forme particulière, la rendant catalytiquement inactive ou permettant de l’éliminer physiquement

CK, LDH, PAL, PAC, amylase

Immunochimie

utilisation d’un anticorps marqué réagissant spécifiquement avec une forme particulière

CK, LDH, PAL, PAC

46

4557_2_.book Page 47 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Enzymologie clinique

– l’automatisation avec des appareils multiparamétriques de biochimie ; – le faible coût de la plupart des analyses. Parmi les inconvénients, le plus important est la dépendance des résultats vis-à-vis des méthodes de mesure employées. En effet, les résultats dépendent des conditions de détermination retenues pour la mesure d’une activité enzymatique et les valeurs obtenues ne sont pas toujours transférables d’un laboratoire à l’autre. Par ailleurs, comme nous l’avons vu plus haut, le calcul d’une concentration d’activité enzymatique à partir de la mesure d’une vitesse réactionnelle en spectrophotométrie fait intervenir un facteur (F) faisant intervenir un coefficient d’absorbance linéique molaire (ε) et tenant compte de la dilution du spécimen dans le milieu réactionnel. Ces quantités, de même que la température de mesure, peuvent faire l’objet d’erreurs systématiques et être à l’origine d’une variabilité des résultats obtenus, même avec des méthodes identiques. Pour obtenir des résultats transférables en enzymologie clinique, plusieurs démarches ont été successivement entreprises, en particulier par le développement de méthodes optimisées et de méthodes recommandées. L’optimisation des méthodes a concerné la nature et la concentration du substrat et des effecteurs, ainsi que le choix du pH, stabilisé à une valeur optimale. Ainsi, le développement de méthodes optimisées a permis d’augmenter la vitesse réactionnelle et d’améliorer la spécificité analytique et la précision des mesures. Parmi ces méthodes optimisées, certaines d’entre elles ont été recommandées par les sociétés savantes nationales et internationales. Ainsi par exemple, entre 1983 et 1998, l’IFCC (International Federation of Clinical Chemistry and laboratory medicine) a publié des recommandations pour la détermination de l’activité catalytique à 30 °C de 6 enzymes fréquemment dosées en enzymologie clinique. Ces méthodes recommandées par l’IFCC ont été considérées comme méthodes de référence. Cependant, à la même époque, de nombreuses recommandations de sociétés savantes nationales (française, allemande, anglaise, néerlandaise, scandinave, suisse, japonaise…) ont été également publiées. Ces méthodes présentaient des différences, puisque par exemple certaines étaient réalisées à 25 °C, d’autres recommandaient la température de 30 °C, alors que d’autres préconisaient de travailler à 37 °C. Même si le développement de ces méthodes a conduit à obtenir quelques progrès dans la standardisation des mesures d’activités enzymatiques, celle-ci restait insuffisante. L’existence de trop nombreuses recommandations restait un handicap à la standardisation, d’autant qu’elles n’étaient pas toujours adaptées à l’automatisation et que l’innovation technologique constante dans le domaine des systèmes analytiques a conduit au développement de variantes plus ou moins prononcées par rapport aux recommandations nationales ou internationales. Les mesures étaient par exemple réalisées à 37 °C, température de travail de la grande majorité des automates, ceci quelles que soient les recommandations. Ainsi, les méthodes de référence avaient montré leurs avantages, mais également leurs limites.

1.7.2. Systèmes de référence en enzymologie clinique À la conférence générale de l’IFCC à Séville en mars 1998 a été décidé de façon consensuelle le développement des procédures de référence optimisées à 37 °C (IFCC primary reference procedures) à partir des méthodes recommandées par l’IFCC à 30 °C, en : – se rapprochant des conditions de routine ; – éliminant un facteur de variation, la température de réaction, dont on sait qu’elle est une source d’erreurs lorsque des facteurs de conversion inter-température sont utilisés ; – favorisant l’utilisation de calibrateurs validés d’activité enzymatique. En effet, l’IFCC a créé dès 1996 un groupe « Calibrateurs en enzymologie clinique » (WG-CCE), visant à promouvoir l’utilisation de matériaux de référence certifiés d’enzymes et à améliorer la cohérence des résultats d’activité enzymatique par l’utilisation de calibrateurs validés d’enzymes (Férard, 1996 et al. ; Férard et Lessinger, 1998). La démarche de l’IFCC a été complétée par une action commune avec l’institut des matériaux et des méthodes de référence (IRMM), la constitution d’un réseau de laboratoires de référence et la création en 2001 au sein de l’IFCC du comité « Systèmes de référence d’enzyme » (C-RSE). L’ensemble « procédures de référence, matériaux de référence et laboratoires de référence » constitue un système de référence de haute qualité métrologique (Müller, 2000 ; Panteghini et al., 2001 ; Panteghini et Forest, 2005). L’objectif en terme de standardisation est de transférer l’exactitude depuis le système de référence jusqu’aux résultats concernant les patients (figure 4). La démarche intègre l’emploi de systèmes analytiques de routine, incluant analyseurs, réactifs et calibrateurs. Elle permet d’être en accord avec la législation internationale, en particulier la directive européenne relative aux dispositifs de diagnostic in vitro et les normes internationales correspondantes qui demandent que la traçabilité soit assurée entre les résultats produits par les LBM et le système de référence (Férard et Lessinger, 2000 ; Canalias et al., 2006 ; Ilenia et al., 2007 ; Ilenia et al., 2010). Des procédures de référence IFCC 37 °C ont été développées pour 6 activités enzymatiques : la LDH, la CK, l’AST, l’AST, la GGT, la PAL et l’α-amylase (Schumann et al., 2002, part. 2 à 6 ; Schumann et al., 2006 ; Schumann et al., 2010 ; Schumann et al., 2011) et les matériaux de référence d’enzymes produits par les experts en enzymologie du Bureau Communautaire de référence (BCR, Bruxelles) (Moss et al., 1994) et l’IFCC ont été certifiés par ces procédures pour la LDH, la CK, la GGT, l’ALT (Schumann et al., 2002, part. 7) et l’AST (Toussaint et al., 2010). Ainsi, un système de référence devrait prochainement exister pour les 8 enzymes les plus fréquemment déterminées en enzymologie clinique, comme le montre l’état d’avancement de la standardisation en 2011 (tableau 2). Dans la pratique, il est indispensable de rappeler que la standardisation en enzymologie clinique par le biais d’un système de référence ne peut être obtenue que pour des méthodes de routine présentant la même spécificité analytique que la procédure de référence. (Férard et al., 1996 ; Ilenia et al., 2007). Par ailleurs, le calibrage inter-méthode ne peut être envisagé que par l’emploi de matériaux commutables, c’est-à-dire ayant le même comportement que

47

4557_2_.book Page 48 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Unité Institutions internationales

Procédure de référence primaire

Fabricants ÉTALONNAGE

Procédure de mesure (validée) Calibrateur Procédure de mesure (validée)

TRAÇABILITÉ

Matériau de référence certifié (calibrateur primaire)

Spécimens de patients

LABM

Résultats

Figure 4

■

Tableau 2

Étalonnage et traçabilité pour la mesure des activités catalytiques des enzymes.

■

État de la standardisation en enzymologie clinique en

2011. Procédure de référence

Matériau de référence

Matériau de référence certifié

LDH

oui

oui

oui

CK

oui

oui

oui

GGT

oui

oui

oui

ALT

oui

oui

oui

AST

oui

oui

oui

Amylase

oui

oui

en projet

PAL

oui

oui

en projet

en projet

oui

en projet

Enzyme

Lipase

les spécimens de patients vis-à-vis de changements de conditions réactionnelles (Lessinger et al., 1995 ; Scharnhorst et al., 2004). Différentes démarches sont mises en œuvre par les industriels du diagnostic in vitro pour rendre les résultats d’activités enzymatiques fournis par leurs systèmes analytiques de routine traçables par rapport à un système de référence. Ces approches passent par l’utilisation de calibrateurs titrés par la procédure de

48

référence (figure 4) ou l’emploi de facteurs de correction établis par comparaison inter-méthode des résultats de spécimens de patients avec ceux obtenus par la procédure de référence IFCC 37 °C. D’une façon générale, les espoirs placés dans la démarche de standardisation actuelle sont de différents ordres et certains résultats sont d’ores et déjà obtenus : – suppression des recommandations nationales et de la multiplicité des méthodes « recommandées » ; – meilleure cohérence interlaboratoire des résultats ; – meilleure utilisation possible des résultats collectés lors des enquêtes d’évaluation externe de la qualité ; – utilisation d’intervalles de référence communs à des méthodes présentant la même spécificité analytique ; – enfin et surtout, amélioration de l’efficacité de l’enzymologie clinique et donc de la qualité de l’information transmise au clinicien par des laboratoires différents.

1.8.

Facteurs pouvant affecter l’interprétation des résultats

Certains facteurs physiologiques sont susceptibles d’affecter la concentration d’activité enzymatique dans le plasma et doivent ainsi être pris en compte dans l’interprétation des résultats (Hohnadel, 2003). Les enzymes ne connaissant pas de rythme circadien, le moment du prélèvement dans la journée n’influence pas les résultats. Ainsi, le diagnostic et le suivi d’affections aiguës ou chroniques pourront être réalisés à n’importe quel moment de la journée et ne dépendront que de la vitesse d’apparition de l’enzyme dans le plasma, de la persistance de l’atteinte et de la demi-vie plasmatique de l’enzyme. Il est ainsi important de prendre en compte le moment où

4557_2_.book Page 49 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Enzymologie clinique

le prélèvement sanguin est réalisé par rapport à l’atteinte tissulaire. Un prélèvement trop précoce peut avoir lieu avant que l’enzyme n’ait pu atteindre la circulation sanguine ; si il est trop tardif, l’enzyme peut avoir disparu de la circulation générale. Si dans une situation physiologique donnée le moment du prélèvement n’a pas d’influence sur les résultats d’activité enzymatique, la qualité du prélèvement est importante. En effet un prélèvement plasmatique hémolysé contient des enzymes érythrocytaires, à l’origine d’une augmentation des activités correspondantes mesurées dans le plasma. Deux enzymes sont particulièrement sensibles à l’hémolyse, l’AST et la LDH, du fait de concentrations intraérythrocytaires importantes et d’un fort gradient de concentration avec le secteur plasmatique. En ce qui concerne le prélèvement, la stabilité des enzymes habituellement déterminées en enzymologie clinique est peu critique, celles-ci étant le plus souvent stables 2 à 3 jours, voire, dans certains cas 1 semaine à température ambiante après avoir décanté le plasma. Des variations physiologiques de la concentration d’une enzyme dans le plasma peuvent être liées à l’âge. Ces variations peuvent être globalement liées à des variations physiologiques du métabolisme de différents organes. Elles peuvent être significatives lors de trois périodes de la vie. La maturation fonctionnelle de différents organes se prolonge souvent lors des premiers mois de la vie, et des changements significatifs accompagnent la puberté d’une part et le vieillissement d’autre part. À titre d’exemple, des variations importantes de valeurs physiologiques en fonction de l’âge sont observées pour la phosphatase alcaline, en relation avec l’activité ostéoblastique qui est à l’origine de la libération d’une quantité plus importante de PAL d’origine osseuse pendant la période de croissance par rapport à l’âge adulte. Des différences de concentrations d’activités enzymatiques peuvent exister entre les hommes et les femmes pour certaines enzymes. C’est par exemple le cas pour la CK dont la concentration physiologique plasmatique est influencée par la masse musculaire, mais également par l’importance de l’exercice physique. Enfin, des variations physiologiques peuvent exister pour certaines enzymes en fonction de l’origine ethnique des individus.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

1.9.

plus souvent suite à l’augmentation persistante et inexpliquée d’une activité enzymatique dans le plasma. Parmi ces enzymes, les prévalences les plus élevées (de l’ordre de 2 à 3 %) sont observées pour la macro-créatine kinase et la macro-amylase. La présence d’une macroenzyme peut être suggérée par la découverte d’une augmentation isolée de son activité plasmatique, en l’absence de symptômes. Une erreur d’interprétation peut être à l’origine d’une erreur de diagnostic car elles ne sont le plus souvent pas associées à une atteinte particulière. Cependant, dans certains cas, la présence d’une macroenzyme correspondant à un complexe enzyme-immunoglobuline peut être retrouvée lors de maladies auto-immunes.

2 ■■ EXEMPLES D’ACTIVITÉS ENZYMATIQUES FRÉQUEMMENT DÉTERMINÉES EN PRATIQUE COURANTE Parmi les marqueurs les plus fréquemment déterminées en enzymologie clinique, on retrouve : – les aminotranférases, – la lactate déshydogénase, – la créatine kinase, – la phosphatase alcaline, – la γ-glutamyltransférase, – l’α-amylase et la lipase. Ces différentes enzymes, qui ont des fonctions différentes, présentent des spécificités tissulaires variables et sont susceptibles d’être libérées dans le plasma dans différentes situations pathologiques. L’augmentation de la concentration plasmatique d’une enzyme donnée peut être due à des atteintes de tissus et d’organes différents. Nous aborderons ici une description sommaire des causes de leurs variations, sachant que des informations complémentaires pourront être trouvées dans d’autres chapitres de cet ouvrage. Enfin, sur le plan analytique, nous nous limiterons à présenter l’état actuel de la standardisation de la détermination de la concentration de ces enzymes et nous indiquerons les isoenzymes déterminées en routine.

Macroenzymes

Les macroenzymes sont des enzymes ayant une masse moléculaire bien plus élevée que l’enzyme correspondante normalement retrouvée dans le plasma dans des conditions physiologiques ou pathologiques (Mifflin et al., 1985 ; Remaley et Wilding, 1989 ; Sturk et Sanders, 1990). Elles se forment soit par auto-polymérisation, soit par association avec d’autres protéines plasmatiques. Le plus souvent, les macroenzymes sont constituées d’un complexe entre des molécules d’enzymes et des molécules d’immunoglobulines, le plus souvent des IgG, plus rarement des IgA ou des IgM. Ces macroenzymes ont une demi-vie plasmatique plus élevée que les enzymes correspondantes habituellement présentes. Elles sont lentement éliminées de la circulation générale, s’y accumulent et sont responsables d’une augmentation de la concentration d’activité enzymatique mesurée dans le plasma. L’existence de macroenzymes a été décrite pour la plupart des enzymes déterminées fréquemment en enzymologie clinique, le

2.1.

Aminotransférases

2.1.1. Origines et isoformes Les aminotransférases (anciennement dénommées transaminases) sont des enzymes qui interviennent dans le métabolisme des acides aminés en catalysant l’interconversion entre un acide aminé et un acide α-cétonique par transfert d’un groupement aminé en présence d’un coenzyme : le phosphate de pyridoxal. Parmi les transaminases, deux d’entre elles sont fréquemment déterminées en enzymologie clinique. L’aspartate aminotransférase (AST, EC 2.6.1.1), anciennement nommée transaminase glutamique oxaloacétique (TGO) qui catalyse le transfert du groupement aminé du L-aspartate sur le 2-oxoglutarate, et l’alanine aminotransférase (ALT, EC 2.6.1.2) anciennement transaminase glutamique pyruvique (TGP) qui catalyse le transfert du groupement aminé de la L-alanine sur le pyruvate, les deux réactions

49

4557_2_.book Page 50 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

étant réversibles. Ces deux enzymes ont une large distribution tissulaire (Moss et Hendersen, 1999). L’AST est présente en particulier dans le cœur, le foie, le rein, le muscle squelettique, le pancréas, la rate, le poumon et les érythrocytes. L’ALT est également retrouvée dans un grand nombre de tissus, mais en faible quantité, en dehors des hépatocytes. Des isoenzymes différentes de l’AST sont respectivement présentes dans le cytosol et dans la mitochondrie des cellules, alors que l’ALT est une enzyme uniquement cytosolique.

2.1.2. Aspects séméiologiques d’une augmentation de concentrations plasmatiques Lors d’atteintes tissulaires modérées, la forme d’AST qui prédomine dans le plasma est d’origine cytosolique, alors que la forme mitochondriale est libérée lors d’atteintes sévères. Des augmentations très importantes d’AST (pouvant atteindre plus de 100 × LSVU) peuvent être observées lors de dommages cellulaires sévères tels que les hépatites aiguës, les lésions par écrasement et l’hypoxie tissulaire. Des augmentations plus modérées (5-10 × LSVU) peuvent faire suite à un infarctus du

myocarde, une pathologie musculaire, un traumatisme ou des atteintes hépatobiliaires autres que celles s’accompagnant d’une cytolyse importante (hépatite chronique, cholestase, carcinome hépatocellulaire). L’activité AST est également augmentée dans le plasma en cas d’embolie pulmonaire ou lors d’hémolyses, que celles-ci aient eu lieu in vivo ou in vitro. Dans la plupart des circonstances dans lesquelles l’activité AST est élevée, on peut observer une augmentation de l’ALT, mais plus modérée (Reij, 1989). Par contre, lors d’une cytolyse hépatocellulaire, la concentration plasmatique en activité ALT est souvent supérieure à celle de l’AST, l’ALT étant plus spécifiquement d’origine hépatique. Cependant, en cas de nécrose hépatocytaire, la libération d’AST d’origine mitochondriale contribue à une diminution du rapport ALT/AST (Panteghini et al., 1990).

2.1.3. Aspects analytiques : standardisation Les principes réactionnels des procédures de référence primaires IFCC 37 °C pour les déterminations des activités aminotransférases dans le plasma sont les suivants (Schumann et al., 2002, part. 4 et 5) :

AST

L − Aspartate + 2 − Oxoglutarate ⎯ ⎯⎯→ Oxaloacétate + L − Glutamate Oxaloacétate + NADH,H+ ⎯ ⎯⎯→ Malate + NAD+ MDH

MDH : malate déshydrogénase ALT

L − Alanine + 2 − Oxoglutarate ⎯ ⎯⎯→ Pyruvate + L − Glutamate Pyruvate + NADH,H+ ⎯ ⎯⎯→ Lactate + NAD+ LDH

L’activité AST est mesurée à pH 7,65 et l’activité ALT à pH 7,15 (37 °C) ; la décroissance de l’absorbance est suivie en cinétique à 339 nm. Du phosphate de pyridoxal (PP), coenzyme indispensable à l’activité des aminotransférases est ajouté dans le milieu réactionnel, permettant ainsi de mesurer la totalité des molécules d’enzyme présentes, qu’elles soient sous forme d’apoenzyme ou liée à son cofacteur, en évitant une sous-estimation de l’activité mesurée du fait d’un déficit éventuel en PP. Dans la pratique, les méthodes sans PP devraient être abandonnées, du fait qu’elles présentent une spécificité analytique différente de celle de la procédure de référence. Pour l’activité ALT, le matériau de référence préparé au niveau du Bureau Communautaire de Référence (BCR) à partir de cœur de porc a été certifié par la procédure de référence IFCC 37 °C. Il s’agit du matériau ERM-AD454 (Siekmann et al., 2002). En ce qui concerne l’AST, un matériau de référence d’origine recombinante a été développé et certifié par la procédure de référence IFCC 37 °C ; il s’agit du matériau ERM-AD457 (Toussaint et al., 2010). Les valeurs préliminaires des limites supérieures de référence des concentrations d’activités plasmatiques des aminotransférases chez les adultes sont les suivantes (Schumann et Klauke, 2003) : – AST : femmes : 31 U/L – hommes : 35 U/L – ALT : femmes : 34 U/L – hommes : 45 U/L

50

2.2.

Créatine kinase

2.2.1. Origines et isoformes La créatine kinase (CK, EC 2.7.3.2) catalyse la phophorylation réversible de la créatine par l’ATP. Cette enzyme est présente en quantité variable dans différents tissus (Bais et Edwards, 1982 ; Moss Hendersen, 1999). Les quantités les plus importantes sont retrouvées dans le muscle squelettique (où elle intervient de façon essentielle dans la mise en réserve et la mobilisation d’énergie), puis viennent le cerveau et le tissu cardiaque, puis d’autres tissus. Certains organes, dont le foie contiennent très peu d’activité CK. La CK est une enzyme dimérique composée de deux sous-unités codées par des gènes différents. L’association de sous-unités B (pour brain) et de sous-unités M (pour muscle), conduit à l’existence de trois isoenzymes, la CK-BB (CK-1), la CK-MB (CK-2) et la CK-MM (CK-3), qui diffèrent en particulier par leurs répartitions tissulaires et, sur le plan analytique, par leur mobilité électrophorétique. La CK-1 prédomine en proportion d’activité CK totale dans le cerveau, la prostate, le tractus digestif, la vessie, l’utérus, la thyroïde et le placenta et la CK-3 prédomine dans le muscle squelettique et le muscle cardiaque. La CK-2 est absente ou présente en faible proportion dans de nombreux tissus, en dehors du muscle cardiaque où elle représente environ 20 % de l’activité CK totale (Lang et Wurtzburg, 1982).

4557_2_.book Page 51 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Enzymologie clinique

2.2.2. Aspects séméiologiques d’une augmentation de concentration plasmatique Dans le plasma de sujets sains, l’activité CK est principalement de type MM (CK-3) et la concentration d’activité CK totale varie en fonction de la masse musculaire des individus (âge, sexe) et augmente en cas d’exercice musculaire intense. Dans des situations pathologiques, les activités CK les plus élevées dans le plasma (pouvant atteindre plus de 10 × LSVU) sont retrouvées lors d’atteintes du muscle squelettique (myopathies congénitales, rhabdomyolyses, écrasements musculaires importants) ou du muscle cardiaque (infarctus du myocarde) (Bais et Edwards, 1982 ; Moss Hendersen, 1999). Lors d’atteintes du muscle squelettique, l’activité CK plasmatique est presque exclusivement de

type MM, alors qu’une origine cardiaque s’accompagne d’une augmentation des activités CK-3 et CK-2, l’activité CK-2 (MB) étant supérieure à 5 % et pouvant atteindre 30 % de l’activité CK totale. Un traumatisme crânien ou certaines affections neurologiques s’accompagnent d’une augmentation d’activité CK de type BB (CK-1) dans le plasma. Enfin, des augmentations d’activité CK plasmatique sont également rencontrées chez des patients atteints d’hypothyroïdie ou de pathologies néoplasiques.

2.2.3. Aspects analytiques : standardisation Le principe réactionnel de la procédure de référence primaire IFCC 37 °C pour la détermination de l’activité CK dans le plasma est le suivant (Schumann et al., 2002, part. 2) :

CK

Créatine phosphate + ADP ⎯ ⎯ ⎯→ Créatine + ATP HK

ATP + Glucose ⎯ ⎯ ⎯→ ADP + Glucose - 6 - phosphate Glucose - 6 - phosphate + NADP+ ⎯ ⎯⎯⎯→ Gluconate - 6 - phosphate + NADPH,H+ G-6 -PD

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

HK : hexokinase G-6-PD : glucose-6-phosphate déshydrogénase

L’activité CK contenue dans le plasma est connue pour être relativement instable, du fait de l’oxydation de groupements sulfhydryls au niveau de son site actif. Elle est restaurée après préincubation en présence de N-acétylcystéine. Des ions Mg ++ (activateurs de kinases) sont présents dans le milieu réactionnel. L’activité CK est mesurée en cinétique à pH 6,50 par le suivi de l’augmentation de l’absorbance à 339 nm. Le matériau de référence préparé au niveau du BCR à partir de cœur humain (isoenzyme CK-2) a été certifié par la procédure de référence IFCC 37 °C. Il s’agit du matériau ERM-AD455 (Siekmann et al., 2002). Les valeurs préliminaires des limites supérieures de référence des concentrations d’activité CK plasmatique chez les adultes sont les suivantes (Schumann et Klauke, 2003) : femmes : 145 U/L – hommes 171 U/L. Parmi les isoenzymes de la CK, seule la CK-2 (CK-MB) est déterminée en enzymologie clinique de routine. Sa mesure peut être réalisée par immunoinhibition en présence d’anticorps anti-M, en se basant sur le fait que l’isoenzyme BB (CK-3) est présente en très faible concentration dans le plasma. En raison d’une meilleure sensibilité, on préfère actuellement déterminer cette isoenzyme d’origine cardiaque en concentration de masse par immunodosage.

2.3.

Lactate déshydrogénase

2.3.1. Origines et isoformes La lactate déshydrogénase (LDH, EC 1.1.1.27) est une enzyme qui catalyse l’oxydation du lactate en pyruvate en présence de NAD + avec formation de NADH,H+ et réversiblement, l’équilibre réactionnel étant fonction du pH, des isoenzymes et de la teneur en oxygène. Elle catalyse la transformation de pyruvate en lactate dans la dernière étape de la glycolyse en anaérobiose, alors qu’elle

permet la formation de pyruvate à partir du lactate lors de la gluconéogenèse. La LDH est une enzyme composée de 4 sousunités de deux types, M et H, codées par des gènes différents, donnant lieu à la formation de cinq isoenzymes de mobilité électrophorétique différente (Moss Hendersen, 1999) : LDH-1 (H4), LDH-2 (H3M), LDH-3 (H2M2), LDH-4 (HM3) et LDH-5 (M4). La LDH est une enzyme ubiquitaire, puisqu’elle est présente dans toutes les cellules de l’organisme, dans lesquelles elle n’est retrouvée que dans le cytosol. Certains tissus contiennent une quantité importante d’activité LDH : le foie, le muscle squelettique, le cœur, le rein et les érythrocytes. Ces différents tissus présentent des différences de composition en isoenzymes. Dans le muscle cardiaque, le rein et les érythrocytes, les isoenzymes qui prédominent sont la LDH-1 et la LDH-2, alors que dans le foie et le muscle squelettique on retrouve de fortes quantités de la LDH-4 et de la LDH5. Les isoenzymes LDH-2 LDH-3 LDH-4 se retrouvent dans la plupart des autres tissus, comme les glandes endocrines, la rate, le poumon, les ganglions lymphatiques (Moss Hendersen, 1999).

2.3.2. Aspects séméiologiques d’une augmentation de concentration plasmatique La LDH étant une enzyme cytosolique présente en grande quantité dans de nombreux tissus, toute cytolyse, quelle qu’en soit l’origine, entraîne une libération de cette enzyme dans la circulation générale. Ainsi, son élévation dans le plasma est un signe sensible et précoce d’une lésion tissulaire, même modérée et cliniquement silencieuse. Peu spécifique, ce marqueur peut être déterminé en première intention à titre de dépistage, mais il doit être associé en cas d’augmentation à d’autres marqueurs biologiques pour orienter le diagnostic (Huijgen et al., 1997 ; Moss Hendersen, 1999). Des élévations importantes d’activité LDH sont observées suite à un infarctus du myocarde (tardivement), dans la plupart des

51

4557_2_.book Page 52 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

atteintes hépatiques s’accompagnant d’une cytolyse hépatocellulaire (en particulier les hépatites aiguës) et lors d’anémies mégaloblastiques et hémolytiques. Par ailleurs, une atteinte pulmonaire sévère (infarctus pulmonaire, œdème aigu du poumon, pneumopathie infectieuse), une nécrose musculaire (traumatique) ou un infarctus rénal, s’accompagnent d’une élévation de l’activité LDH dans le plasma. Enfin, une augmentation de l’activité LDH peut accompagner de nombreux processus néoplasiques et, malgré un manque de spécificité, la bonne sensibilité de ce test fait qu’il est souvent utilisé comme marqueur de surveillance, particulièrement en onco-hématologie. Une élévation de l’activité LDH a par exemple une valeur pronostique péjorative chez les patients atteints de lymphome. Ceci est également le cas lors d’autres pathologies malignes. Toute hémolyse, même légère, entraîne une augmentation de la concentration en activité LDH dans le plasma, faisant que l’hémolyse in vitro représente la principale interférence de ce dosage.

2.3.3. Aspects analytiques : standardisation Le principe réactionnel de la procédure de référence primaire IFCC 37 °C pour la mesure de l’activité LDH dans le plasma est le suivant (Schumann et al., 2002, part. 3) :

Pyruvate + NADH,H+ ⎯ ⎯⎯→ Lactate + NAD+ LDH

Le milieu réactionnel est tamponné à pH 9,40 (37 °C) et l’activité de la LDH est mesurée en cinétique par le suivi de la diminution d’absorbance à 339 nm. Le matériau de référence préparé au niveau du BCR à partir d’érythrocytes humains, a été certifié par la procédure de référence IFCC 37 °C. Il s’agit du matériau ERM-AD453 (Siekmann et al., 2002). Les valeurs préliminaires des limites supérieures de référence des concentrations d’activité LDH plasmatique chez les adultes sont les suivantes (Schumann et Klauke, 2003) : femmes : 247 U/L – hommes 248 U/L. Il est à noter que la détermination des isoenzymes de la LDH en biochimie clinique quotidienne ne présente de nos jours plus d’intérêt, compte tenu de l’existence de marqueurs plus spécifiques pour mettre en évidence une cytolyse hépatique ou une nécrose myocardique.

2.4.

Phosphatase alcaline

2.4.1. Origines et isoformes La phosphatase alcaline (PAL, EC 3.1.3.1) catalyse l’hydrolyse de liaisons ester phosphorique d’une large variété de substrats. Cette enzyme est localisée au niveau de la membrane cytoplasmique et est retrouvée dans de nombreux tissus de l’organisme. Elle est présente en grande quantité dans l’épithélium intestinal, les tubules rénaux, l’os (ostéoblastes), le foie et le placenta. La synthèse de la PAL est codée par trois gènes différents, un gène intestinal, un gène placentaire et un gène non intestinal non placentaire codant pour les isoformes osseuse, hépatique et rénale. L’hétérogénéité de ces isoformes résulte de modifications posttraductionnelles et plus particulièrement d’un degré différent de

52

glycosylation et de sialylation, mais les isoformes d’origine osseuse, hépatique et rénale présentent entre elles peu de différences de propriétés catalytiques, alors que des différences importantes existent pour les isoformes d’origine intestinale et placentaire. Les isoformes qui prédominent dans le plasma de sujets sains sont principalement d’origine hépatique et osseuse, avec une forte variabilité en fonction de l’âge pendant la période de croissance osseuse. Il est à noter que le dernier trimestre de la grossesse s’accompagne d’une augmentation de la concentration en activité PAL totale dans le plasma, du fait de la présence de l’isoforme placentaire (Moss Hendersen, 1999).

2.4.2. Aspects séméiologiques d’une augmentation de concentration plasmatique Les deux causes principales d’une augmentation de l’activité phosphatase alcaline dans le plasma sont les pathologies hépatobiliaires d’une part et les pathologies osseuses d’autre part (Moss, 1982 ; Moss, 1987). Toute forme d’obstruction des voies biliaires, qu’elle soit d’origine intrahépatique (cancéreuse, médicamenteuse) ou extrahépatique (calcul biliaire, cancer de la tête du pancréas), s’accompagne d’une augmentation de la synthèse de PAL par les hépatocytes adjacents aux canalicules biliaires, cette induction enzymatique étant à l’origine d’une élévation de l’activité PAL dans le plasma. Les concentrations les plus élevées sont retrouvées dans les cholestases extrahépatiques. Ainsi, à côté de la détermination des formes conjuguée et non conjuguée de la bilirubine, la détermination de l’activité PAL présente un intérêt certain dans l’exploration biologique des ictères. Il est à noter que les atteintes hépatiques qui touchent principalement les tissus parenchymateux et dans lesquelles le syndrome de cytolyse prédomine, peuvent également s’accompagner d’une élévation, mais modérée, de l’activité PAL plasmatique. Parmi les pathologies osseuses s’accompagnant d’une augmentation de l’activité ostéoblastique, les concentrations plasmatiques les plus élevées en activité PAL sont observées dans la maladie de Paget (plus de 10 × LSVU). Des élévations plus modérées sont observées lors d’ostéomalacie ou d’hyperparathyroïdies (primaire ou secondaire), alors que des augmentations transitoires peuvent être retrouvées lors de la consolidation de fractures osseuses. Enfin, certaines formes particulières de PAL peuvent être libérées dans la circulation générale lors de pathologies malignes autres que hépatiques ou osseuses. C’est le cas par exemple de l’isoenzyme Reagan qui est une forme carcino-placentaire résultant de la dérépression du gène codant pour la PAL placentaire et qui est retrouvée chez certains patients atteints de carcinome bronchique. Il n’est pas rare de découvrir, à l’occasion d’un bilan d’exploration, une augmentation d’activité PAL en absence de signes cliniques pouvant orienter vers une pathologie hépatique ou osseuse. Un moyen simple qui apporte une aide pour préciser l’origine d’une telle augmentation est de mesurer l’activité γ-glutamyltransférase dans le plasma. En effet, cette enzyme, présente dans le foie mais pas dans le tissu osseux, augmente également dans le plasma en cas de cholestase.

4557_2_.book Page 53 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Enzymologie clinique

2.4.3. Aspects analytiques : standardisation Le principe réactionnel de la procédure de référence primaire IFCC 37 °C pour la mesure de l’activité PAL dans le plasma est le suivant (Schumann et al., 2011, part. 9) : PAL

4-Nitrophényl phosphate + H2O ⎯⎯⎯→ 4 -Nitrophénoxide + Phosphate PAL

4-Nitrophényl phosphate + AMP ⎯⎯⎯→ 4 -Nitrophénoxide + AMP -phosphate AMP : 2-amino-2-méthyl-1-propanol

La PAL catalyse l’hydrolyse du 4-nitrophénylphosphate, avec libération de 4-nitrophénol et de phosphate. En milieu alcalin, le 4nitrophénol est converti en 4-nitrophénoxide. AMP et H 2O sont utilisés comme accepteurs de phosphate. La réaction se déroule à pH 10,20 (37 °C) et l’activité de la PAL est mesurée en cinétique par le suivi de l’augmentation d’absorbance à 405 nm. Un matériau de référence a été préparé au niveau du Bureau Communautaire de Référence (BCR 371) ; il contient une activité PAL qui a été purifiée à partir de rein de porc. Il a été démontré que l’utilisation de ce matériau comme calibrateur de techniques différentes permet, dans des conditions de routine, de réduire considérablement les différences inter-techniques entre des résultats d’activités PAL obtenues pour des plasmas de patients (Lessinger et al., 1995). Les limites supérieures de référence des concentrations d’activité PAL plasmatique chez les adultes sont les suivantes (Schumann et al., 2011) : femmes : 98 U/L – hommes 115 U/L. L’utilisation de différentes techniques pour la détermination de différentes isoformes de la PAL (précipitation, thermodénaturation ou électrophorèse) n’a pas connu de développement important en enzymologie clinique de routine. L’objectif principal est de différencier une augmentation d’activité PAL d’origine hépatobiliaire d’une augmentation d’origine osseuse. La démarche usuelle consiste à associer la détermination de l’activité PAL à d’autres marqueurs de pathologies hépatiques (GGT, bilirubines, aminotransférases). Seule l’isoenzyme osseuse est habituellement dosée, par méthode immunométrique, comme marqueur de l’activité ostéoblastique.

2.5.

g-Glutamyltransférase

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

2.5.1. Origines et isoformes La γ-glutamyltransférase (GGT, EC 2.3.2.2) est une enzyme qui catalyse le transfert d’un groupement γ-glutamyl vers un accepteur d’acides aminés. Elle est présente dans le cytosol, mais surtout localisée au niveau de la membrane cellulaire où elle joue un rôle dans le transport de peptides. Elle intervient en particulier dans le métabolisme du glutathion. Il existe différentes isoformes de GGT, provenant de modifications post-traductionnelles de résidus oligosaccharidiques, mais contrairement à d’autres enzymes, ces isoformes ne présentent pas de spécificité tissulaire. La GGT est présente dans de nombreux tissus, excepté le muscle squelettique et le muscle cardiaque. Elle est retrouvée en forte quantité dans le foie, le rein, le pancréas et l’intestin. L’activité GGT dans le plasma de sujets sains est principalement d’origine hépatobiliaire (Moss Hendersen, 1999).

2.5.2. Aspects séméiologiques d’une augmentation de concentration plasmatique La mesure de l’activité GGT dans le plasma est un test sensible pour mettre en évidence une atteinte des capacités excrétrices ou de l’intégrité structurale du foie. De façon générale, deux mécanismes différents peuvent entraîner une augmentation de la GGT dans le plasma à partir des hépatocytes : une induction microsomale de sa synthèse et une altération de la membrane plasmique. Des activités GGT très élevées (5-30 × LSVU) sont retrouvées en cas de cholestase intrahépatique ou d’obstruction biliaire posthépatique ; son augmentation débute avant celle d’autres enzymes telles que la PAL et persiste plus longtemps. Des augmentations modérées peuvent être observées lors d’une cytolyse hépatocellulaire, et dans ces circonstances, la détermination de l’activité GGT présente moins d’intérêt que celle des aminotransférases. Des augmentations précoces et importantes d’activité GGT dans le plasma sont également observées lors de carcinomes hépatocellulaires ou de métastases hépatiques. Des augmentations de 2 à 5 fois la LSVU peuvent être rencontrées lors d’une stéatose hépatique ou d’une intoxication médicamenteuse. Lors d’atteintes pancréatiques telles que les pancréatites aiguës ou chroniques, ou de tumeurs pancréatiques (en particulier lorsqu’elles s’accompagnent d’une compression des voies biliaires excrétrices), la GGT plasmatique peut atteindre 5 à 15 fois la LSVU. En résumé, la GGT est l’un des marqueurs les plus sensibles d’une atteinte hépatocellulaire, mais présente peu d’intérêt sur le plan de la discrimination entre des atteintes hépatiques différentes (Nemesánszky et Lott, 1985). Comme indiqué plus haut, sa détermination peut être utile pour préciser l’origine d’une augmentation de l’activité plasmatique de la PAL, la GGT restant normale lors de pathologies osseuses. Une valeur d’activité GGT est rarement trouvée normale lors d’une pathologie hépatique. Néanmoins, des augmentations dans le plasma peuvent être induites en absence d’une atteinte hépatique (Penn et Worthington, 1983 ; Whitfield, 2001). Des concentrations élevées de GGT sont présentes dans le plasma, non seulement en cas de cirrhose alcoolique, mais également chez des consommateurs abusifs de boissons alcoolisées, par induction enzymatique et en absence de dommages hépatiques (Niemela, 2007). Dans cette situation, la détermination de l’activité GGT présente une certaine utilité pour le suivi d’un sevrage alcoolique. On observe fréquemment des augmentations d’activité GGT dans le plasma de patients qui ingèrent certains médicaments tels que la phénytoïne ou le phénobarbital. Ces augmentations qui sont le reflet de l’induction enzymatique par

53

4557_2_.book Page 54 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

les médicaments anticonvulsivants, sont également observées pour d’autres classes thérapeutiques. Des quantités élevées de GGT sont également présentes au niveau de la prostate et une tumeur de la prostate peut être à l’origine d’une augmentation de l’activité GGT plasmatique.

2.5.3. Aspects analytiques : standardisation Le principe réactionnel de la procédure de référence primaire IFCC 37 °C pour la mesure de l’activité GGT dans le plasma est le suivant (Schumann et al., 2002, part. 6) :

GGT

L - γ - Glutamyl - 3 - carboxy - 4 - nitroanilide + Glycylglycine ⎯ ⎯⎯→ 5 - Amino - 2 - nitrobenzoate + L - γ - Glutamyl - glycylglycine Une réaction d’auto-transfert contribue à 1 % de la transformation totale du substrat : GGT

L - γ - Glutamyl - 3 - carboxy - 4 - nitroanilide + L - γ - Glutamyl - 3 - carboxy - 4 - nitroanilide ⎯ ⎯⎯→ 5 - Amino - 2 - nitrobenzoate + L - γ - Glutamyl - γ - Glutamyl - 3 - carboxy - 4 - nitroanilide

La réaction se déroule à pH 7,70 (37 °C) et l’activité de la GGT est mesurée en cinétique par le suivi de l’augmentation d’absorbance à 410 nm. Le matériau de référence préparé au niveau du BCR à partir de rein de porc, a été certifié par la procédure de référence IFCC 37 °C. Il s’agit du matériau ERM-AD452 (Siekmann et al., 2002). Les valeurs préliminaires des limites supérieures de référence des concentrations d’activité GGT plasmatique chez les adultes sont les suivantes (Schumann et Klauke, 2003) : femmes : 38 U/L – hommes 55 U/L.

2.6.

a-Amylase et lipase

2.6.1. Origines et isoformes L’α-amylase (EC 3.2.1.1) et la lipase (EC 3.1.1.3) sont deux enzymes digestives qui sont principalement mesurées dans le plasma pour l’investigation de pathologies inflammatoires du pancréas exocrine (Moss et Hendersen, 1999). L’α-amylase est une enzyme qui joue un rôle essentiel dans la digestion des glucides, puisqu’elle est capable d’hydrolyser des liaisons α-1,4-glucosidiques à l’intérieur de polysaccharides composés d’α-D-glucose, tels le glycogène et l’amidon, pour donner lieu à la libération de molécules plus petites : glucose, maltose et dextrines limites (contenant des liaisons α-1,6-glucosidiques). Deux organes contiennent des quantités importantes d’amylase, le pancréas et les glandes salivaires, avec différentes isoformes. Le pancréas exocrine synthétise une activité amylasique de type P qui est secrétée dans la lumière intestinale, alors que les glandes salivaires libèrent une activité amylasique de type S qui initie la digestion des polysaccharides alors que les aliments se trouvent encore dans la bouche ou dans l’œsophage. L’isoamylase P et l’isoamylase S sont produites par deux gènes différents et peuvent présenter une certaine variabilité phénotypique. De plus, ces isoenzymes peuvent subir des modifications posttraductionnelles (désamidations, glycosylations et déglycosylations), conduisant à la formation de nombreuses isoformes. Il est à noter que d’autres organes, tels que les trompes, les ovaires, les testicules et le tissu bronchique contiennent également des quantités importantes d’amylase. Cependant, chez le sujet sain, l’activité amylasique retrouvée dans le plasma est très majoritairement d’origine pancréatique et salivaire.

54

La lipase est une enzyme secrétée par le pancréas qui joue un rôle fondamental dans la digestion des triglycérides à chaînes longues, dont elle hydrolyse les liaisons ester en position 1 et 3 pour libérer deux acides gras et un 2-monoglycéride qui sont absorbables. Cette réaction a lieu à l’interface de triglycérides émulsionnés dans la lumière intestinale, en présence de sels biliaires et de colipase, cofacteur d’origine pancréatique de la lipase. L’activité lipasique du plasma peut résulter de la présence de différentes autres activités lypolytiques, telles la triglycéride lipase hépatique et la lipoprotéine lipase, auxquelles se rajoutent de nombreuses activités estérasiques d’origines différentes. Cependant, les méthodes actuellement utilisées en enzymologie clinique permettent d’assurer une bonne spécificité de la détermination de la lipase pancréatique. Il est à noter que différentes isoformes de lipase pancréatique ont pu être mises en évidence, l’une d’entre elles apparaissant spécifiquement dans le plasma en cas de pancréatite aiguë (Lessinger et al., 1986).

2.6.2. Aspects séméiologiques d’une augmentation de concentrations plasmatiques Les mesures d’activités amylasique et lipasique dans le plasma concernent principalement le diagnostic d’une pancréatite aiguë, en présence d’un syndrome abdominal aigu (Tietz, 1988 ; Tietz et al., 1989). Par rapport à l’amylase, la lipase augmente plus précocement, de façon beaucoup plus importante et persiste plus longtemps. Il est à noter que différentes pathologies extra-pancréatiques sont susceptibles d’entraîner des augmentations modérées de lipase et d’amylase dans le plasma. C’est le cas par exemple de l’insuffisance rénale (par défaut d’élimination) ou de pathologies hépatobiliaires et intestinales. Il n’est en effet pas rare d’observer des augmentations d’enzymes pancréatiques dans le plasma lors d’inflammations d’organes proches du pancréas, traduisant la sensibilité particulière de cette glande à l’atteinte d’un organe adjacent (Lott et al., 1989). Des augmentations transitoires sont également observées suite à l’administration de médicaments pouvant entraîner une contraction du sphincter d’Oddi, tels que des opiacés. Diverses autres causes d’augmentation d’activités plasmatiques concernent l’amylase et non la lipase (Lott et al., 1989). Les atteintes des glandes salivaires (oreillons, parotidites, traumatisme crânien…) s’accompagnent d’une libération d’isoformes de

4557_2_.book Page 55 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Enzymologie clinique

type S de l’amylase dans la circulation générale. Il en est de même lors de certaines atteintes gynécologiques (salpingite, grossesse extra-utérine…). Par ailleurs, des élévations d’activité amylasique (le plus souvent de type S) sont observées au cours de certains processus néoplasiques, touchant par exemple l’ovaire, la prostate ou les bronches. Enfin, la prévalence d’une macroamylasémie est bien plus élevée que celle d’une macrolipasémie, dont la découverte est exceptionnelle. Au total, si l’objectif de la détermination de ces deux enzymes est le diagnostic d’une pancréatite aiguë, la sensibilité et la spécificité cliniques de la mesure de la lipase sont supérieures à celles de l’amylase et même à celles de l’amylase P (Lott et al., 1986 ; Lott et Lu, 1991). Une augmentation isolée de l’activité amylasique dans le plasma peut orienter vers une atteinte de glandes salivaires, mais également vers une cause néoplasique.

Un rapport récent publié par la Haute Autorité de Santé confirme la supériorité de la lipase par rapport à l’amylase pour le diagnostic biologique de la pancréatite aiguë (HAS, 2009).

2.6.3. Aspects analytiques : standardisation De nombreuses techniques ont été développées pour la mesure de l’activité α-amylasique. La plupart d’entre elles utilisent actuellement un dérivé d’un 4-nitrophényl oligosaccharide comme substrat, avec mesure de la vitesse de libération du 4-nitrophénol après action d’enzymes auxilliaires (α-glucosidases, β-glucosidases, glucoamylases). Le principe réactionnel de la procédure de référence primaires IFCC 37 °C pour la mesure de l’activité de l’α-amylase dans le plasma est le suivant (Schumann et al., 2006) :

α -Amylase

EPS + H2O ⎯ ⎯⎯⎯⎯→ 4,6 - Ethylidène - Gx + 4 - Nitrophényl - G(7 - x) α -Glucosidase

4 - Nitrophényl - G(7 - x) + (7 - x) H2O ⎯ ⎯⎯⎯⎯⎯ ⎯→ (7 - x) Glucose + 4 - Nitrophénoxyde

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

EPS : éthylidène-4-nitrophényl-maltoheptaoside La réaction se déroule à pH 7,00 (37 °C) en présence d’ions Cl– (activateurs de l’amylase) et l’activité enzymatique est mesurée en cinétique par le suivi de l’augmentation d’absorbance à 405 nm. Un matériau de référence a été préparé au niveau du Bureau Communautaire de Référence (IRMM/IFCC 456) ; il contient une activité α-amylase qui a été purifiée à partir de pancréas humain. Il a été démontré que l’utilisation de ce matériau comme calibrateur de techniques utilisant des substrats différents permet, dans des conditions de routine, de réduire considérablement les différences inter-techniques entre résultats d’activités amylasiques obtenues pour des plasmas de patients (Lessinger et al., 1995). Tout comme pour l’amylase, de très nombreuses méthodes ont été décrites pour la détermination de l’activité lipasique. Les méthodes de routine actuelles sont principalement basées sur l’hydrolyse d’un diglycéride (ou dérivé) contenant des acides gras à chaîne longue, en présence d’un sel biliaire et de colipase, avec mesure du glycérol (ou dérivé) en colorimétrie. Il n’existe pas actuellement de méthode de référence IFCC 37 °C pour la détermination de l’activité lipasique, mais l’utilisation de la titrimétrie à pH constant a été proposée (Tietz et al., 1989 : Arzoglou et al., 1994). Deux matériaux de référence de lipase ont été préparés au niveau du Bureau Communautaire de Référence. Le BCR 693 contient de la lipase purifiée à partir de suc pancréatique humain et le BCR 694 contient de la lipase pancréatique humaine recombinante. Tout comme pour l’amylase, il a été démontré que l’utilisation de ces matériaux comme calibrateurs, permet de réduire la dépendance des résultats d’activité lipasique vis-à-vis des techniques employées (Lessinger et al., 1996 ; Lessinger et al., 2004).

• Des augmentations d’activités enzymatiques dans le plasma sont associées de façon plus ou moins spécifique à de nombreuses pathologies (cardiaques, pulmonaires, musculaires, hépatiques, pancréatiques, osseuses, hématologiques, cancéreuses…). • Les différences de répartitions des enzymes en fonction des tissus peuvent être mises à profit par l’association de la détermination d’enzymes (ou d’isoformes) différentes, pour l’exploration biologique d’un organe particulier. • Les enzymes les plus fréquemment déterminées en enzymologie clinique sont : les aminotransférases, la lactate déshydogénase, la créatine kinase, la phosphatase alcaline, la γ-glutamyltransférase, l’α-amylase et la lipase. • Dans l’interprétation des résultats, il faut rester vigilant à l’existence éventuelle d’une hémolyse (en particulier pour l’AST et la LDH) et à la présence possible de macroenzymes (en particulier pour la CK et l’α-amylase). • La démarche de standardisation actuellement en cours (IFCC) permettra d’ici peu, pour les 8 enzymes les plus fréquemment dosées en routine, d’assurer le transfert d’exactitude du système de référence jusqu’aux résultats obtenus pour les patients. • Les évolutions et perspectives de ces dernières années conduisent à une amélioration de l’efficacité de l’enzymologie clinique et de la qualité de l’information transmise au clinicien par des laboratoires différents.

55

4557_2_.book Page 56 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Références bibliographiques Arzoglou P, Goudoula C, Tsantili P, Lessinger JM, Férard G, Mignot V, Samyn N, Demeester J, Lauwers A, Brettschneider H, Ceriotti F, Avranas A, Profilis C, Colinet C (1994). Transferability of lipase titrimetric assay : deductions from an interlaboratory study. Eur J Clin Chem Clin Biochem, 32 : 773-777. Bais R, Edwards JB (1982). Creatine kinase. Crit Rev Clin Lab Sci, 16 : 291-335. Canalias F, Camprubi S, Sanchez A, Gella FJ (2006). Metrological traceability of values for catalytic concentration of enzymes assigned to a calibration material. Clin Chem Lab Med, 44 : 333-339. Férard G, Edwards J, Kanno T, Lessinger JM, Moss DW, Schiele F, Tietz NW, Vassault A (1996). Interassay calibration as a major contribution to the comparability of results in clinical enzymology. Clin Biochem, 31 : 489-494. Férard G, Edwards J, Kanno T, Lessinger JM, Moss DW, Schiele F, Tietz NW, Vassault A (1996). Validation of an enzyme calibrator – An IFCC guideline. Clin Biochem, 31 : 495-500. Férard G, Lessinger JM (1998). Preparation of enzyme calibration materials. Clin Chim Acta, 278 : 151-162. Férard G, Lessinger JM (2000). L’enzymologie clinique des années 2000 : vers une meilleure efficacité pour le clinicien et le patient. Ann Biol Clin, 58 : 380-383. HAS (2009). Évaluation de l’amylasémie et de la lipasémie pour le diagnostic initial de la pancréatite aiguë. Haute Autorité de Santé, Paris, http ://www.has-sante.fr Hohnadel DC (2003). Isoenzymes and isoformes. In : Kaplan LA, Pesce AJ, Kazmierczak SC. Clinical chemistry : theory, analysis, correlation. Mosby, St. Louis, Missouri, 1043-1063. Huijgen HJ, Sanders GTB, Koster RW, Vreeken J, Bossuyt PMM (1997). The clinical value of lactate dehydrogenase in serum : a qualitative review. Eur J Clin Chem Biochem, 35 : 569-579. Infusino I, Bonora R, Panteghini M (2007). Traceability in clinical enzymology. Clin Biochem Rev, 28 : 155-161. Infusino I, Schumann G, Ceriotti F, Panteghini M (2010). Standardization in clinical enzymology : a challenge for the theory of metrological traceability. Clin Chem Lab Med, 48 : 301-307. Lang H, Wurtzburg U (1982). Creatine kinase, an enzyme of many forms. Clin Chem, 28 : 1439-1447. Lessinger JM, Arzoglou PL, Férard G (1986). Evidence for multiple forms of pancreatic lipase in human plasma. In : Moss DW, Schmidt E, Schmidt FW. Advances in Clinical Enzymology, Vol. 3, Karger, Basel, 139-150. Lessinger JM, Férard G, Grafmeyer D, Labbé D, Maire I, Schiele F, Vassault A (1995). Usefulness of reference materials in calibration of enzyme activities. Eur. J Clin Chem Clin Biochem, 33 : 859-864. Lessinger JM, Dourson JL, Férard G (1996). Importance of standardization of lipase assays by using appropriate calibrators. Clin Chem, 42 : 1979-1983. Lessinger JM, Parashou S, Arzoglou P, Ramos P, Chapus C, Dufaux J, Junge W, Profilis C, Férard G (2004). Determination of lipase catalytic activity in two reference materials : BCR 693 and BCR 694 by titrimetry at constant pH. Clin Chem Lab Med, 2004, 42 : 62-66. Lott JA, Patel ST, Sawney AK, Kazmierczak SC, Love JE Jr (1986). Assays of serum lipase : analytical and clinical consideration. Clin Chem, 32 : 1290-1302.

56

Lott JA, Ellison EC, Applegate D (1989). The importance of objective data in the diagnosis of pancreatitis. Clin Chim Acta, 183 : 33-40. Lott JA, Lu CJ (1991). Lipase isoforms and amylase isoenzymes : assays and application in the diagnosis of acute pancreatitis. Clin Chem, 37 : 361-368. Mifflin TE, Bruns DE, Wrotnoski U, MacMillan RH, Stallings RG, Felder RA, Herold DA (1985). University of Virginia case conference. Macroamylase, macro creatine kinase, and other macroenzymes. Clin Chem, 31 : 1743-1748. Moss DW (1982). Alkaline phophatase isoenzymes. Clin Chem, 28 : 2007-2016. Moss DW (1987). Diagnostic aspects of alkaline phosphatase and its isoenzymes. Clin Biochem, 20 : 225-230. Moss DW, Maire I, Calam DH, Gaines Das RE, Lessinger JM, Gella F, Férard G (1994). Reference materials in clinical enzymology : preparation, requirements and practical interests. Ann Biol Clin, 52 : 189-198. Moss DW, Hendersen AR (1999). Clinical enzymology. In : Burtis CA, Ashwood ER. Tietz textbook of clinical chemistry. Saunders, 617721. Müller MM (2000). Implementation of reference systems in clinical medicine (2001). Clin Chem, 12 : 1997-1999. Nemesánszky E, Lott JA (1985). Gamma-glutamyltransferase and its isoenzymes : progress and problems. Clin Chem, 31 : 797-803. Niemela O (2007). Biomarkers in alcoholism. Clin Chim Acta, 377 : 3949. Panteghini M. Aspartate aminotransferase isoenzymes (1990). Clin Biochem, 23 : 311-319. Panteghini M, Ceriotti F, Schumann G, Siekmann J (2001). Establishing a reference system in clinical enzymology. Clin Chem Lab Med, 39 : 795-800. Panteghini M, Forest JC (2005). Standardisation in laboratory medicine : new challenges. Clin Chim Acta, 355 : 1-12. Penn R, Worthington DJ (1983). Is gamma-glutamyltransferase a misleading test ? Br Med J, 286 : 831-535. Reij R (1989). Aminotransferases in disease. Clin Lab Med, 9 : 667687. Reij R (1998). They use enzymes for everything ! Clin Clem, 44 : 11491153. Remaley AT, Wilding P (1989). Macroenzymes : biochemical characterisation, clinical significance, and laboratory detection. Clin Chem, 35 : 2261-2270. Sanhai WR, Christenson RH (2003). Isoenzymes and isoformes. In : Kaplan LA, Pesce AJ, Kazmierczak SC. Clinical chemistry : theory, analysis, correlation. Mosby, St. Louis, Missouri, 1064-1072. Scharnhort V, Apperloo J, Baadenhuijsen H, Vader HL (2004). Multicenter evaluation of the commutability of potential reference material for harmonisation of enzyme activities. Clin Chem Lab Med, 42 : 1401-1407. Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, Clerc-Renaud P, Ferrero CA, Férard G, Franck PFH, Gella FJ, Hoelzel W, Jørgensen PJ, Kanno T, Kessner A, Klauke R, Kristiansen N, Lessinger JM, Linsinger TPJ, Misaki H, Panteghini M, Pauwels J, Schimmel HG, Vialle A, Weidemann G, Siekmann L (2002). IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of

4557_2_.book Page 57 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Enzymologie clinique

enzymes at 37 °C. Part 2. Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of creatine kinase [ATP : Creatine N-Phosphotransferase (CK), EC 2.7.3.2]. Clin Chem Lab Med, 40 : 635-642.

Schumann G, Canalias F, Jørgensen PL, Kang D, Lessinger JM, Klauke R (2010). IFCC reference procedures for catalytic concentration measurement of enzymes : corrigendum, notes and useful advice. Clin Chem Lab Med, 48 : 615-621.

Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, Clerc-Renaud P, Ferrero CA, Férard G, Franck PFH, Gella FJ, Hoelzel W, Jørgensen PJ, Kanno T, Kessner A, Klauke R, Kristiansen N, Lessinger JM, Linsinger TPJ, Misaki H, Panteghini M, Pauwels J, Schimmel HG, Vialle A, Weidemann G, Siekmann L (2002). IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 °C. Part 3. Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of lactate dehydrogenase [LLactate : NAD+ Oxidoreductase (LDH), EC 1.1.1.27]. Clin Chem Lab Med, 40 : 643-648.

Schumann G, Klauke R, Canalias F, Bossert-Reuther S, Franck PFH, Gella FJ, Jørgensen PJ, Kang D, Lessinger JM, Panteghini M, Ceriotti F (2011). IFCC Primary Reference Procedures for the Measurement of Catalytic Activity Concentrations of Enzymes at 37 °C. Part 9. Reference Procedure for the Measurement of Catalytic Concentration of Alkaline Phosphatase [OrthophosphoricMonoester Phosphohydrolase, Alkaline Optimum, EC 3.1.3.1]. Clin Chem Lab Med (in press).

Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, Férard G, Ferrero CA, Franck PFH, Gella FJ, Hoelzel W, Jørgensen PJ, Kanno T, Kessner A, Klauke R, Kristiansen N, Lessinger JM, Linsinger TPJ, Misaki H, Panteghini M, Pauwels J, Schiele F, Schimmel HG, Weidemann G, Siekmann L (2002). IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 °C. Part 4. Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of alanine aminotransferase [L-Alanine : 2-Oxoglutarate Aminotransferase (ALT), EC 2.6.1.2]. Clin Chem Lab Med, 40 : 718-724. Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, Férard G, Ferrero CA, Franck PFH, Gella FJ, Hoelzel W, Jørgensen PJ, Kanno T, Kessner A, Klauke R, Kristiansen N, Lessinger JM, Linsinger TPJ, Misaki H, Panteghini M, Pauwels J, Schiele F, Schimmel HG, Weidemann G, Siekmann L (2002). IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 °C. Part 5. Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of aspartate aminotransferase [L-Aspartate : 2-Oxoglutarate Aminotransferase (AST), EC 2.6.1.1]. Clin Chem Lab Med, 40 : 725-733. Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, Férard G, Ferrero CA, Franck PFH, Gella FJ, Hoelzel W, Jørgensen PJ, Kanno T, Kessner A, Klauke R, Kristiansen N, Lessinger JM, Linsinger TPJ, Misaki H, Panteghini M, Pauwels J, Schiele F, Schimmel HG, Weidemann G, Siekmann L (2002). IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 °C. Part 6. Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of γ-glutamyltransferase [(γ-Glutamyl)-Peptide : Amino AcidGlutamyltransferase (GGT), EC 2.3.2.1]. Clin Chem Lab Med, 40 : 734-738.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Schumann G, Klauke R (2003). New IFCC reference procedures for the determination of catalytic activity concentrations of five enzymes in serum : preliminary upper reference limits obtained in hospitalized subjects. Clin Chim Acta, 327 ; 69-79. Schumann G, Aoki R, Ferrero CA, Ehlers G, Férard G, Gella FJ, Jørgensen PJ, Kanno T, Kessner A, Klauke R, Kytzia HJ, Lessinger JM, Miller WG, Nagel R, Pauwels J, Schimmel H, Siekmann L, Weidemann G, Yoshida K, Ceriotti F (2006). IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 °C. Part 8. Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of alpha-amylase [alphaAmylase : 1,4-alpha-D-glucan 4-glucanohydrolase (AMY), EC 3.2.1.1]. Clin Chem Lab Med, 44 : 1146-1155.

Schwartz NK (1973). Enzymes in cancer. Clin Chem, 19 : 10-22. Siekmann L, Bonora R, Burtis CA, Ceriotti F, Clerc-Renaud P, Férard G, Ferrero CA, Forest JC, Franck PFH, Gella FJ, Hoelzel W, Jørgensen PJ, Kanno T, Kessner A, Klauke R, Kristiansen N, Lessinger JM, Linsinger TPJ, Misaki H, Müller MM, Panteghini M, Pauwels J, Schiele F, Schimmel HG, Vialle A, Weidemann G, Schumann G (2002). IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 °C. Part 1. The concept of reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes. Clin Chem Lab Med, 40 : 631634. Siekmann L, Bonora R, Burtis CA, Ceriotti F, Clerc-Renaud P, Férard G, Ferrero CA, Forest JC, Franck PFH, Gella FJ, Hoelzel W, Jørgensen PJ, Kanno T. Kessner A, Klauke R, Kristiansen N, Lessinger JM, Linsinger TPJ, Misaki H, Müller MM, Panteghini M Pauwels J, Schiele F, Schimmel HG, Vialle A, Weidemann G, Schumann G (2002). IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 °C. Part 7. Certification of four reference materials for the determination of enzymatic activity of γ-glutamyltransferase, lactate dehydrogenase, alanine aminotransferase and creatine kinase according to IFCC reference procedures at 37 °C. Clin Chem Lab Med, 40 : 739-745. Sturk A, Sanders GTB (1990). Macro enzymes : prevalence, composition, detection and clinical relevance. J Clin Chem Clin Biochem, 26 : 65-81. Tietz NW (1988). Amylase measurements in serum – old myths die hard. J Clin Chem Clin Biochem, 26 : 251-253. Tietz NW, Astles JR, Shuey DF (1989). Lipase activity measured in serum by a continuous-monitoring pH-stat technique – An update. Clin Chem, 35 : 1688-1693. Tietz NW, Shuey DF (1993). Lipase in serum – the elusive enzyme. Clin Chem, 38 : 1000-1010. Toussaint B, Emons H, Schimmel HG, Bossert-Reuther S, Canalias F, Ceriotti F, Férard G, Ferrero CA, Franck PFH, Gella FJ, Henny J, Jørgensen PJ, Klauke R, Lessinger JM, Mazziotta D, Panteghini M, Ueda S, Schumann G (2010). Traceability of values for catalytic activity concentration of enzymes : a Certified Reference Material for aspartate transaminase. Clin Chem Lab Med, 48 : 795-803. Whitfield LB (2001). Gamma glutamyl transferase. Crit Rev Clin Lab Sci, 38 : 263-355. Wolf PL (2006). History of diagnostic enzymology. Clin Chim Acta, 396 : 144-147.

57

4557_2_.book Page 58 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4557_2_.book Page 59 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4 Biologie et essais cliniques Jean-Marie Bard, Murielle Cazaubiel, Adeline Filliâtre

INTRODUCTION 1 ■■ DÉFINITIONS 2 ■■ L’ENVIRONNEMENT NORMATIF ET RÉGLEMENTAIRE DES ESSAIS CLINIQUES 2.1. 2.2. 2.3.

Les Bonnes Pratiques Cliniques Les autres normes de qualité Les textes réglementaires français

3 ■■ LE RÔLE ET LES ENGAGEMENTS DU BIOLOGISTE DANS LE CADRE DES ESSAIS CLINIQUES

3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6.

Place du laboratoire dans les essais cliniques Le choix d’un référentiel de qualité Le choix des marqueurs Les engagements du biologiste Le suivi des essais La question des collections d’échantillons biologiques

CONCLUSION

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Références bibliographiques

59

4557_2_.book Page 60 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4557_2_.book Page 61 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biologie et essais cliniques

INTRODUCTION La plupart des essais cliniques conduisent à la réalisation de dosages biologiques qu’il faut savoir gérer. Le laboratoire joue généralement un rôle de premier plan pour assurer la qualité des données générées par l’essai clinique. Encore faut-il que le biologiste prenne les précautions nécessaires pour pouvoir démontrer à tout moment et parfois plusieurs années après la fin de l’essai, que les analyses ont été réalisées dans des conditions garantissant leur qualité. Parce que la gestion d’un essai clinique répond à des règles spécifiques, le travail du biologiste agissant dans ce contexte peut être modifié par rapport à la pratique habituelle. Nous décrirons, dans ce chapitre, quelles sont les lignes directrices de la gestion des analyses de biologie réalisées dans le cadre de l’essai clinique.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

1 ■■ DÉFINITIONS Au sens des lois française et européenne, on entend par essai clinique toute recherche organisée et pratiquée sur l’être humain en vue du développement des connaissances biologiques ou médicales. Il s’agit donc le plus souvent d’une recherche destinée à mettre en évidence l’activité thérapeutique ou l’innocuité d’une molécule mais les recherches à visée purement cognitive ou celles portant sur les dispositifs médicaux, les cosmétiques, les aliments et compléments alimentaires et… les produits de tatouage sont également concernées par la loi. Toute recherche réalisée sur l’être humain, en dehors de celles destinées à évaluer les pratiques médicales courantes et ne s’accompagnant ni d’une procédure particulière de suivi ni d’acte invasif, est donc concernée par la loi sur les recherches biomédicales. – Les actes réalisés dans le cadre de cette recherche doivent l’être conformément aux « Bonnes Pratiques Cliniques » (BPC). Celles-ci, ainsi que la loi sur les recherches biomédicales définissent les principaux acteurs de la recherche. – Le volontaire représente l’acteur principal de l’essai clinique dans le sens où tout ce qui sera mis en œuvre, en termes de management de la qualité et de suivi, vise à garantir sa sécurité. Il s’agit de la personne, souffrant ou non d’une pathologie déterminée, qui accepte de se prêter à la recherche. – Le promoteur représente la personnalité physique ou morale prenant l’initiative de la recherche. Il est responsable du bon déroulement de l’essai et doit tout mettre en œuvre pour assurer la qualité des données générées dans le cadre de cet essai. Il doit en particulier organiser un système de monitoring de l’essai, représentant le contrôle qualité des données, réalisé par les moniteurs ou les attachés de recherche clinique (ARC). – Le terme d’investigateur désigne en général le médecin en charge de la sécurité du volontaire qu’il suit au quotidien. Cependant, on peut assimiler le biologiste, comme le pharmacien au groupe investigateur même si le langage commun et le décret d’application de la Loi sur la Recherche Biomédicale désignent habituellement le médecin sous cet intitulé.

– On regroupe sous le terme « autorités de tutelle » les différents organismes ayant en charge l’autorisation et la surveillance de l’essai. Il s’agit, en France, d’une organisation bicéphale. Une autorisation de mener l’essai doit être obtenue de l’AFSSAPS et d’un Comité de Protection des Personnes (CPP) avant toute inclusion de volontaire dans l’essai. L’AFSSAPS juge du caractère scientifique de l’étude envisagée et le CPP juge plutôt du respect de l’éthique et de la qualité de l’information portée à la connaissance des volontaires. Le CPP peut cependant s’attacher, dans la mesure de la compétence de ses membres, à juger partiellement du caractère scientifique de l’étude puisque ce qui n’est pas scientifique n’est pas éthique. C’est la raison pour laquelle certaines spécialités médicales et des méthodologistes doivent figurer parmi les membres des CPP. Une organisation similaire est retrouvée dans chaque pays européen, ainsi qu’aux États-Unis et au Japon mais les BPC, dans leur version originale, utilisent néanmoins le terme plus général de « Comité d’Éthique » pour désigner l’entité en charge de la vérification préalable du caractère éthique de la recherche.

2 ■■ L’ENVIRONNEMENT NORMATIF ET RÉGLEMENTAIRE DES ESSAIS CLINIQUES La réalisation des essais cliniques s’effectue dans un contexte normatif et réglementaire particulier. La référence à une norme ou un référentiel de qualité n’engage les acteurs des essais cliniques que dans le cadre des relations « client-fournisseur » qu’ils peuvent avoir les uns avec les autres. Elle a donc un caractère facultatif, tant qu’un texte législatif n’a pas rendu obligatoire l’application de cette norme. C’est très exactement ce qui relie le référentiel BPC à la loi sur les recherches biomédicales. Avant la publication de cette loi, dont la première version date de décembre 1988, la mise en application des BPC gardait un caractère facultatif. Aujourd’hui, dans la mesure où l’essentiel des recommandations figurant dans les BPC est repris dans la loi sur les recherches biomédicales, le non-respect de cette norme est passible de poursuites pénales. On peut donc distinguer les référentiels et normes de qualité, dont le respect reste facultatif pour certains d’entre eux et les textes législatifs et réglementaires.

2.1.

Les Bonnes Pratiques Cliniques

Le premier de ces référentiels, considéré comme incontournable est donc représenté par les BPC. Celles-ci précisent les différents éléments à mettre en œuvre pour garantir l’éthique et la protection des personnes. Elles ont évolué parallèlement dans les différents pays et il s’est développé ces dernières années un effort d’harmonisation des bonnes pratiques des continents américain, asiatique et européen. Les conférences d’harmonisation (International Conference of Harmonization ou ICH) ont édicté des référentiels parmi lesquels on trouvera les BPC-ICH.

61

4557_2_.book Page 62 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

2.1.1. Historique La véritable raison d’être et le fil conducteur des BPC sont représentés par l’éthique. Ces règles d’éthique se sont progressivement imposées à la suite des horreurs commises pendant la Seconde Guerre mondiale. Des initiatives distinctes furent prises dans le cadre du renouveau politique, juridique et philosophique qui a fait suite au scandale d’une science et d’une technique mises au service de la barbarie et du crime contre l’humanité. D’une part, la Déclaration universelle des droits de l’homme du 10 décembre 1948 affirme, dans son article 3, « le droit à la vie pour tout individu » et condamne, en son article 5, « la torture, les traitements cruels, inhumains ou dégradants ». D’autre part, des déclarations plus spécialisées ont été émises conformément aux principes fondamentaux énoncés par le tribunal de Nuremberg les 19 et 20 août 1947 sur les conditions de l’expérimentation médicale. L’Association Médicale Mondiale a été à l’origine de plusieurs textes définissant l’éthique médicale pour aboutir à la Déclaration d’Helsinki, adoptée en 1964 et révisée à Tokyo en 1975, Venise en 1983, Hong Kong en 1989, Somerset West en 1996, Edimbourg en 2000 puis Séoul en 2008. C’est finalement la version en vigueur de la déclaration d’Helsinki, d’octobre 2008, qui constitue la base éthique des essais cliniques et guide les médecins dans les recherches biomédicales portant sur l’être humain.

2.1.2. Les éléments de la protection des personnes Partant de ces bases éthiques, les BPC intègrent les deux éléments majeurs de la protection des personnes que sont l’existence des Comités d’Éthique et celle du consentement éclairé. ■ Les Comités d’Éthique

Des initiatives du corps médical, parallèlement à la rédaction des recommandations internationales, conduisent à l’organisation des modalités du contrôle éthique de l’expérimentation, à l’hôpital et dans les organismes de recherche. Suivant le lieu géographique concerné et selon les particularismes culturels, des comités locaux de composition très variable, intégrant plus ou moins de représentants des professions non médicales, se sont créés. En France, cette prolifération et cette diversité ont inquiété. La loi sur la protection des personnes qui se prêtent à des recherches biomédicales (n° 88-1138 du 20 décembre 1988 modifiée par la loi n° 90-86 du 23 janvier 1990 puis par la loi n° 2004-806 du 9 août 2004) a légalisé leur rôle et les a dotés d’une personnalité juridique. Par les arrêtés des 12, 19 et 26 juin 2006, le nombre de ces comités, dits Comités de Protection des Personnes (CPP) a été fixé à 40, répartis dans les différentes inter-régions. Les BPC reprennent donc comme élément de base de la protection des personnes l’existence d’un comité indépendant, constitué de membres médecins, de scientifiques et de membres non scientifiques, chargé d’assurer la protection des droits, de la sécurité et du bien-être des participants à un essai. D’une manière générale, dans les BPC, ce comité est appelé Independent Ethics Committee. En France ce Comité, tel que défini dans la loi sur les recherches biomédicales est donc le CPP. Plus précisément, les responsabilités dévolues aux comités d’éthique sont :

62

– Vérifier l’adéquation du protocole aux objectifs de l’étude, la possibilité de parvenir à des conclusions sûres avec une exposition aussi limitée que possible des personnes au risque, la justification des risques et inconvénients par rapport aux avantages prévus pour les personnes participant à l’essai et les autres personnes. – Vérifier le caractère complet et la qualité des informations écrites à communiquer aux participants, ainsi que les modalités de recueil du consentement des participants. – Vérifier la capacité des investigateurs à réaliser l’essai : qualification, expérience, moyens logistiques, équipe… Il est donc bien évident que le laboratoire est concerné par ce point spécifique. – Vérifier les dispositions prévoyant l’indemnisation et/ou le traitement des sujets en cas de dommage ou décès pouvant être attribué à l’essai, les assurances couvrant la responsabilité du promoteur et de l’investigateur. – Vérifier le caractère « normal » des rémunérations envisagées pour l’investigateur participant à l’essai. En France la loi DMOS (Diverses Mesures d’Ordre Social) complète les recommandations BPC puisqu’elle oblige les investigateurs à déclarer leur rémunération au Conseil de l’ordre dont ils dépendent. – Vérifier la nature des indemnisations prévues pour les participants. L’objectif est ici de vérifier que la rémunération n’est pas telle qu’elle puisse induire un lien de dépendance du participant vis-à-vis de l’essai. La rémunération doit par ailleurs être proportionnelle à la participation et ne pas dépendre de l’engagement du sujet à participer à la totalité de l’essai. Sur l’examen de ces différents aspects, le comité donne un avis qui doit être favorable pour avoir le droit de commencer l’essai. Par la suite, le comité doit effectuer une revue régulière des essais en cours, au moins une fois par an. En particulier, il doit être tenu informé de tout événement indésirable grave pouvant affecter la sécurité des personnes. Chaque fois qu’une modification du protocole remet en cause le caractère éthique de l’essai, un nouvel avis doit être de nouveau demandé. Les autres modifications mineures (amendements) font l’objet d’une simple déclaration avec avis simplifié. ■ Le consentement éclairé

Le principe d’un consentement éclairé figure dans la déclaration d’Helsinki. Il a donc été repris dans les BPC et la loi sur les Recherches Biomédicales et doit donc être respecté pour tout essai clinique. Le consentement doit être libre, éclairé et exprès. Cela impose donc qu’il y ait une information, d’où la nécessité de rédiger une lettre d’information compréhensible par une personne non initiée au fait médical. Cette information doit mentionner clairement que le sujet a toujours le droit de refuser de participer à l’essai, sans préjudice pour son suivi médical et que, même en cas d’acceptation, il peut toujours se retirer sans avoir à se justifier. Il doit être clair que le volontaire a donné son consentement d’où la nécessité d’apposer une signature en bas du consentement. La lettre d’information doit préciser les objectifs de la recherche, sa méthodologie (notamment l’existence éventuelle d’un placebo) et sa durée. Elle doit également préciser quels sont les bénéfices attendus, les contraintes et les risques prévisibles. On

4557_2_.book Page 63 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biologie et essais cliniques

doit également mentionner l’avis du comité d’éthique. Les procédures d’indemnisation en cas de dommage doivent être précisées. La personne doit également être informée que des informations personnelles pourront être utilisées par des personnes compétentes mais qu’elles seront traitées et conservées de manière anonyme. En France, la loi informatique et libertés permet de garantir cet anonymat. C’est la raison pour laquelle tout fichier de données personnelles doit être déclaré à la Commission Nationale Informatique et Libertés (CNIL). Un certain nombre de cas particuliers doivent être considérés. Ces cas particuliers imposent la signature d’un représentant légal ou d’un témoin impartial (BPC-ICH) qui atteste ainsi que l’information lui a été donnée ou a été donnée au sujet et qu’elle a été comprise par le témoin ou le sujet. Il s’agit essentiellement des cas d’urgence et de malades inconscients et des mineurs et majeurs protégés par la loi.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

2.1.3. Les responsabilités des intervenants Les BPC sont très précises quant aux responsabilités des intervenants dans l’essai clinique. Nous ne détaillerons ici que celles qui peuvent avoir un impact sur le fonctionnement du laboratoire de biologie. L’une des responsabilités essentielles du promoteur est de s’assurer de la qualité des données générées au cours de l’essai. Ceci implique un suivi (monitorage) quotidien assuré par un personnel spécialisé, les moniteurs et les ARC. Ceux-ci ont donc pour mission de visiter les investigateurs, avant, pendant et après l’essai. Cela signifie qu’ils sont amenés à visiter le laboratoire de biologie impliqué dans un essai clinique pour vérifier qu’il dispose bien des équipements, du personnel et de l’organisation nécessaires au bon déroulement de l’essai. À cette étape, ils doivent vérifier la qualification des personnels impliqués. Il n’est donc pas étonnant qu’ils souhaitent se procurer le Curriculum Vitae du biologiste responsable. Avant le démarrage de l’essai, ils organisent une visite dite de mise en place au cours de laquelle ils pourront être amenés, le cas échéant, à présenter l’utilisation d’un matériel spécifique à l’essai pour la réalisation des prélèvements. Il n’est pas rare, à ce sujet, que des kits spécifiques de prélèvement soient fournis afin de standardiser cette phase essentielle de l’analyse. Ils réalisent également des opérations de suivi durant le déroulement de l’essai qui consistent à vérifier que les données reportées pour chaque volontaire ne sont pas erronées. Lors de cette étape, les ARC peuvent donc être amenés à visiter le laboratoire. Enfin, l’essai se termine par une visite de fermeture qui consiste à vérifier que l’ensemble des données est disponible et à reprendre l’ensemble du matériel spécifique à l’essai. Le promoteur a également la responsabilité de mettre en œuvre un système de management de la qualité qui permette d’assurer la « traçabilité » des données. Cela signifie qu’il doit établir des procédures opératoires (Standard Operating Procedure (SOP)) pour toutes les opérations réalisées dans le cadre de l’essai. Certaines d’entre elles concernent le laboratoire de biologie et il faut donc s’y conformer. Cela signifie également qu’il doit organiser un système de contrôle permettant de s’assurer, au travers d’audits, qu’on ne dérive pas par rapport à ce qui est décrit dans les procédures. Les laboratoires impliqués dans un essai clinique

doivent donc accepter ces audits, au risque de rendre caduques les données générées. En tant qu’investigateur le biologiste a donc la responsabilité de se conformer aux procédures spécifiques de l’essai et en particulier au protocole de l’étude qui précise toutes les étapes de l’essai, notamment les analyses à réaliser dans le cadre du suivi des volontaires. Afin de permettre la vérification a posteriori des données générées, le biologiste doit mettre en œuvre un système d’archivage adéquat. Rappelons à ce sujet que les durées d’archivage sont précisées par Arrêté du 8 novembre 2006 et fixées à 15 années après la fin de la recherche biomédicale concernée.

2.1.4. Les moyens à mettre en œuvre À partir de ces constatations, on comprend aisément quels sont les moyens principaux à mettre en œuvre pour réaliser un essai clinique. Le premier de ces moyens concerne la rédaction de procédures. En effet, l’improvisation n’a pas sa place dans ce domaine. Il faut donc préparer des procédures écrites pour chaque étape de la réalisation de l’essai. Pour être utilisables ces procédures doivent être adaptées à l’organisation et aux habitudes de l’entreprise. L’écueil à éviter est donc d’envisager l’application de procédures écrites pour une autre entreprise. Parallèlement aux procédures opératoires, le protocole doit définir clairement les objectifs et la méthodologie de l’essai et doit répondre à tous les problèmes que se posent les participants à l’essai, y compris le biologiste. Le deuxième point essentiel consiste à garder des traces écrites de toutes les opérations effectuées. À toutes les étapes il est nécessaire d’avoir des traces écrites datées et signées. Des vérifications (contrôle de qualité) doivent avoir lieu à chaque étape, liste de vérification à l’appui. L’objectif des traces écrites est de permettre la vérification a posteriori des données puisqu’elles seront archivées. L’une des conséquences principale est l’existence d’un cahier d’observations pour chaque volontaire ou seront recueillies l’ensemble des données cliniques et biologiques. Ce cahier d’observations constitue une annexe du protocole. Le troisième point a déjà été mentionné plus haut puisqu’il est relatif à la mise en place des audits. Ceux-ci doivent être réalisés par une personne indépendante de la réalisation de l’essai qui vérifie l’application des procédures pour éviter les dérives nées de la routine. Enfin, l’essai clinique peut donner lieu à des inspections. Il s’agit de la vérification de la réalisation d’un essai par les autorités de tutelle dans le but de valider les données soumises pour l’enregistrement du produit ou l’approbation d’une nouvelle indication.

2.2.

Les autres normes de qualité

2.2.1. La certification ISO 9001 Même si les BPC constituent le référentiel incontournable pour tout acteur d’un essai clinique, il peut être utile de se conformer parallèlement à d’autres référentiels. Parmi ceux-ci, on peut faire une place particulière aux normes ISO (International Organization for Standardization). Pour le laboratoire qui veut se constituer en

63

4557_2_.book Page 64 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

« laboratoire central » des essais cliniques, recevant les prélèvements provenant de l’ensemble des centres investigateurs, l’application de la norme ISO 9001-2008 peut être un objectif. Les normes ISO 9000 décrivent l’ensemble des dispositions à prendre dans l’entreprise pour mettre en œuvre un système de management de la qualité. L’objectif de l’application de ces normes est double. Il s’agit d’abord de démontrer que l’entreprise est apte à fournir régulièrement un produit ou un service conforme aux exigences de ses clients. Il s’agit ensuite de satisfaire les clients par l’application efficace du système. On comprend dès lors qu’il s’agit d’une norme très générale applicable dans tous les secteurs économiques. La principale originalité de cette norme est la mise en œuvre d’un système d’amélioration continue de la qualité qui exige la mise en place d’indicateurs de satisfaction du client et de processus de prévention des non-conformités. Le laboratoire, assimilable à une activité de service, peut être intéressé à appliquer la norme 9001 qui regroupe depuis 2000 les anciennes normes 9001, 9002 et 9003. Le texte de la norme présente les quatre processus principaux : responsabilité de la direction, management des ressources, réalisation du produit et mesure, analyse et amélioration. Plusieurs types de documents sont exigés par la norme ISO 9001-2000 : ■ L’expression documentée de la politique et des objectifs qualités

L’expression de cette politique doit passer par un texte court, d’une page environ, et doit permettre la compréhension, par l’ensemble de l’entreprise, des objectifs qualités. Ce texte doit également démontrer l’engagement du chef d’entreprise pour la qualité. ■ Le Manuel Qualité

Il décrit l’organisation de l’entreprise au travers du système de management de la qualité mis en œuvre. Il est généralement organisé en deux grands chapitres : la description de l’organisation et le système de management de la qualité. Ce document est un outil de travail interne de l’entreprise mais il peut également être montré à un client pour lui permettre de prendre connaissance de l’organisation de l’entreprise. ■ Les procédures exigées par la norme

• – – – – – – •

La norme ISO 9001-2000 exige la rédaction de six procédures : La maîtrise de la documentation La maîtrise des enregistrements qualité L’audit interne La maîtrise du produit non conforme Les actions correctives Les actions préventives Les autres procédures sont au choix de l’entreprise et dépendent de sa propre organisation.

■ Les documents nécessaires au bon fonctionnement de l’entreprise

Il s’agit des documents utilisés chaque jour par l’entreprise : catalogues, factures, bons de commande, fiches techniques… D’autres documents peuvent avoir une utilité non négligeable, comme les fiches de description de fonction, les fiches de formation du personnel, le livret d’accueil des nouveaux employés…

64

■ Les enregistrements qualité

Pour démontrer la conformité aux exigences et pour prouver l’efficacité du système de management de la qualité, l’entreprise doit établir un certain nombre d’enregistrements sur une base de formulaires types. Ces enregistrements permettent de prouver aux clients et aux auditeurs que le système est effectivement mis en œuvre et constituent une véritable base de données permettant l’analyse des dysfonctionnements et la mise en œuvre de l’amélioration continue. La certification à la norme ISO 9001-2008 est la reconnaissance, par un organisme de certification accrédité, que les exigences de la norme sont appliquées. Elle permet de démontrer que l’entreprise est apte à fournir une qualité régulière. En résumé la certification ISO n’est pas spécifique aux métiers de la biologie et des essais cliniques mais elle permet d’assurer le promoteur que le laboratoire a mis en œuvre un système de management lui permettant d’assurer la qualité de la prestation offerte au client. En terme d’organisation, la norme ISO va bien au-delà de ce qui est requis par les BPC ou le Guide de Bonne Exécution des Analyses (GBEA) décrit ci-dessous. Elle exige la description de l’activité de l’entreprise au travers de processus regroupés dans la cartographie des processus. Ceux-ci se divisent en trois grandes catégories : les processus de management, les processus de réalisation et les processus supports. Bien qu’il n’existe pas d’organisation unique de l’activité de biologie des essais cliniques, la figure 1 décrit un exemple de cartographie des processus éventuellement applicable au laboratoire de biologie.

2.2.2. L’accréditation Tandis que la certification permet de garantir qu’une entreprise met tout en œuvre pour garantir la qualité du produit qu’elle délivre à ses clients, elle n’a pas comme objectif de garantir sa conformité à un standard universel. La certification n’est donc pas spécifique d’un métier donné, comme l’atteste l’extrême diversité des secteurs économiques potentiellement concernés par cette démarche. L’accréditation permet au contraire de garantir la conformité d’une catégorie de produit donnée aux standards reconnus par la profession. Elle permet de garantir la compétence technique dans un domaine particulier. Elle est donc complémentaire et indépendante de la certification. L’accréditation des laboratoires de biologie atteste de l’adhésion à un certain nombre de standards que l’on peut regrouper en plusieurs catégories : – La première concerne la qualification, les responsabilités et le rôle du directeur du laboratoire. – La seconde regroupe l’ensemble des règles relatives aux locaux, l’hygiène et la sécurité, notamment les équipements, les systèmes d’information et de communication, la ventilation, la sécurité incendie… – La troisième est relative aux contrôles et à l’amélioration de la qualité, la maintenance des appareils et le management de la qualité. L’accréditation est délivrée par des organismes spécialisés qui prennent leur décision à l’issue d’une inspection. En France, le COFRAC (Comité Français d’Accréditation) est en mesure de délivrer une accréditation pour un laboratoire de biologie. L’appli-

4557_2_.book Page 65 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biologie et essais cliniques

Processus de pilotage Management Engagement du directeur Politique qualité Stratégie Planification Revues de direction

Système de management de la qualité Communication interne de la démarche qualité Documentation Amélioration continue

BESOINS CLIENTS

Conception et développement Identification, planification, revue des projets

Relations clients Prospection Faisabilité Revue des contrats

Préparation de l’essai Préparation des kits Documents Programmation

Gestion de l’essai Suivi Contrôles Validation

Data management Création base de données Exportation des données

SATISFACTION CLIENTS

Processus de réalisation

Processus support

Ressources Humaines Recrutement Formation

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Figure 1

■

Achats Approvisionnement Réactifs Matériel

Informatique Organisation du système d’information

Un exemple de cartographie des processus selon la norme ISO 9001-2008.

cation de la norme ISO 15189, norme internationale édictée par l’ISO en 2003 spécifiant les exigences de qualité et de compétence propres aux laboratoires de biologie médicale (LBM) permet de concilier les exigences de la certification ISO 9001-2008 et les exigences spécifiques à la biologie médicale. Cette norme est spécifique aux LBM à la différence de la norme ISO 17025 qui concerne tous les laboratoires d’analyses et d’essais. Le système de management de la qualité des laboratoires accrédités 15189 est fondé sur la norme ISO 9001. Cependant, une accréditation obtenue auprès d’un organisme américain tel que le « College of American Pathologists (CAP) » est parfois préférée des promoteurs de l’industrie pharmaceutique qui développent leur médicament pour le marché mondial et devront faire valider leurs résultats par la FDA (Food and Drug Administration) américaine. Une alternative à la norme ISO 15189, utilisée par les laboratoires réalisant exclusivement leur activité en recherche clinique peut donc être la certification ISO 9001-2008, associée à l’accréditation CAP.

2.3.

Les textes réglementaires français

2.3.1. La loi sur les recherches biomédicales Cette loi constitue le texte législatif de référence dès lors qu’on intervient dans une recherche effectuée sur l’homme. Comme il a été mentionné plus haut, cette loi publiée une première fois le 15 décembre 1988 et connue sous le nom de loi Huriet-Sérusclat, modifiée à plusieurs reprises, a rendu obligatoire l’application des BPC. Elle a été modifiée une dernière fois le 9 août 2004 dans un but d’harmonisation européenne. Dès la version initiale, cette loi reprenait les principales recommandations des BPC, notamment l’instauration du consentement éclairé et des comités d’éthique intitulés en France comités de protection. Ainsi, avant l’existence de cette loi, l’application des BPC n’avait aucun caractère obligatoire et ne s’envisageait que dans le contexte de la relation « client-fournisseur » entre l’investigateur et le promoteur. Depuis la parution de la première loi sur les recherches biomédicales,

65

4557_2_.book Page 66 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

l’application des BPC est devenue obligatoire et les manquements à leurs règles sont passibles de sanctions pénales.

2.3.2. Le Guide de Bonne Exécution des Analyses (GBEA) et l’ordonnance du 13 janvier 2010 relative à la biologie médicale Aujourd’hui, le GBEA (Guide de Bonne Exécution des Analyses) s’impose à tout laboratoire de biologie réalisant des analyses destinées au diagnostic. Il sera progressivement remplacé par la norme ISO 15189, dont la mise en œuvre dans chaque laboratoire de biologie médicale (LBM) a été rendue obligatoire par l’ordonnance 2010-49 du 13 janvier 2010. Néanmoins, l’examen du GBEA reste intéressant parce qu’il renferme un chapitre complet consacré à l’activité réalisée dans le cadre des essais cliniques. Il y est ainsi précisé que le protocole doit être établi par concertation entre les différentes parties intéressées : le promoteur, le médecin investigateur, le biologiste et le statisticien. Cette précision semble primordiale car elle permet de rappeler l’importance de la réflexion sur les analyses biologiques dans les essais cliniques. En contrepartie, le biologiste intervenant dans un essai clinique doit s’obliger à lire et critiquer le projet de protocole. Évidemment, on peut comprendre qu’une discussion préalable ne puisse pas toujours être engagée dans le cas d’un essai multicentrique faisant intervenir un grand nombre de laboratoires. Cependant, dans le cas du choix d’un seul laboratoire centralisé, qui tend à juste titre à se généraliser, cette concertation préalable, aboutissement logique du choix d’une biologie centralisée, permettrait de prendre en compte les aspects pré-analytiques et analytiques pouvant mettre en cause la qualité des résultats de l’essai clinique. On peut ainsi rappeler les éléments essentiels, concernant la biologie, qui doivent impérativement figurer dans le protocole de l’étude : – Détailler la nature, le nombre et la fréquence des examens biologiques demandés. – Préciser si le(s) médicament(s) utilisé(s) est (sont) susceptible(s) de fausser certains résultats analytiques. – Préciser l’heure de prélèvement par rapport à l’heure de l’administration médicamenteuse. – Préciser les conditions de prélèvement, d’étiquetage, de transport au laboratoire, du traitement préalable, des conditions de température et de durée de conservation des échantillons en cas d’analyse différée. – Préciser l’incidence des jours fériés. En contrepartie de ces obligations liées au promoteur ou au rédacteur du protocole, le biologiste qui accepte d’intervenir dans un essai clinique a également un certain nombre de devoirs rappelés dans le GBEA : – Adapter la méthode analytique aux exigences de l’expertise (appareillage, réactifs, étalons, contrôles). – Communiquer les performances, la précision, l’exactitude, la spécificité des méthodes utilisées. Pour cela il peut établir, avant le début de l’étude, un document général concernant l’ensemble de la méthode analytique, les modalités du contrôle de qualité, de l’expression et de la transmission des résultats. Ce document est communiqué au promoteur et aux médecins

66

investigateurs. Il a pour objectif d’engager le biologiste sur le respect de ses obligations quant au choix des méthodes analytiques, des modalités du contrôle de qualité et des délais et mode de transmission et d’expression des résultats. – Utiliser une méthode identique (mêmes réactifs, solutions de calibrage et de contrôle) pendant toute la durée de l’essai et pour tous les laboratoires impliqués dans l’essai si la solution d’un laboratoire central n’est pas retenue. – Établir des procédures opératoires claires et détaillées à l’usage du personnel chargé du prélèvement, de l’identification, du traitement préalable, du transport et de l’exécution des analyses. Enfin, correspondant à la nécessité d’introduire une concertation au moment de l’établissement du protocole, le GBEA mentionne explicitement que : « Le biologiste doit donner un avis sur les méthodes statistiques afin d’éviter de fausser les conclusions de l’étude ». Le biologiste qui s’engage à réaliser des analyses dans le cadre d’un essai clinique doit prendre un certain nombre de précautions pour se conformer au protocole et pour assurer la qualité des données et la sécurité des patients inclus dans l’essai. La plupart de ces précautions peuvent paraître correspondre à celles que l’on doit classiquement prendre dans le cadre de la biologie clinique. Cependant, elles prennent toute leur importance lorsqu’il s’agit d’un essai clinique, notamment parce que l’on retrouve une notion de risque attachée à l’administration d’un traitement dont les effets sont peu connus. Le GBEA mentionne ainsi les obligations suivantes : – Veiller à ce que les résultats des analyses qui explorent des fonctions vitales puissent être utilisés dans des délais compatibles avec la mise en œuvre d’une surveillance clinique. – Veiller à la bonne exécution des analyses en conformité avec les prescriptions du protocole. – Veiller à la validation. – Veiller à l’édition des résultats. – Veiller à la bonne et rapide transmission du compte rendu. – Veiller à l’archivage des résultats et des données brutes (y compris celles relatives au suivi de l’analyse). Deux points particuliers parmi ceux-ci méritent d’être développés. Le premier concerne la rapidité de réalisation et de transfert des résultats. En effet, la tendance actuelle est de préférer confier la réalisation des analyses de biologie à un seul laboratoire central. Cette solution est particulièrement justifiée par le fait qu’elle permet de s’affranchir de la variabilité inter-laboratoires qui renforce la puissance de l’analyse statistique de fin d’essai. Par ailleurs, le recours à un laboratoire central présente l’énorme avantage pour le promoteur de n’avoir qu’un seul interlocuteur pour la biologie, ce qui accélère la mise à disposition de la base de données finale, d’autant que certains laboratoires assurent un véritable « monitoring biologique » qui permet une correction des non-conformités au protocole au jour le jour et facilite le travail du gestionnaire de données et du biostatisticien. Néanmoins, le recours au laboratoire central doit rester compatible avec le délai d’analyse et de transmission du résultat imposé par la sécurité du patient. Il est donc bien évident que cette solution n’est envisageable que pour les analyses pouvant accepter un délai de retour du résultat de 24 à 36 heures, correspondant au temps d’achemi-

4557_2_.book Page 67 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Biologie et essais cliniques

nement du prélèvement au laboratoire central additionné du temps de réalisation de l’analyse. Cela implique donc que le laboratoire central devra avoir recours, en accord avec le promoteur, à la télétransmission des résultats. Le second point concerne l’archivage. En effet, les BPC imposent clairement un archivage des données pendant au moins 15 ans après l’achèvement ou l’interruption de l’essai. Cette obligation d’archivage concerne non seulement l’édition finale des résultats mais aussi les données brutes, en particulier les éléments de suivi de l’analyse et le contrôle de qualité, les valeurs de référence, les procédures utilisées dans le cadre de l’essai et les documents de gestion et de suivi des échantillons présents dans la sérothèque s’il y a lieu. On remarquera donc que cette obligation d’archivage va bien au-delà de ce qui est requis pour les analyses réalisées dans le cadre habituel. On ne saurait trop insister sur le fait que la participation d’un laboratoire de biologie à un essai clinique impose de se conformer au référentiel le plus exigeant sur ce point, à savoir les BPC. La question du compte rendu d’analyse délivré dans le cadre d’un essai clinique nous semble mériter une attention particulière puisqu’un essai clinique implique l’établissement d’un rapport d’analyse sensiblement différent de celui délivré dans le cadre de la biologie clinique habituelle. En effet, ce qui importe au promoteur est de pouvoir avoir une vision globale, patient par patient, des résultats obtenus à chaque visite ayant fait l’objet d’un prélèvement pour analyse. Ce document doit permettre non seulement d’établir l’éventuel effet des médicaments à l’essai sur les paramètres biologiques d’efficacité et de sécurité, mais également de vérifier l’adhérence au protocole en termes de délai entre visites et d’heure de prélèvement. Par ailleurs, ce document doit permettre d’analyser, sur le plan statistique, l’influence du délai de réalisation de l’analyse et d’une éventuelle dérive analytique. Pour toutes ces raisons, il est précisé dans le GBEA que le biologiste doit établir, pour chaque personne impliquée dans l’étude, un document récapitulatif indiquant les différents résultats avec la date et l’heure de prélèvement et celle de l’exécution de l’analyse, les résultats des échantillons de contrôle avec les mêmes renseignements chronologiques, les remarques éventuelles et les incidents survenus. C’est donc à ce niveau que l’on pourra faire part de commentaires sur la qualité de l’échantillon (hémolyse, opalescence…) et les difficultés éventuelles lors de la réalisation de l’analyse. Rappelons enfin qu’à la différence de l’activité habituelle liée au diagnostic ce compte rendu doit être anonyme, le promoteur ne devant en aucun cas avoir connaissance de l’identité du volontaire, a fortiori pour des données destinées à être informatisées.

2.3.3. Les autres textes à prendre en compte À côté de ces deux textes réglementaires incontournables, il faut rappeler que le biologiste impliqué dans un essai clinique devra tenir compte de : – La loi DMOS qui l’oblige à déclarer auprès du Conseil de l’Ordre dont il dépend, les honoraires perçus de l’industrie délivrant des produits remboursés par la Sécurité sociale. – La loi informatique et libertés qui oblige à déclarer auprès de la CNIL les fichiers personnels mis en œuvre.

– Les normes IATA (International Air Transport Association) réglementant le transport aérien des échantillons biologiques. Ces normes peuvent avoir leur importance pour les échanges de prélèvements entre centres investigateurs et laboratoire ou entre laboratoires impliqués dans l’essai. Enfin, dans la stratégie de développement d’une molécule ou d’un dispositif faisant l’objet d’un essai clinique, les autres référentiels qualités, tels que les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) ou les Bonnes Pratiques de Laboratoire (BPL) devront nécessairement être considérés également.

3 ■■ LE RÔLE ET LES ENGAGEMENTS DU BIOLOGISTE DANS LE CADRE DES ESSAIS CLINIQUES

3.1.

Place du laboratoire dans les essais cliniques

Les analyses biologiques réalisées dans le cadre d’un essai peuvent avoir, selon les études, quatre finalités différentes : – Évaluer l’efficacité du traitement : C’est le cas en particulier lorsque le marqueur biologique constitue le critère de jugement principal de l’essai (hypocholestérolémiants, antidiabétiques…). – Apprécier l’innocuité du produit : La plupart des essais cliniques sur les médicaments incluent généralement des marqueurs de toxicité hépatique ou rénale. – Préciser les critères d’inclusion du patient dans l’étude : Confirmation du diagnostic, exclusion des patients présentant une insuffisance rénale ou hépatique… – Doser le principe actif : il s’agit dans ce cas le plus souvent des essais de pharmacocinétique. Il faut souligner que tous les médicaments administrés peuvent modifier les résultats des analyses biologiques. Ces modifications peuvent être dues à une interférence analytique lors du dosage ou à une action pharmacologique ou toxique du traitement.

3.2.

Le choix d’un référentiel de qualité

Il découle de ce qui précède que le biologiste intervenant dans un essai clinique se retrouve face à un référentiel qualité incontournable, les BPC, dont l’application est rendue obligatoire par la loi sur les recherches biomédicales. À partir de cet élément de base, il a ensuite le choix d’aller au-delà ou non de ce qui est requis par la loi, dans l’objectif de satisfaction du promoteur qui est en même temps son client. La certification ISO semble alors un objectif à recommander. Deux cas de figure peuvent alors se présenter. Dans le cas d’un laboratoire ayant le statut de LBM, la certification/accréditation ISO 15189 devrait être exigée d’ici novembre 2016, selon l’ordonnance 2010-49 du 13 janvier 2010. Dans le cas d’un laboratoire n’ayant pas le statut de LBM, il peut sembler préférable d’envisager une certification ISO 9001-2008, suivie d’une accréditation CAP. La figure 2 résume les objectifs de ces différentes stratégies.

67

4557_2_.book Page 68 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Textes réglementaires

Référentiels qualité

Objectifs

Certification ISO 9001-2000

Management qualité Amélioration continue

Satisfaction client Accréditation CAP/ISO 15189

Compétence technique

DMOS Loi sur la recherche biomédicale GBEA

Assurance qualité Consentement éclairé Comité d’éthique

BPC BPL

Protection des personnes

BPF

Informatique et libertés

Figure 2

■ Présentation synthétique des objectifs couverts par les différents textes réglementaires et référentiels qualités applicables aux essais cliniques.

3.3.

Le choix des marqueurs

Il est évidemment impossible de donner des règles universelles permettant le choix des marqueurs à utiliser dans le cadre d’un essai clinique. On se contentera donc de rappeler quelques éléments qui peuvent être utilisés comme guides au moment du choix. Il faut tout d’abord se souvenir qu’un essai clinique a en général un objectif principal et quelques objectifs secondaires. Bien qu’il puisse être tentant de multiplier les critères de jugement, cet écueil doit être évité à tout prix, au risque de faire perdre toute sa valeur à l’essai. Un bon essai clinique met en général en avant un critère de jugement principal et quelques critères secondaires qui peuvent être cliniques et biologiques. Il faut avoir présent à l’esprit que c’est sur le critère de jugement principal que les statisticiens calculeront le nombre théorique de sujets à inclure. Celui-ci dépend de la différence à mettre en évidence (d) et de la variance (s 2) du paramètre considéré et est proportionnel au carré du rapport s/d. Les critères biologiques utilisés comme critères secondaires font le plus souvent partie des paramètres évaluant la toxicité hépatique, rénale et hématologique. Dans le cas où le critère de jugement principal est un paramètre biologique, le choix de ce paramètre dépendra de plusieurs facteurs. Dans un premier temps, il faut se demander s’il existe un marqueur biologique clairement associé à la morbidité ou à la mortalité dans le domaine d’investigation concerné. Par exemple, dans

68

le domaine cardiovasculaire, il est clair que le cholestérol-LDL représente un marqueur généralement incontournable puisqu’il est lié significativement au risque cardiovasculaire. Ce sera donc assez souvent le critère de jugement principal dans le cas des essais sur les médicaments hypocholestérolémiants. Cependant, il n’est pas rare qu’une intervention modifie un paramètre dans un sens favorable et un autre paramètre dans un sens défavorable. C’est la raison pour laquelle, dans notre exemple, on introduira les autres paramètres du bilan lipidique comme marqueurs secondaires. Par ailleurs, si on s’intéresse au contraire à un médicament qui cible l’augmentation du cholestérol-HDL, considéré alors comme critère de jugement principal, il est évident que le cholestérol-LDL fera partie des critères secondaires puisqu’il ne serait pas judicieux d’augmenter le cholestérol-HDL parallèlement au cholestérol-LDL. L’exemple du domaine cardiovasculaire est relativement exceptionnel puisqu’il est plus fréquent de ne pas avoir de paramètre clairement associé à la morbidité/mortalité. Dès lors qu’on s’intéresse à des domaines tels que le stress oxydant, la santé de l’os, la sensibilité à l’insuline, l’obésité, le fonctionnement intestinal ou l’immunité, on est généralement placé devant un choix extrêmement large de marqueurs potentiels dont aucun n’a démontré une véritable supériorité sur les autres. Si on se réfère à la démarche concertée engagée pour les marqueurs nutritionnels (Agget et al., 2005), les critères suivants peuvent être utilisés au moment du choix :

4557_2_.book Page 69 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biologie et essais cliniques

– Le marqueur sera de préférence un marqueur de fonction. Par exemple, on peut considérer les marqueurs de formation ou de résorption osseuse, les marqueurs d’inflammation, les marqueurs du statut pro-oxydant ou anti-oxydant, les marqueurs de l’équilibre glucidique… Parfois, on aura recours à un panel de marqueurs pour refléter une seule fonction. C’est le cas, par exemple des marqueurs du stress oxydant qui doivent généralement être associés entre eux. – Le marqueur peut être un marqueur d’exposition. Par exemple, les folates érythrocytaires pourront refléter l’exposition aux folates. – La variation du marqueur doit avoir un impact clinique. Pour certains marqueurs, une faible variation peut conduire à une signification statistique mais ne pas avoir d’intérêt clinique. Par exemple, une faible variation du cholestérol LDL représente un intérêt clinique indiscutable, tandis qu’une faible variation d’un marqueur de la fonction immunitaire peut conduire à des différences statistiques entre groupes de traitement sans induire d’avantage clinique. – On privilégiera généralement les marqueurs mesurables et mesurés selon une méthodologie reconnue. – La rapidité d’obtention et le coût de réalisation seront enfin des éléments à considérer dans le choix du marqueur. C’est ici qu’on sera généralement amené à effectuer des choix entre ce qui est idéal sur le plan scientifique et ce qui est réalisable en pratique. Par exemple, la concentration de PGF2α, ou isoprostanes, considéré comme un des marqueurs d’oxydation lipidique, peut être mesuré par une méthode de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse. Cette méthode représente la méthode de choix, malheureusement difficilement réalisable à grande échelle. On lui préférera vraisemblablement une méthode ELISA qui tend à se développer, pour des raisons pratiques et économiques, à la condition que l’ELISA ait démontré ses qualités.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

3.4.

Les engagements du biologiste

En dehors des engagements mentionnés ci-dessus et figurant explicitement dans le texte du GBEA, le biologiste participant à un essai clinique devra plus précisément s’engager à gérer les particularités liées au domaine spécifique des essais. Ces éléments prennent toute leur importance dans le cas d’un laboratoire central, effectuant l’intégralité des analyses d’un essai donné. Dans ce cas, le promoteur attend en effet du biologiste qu’il lui rende un véritable service de « monitoring biologique », lui permettant de garantir la qualité des données générées. Avant la mise en place de l’essai, le biologiste devra, en concertation avec le promoteur, définir les modalités de prélèvement et de prétraitement des échantillons (centrifugation, décantation). Ils devront ensemble décider de la nécessité ou non de prévoir des tubes de réserve. Le biologiste devra également préciser les conditions de transport des échantillons (température, délai) et la nomenclature d’identification des échantillons. Par conséquent, il faudra s’assurer, avant le début de l’essai, que les modalités de prélèvement et de pré-traitement des échantillons soient applicables dans tous les centres investigateurs. Si néces-

saire, on pourra faire appel à un centre de prélèvement, en accord avec le promoteur. À partir des informations figurant dans le protocole (calendrier de l’étude, nombre de participants prévus, liste des centres investigateurs, liste et planning prévisionnel des analyses biologiques), on prépare les documents nécessaires à la gestion des prélèvements biologiques, en particulier les modes opératoires correspondant à la phase de prélèvement, de pré-traitement, de conservation et d’envoi des échantillons depuis les centres investigateurs jusqu’au laboratoire. Parallèlement, le laboratoire prépare des kits de prélèvement, identifiés par le code de l’étude, le code du volontaire et le numéro de visite, comprenant tout le matériel nécessaire au prélèvement et à sa préparation. Pour le bon fonctionnement de ces opérations au cours de l’essai, il est préférable de prévoir, lors de la visite de mise en place de l’essai par les ARC, une présentation de ces modes opératoires en présence du matériel adéquat. Le bon de transport accompagnant l’envoi des échantillons biologiques par les centres investigateurs sera, dans la mesure du possible, fourni par la société en charge du transport. Celui-ci devra mentionner les points suivants : – L’adresse complète du laboratoire. – Le nom et l’adresse du centre expéditeur. – La température de transport. Un document accompagnant les prélèvements devra porter les informations relatives à la réception des échantillons : date et heure d’arrivée des tubes (à compléter par le laboratoire lors de la réception), le nombre de tubes attendus avec une mention à compléter lors de la réception concernant l’intégrité des tubes et l’adéquation entre le nombre et la nature des tubes attendus et le nombre et la nature des tubes reçus. Avant tout envoi de prélèvements au laboratoire, le système de gestion informatique des données doit avoir été validé, l’objectif étant de tester l’ensemble de la chaîne depuis la saisie de la réception du prélèvement jusqu’au résultat final figurant dans la base de données de l’essai clinique. Cette étape peut être primordiale dans la mesure où chaque essai étant différent des autres, les formats d’identification anonyme des échantillons, les unités transférées et les transformations de données éventuelles, les formats informatiques requis par le gestionnaire de données diffèrent. Il est donc important de valider cette étape pour tout nouvel essai géré par le laboratoire.

3.5.

Le suivi des essais

Dès réception des tubes par le laboratoire, les vérifications suivantes doivent être effectuées : – L’intégrité des tubes. – L’adéquation du contenu du colis avec la liste prévisionnelle (nombre de tubes et numéro d’identification). – La correspondance entre les informations figurant sur la feuille de demande avec les prélèvements reçus (identification des prélèvements, numéro de visite). Pour chaque anomalie constatée, un formulaire de non-conformité est complété. Les mesures correctives sont prises sous la responsabilité du chef de projet de l’essai. Celles-ci peuvent

69

4557_2_.book Page 70 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

consister en une demande de nouveau prélèvement ou en l’utilisation des échantillons de réserve par exemple. Le monitoring biologique correspond aux vérifications de conformité des prélèvements par rapport au protocole d’étude et au manuel opératoire. Ces vérifications comprennent : – Le respect du calendrier des analyses et des heures de prélèvement. – L’adéquation des kits de prélèvement utilisés (un kit est prévu par patient et par visite). – Le respect des conditions de prélèvement et de transport. L’investigateur du centre concerné et le promoteur sont immédiatement informés des écarts constatés, afin de permettre la mise en œuvre des mesures correctives et/ou préventives appropriées. L’investigateur est immédiatement informé par téléphone si une valeur critique d’un paramètre biologique apparaît sur le bilan. Ces valeurs sont définies par les biologistes, au début de l’essai. Sauf demande spécifique du promoteur, une édition papier des résultats est adressée à l’investigateur du centre concerné et un document récapitulatif des résultats par patient lui est transmis en fin d’étude. La clôture de la base de données est effectuée par le responsable du service informatique du laboratoire central, lorsqu’il a reçu la confirmation écrite du promoteur de la fermeture de tous les centres et après prise en compte des formulaires de demande de correction (queries ou data clarification form), complétés par l’investigateur. Le laboratoire édite un rapport biologique final destiné au promoteur et contenant l’ensemble des résultats des analyses, les contrôles qualité associés et les anomalies constatées lors du monitoring. La base de données est transmise au promoteur, sur demande expresse. À la fin de l’essai, le laboratoire assure le retour du matériel non utilisé dans les centres investigateurs et/ou préleveurs (kits de prélèvement, boîtes de transport…). Cela constitue, pour la biologie, l’équivalent de la fermeture de centre réalisée dans le cadre du monitoring clinique.

3.6.

La question des collections d’échantillons biologiques

Cette question n’est pas spécifique aux essais cliniques et se pose à tout laboratoire de biologie médicale. Elle mérite cependant une attention particulière car elle se pose fréquemment dans ce cadre.

3.6.1. Définition d’une collection d’échantillons biologiques Les collections d’échantillons biologiques humains (CEBH) se définissent par la réunion, à des fins scientifiques, de prélèvements biologiques effectués sur un groupe de personnes identifiées et sélectionnées en fonction des caractéristiques cliniques ou biologiques d’un ou plusieurs membres du groupe, ainsi que des dérivés de ces prélèvements. Il s’agit de prélèvements réalisés spécifiquement en première intention. La CEBH se distingue donc des séries d’échantillons, où les échantillons sont utilisés pour une autre fin que celle pour laquelle ils avaient été prélevés (soins, recherches biomédicales, autres). Il s’agit alors d’un changement de finalité.

3.6.2. Les démarches réglementaires Selon que la collection d’échantillons biologiques est réalisée dans le cadre d’une recherche biomédicale ou d’un autre programme de recherche, les démarches réglementaires diffèrent. Celles-ci sont définies par arrêté ministériel. Une CEBH constituée dans le cadre d’une recherche biomédicale doit être déclarée à l’AFSSAPS et soumise pour avis au CPP avant de pouvoir être mise en œuvre. Ces échantillons doivent en principe être détruits à l’issue de la recherche. Une CEBH constituée à des fins de recherche, autre que biomédicale, doit être déclarée au ministère de la Recherche et soumise pour avis au CPP. Si l’organisme prévoit la cession, à titre gratuit ou commercial, de tout ou partie de sa collection, il ne s’agit plus d’une simple déclaration : cette activité doit faire l’objet d’une demande d’autorisation auprès du ministère de la Recherche.

CONCLUSION Les règles d’éthique imposent la mise en place d’un système d’Assurance de la Qualité et le respect de règles contraignantes qui visent à garantir la sécurité du participant et la qualité des données. Tenant une place centrale dans certains essais cliniques, le laboratoire de biologie n’échappe pas à ces règles. Le respect de la réglementation qui s’impose à tout laboratoire de biologie clinique permet de répondre à certaines de ces exigences mais ne suffit pas. La participation à des essais internationaux dans lesquels la biologie est prépondérante exige la conformité aux référentiels qualité les plus exigeants.

Références bibliographiques Aggett PJ, Antoine JM, Asp NG, Bellisle F, Contor L, Cummings JH, Howlett J, Muller DJ, Persin C, Pijls LT, Rechkemmer G, Tuijtelaars

70

S, Verhagen H (2005). PASSCLAIM : consensus on criteria. Eur J Nutr, 44 Suppl 1 : 15-30.

4557_2_.book Page 71 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

5 Méthodologies innovantes d’analyse des gènes et des génomes Antoinette Lemoine, Laurent Metzinger

INTRODUCTION 1 ■■ LE MATÉRIEL GÉNÉTIQUE 1.1. 1.2.

ADN génomique ARNm et ARN régulateurs

2 ■■ LES MÉTHODES « CLASSIQUES » D’ANALYSE DES GÈNES 2.1. 2.2.

ADN : Southern blot, PCR, séquençage et clonage ARN : RT-PCR

3 ■■ LES MÉTHODES INNOVANTES D’ANALYSE DES GÈNES 3.1. 3.2.

Séquençage à haut débit Automatisation, puces à ADN

4 ■■ LES APPLICATIONS BASÉES SUR LES TECHNOLOGIES DES PUCES À ADN 4.1. 4.2.

Génomique Transcriptomique, puces à ADNc

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

CONCLUSION ET PERSPECTIVES Références bibliographiques

71

4557_2_.book Page 72 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4557_2_.book Page 73 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Méthodologies innovantes d’analyse des gènes et des génomes

INTRODUCTION

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

La médecine actuelle dispose depuis plusieurs décennies de nombreux outils biologiques sur lesquels elle peut baser le diagnostic et le suivi de la plupart des grandes pathologies. Nous en voyons de nombreux exemples dans les différents chapitres de ce livre. Cependant, au cours des vingt dernières années, le séquençage du génome humain dans sa globalité (Human Genome Project) a permis de développer de nouvelles approches du diagnostic et du suivi d’une maladie. L’ensemble de ces méthodes est basé pour l’essentiel sur les profils d’expression génomique de cohortes de patients présentant une pathologie donnée, celle-ci étant parfois déjà sous-divisée à partir de données cliniques ou biologiques existantes. Elles ont ouvert la voie à l’étude globale de molécules en une expérimentation ou de groupes de molécules d’une même famille. L’ensemble de ces analyses est regroupé sous le terme de -omics. On dispose ainsi de données de protéomique, de lipidomique ou de glycomique pour l’étude des glucides et des glycosylations de protéines, ou encore de métabolomique qui consiste en l’étude de l’ensemble des métabolites produits dans une cellule ou un tissu « dans des conditions particulières ». L’analyse globale des polymorphismes génétiques pour un patient donné a également permis de faire évoluer la pharmacologie vers la pharmacogénomique ou la toxicogénomique. Ces études tiennent compte de l’idiosyncrasie et utilisent les méthodes de la génomique. L’ensemble de ces techniques offrent de grandes promesses dans la notion de « médecine personnalisée » que les anglo-saxons appellent « theranostic », avec pour finalité de permettre au clinicien de prescrire un traitement adapté, à une dose individualisée et au moment requis dans l’évolution de la maladie, à chaque patient afin de diminuer la toxicité et d’améliorer l’efficacité. De nombreuses sociétés pharmaceutiques ou biotechnologiques se sont lancées dans une compétition afin de mettre rapidement sur le marché de nouveaux outils diagnostiques basés sur ces approches. Quand ceux-ci sont développés en parallèle de la cible thérapeutique, on parle de marqueur compagnon. Dans la première partie du chapitre, nous traiterons du matériel génomique en décrivant la famille récemment découverte des micro ARN (miARN). Dans la seconde partie, nous aborderons les méthodes d’étude ciblées et globale, anciennes et récentes d’analyse des gènes et des génomes. Dans la dernière partie, nous traiterons des méthodes d’analyse du génome et du transcriptome et de leurs applications actuelles en biologie clinique.

1 ■■ LE MATÉRIEL GÉNÉTIQUE 1.1.

ADN génomique

Le génome contient toute l’information nécessaire pour diriger la synthèse des protéines et assurer le fonctionnement de la cellule. Toute modification du génome, entraînant un processus pathologique pour l’individu, est considérée comme une maladie génique. Leur diagnostic est capital pour mettre en place une thérapie. On distingue : (1) les altérations des chromosomes, c’est-àdire les modifications du matériel chromosomique (visibles sur le

caryotype : exemple de la trisomie 21) ; (2) les altérations des gènes, généralement des mutations ou des délétions. Certaines maladies génétiques sont liées à l’altération d’un seul gène (monogénique), la plupart étant héréditaires. Les plus fréquentes sont la mucoviscidose, la myopathie de Duchenne, les hémophilies A et B, la maladie de Huntington, l’hémochromatose, l’albinisme et certaines formes familiales de cancers. D’autres maladies sont causées par des anomalies dans deux ou plusieurs gènes (multigéniques), puis aggravées par des facteurs environnementaux. Citons, pour exemple, les maladies multigéniques les plus étudiées comme le cancer, les maladies cardiovasculaires, le diabète, l’obésité, les maladies immunitaires et inflammatoires…

1.2.

ARNm et ARN régulateurs

Les ARNm sont les séquences de ribonucléotides complémentaires du brin codant de l’ADN des gènes. Ils représentent la copie conforme des gènes, support temporaire de l’information génétique, qui servira de matrice lors de la traduction. Il existe d’autres types d’ARN dans la cellule comme les ARN ribosomiques qui constituent 80 % des ARN totaux et sont indispensables à la lecture de l’information génétique au cours de la traduction. La mise en évidence de molécules d’ARN interférant, capable de contrôler l’expression des gènes en se fixant par complémentarité sur leur séquence nucléotidique, a constitué une avancée importante dans le domaine de la biologie moléculaire (technique de l’interférence par ARN). Une classe particulière d’ARN antisens est celle des miARN, éléments naturels de régulation de la cellule. Les miARN sont des molécules découvertes récemment, qui présentent un nouvel espoir comme cibles thérapeutiques et marqueurs biologiques originaux. Le terme de microARN est apparu en 2001 et a été couronné d’un prix Nobel en 2006 pour l’ensemble des travaux sur l’interférence par les petits ARN de Fire et Mello. Il est maintenant clairement établi que les miARN jouent un rôle important dans les processus de différenciation de nombreux types cellulaires eucaryotes ainsi que lors de nombreux processus pathogènes. Ils ouvrent également des horizons nouveaux dans la compréhension des régulations épigénétiques. Mais, dans ce chapitre, nous traiterons principalement des évidences cliniques qui s’accumulent quant aux rôles de marqueurs biologiques et de cibles thérapeutiques innovantes des miARN dans un nombre croissant de maladies. Les miARN sont de petits ARN simple-brin non-codants, longs d’environ 20 à 25 nucléotides, dont la biogenèse est décrite en figure 1. Des centaines de gènes de miARN ont été découverts dans les génomes de la plupart des organismes pluricellulaires. On estime le nombre de gènes codant des miARN à plus de 1 000 dans le génome des eucaryotes supérieurs, et environ 800 sont déjà identifiés chez l’humain. Ce sont des répresseurs posttranscriptionnels qui s’apparient par des interactions spécifiques avec la partie 3'-non traduite des ARN messagers (ARNm), et qui, de façon générale, répriment leur traduction en protéine (figure 1, Brodersen et Voinnet, 2009). Cependant, ce mécanisme d’action « canonique » est déjà mis à mal par des articles récents montrant que les miARN sont aussi capables de se lier dans certains cas à la région codante et/ou 5'-non traduite des ARNm. De plus, un rôle inédit de leurre vient d’être publié dans une revue presti-

73

4557_2_.book Page 74 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Chromosome ARN Polymérase II/III

A

Pri-miARN

B

Dégradation/inhibition de la traduction des ARNm cibles

Drosha/DGCR8

Pre-miARN ARNm cible

C

miARN mature

Exportine 5 ARNm cible Pre-miARN

D

Dicer/TRBP

miARN mature E RISC

miARN / miARN*

Figure 1

■

Biogenèse et mécanisme général d’action des miARN.

A, La plupart des miARN sont produits à partir de transcrits polycistroniques, appelés pri-miARN, comprenant en leur sein plusieurs miARN (les miARN sont représentés comme des structures en tige-boucle colorées). B, Le transcrit est ensuite clivé en autant de pré-miARN par le complexe Drosha – DGCR8 (DiGeorge Syndrome Critical Region 8). C, Les pré-miARN sont exportés dans le cytoplasme par la navette nucléocytoplasmique exportine. D, Dans le cytoplasme, la ARNase Dicer clive la tige-boucle du pré-miARN, produisant les hybrides miARN : miARN* (miARN est le brin actif représenté en vert ou rouge, miARN* est le brin non-actif appelé généralement à être dégradé, coloré en marron). E, L’hybride est ensuite pris en charge par le complexe enzymatique RISC (RNA-induced silencing complex), induisant une liaison des miARN matures (représentés en vert et rouge dans la figure) à leurs messagerscibles, et entraînant une inhibition de leur traduction et/ou dégradation.

gieuse (Eiring et al., 2010). Le miARN 328 peut ainsi se substituer à l’ARNm pour lier la protéine régulatrice hnRNPe2 et activer indirectement l’expression de la protéine CEBPA (CCAAT/enhancerbinding protein alpha), un facteur de transcription impliqué dans la régulation de la leptine. Ces descriptions originales et récentes nous indiquent que les fonctions des miARN ne sont pas complètement élucidées et peuvent nous réserver des surprises. Un miARN donné est capable de réguler plusieurs gènes car il se lie aux ARNm cibles avec une complémentarité parfaite ou imparfaite. Il est ainsi estimé à l’heure actuelle que pas moins d’un tiers des gènes (voire 60 % pour certains travaux) d’une cellule eucaryote sont contrôlés par la voie des miARN (Bartel, 2009). De façon plus spécifique, ils contrôlent de nombreuses fonctions clefs de la cellule eucaryote comme le développement, la différenciation, la prolifération, l’apoptose ou la réponse au stress. Ainsi, toute modification dans l’expression ou la fonction des miARN est susceptible de provoquer l’apparition de dysfonctionnements cellulaires. Des travaux récents ont mis en évidence des mutations ou un défaut d’expression de miARN dans différents cancers humains, indiquant que ces derniers peuvent fonctionner comme des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeurs (He et al., 2007). Par exemple, de plus en plus de miARN sont directement

74

impliqués dans le contrôle de la différenciation cellulaire et l’apoptose, pendant que d’autres vont cibler les oncogènes et/ou les gènes suppresseurs de tumeurs (Drakaki et Iliopoulos, 2009). Ils sont également impliqués dans le développement des maladies métaboliques, cardiovasculaires, rhumatismales (d’Allesandra et al., 2010 ; Zampateki et al., 2010)… La compréhension des fonctions des miARN fournit ainsi de nouvelles bases moléculaires pour appréhender les mécanismes physiopathologiques et apporter de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques. On pouvait penser que l’activité diagnostique serait limitée par l’expression cytoplasmique des miARN et qu’il serait difficile de détecter leur présence dans le plasma riche en RNAses. Or, des miARN ont été décrits tant dans des tissus pathologiques que dans des liquides biologiques (sérum, urine, salive) (Mitchell et al., 2008). Leur présence y est stable, reproductible et corrélée à la quantité tissulaire dans plusieurs types de cancers (Kosaka et al., 2010). Ceci accroît leur potentiel en tant que marqueurs biologiques non invasifs dans le futur. Les innovations thérapeutiques basées sur les miARN sont dès à présent décrites comme les plus prometteuses sur le marché des biotechnologies (Mack, 2007). Les miARN les plus dérégulés représentent des cibles novatrices pour développer des traitements originaux dans le cadre de maladies cancéreuses, métaboliques et autres. Cependant, leur pénétration dans les cellules du tissu pathologique est une des difficultés que de nombreuses équipes de chimistes tentent de résoudre. Mais, des progrès notables ont déjà été réalisés dans l’administration et la vectorisation de petits ARN. Par exemple, Fontana et al. (2008) ont montré in vivo qu’un anti-miR dirigé contre le miARN miR-17-5p permettait, chez la souris, d’abolir la croissance de tumeurs de type neuroblastome.

2 ■■ LES MÉTHODES « CLASSIQUES » D’ANALYSE DES GÈNES 2.1.

ADN : Southern blot, PCR, séquençage et clonage

L’analyse des acides nucléiques est basée sur la notion d’hybridation des bases complémentaires. La technique la plus ancienne, décrite par Edwin Southern et dénommée Southern blot, permet de rechercher l’expression d’un gène par hybridation complémentaire sur la séquence d’intérêt immobilisée sur une membrane. L’analyse des anomalies ponctuelles du génome est principalement basée sur l’utilisation de la PCR et du séquençage. Le séquençage de l’ADN consiste à déterminer l’ordre d’enchaînement des nucléotides d’un fragment d’ADN d’intérêt, généralement réalisé selon la méthode de Sanger. La PCR (Polymerase Chain Reaction, amplification en chaîne) permet d’obtenir, à partir d’un échantillon complexe et peu abondant, d’importantes quantités d’un fragment d’ADN spécifique, normal ou muté, de longueur définie. Les applications de la PCR sont nombreuses dans le domaine du diagnostic génétique des maladies. Le clonage positionnel ou la génétique inverse vise à identifier tous les sujets atteints dans une famille en comparant le patrimoine géné-

4557_2_.book Page 75 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Méthodologies innovantes d’analyse des gènes et des génomes

tique au sein de cette même famille, à l’aide de marqueurs polymorphes du génome, ou à la recherche de mutations spécifiques (cette méthodologie fait partie des études de liaison).

2.2.

ARN : RT-PCR

La technique de Northern blot, dénommée ainsi par analogie avec celle du Southern blot, permet d’apprécier la distribution des ARN immobilisés sur une membrane et d’étudier leur abondance relative par hybridation complémentaire à l’aide d’une sonde. Elle a été supplantée par la méthode d’analyse des ARNm basée sur la transcription inverse puis amplification par PCR (RT-PCR, reverse transcription PCR). La PCR en temps réel permet de mesurer, de façon relative (comparaison d’états biologiques) ou absolue (nombre de copies du messager), le niveau d’expression d’un gène d’intérêt au sein d’un type cellulaire. Cette méthode est devenue indispensable au cours des dix dernières années dans le diagnostic ou la compréhension de pathologies, en particulier pour valider les résultats des expériences par puces à ADN. Le développement de cette méthodologie, fiable et rapide, associée aux techniques d’extraction automatisée, va probablement permettre d’optimiser la sensibilité et la spécificité des tests diagnostiques. L’étude de l’expression des miARN utilise les mêmes techniques de RT-PCRq (Peltier et Latham, 2008). On peut également évaluer la fonction des miARN par l’étude de : (1) l’impact de leur inactivation par anti-miR spécifique : il s’agit d’une technologie permettant de faire une ARN interférence d’un miARN donné ; (2) l’impact de leur expression augmentée par le système de précurseurs de miARN de type Pre-miR, qui permet d’exprimer un miARN de façon spécifique, en transfectant le précurseur de cet ARN dans des lignées cellulaires.

3 ■■ LES MÉTHODES INNOVANTES D’ANALYSE DES GÈNES

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

3.1.

Séquençage à haut débit

Le développement en plein essor d’appareils de séquençage robotisés permettant d’augmenter la productivité a rendu possible le séquençage d’un génome entier. La réaction de séquençage est classiquement basée sur la méthode de Sanger couplée à l’utilisation de marqueurs fluorescents dont la magnitude du signal est liée au nombre de brins d’ADN présents dans la réaction. Cependant, de nouvelles méthodes sont apparues ces dernières années, qui nous forcent à redéfinir le concept de « séquençage ». En effet, elles surclassent la méthodologie de Sanger d’un facteur 100 à 1 000, en ce qui concerne la génération de données, et le prix de revient du million de bases séquencé est réduit d’un ordre de 99 %. La première plateforme de séquençage « haut débit » a été commercialisée en 2005 et utilise une méthode de pyroséquençage, surnommée « séquençage par synthèse ». Cette méthode repose, comme celle de Sanger, sur la synthèse du brin complémentaire de l’ADN à séquencer, mais dans ce cas, on ajoute puis on élimine de façon très rapide des solutions de nucléotides A, C, T, ou G, de façon séquentielle. L’incorporation

du nucléotide complémentaire adéquat entraîne la libération de pyrophosphate. Celui-ci est ensuite converti en ATP, par une ATP sulfurylase, en présence du cofacteur adénosine 5'-phosphosulfate. Cet ATP est indispensable à l’enzyme luciférase pour la conversion de la luciférine en oxyluciférine, réaction qui émet une lumière détectée par une caméra et analysée informatiquement. Ceci donne des lectures de séquence d’une longueur modeste (300-500 nts), mais que l’on peut faire de façon massive en parallèle, la séquence complète étant ensuite reconstituée in silico. On peut ainsi envisager dans un futur proche d’obtenir la séquence précise du transcriptome de cohortes de patient. Ces méthodes de séquençage massif auront d’ici quelques années, un impact majeur dans la connaissance des maladies ainsi que dans le diagnostic, les traitements et la prévention des maladies génétiques. Mais, ces avancées technologiques posent encore le problème de la compilation de milliers de données en une expérimentation et de leur analyse, nécessitant de façon urgente le développement d’une analyse bio-informatique adaptée et fiable.

3.2.

Automatisation, puces à ADN

Le décryptage des génomes entiers au cours des dernières années, couplée à l’essor des techniques de miniaturisation et d’informatique, a permis le développement de techniques d’analyse des génomes en une expérimentation. La génomique représente une nouvelle spécialité biologique qui vise à l’analyse moléculaire du matériel héréditaire complet des organismes vivants. Les objectifs de la génomique sont multiples et ouvrent des perspectives très larges dans le domaine de la biologie fondamentale et de la médecine. Elle repose sur des techniques qui évoluent très rapidement et contribuent à alimenter des bases de données. L’analyse du génome est aujourd’hui rendue très accessible grâce à des technologies bien maîtrisées et au large spectre d’applications comme les puces à ADN ou « microarrays » qui permettent de mesurer, de façon simultanée, l’expression de plusieurs milliers de gènes. Comme les méthodes classiques de Northern- et Southern-blots, la technologie des puces à ADN est basée sur le principe de l’hybridation moléculaire. Elle repose sur l’hybridation d’un jeu ordonné de molécule (« arrays ») d’ADN fixées sur un support solide (les sondes) avec des cibles marquées, préparées à partir de l’ADN ou de l’ARN d’un échantillon biologique. Lors de l’hybridation, les molécules marquées en solution vont se fixer sur les molécules d’ADN correspondantes présentes sur la puce. Après lavage et exposition, on obtient une image d’hybridation avec des signaux quantifiables, d’intensité variable, représentant les niveaux variables d’amplification ou d’expression du gène correspondant. Ces intensités sont ensuite quantifiées, normalisées, puis les résultats sont analysés et visualisés à l’aide d’outils bio-informatiques sophistiqués. Il existe deux procédés de fabrication des puces : le dépôt d’ADN complémentaire (ADNc) sur le support solide ou la synthèse in situ d’oligonucléotides sur des lames ou des billes. Dans la première approche, il est nécessaire d’établir une collection de sondes spécifiques d’un grand nombre de gènes. Cette collection est réalisée à partir de banques de clones d’ADNc obtenus par transcription inverse des ARNm ou des miARN d’une cellule ou d’un tissu donné. Il faut ensuite établir, par tri bioinformatique, des

75

4557_2_.book Page 76 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

jeux minimaux de clones représentatifs de gènes uniques. Ces clones sont ensuite amplifiés par PCR, puis déposés de façon ordonnée au moyen de robots sur un support solide en verre ou en nylon. On distingue alors deux types de puces selon le degré d’intégration des sondes : les macroarrays intégrant quelques dizaines ou centaines de sondes au centimètre carré, et les microarrays intégrant plusieurs milliers de sondes au centimètre carré. Ces supports, quel que soit leur format, peuvent être fabriqués dans des laboratoires disposant de robots « spotteurs » ou être directement acquis auprès de fabricants. On dispose de microarrays « génome entier » représentant l’ensemble des trente mille gènes que contient le génome humain. La deuxième approche est celle des puces à oligonucléotides de 20- ou 25-mères, spécifiques de chaque gène, synthétisés in situ directement sur le support. Cette approche repose donc sur la seule connaissance de la séquence du génome à étudier et ne nécessite pas l’établissement préalable de collections de clones et la préparation des produits de PCR. Afin de compenser le manque relatif de spécificité de ces oligonucléotides de petite taille, on utilise plusieurs oligonucléotides par gène (une vingtaine environ). La synthèse se fait sur un support en silicium par des techniques de photolithographie issues de la technologie des microprocesseurs. Elle permet une très grande intégration des sondes, jusqu’à plusieurs centaines de milliers d’oligonucléotides différents au centimètre carré avec un potentiel maximal de miniaturisation encore important. Une fois fabriquées, les puces à ADN sont hybridées avec des cibles d’ADN marquées (ADN génomique pour l’étude du génome, ou ADNc pour l’étude du transcriptome). Le marquage se fait par incorporation de radioactivité ou de colorimétrie pour les puces en nylon, de fluorescence pour les puces en verre et les oligochips. Après lavage, l’intensité des signaux d’hybridation est déterminée au moyen d’un scanner. L’intensité mesurée pour chaque sonde est proportionnelle à l’abondance du segment d’ADN génomique ou d’ADNc dans l’échantillon analysé. Des étapes de normalisation des données sont recommandées à ce stade, à l’aide de différents programmes informatiques dédiés, afin d’éliminer les intensités aberrantes. Cependant, si le principe de la technologie des puces à ADN peut apparaître relativement simple, son utilisation pratique l’est beaucoup moins. Depuis la planification d’une étude jusqu’à l’interprétation des résultats obtenus vont se succéder de nombreuses étapes, 39 selon Imbeaud et Auffray (2005). Ces différentes étapes, plus ou moins complexes, font appel à des intervenants différents et peuvent être source de malfaçons, propres, pour certaines d’entre elles, à invalider les résultats d’une étude. De plus, la technologie étant relativement récente (une dizaine d’années), il n’existe pas de standard d’étude clairement établi. Pour la plupart des étapes, plusieurs stratégies sont possibles. Les investigateurs vont donc être obligés de faire des choix. Il importe cependant d’être conscient que d’autres choix auraient été possibles et auraient sans doute délivré des résultats sensiblement différents. Il importe également, dans les rapports d’études, de donner le maximum d’informations sur le matériel étudié et les conditions expérimentales (en respectant au minimum les critères MIAME établis en 2001) (Brazma et al., 2001) et de préciser clairement les différents choix réalisés. Ceci est loin d’être

76

constamment réalisé. En effet, Jafari et Azuaje (2006) ont ainsi sélectionné sur Pubmed (site web de centralisation des publications scientifiques dans le domaine de la Santé) 293 articles publiés entre 2003 et 2005 (152 articles méthodologiques et 141 articles mettant en application la technologie des puces à ADN). Ils ont évalué leurs qualités scientifiques sur les informations relatives à l’expérience et à l’analyse bio-informatique des résultats fournis par les auteurs, en sélectionnant un certain nombre de critères (calcul d’effectif, puissance statistique, existence d’une normalisation et technique utilisée, caractère unilatéral ou bilatéral du test utilisé, hypothèses nulle et alternative, données manquantes, logiciel utilisé, technique d’analyse, caractère égal ou inégal des variances). Les résultats montraient une grande hétérogénéité dans les outils informatiques et les analyses utilisés, pointant notamment l’étape de normalisation des données comme source des plus grandes divergences de résultats. À l’inverse, des résultats rassurants ont été publiés sur des études diligentées par la FDA. Elles avaient pour objectif de contrôler la qualité et la reproductibilité entre différentes plateformes de microarrays (MAQC), par l’analyse d’ARN identiques. Une très bonne reproductibilité avec seulement 5 à 15 % de variation a été rapportée (Canales et al., 2006). Ces contrôles de qualité ont été étendus à un plus grand nombre de plateformes (Shi et al., 2010) et aux supports utilisant des miARN (Sato et al., 2009) ou des SNP (Miclaus et al., 2010). Le nombre de prélèvements à inclure dans une étude, bien que théorique, est également un élément important. En pratique, le nombre d’inclusions est limité par la disponibilité du matériel d’étude et les possibilités financières. Il semble que les effectifs inclus dans la plupart des études (quelques dizaines) permettent d’établir une signature génique d’intérêt, dont les performances doivent être évaluées et validées en distinguant 2 groupes indépendants de malades, un groupe d’apprentissage et un groupe de validation (Michiels et al., 2005). C’est ainsi que le développement d’un kit diagnostique agréé par la FDA, mammaPrint ® (Agendia, Amsterdam, Pays-Bas), basé sur le profil d’expression de 70 gènes pour prédire le risque de récidive tumorale chez des patientes opérées d’un cancer du sein sans extension ganglionnaire, quel que soit le statut immunologique des récepteurs aux œstrogènes, est issu d’une étude incluant 78 patientes avec un cancer du sein sporadique et sans extension ganglionnaire. La signature a ensuite été validée dans 3 cohortes indépendantes incluant chacune environ 300 patientes (Buyse et al., 2006 ; van de Vijver et al., 2002 ; van’t Veer et al., 2002). La signature génique représentait un facteur pronostique de la récidive tumorale et de la survie globale, indépendant et supérieur à l’évaluation clinico-pathologique. Ce test permet de décider d’une chimiothérapie adjuvante dans ce sous-groupe de patientes. Une autre possibilité est de constituer, au cours d’une seule étude, des groupes indépendants d’apprentissage et de validation par tirage au sort des sujets malades et contrôles, augmentant ainsi les performances de la signature génique comme prédicteur de l’appartenance d’un sujet à la classe « malade » ou à la classe « contrôle » (Barrier et al., 2006). Il est important de noter qu’une signature génique, établie dans des études indépendantes, incluant des tissus de patients ayant le même stade clinico-pathologique peut comprendre très peu ou pas de gènes en commun.

4557_2_.book Page 77 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Méthodologies innovantes d’analyse des gènes et des génomes

4 ■■ LES APPLICATIONS BASÉES SUR LES TECHNOLOGIES DES PUCES À

ADN

Les champs d’application des puces à ADN sont nombreux, aussi bien au niveau de la recherche fondamentale pour les études portant sur le développement et l’évolution des organismes vivants que clinique pour le diagnostic ou l’aide à la décision thérapeutique.

4.1.

Génomique

4.1.1. Identification des gènes mutés au sein d’un génome entier Une application de la technologie des puces concerne la détection de mutations de gènes d’intérêt, impliqués par exemple dans une pathologie. Il s’agit de constituer une puce à ADN capable d’interroger chaque base d’une séquence connue. La technologie repose sur la capacité de ces puces à distinguer l’hybridation sur un oligonucléotide d’une séquence ayant une complémentarité parfaite de celle d’une séquence ayant une complémentarité imparfaite (nonappariement d’une paire de bases). Une telle puce a été utilisée pour détecter de micro-organismes pathogènes dans des échantillons biologiques (Salazar et Caetano-Anolles, 1996), caractériser les variants de micro-organismes (Troesch et al., 1999), pour étudier les mutations de l’ADN mitochondrial chez l’homme (Chee et al., 1996), pour détecter les mutations de certains gènes comme BRCA1 (Hacia et al., 1996), et le protéase du VIH-1 (Kozal et al., 1996). L’utilisation des puces à ADN présente également un intérêt dans les maladies multigéniques pour vérifier en une expérimentation la présence ou l’absence de dizaines ou de centaines de mutations. Dans la mucoviscidose par exemple, l’utilisation d’une puce dédiée à cette pathologie, permettra l’étude simultanée des centaines de mutations décrites dans le gène CFTR, et a fortiori celle des vingt-trois mutations les plus fréquentes dont l’étude est recommandée par l’« American College of Medical Genetics ».

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

4.1.2. Identification des pertes et des gains chromosomiques Les puces à ADN ont également été couplées à la méthode d’hybridation génomique comparative (comparative genomic hybridization array, CGH-array) pour caractériser les remaniements chromosomiques complexes associés aux cancers (Pinkel et al., 1998). Cette technique permet de mettre en évidence des microdélétions ou amplifications de l’ADN génomique, en analysant les variations du nombre de copies géniques de patients, comparé à de l’ADN témoin. Grâce au dépôt de plusieurs milliers de sondes sur une puce, on peut analyser autant de gènes correspondants de manière simultanée, ce qui en fait une technique de cytogénétique à haut-débit.

4.1.3. Identification des polymorphismes génétiques La commercialisation de puces à ADN comportant tout ou partie des sites de polymorphisme touchant un seul nucléotide (les SNP : single nucleotide polymorphisms) (Wang et al., 1998) a permis le

développement de la pharmacogénomique ou de la toxicogénomique et plus récemment d’études d’association de ces anomalies au risque de développement dune maladie (Genome Wide Association Studies). La toute première puce commercialisée dans le cadre d’un diagnostic de pharmacogénomique a été celle basée sur l’expression de 15 000 oligonucléotides permettant de distinguer les polymorphismes caractéristiques des « métaboliseurs lents » et des « métaboliseurs rapides » de médicaments. En effet, on distingue dans la population générale, un pourcentage d’individus présentant des allèles particuliers d’enzymes du métabolisme des xénobiotiques (e.g. cytochromes P-450) qui les rendent plus sensibles à la toxicité du médicament ou qui imposent inversement l’administration de doses plus élevées pour obtenir l’efficacité requise. Ces puces à ADN devraient être réalisées pour chaque individu avant tout traitement afin de l’optimiser. Le coût d’une telle puce reste cependant onéreux, mais peut revêtir un bénéfice non négligeable dans des cas particuliers. Citons, pour exemple, la détermination du profil métabolique du CYP2D6 des femmes recevant une chimiothérapie adjuvante à base de tamoxifène pour cancer du sein. Une telle individualisation de la dose administrée diminuerait le risque de récidive métastatique chez les patientes présentant certains allèles du CYP2D6 (Goetz et al., 2005). Les puces à ADN comportant les variants génétiques répartis sur l’ensemble du génome permettent également la comparaison des fréquences alléliques ou des génotypes entre des cas atteints d’une maladie d’intérêt et des cas témoins. Ces sujets sont choisis au hasard dans une population sans critères de sélection autres que la maladie. L’objectif est de mettre en évidence, sans hypothèse a priori, de nouveaux facteurs de susceptibilité génétique de la maladie, ouvrant la voie à de nouvelles cibles thérapeutiques et diagnostiques. Ces travaux ont permis d’identifier par exemple des gènes de prédisposition au cancer du côlon (Tomlinson et al., 2007 ; Zanke et al., 2007) ou à la maladie d’Alzheimer (Lambert et al., 2009).

4.2.

Transcriptomique, puces à ADNc

Les puces à ADNc permettent de mesurer simultanément le niveau d’expression de plusieurs milliers de gènes dans un échantillon par l’hybridation d’ARN rétrotranscrits et marqués sur des sondes spécifiques fixées sur la puce. C’est actuellement l’application des puces à ADNc la plus développée. Ces études se font par comparaison des transcriptomes de deux populations (population d’intérêt et population contrôle) permettant de définir une signature de gènes spécifiques de la maladie analysée. Il est intéressant de noter que les signatures géniques issues de ces analyses comportent non seulement des gènes de classe II, mais également des gènes de classe I et de classe III, non étudiés par les méthodes classiques de biologie moléculaire. L’analyse de l’expression différentielle de gènes entre ces 2 populations se fait par différentes techniques d’analyses statistiques et ont plusieurs finalités (figure 2). Les premières analyses du transcriptome avec les puces à ADNc ont établi des catalogues de gènes exprimés dans diverses cellules ou divers tissus. Ces catalogues ont été comparés à partir d’échantillons biologiques afin de détecter des gènes différemment exprimés. Ainsi, la comparaison du transcriptome du tissu

77

4557_2_.book Page 78 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Sous-classifications de maladie pour un traitement mieux ciblé Découverte de nouvelles cibles thérapeutiques

P1 (N) P8 (N) P2 (N) P7 (N) P5 (N) P3 (N) P6 (N) P4 (N) P9 (N) P17 (N) P12 (N) P14 (N) P13 (N) P16 (N) P10 (N) P11 (N) P15 (N) P18 (N)

Découverte de nouveaux marqueurs biologiques

Signatures géniques ou Profil d’expression de gènes pronostiques

Figure 2

■ La comparaison du transcriptome de tissus d’une population malade et de tissus de même nature d’une population contrôle permet l’établissement d’une « signature de gènes » exprimés différentiellement entre ces 2 populations ou le calcul d’un « prédicteur pronostique » de la maladie (probabilité de retrouver toujours la même signature de gènes chez un individu malade pris au hasard). À partir de ces outils, la maladie pourra être recherchée par analyse du transcriptome chez un nouvel individu.

musculaire avec celui d’autres organes a permis de mettre en évidence des gènes d’expression spécifiquement musculaire (Pietu et al., 1996), ou d’expression modulée dans certaines pathologies musculaires (Tkatchenko et al., 2000). Une autre application de l’étude du transcriptome concerne la caractérisation des voies de régulation. La mesure des niveaux de transcription génique dans un organisme donné dans différentes conditions, dans différents tissus, et à différents stades du développement permet de construire un profil d’expression caractérisant la dynamique de différents gènes dans le génome. On peut, par exemple, étudier la cinétique de réponse à un effecteur et mettre en évidence des vagues successives de gènes activés ou réprimés sur la voie métabolique étudiée, mais également sur d’autres voies corégulées. On peut également, en comparant les séquences de gènes ayant des profils d’expression similaires, mettre en évidence des séquences cibles identiques pour des facteurs de transcription situées dans leur promoteur. Une application très développée de l’étude du transcriptome consiste en l’établissement de profils d’expression génique ou « signature génique » de différents échantillons caractéristiques d’un état biologique donné, par exemple un phénotype tumoral. Un nombre croissant de publications montre que mesurer l’expression des miARNs dans les tissus pathologiques et/ou dans le sérum des patients à l’aide de puces comportant les miARN du génome a une valeur prédictive ou pronostique avérée. Par exemple, Li et al. (2010) indiquent qu’une signature de 7 miARN suffit pour prédire la survie générale et la survie sans récidive de patients atteints de cancer de l’estomac.

78

L’analyse comparative des profils d’expression a pour but une classification des échantillons basée uniquement sur le transcriptome, avec l’espoir d’identifier de nouveaux sous-types non séparés par les facteurs histologiques et cliniques habituels et ayant un intérêt d’ordre diagnostique ou pronostique. Il est possible que dans l’avenir des décisions thérapeutiques soient basées sur de tels profils génomiques. Ceci représente un espoir considérable dans le diagnostic et le pronostic de nombreux cancers et notamment le cancer du côlon (Barrier et al., 2006). L’une des premières études sur la prédiction de classe a été celle publiée par Golub et al. (1999). Dans cette étude, il a été suggéré qu’il serait possible, par l’étude des mesures d’expression des ARNm extraits de cellules sanguines de malades ayant une leucémie aiguë, de déterminer s’il s’agit d’une leucémie aiguë lymphoblastique ou d’une leucémie aiguë myéloblastique, autrement dit qu’il serait possible de retrouver, par les profils d’expression génique, la classification phénotypique déjà connue. Des études plus récentes, dans d’autres types de tumeurs, notamment le sein et le côlon, permettent de remplacer les classifications anatomopathologiques existantes en démontrant une meilleure aptitude à prédire l’évolution de l’ensemble des maladies. Elles permettent de compléter les classifications anatomopathologiques en isolant, au sein d’un stade donné, des sousgroupes de malades ayant des pronostics différents. L’établissement de profils d’expression génique à visée pronostique (à différencier des profils d’expression à visée diagnostique) permet de répondre à des questions telles que « ce cancer est-il métastatique ? » ou « ce cancer est-il sensible à l’anthracy-

4557_2_.book Page 79 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Méthodologies innovantes d’analyse des gènes et des génomes

cline ? ». Ces profils d’expression sont issus de la comparaison de deux groupes de patients semblables dans de nombreux caractères mais différents dans le caractère d’intérêt (métastatique – non métastatique ou sensible à l’anthracycline – non sensible à l’anthracycline). Une fois l’analyse du transcriptome réalisée sur ces paires de patients, la première étape de la construction d’un prédicteur pronostique est la sélection d’un certain nombre de gènes dits informatifs qui vont entrer dans la composition de la signature pronostique. Cette étape, effectuée sur les malades du groupe d’apprentissage, consiste à identifier les gènes les plus différemment exprimés entre les 2 groupes évolutifs (par exemple patients ayant récidivé versus patients ayant guéri). De très nombreux tests statistiques et critères de sélection peuvent être utilisés pour établir la signature pronostique. Il est possible de comparer les mesures d’expression entre les deux groupes évolutifs de malades par un test t de Student ou des tests non paramétriques, mais il est également possible d’intégrer le délai de survenue de la récidive. Il est possible de réaliser ces tests de façon indépendante ou, au contraire, d’utiliser les méthodes d’homologie de groupes (cluster). Quelle que soit la méthode retenue, l’expérimentateur doit choisir le critère de sélection pour déclarer un gène informatif. Ce critère peut être un seuil fixé pour la statistique calculée ou le nombre de gènes ayant la statistique la plus élevée en valeur absolue. La deuxième étape de la construction d’un prédicteur pronostique consiste en la sélection d’une règle de classification (« classifier »). Là encore, il existe de nombreuses possibilités parmi lesquelles l’expérimentateur devra faire un choix. Les règles les plus utilisées sont la technique des k plus proches voisins (« knearest neighbours »), l’analyse diagonale discriminante linéaire (« diagonal linear discriminant analysis »), et la technique des « weighted votes ». L’évaluation de la performance d’un prédicteur pronostique se fait sur le groupe de validation, et consiste à comparer, pour chaque malade de ce groupe, l’évolution prédite et l’évolution réellement observée. Le critère le plus simple d’évaluation est l’exactitude prédictive, c’est-à-dire la proportion d’évolutions correctement prédites. Ce critère peut être affiné en déterminant la sensibilité (proportion d’évolutions correctement prédites parmi les malades ayant récidivé) et la spécificité (proportion d’évolutions correctement prédites parmi les malades n’ayant pas récidivé) du prédicteur. Il est également possible de comparer la composition de ces différentes signatures. Plusieurs critères peuvent être utilisés pour apprécier la « stabilité » de ces signatures comme, par exemple, le pourcentage de gènes constamment sélectionnés ou la moyenne du nombre de gènes en commun entre deux signatures. La valeur prédictive ou pronostique ainsi définie doit être validée par l’analyse en aveugle d’un grand nombre d’échantillons

différents de ceux inclus dans l’analyse. Cette validation peut se faire, non pas à l’aide de puces à ADNc, mais par RT-PCR. Quelques tests basés sur ces résultats ont déjà reçus le marquage CE (Communauté Européenne) et sont en cours d’examen par la FDA (Food Drug Administration). Le type de renseignement fourni par ce type de test au clinicien est un « indice de récidive » exprimé sur une échelle. Il représente actuellement un élément de diagnostic et pourrait être déterminant pour la décision d’instaurer ou non une chimiothérapie. Le cancer actuellement ciblé pour la commercialisation de ces tests est le cancer du sein basé sur les travaux de van de Vijver et van’t Veer au « Netherlands Cancer Institute » (van de Vijver MJ et al., 2002). Nous voyons par ces exemples que les puces à ADNc prennent leur place dans l’arsenal du diagnostic et du pronostic de différentes maladies. Le développement et l’utilisation de telles techniques dans le but de rendre un résultat qui motivera une décision thérapeutique nécessitent des mesures fiables et reproductives et ne pourront se faire que sur des plateformes standardisées et validées.

CONCLUSION ET PERSPECTIVES L’avènement de nouvelles technologies permettant l’étude des gènes, du génome et du transcriptome en parallèle du développement des techniques d’analyse du protéome et aussi des métabolome, lipidome et glycome constitue un challenge de la biologie médicale pour le début du 21e siècle, tant dans la compréhension de la physiopathologie que dans le diagnostic et le pronostic de maladies, qu’elles soient rares ou fréquentes, monogéniques ou polygéniques. Elles permettront : (1) d’affiner le classement de pathologies d’histologie et/ou de clinique similaires, (2) de pronostiquer leur évolution, (3) de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques et d’individualiser les traitements et (4) d’approfondir notre connaissance des mécanismes physiopathologiques. Cependant, les informations, obtenues par ces approches à hautdébit, sont sous-utilisées car produites en masse et non reliées. Grâce au développement d’une discipline que l’on appelle la biologie systémique, l’extraction rationnelle de ces données, leur interrelation, et leur connexion à des bases de données existantes (nomenclature, topographie chromosomique ou cellulaire, ontologie des gènes…) ou à créer (relations avec l’histologie, la chimiothérapie…) permettront de mieux appréhender dans l’avenir la maladie en proposant un nouveau modèle dynamique des séquences d’altérations génétique, protéique et métabolique et de développer des thérapies potentielles.

79

4557_2_.book Page 80 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Références bibliographiques Barrier A, Boelle PY, Roser F, Gregg J, Tse C, Brault D, Lacaine F, Houry S, Huguier M, Franc B, Flahault A, Lemoine A, Dudoit S (2006). Stage II colon cancer prognosis prediction by tumor gene expression profiling. J Clin Oncol, 24 : 4685-4691. Bartel DP (2009). « MicroRNAs : target recognition and regulatory functions ». Cell, 136 : 215-233. Brazma A, Hingamp P, Quackenbush J, Sherlock G, Spellman P, Stoeckert C, Aach J, Ansorge W, Ball CA, Causton HC, Gaasterland T, Glenisson P, Holstege FC, Kim IF, Markowitz V, Matese JC, Parkinson H, Robinson A, Sarkans U, Schulze-Kremer S, Stewart J, Taylor R, Vilo J, Vingron M (2001). Minimum information about a microarray experiment (MIAME) – towards standards for microarray data. Nature Genet, 29 : 365-371. Brodersen P, Voinnet O (2009). Revisiting the principles of microRNA target recognition and mode of action. Nat Rev Mol Cell Biol, 10 : 141-148. Buyse, M. Loi S, van’t Veer L, Viale G, Delorenzi M, Glas AM, d'Assignies MS, Bergh J, Lidereau R, Ellis P, Harris A, Bogaerts J, Therasse P, Floore A, Amakrane M, Piette F, Rutgers E, Sotiriou C, Cardoso F, Piccart MJ ; TRANSBIG Consortium (2006). Validation and clinical utility of a 70-gene prognostic signature for women with node-negative breast cancer. J. Natl Cancer Inst, 98 : 1183-1192. Canales RD, Luo Y, Willey JC, Austermiller B, Barbacioru CC, Boysen C, Hunkapiller K, Jensen RV, Knight CR, Lee KY, Ma Y, Maqsodi B, Papallo A, Peters EH, Poulter K, Ruppel PL, Samaha RR, Shi L, Yang W, Zhang L, Goodsaid FM (2006). Evaluation of DNA microarray results with quantitative gene expression platforms. Nat Biotechnol, 24 : 1115-1122. Chee M, Yang R, Hubbell E, Berno A, Huang XC, Stern D, Winkler J, Lockhart DJ, Morris MS, Fodor SP (1996). Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science, 274 : 610-614. d’Alessandra Y, Devanna P, Limana F, Straino S, Di Carlo A, Brambilla PG, Rubino M, Carena MC, Spazzafumo L, De Simone M, Micheli B, Biglioli P, Achilli F, Martelli F, Maggiolini S, Marenzi G, Pompilio G, Capogrossi MC (2010). Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J, 31 : 2765-2773. Drakaki A, Iliopoulos D (2009). MicroRNA Gene Networks in Oncogenesis. Curr Genomics, 10 : 35-41. Eiring AM, Harb JG, Neviani P, Garton C, Oaks JJ, Spizzo R, Liu S, Schwind S, Santhanam R, Hickey CJ, Becker H, Chandler JC, Andino R, Cortes J, Hokland P, Huettner CS, Bhatia R, Roy DC, Liebhaber SA, Caligiuri MA, Marcucci G, Garzon R, Croce CM, Calin GA, Perrotti D (2010). miR-328 functions as an RNA decoy to modulate hnRNP E2 regulation of mRNA translation in leukemic blasts. Cell, 140 : 652-665. Fontana L, Fiori ME, Albini S, Cifaldi L, Giovinazzi S, Forloni M, Boldrini R, Donfrancesco A, Federici V, Giacomini P, Peschle C, Fruci D (2008). Antagomir-17-5p abolishes the growth of therapy-resistant neuroblastoma through p21 and BIM. PLoS One, 3 : e2236. Goetz MP, Rae JM, Suman VJ, Safgren SL, Ames MM, Visscher DW, Reynolds C, Couch FJ, Lingle WL, Flockhart DA, Desta Z, Perez EA, Ingle JN (2005). Pharmacogenetics of tamoxifen biotransformation is associated with clinical outcomes of efficacy and hot flashes. J Clin Oncol, 23 : 9312-9318. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, Huard C, Gaasenbeek M, Mesirov JP, Coller H, Loh ML, Downing JR, Caligiuri MA, Bloomfield CD,

80

Lander ES (1999). Molecular classification of cancer : class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science, 286 : 531-537. Hacia JG, Brody LC, Chee MS, Fodor SP, Collins FS (1996). Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high density oligonucleotide arrays and two-colour fluorescence analysis. Nature Genet, 14 : 441-447. He L, He X, Lim LP, de Stanchina E, Xuan Z, Liang Y, Xue W, Zender L, Magnus J, Ridzon D, Jackson AL, Linsley PS, Chen C, Lowe SW, Cleary MA, Hannon GJ (2007). A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature, 447 : 1130-1134. Imbeaud S, Auffray C (2005). « The 39 steps » in gene expression profiling : critical issues and proposed best practices for microarray experiments. Drug Discov Today, 1 : 1175-1182. Jafari P, Azuaje F (2006). An assessment of recently published gene expression data analyses : reporting experimental design and statistical factors. BMC Medical Informatics and Decision Making, 6 : 27. Kosaka N, Iguchi H, Ochiya T (2010). Circulating microRNA in body fluid : a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis. Cancer Sci, 101 : 2087-2092. Kozal MJ, Shah N, Shen N, Yang R, Fucini R, Merigan TC, Richman DD, Morris D, Hubbell E, Chee M, Gingeras TR (1996). Extensive polymorphisms observed in HIV-1 clade B protease gene using high-density oligonucleotide arrays. Nature Med, 2 : 753-759. Lambert JC, Heath S, Even G, Campion D, Sleegers K, Hiltunen M, Combarros O, Zelenika D, Bullido MJ, Tavernier B, Letenneur L, Bettens K, Berr C, Pasquier F, Fiévet N, Barberger-Gateau P, Engelborghs S, De Deyn P, Mateo I, Franck A, Helisalmi S, Porcellini E, Hanon O ; European Alzheimer’s Disease Initiative Investigators, de Pancorbo MM, Lendon C, Dufouil C, Jaillard C, Leveillard T, Alvarez V, Bosco P, Mancuso M, Panza F, Nacmias B, Bossù P, Piccardi P, Annoni G, Seripa D, Galimberti D, Hannequin D, Licastro F, Soininen H, Ritchie K, Blanché H, Dartigues JF, Tzourio C, Gut I, Van Broeckhoven C, Alpérovitch A, Lathrop M, Amouyel P (2009). Genome-wide association study identifies variants at CLU and CR1 associated with Alzheimer’s disease. Nat Genet, 41 (10) : 1094-1099. Li X, Zhang Y, Zhang Y, Ding J, Wu K, Fan D (2010). Survival prediction of gastric cancer by a seven-microRNA signature. Gut, 59 : 579-585. Mack GS (2007). MicroRNA gets down to business. Nat Biotechnol, 25 : 631-638. Michiels S, Koscielny S, Hill C (2005). Prediction of cancer outcome with microarrays : a multiple random validation strategy. Lancet, 365 : 488-492. Miclaus K, Chierici M, Lambert C, Zhang L, Vega S, Hong H, Yin S, Furlanello C, Wolfinger R, Goodsaid F (2010). Variability in GWAS analysis : the impact of genotype calling algorithm inconsistencies. Pharmacogenomics J, 10 : 324-335. Mitchell PS, Parkin RK, Kroh EM, Fritz BR, Wyman SK, PogosovaAgadjanyan EL, Peterson A, Noteboom J, O’Briant KC, Allen A, Lin DW, Urban N, Drescher CW, Knudsen BS, Stirewalt DL, Gentleman R, Vessella RL, Nelson PS, Martin DB, Tewari M (2008). Circulating microRNAs as stableblood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci USA, 105 : 10513-10518.

4557_2_.book Page 81 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Méthodologies innovantes d’analyse des gènes et des génomes

Peltier HJ, Latham GJ (2008). Normalization of microRNA expression levels in quantitative RT-PCR assays : identification of suitable reference RNA targets in normal and cancerous human solid tissues. RNA, 14 : 844-852. Pietu G, Alibert O, Guichard V, Lamy B, Bois F, Leroy E, MariageSampson R, Houlgatte R, Soularue P, Auffray C (1996). Novel gene transcripts preferentially expressed in human muscles revealed by quantitative hybridization of a high density cDNA array. Genome Res, 6 : 492-503. Pinkel D, Segraves R, Sudar D, Clark S, Poole I, Kowbel D, Collins C, Kuo WL, Chen C, Zhai Y, Dairkee SH, Ljung BM, Gray JW, Albertson DG (1998). High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays. Nature Genet, 20 : 207-211. Salazar NM, Caetano-Anolles G (1996). Nucleic acid scanning-byhybridization of enterohemorrhagic Escherichia coli isolates using oligodeoxynucleotide arrays. Nucleic Acids Res, 24 : 5056-5057.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Sato F, Tsuchiya S, Terasawa K, Tsujimoto G (2009). Intra-platform repeatability and inter-platform comparability of microRNA microarray technology. PLoS One, 4 : e5540. Shi L, Campbell G, Jones WD, Campagne F, Wen Z, Walker SJ, Su Z, Chu TM, Goodsaid FM, Pusztai L, Shaughnessy JD Jr, Oberthuer A, Thomas RS, Paules RS, Fielden M, Barlogie B, Chen W, Du P, Fischer M, Furlanello C, Gallas BD, Ge X, Megherbi DB, Symmans WF, Wang MD, Zhang J, Bitter H, Brors B, Bushel PR, Bylesjo M, Chen M, Cheng J, Cheng J, Chou J, Davison TS, Delorenzi M, Deng Y, Devanarayan V, Dix DJ, Dopazo J, Dorff KC, Elloumi F, Fan J, Fan S, Fan X, Fang H, Gonzaludo N, Hess KR, Hong H, Huan J, Irizarry RA, Judson R, Juraeva D, Lababidi S, Lambert CG, Li L, Li Y, Li Z, Lin SM, Liu G, Lobenhofer EK, Luo J, Luo W, McCall MN, Nikolsky Y, Pennello GA, Perkins RG, Philip R, Popovici V, Price ND, Qian F, Scherer A, Shi T, Shi W, Sung J, Thierry-Mieg D, Thierry-Mieg J, Thodima V, Trygg J, Vishnuvajjala L, Wang SJ, Wu J, Wu Y, Xie Q, Yousef WA, Zhang L, Zhang X, Zhong S, Zhou Y, Zhu S, Arasappan D, Bao W, Lucas AB, Berthold F, Brennan RJ, Buness A, Catalano JG, Chang C, Chen R, Cheng Y, Cui J, Czika W, Demichelis F, Deng X, Dosymbekov D, Eils R, Feng Y, Fostel J, Fulmer-Smentek S, Fuscoe JC, Gatto L, Ge W, Goldstein DR, Guo L, Halbert DN, Han J, Harris SC, Hatzis C, Herman D, Huang J, Jensen RV, Jiang R, Johnson CD, Jurman G, Kahlert Y, Khuder SA, Kohl M, Li J, Li L, Li M, Li QZ, Li S, Li Z, Liu J, Liu Y, Liu Z, Meng L, Madera M, Martinez-Murillo F, Medina I, Meehan J, Miclaus K, Moffitt RA, Montaner D, Mukherjee P, Mulligan GJ, Neville P, Nikolskaya T, Ning B, Page GP, Parker J, Parry RM, Peng X, Peterson RL, Phan JH, Quanz B, Ren Y, Riccadonna S, Roter AH, Samuelson FW, Schumacher MM, Shambaugh JD, Shi Q, Shippy R, Si S, Smalter A, Sotiriou C, Soukup M, Staedtler F, Steiner G, Stokes TH, Sun Q, Tan PY, Tang R, Tezak Z, Thorn B, Tsyganova M, Turpaz Y, Vega SC, Visintainer R, von Frese J, Wang C, Wang E, Wang J, Wang W, Westermann F, Willey JC, Woods M, Wu S, Xiao N, Xu J, Xu L, Yang L, Zeng X, Zhang J, Zhang L, Zhang M, Zhao C, Puri RK, Scherf U, Tong W, Wolfinger RD ; MAQC Consortium (2010). The MicroArray Quality Control (MAQC)-II study of

common practices for the development and validation of microarray-based predictive models. Nat Biotechnol, 28 : 827-38. Tkatchenko AV, Le Cam G, Leger JJ, Dechesne CA (2000). Largescale analysis of differential gene expression in the hindlimb muscles and diaphragm of mdx mouse. Biochim Biophys Acta, 1500 : 17-30. Tomlinson I, Webb E, Carvajal-Carmona L, Broderick P, Kemp Z, Spain S, Penegar S, Chandler I, Gorman M, Wood W, Barclay E, Lubbe S, Martin L, Sellick G, Jaeger E, Hubner R, Wild R, Rowan A, Fielding S, Howarth K ; CORGI Consortium, Silver A, Atkin W, Muir K, Logan R, Kerr D, Johnstone E, Sieber O, Gray R, Thomas H, Peto J, Cazier JB, Houlston R (2007). A genome-wide association scan of tag SNPs identifies a susceptibility variant for colorectal cancer at 8q24.21. Nat Genet, 39 : 984-988. Troesch A, Nguyen H, Miyada CG, Desvarenne S, Gingeras TR, Kaplan PM, Cros P, Mabilat C (1999). Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J Clin Microbiol, 137 : 49-55. van de Vijver MJ, He YD, van’t Veer LJ, Dai H, Hart AA, Voskuil DW, Schreiber GJ, Peterse JL, Roberts C, Marton MJ, Parrish M, Atsma D, Witteveen A, Glas A, Delahaye L, van der Velde T, Bartelink H, Rodenhuis S, Rutgers ET, Friend SH, Bernards R (2002). A geneexpression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med, 347 : 1999-2009. van’t Veer, L. J. He YD, van’t Veer LJ, Dai H, Hart AA, Voskuil DW, Schreiber GJ, Peterse JL, Roberts C, Marton MJ, Parrish M, Atsma D, Witteveen A, Glas A, Delahaye L, van der Velde T, Bartelink H, Rodenhuis S, Rutgers ET, Friend SH, Bernards R (2002). Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature, 415 : 530-536. Wang DG, Fan JB, Siao CJ, Berno A, Young P, Sapolsky R, Ghandour G, Perkins N, Winchester E, Spencer J, Kruglyak L, Stein L, Hsie L, Topaloglou T, Hubbell E, Robinson E, Mittmann M, Morris MS, Shen N, Kilburn D, Rioux J, Nusbaum C, Rozen S, Hudson TJ, Lipshutz R, Chee M, Lander ES (1998). Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome. Science, 280 : 1077-1082. Zampetaki A, Kiechl S, Drozdov I, Willeit P, Mayr U, Prokopi M, Mayr A, Weger S, Oberhollenzer F, Bonora E, Shah A, Willeit J, Mayr M (2010). Plasma microRNA profiling reveals loss of endothelial miR-126 and other microRNAs in type 2 diabetes. Circ Res, 107 : 810-817. Zanke BW, Greenwood CM, Rangrej J, Kustra R, Tenesa A, Farrington SM, Prendergast J, Olschwang S, Chiang T, Crowdy E, Ferretti V, Laflamme P, Sundararajan S, Roumy S, Olivier JF, Robidoux F, Sladek R, Montpetit A, Campbell P, Bezieau S, O'Shea AM, Zogopoulos G, Cotterchio M, Newcomb P, McLaughlin J, Younghusband B, Green R, Green J, Porteous ME, Campbell H, Blanche H, Sahbatou M, Tubacher E, Bonaiti-Pellié C, Buecher B, Riboli E, Kury S, Chanock SJ, Potter J, Thomas G, Gallinger S, Hudson TJ, Dunlop MG (2007). Genome-wide association scan identifies a colorectal cancer susceptibility locus on chromosome 8q24. Nat Genet, 39 (8) : 989-994.

81

4557_2_.book Page 82 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4557_2_.book Page 83 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

6 Protéomique et métabolomique Bruno Baudin, Jean-François Benoist

INTRODUCTION 1 ■■ PROTÉOMIQUE 1.1. 1.2. 1.3.

Introduction Les méthodes d’étude Les applications actuelles et nouvelles technologies

2 ■■ MÉTABOLOMIQUE 2.1. 2.2. 2.3.

Introduction Les méthodes d’étude Deux approches complémentaires sont utilisées dans l’étude du métabolome

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Références bibliographiques

83

4557_2_.book Page 84 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4557_2_.book Page 85 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Protéomique et métabolomique

INTRODUCTION

1 ■■ PROTÉOMIQUE

La médecine actuelle dispose depuis plusieurs décennies de nombreux outils biologiques sur lesquels elle peut baser le diagnostic et le suivi de la plupart des grandes pathologies. Nous en voyons de nombreux exemples dans les différents chapitres de ce livre. Cependant, au cours des dix dernières années, le séquençage du génome humain dans sa globalité (Human Genome Project) a permis de développer de nouvelles approches du diagnostic et du suivi d’une maladie. L’ensemble de ces méthodes est basé pour l’essentiel sur les profils d’expression génomique ou protéomique de cohortes de patients présentant une pathologie donnée, celle-ci étant parfois déjà sous-divisée à partir de données cliniques ou biologiques existantes. On dispose également de données de métabolomique qui consiste en l’étude de l’ensemble des métabolites produits dans une cellule ou un tissu « dans des conditions particulières », de peptidomique qui se situe au confluent de la métabolomique et de la protéomique, de glycomique pour l’étude des glucides et des glycosylations de protéines, peptides et lipides, et de lipidomique, pour celle des lipides sous leurs diverses formes. L’ensemble de ces analyses est regroupé sous le terme de « -omics ». De nombreuses sociétés pharmaceutiques ou biotechnologiques se sont lancées dans une compétition afin de mettre rapidement sur le marché de nouveaux outils diagnostiques basés sur ces approches. Dans la première partie de ce chapitre, nous traiterons des méthodes d’étude du protéome, puis de celles du métabolome dans le deuxième chapitre. Des applications actuelles en biologie clinique seront données dans chaque chapitre, complétées par les perspectives à plus ou moins long terme.

1.1.

Introduction

Le séquençage des génomes représente un exploit extraordinaire qui a permis de donner un nouvel essor à la biologie et à la médecine. Il en est de même pour la protéomique grâce aux nombreux travaux sur la représentation détaillée des protéines en gels bidimensionnels. Le développement de la spectrométrie de masse et l’enrichissement des banques de données ont largement participé à cet engouement. En effet, ces technologies permettent des études différentielles et la caractérisation fonctionnelle des protéines, même si les méthodes de quantification restent difficiles. De nombreuses applications sont disponibles aussi bien en biologie fondamentale qu’en médecine, pour la recherche de nouveaux médicaments, le diagnostic et le pronostic des maladies humaines. La finalité de l’analyse du protéome, représenté par les protéines que code l’ensemble des ARN messagers (ARNm), a la même finalité que l’analyse du transcriptome constitué par ces ARNm. En effet, les méthodes d’analyse protéomique permettent d’identifier voire de quantifier les produits de l’expression des gènes d’une cellule ou d’un tissu à un instant et dans un environnement donné, puisque cette expression varie continuellement dans les cellules et les tissus (figure 1). L’établissement du profil d’expression globale de protéines sous leurs formes variées est appelé protéomique descriptive. Cependant, seulement 500 à 1 000 protéines sont caractéristiques d’un type cellulaire. En effet, 80 % de ces protéines ne sont pas spécifiques d’un type cellulaire ; c’est le cas des « protéines de ménage », souvent fortement exprimées car elles portent les fonctions essentielles à la vie de toute cellule. Or si l’on considère

Terminologie

Molécules

Méthodes d’étude

Génome

ADN

PCR, clonage, SB

ARNm

RT-PCR, NB, puces ADNc

Protéome

Protéines (enzymes, récepteurs, FT)

2-DE, MS, WB, puces protéiques

Métabolome

Métabolites

Méthodes variées

Réplication Transcription

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Environnement Interactions cellulaires

Transcriptome

Traduction

Fonctions intégrées

Figure 1

■

L’ère post-génomique et ses outils.

Abréviations : PCR (Polymerase Chain Reaction) ; RT-PCR (Reversed Transcriptase – PCR) ; SB, NB et WB (Southern, Northern et Western-blot, respectivement) ; 2-DE (Électrophorèse bi-dimensionnelle) ; MS (Spectrométrie de Masse) ; FT (Facteur de Transcription).

85

4557_2_.book Page 86 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

qu’il existe environ 250 cellules hautement différenciées dans le corps humain, 100 000 protéines seraient potentiellement intéressantes. L’étude de celles-ci, et plus particulièrement de leurs différences d’expression en fonction de l’environnement et des conditions de vie, est appelée protéomique fonctionnelle. Les modifications de l’environnement induisent des variations d’expression de plusieurs protéines, spécifiques à cette cellule ou communes à différents types cellulaires. Le protéome constitutif est la ligne de base des études fonctionnelles et l’analyse des modifications post-traductionnelles prend ici une importance toute particulière. Toutes ces modifications induisent des changements dans la masse des polypeptides analysables par spectrométrie de masse, et visibles par les méthodes bidimensionnelles, en particulier l’électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) qui est la technique au cœur de l’analyse protéomique. En fait, la plus grande différence entre génomique et protéomique réside dans le fait qu’à un génome statique va correspondre une infinité de protéomes par organisme et en évolution constante, ce qui amène une vision plus dynamique. Quels sont les buts et les promesses de la protéomique ? En biologie fondamentale, elle va permettre une meilleure compréhension de la physiologie complète des cellules et de leurs régulations sous l’influence de stimuli. L’un des premiers challenges est actuellement l’acquisition de données reliées à la croissance, la différenciation, la sénescence, les modifications de l’environnement et les manipulations génétiques. Un grand espoir se porte aussi sur la puissance de la protéomique pour identifier de nouvelles cibles d’intervention thérapeutiques sur les maladies, étant donné que près de 80 % des cibles des médicaments sont des protéines. En biologie clinique, la protéomique permettra l’identification de marqueurs spécifiques et sensibles de maladies, qui pourraient s’avérer utiles aux diagnostic et pronostic des maladies humaines comme le cancer, les maladies cardio-vasculaires, neuro-dégénératives ou encore infectieuses et inflammatoires. L’analyse protéomique peut également être utilisée avec profit dans les études toxicologiques. Avant de développer les acquis et de dessiner les promesses de la protéomique en biologie clinique, nous nous proposons de décrire les différentes approches techniques actuelles avec, en particulier, l’électrophorése bidimensionnelle (2-DE) et les méthodes de spectrométrie de masse appliquées à l’analyse protéomique.

1.2.

sance des sites de coupure par des protéases. Nous verrons que pour mener à bien cette analyse, et plus encore pour déterminer les modifications post-traductionnelles, il est nécessaire de combiner plusieurs types de spectrométries de masse. La 2-DE associe la séparation des protéines contenues dans l’échantillon biologique, d’abord par isoélectrofocalisation (IEF) en fonction de leur point isoélectrique (pI), c’est la première dimension, puis par électrophorèse dénaturante en gel de polyacrylamide (PAGESDS) en fonction de la masse moléculaire (Mr), c’est la deuxième dimension ; on réalise en fait un tamisage moléculaire. L’IEF sur gel est devenue aisée et reproductible grâce aux gels à gradient de pH immobilisé (IPG) dont il existe de nombreuses gammes. Un grand soin doit être apporté à la préparation des échantillons, toutes les protéines n’étant pas facilement solubles ni même extractibles. Les méthodes actuelles permettent de travailler sur quelques dizaines de microgrammes de protéines et de réaliser des électrophorèses multiples en parallèle. Une fois la 2-DE réalisée, les protéines sont révélées par des méthodes de coloration classiques comme l’emploi du bleu de Coomassie ou du nitrate d’argent (figure 2). On peut aussi utiliser la révélation de radioactivité après marquage sélectif, par exemple l’incorporation de 35S-méthionine en cours de traduction ou le marquage par le 32P pour l’étude des phosphorylations. L’emploi de marqueurs fluorescents est en plein essor. Le marquage peut être réalisé avant la 2-DE, ou après l’étape d’IEF ou encore après la 2-DE. Ils permettent un marquage différentiel par l’utilisation de marqueurs fluorescents émettant à des longueurs d’onde différentes. Toutes ces méthodes de détection sont compatibles avec la spectrométrie de masse (MS, mass spectrometry) mais nécessitent un appareillage coûteux (Baudin et Bruneel, 2003 ; Görg et al., 2000 ; O’Farell, 1975). Des logiciels permettent l’acquisition des données présentes sur les gels. La diminution du bruit de fond, l’élimination des défauts sur les gels, le dénombrement des taches, leur comparaison par superposition de fichiers, la quantification par les mesures d’intensité et de volume des taches sont traités par des logiciels. Ce travail, souvent long, est nécessaire pour établir une banque de données qui pourra servir de référence. Ces données peuvent être mises à disposition sur internet (Pernet et al. 2006 ; huvec.com).

Les méthodes d’étude

1.2.1. L’électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) L’approche protéomique classique associe l’électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) à l’analyse des taches d’intérêt par spectrométrie de masse en utilisant le principe du « peptide mass fingerprinting » (PMF), c’est-à-dire l’hydrolyse des protéines par une protéase, généralement la trypsine dans un premier temps, puis la détermination précise de la masse des peptides obtenus. Ceci est maintenant possible grâce aux grands progrès qu’a connus la spectrométrie de masse ces dernières années. Les masses des peptides sont alors enregistrées dans des banques de données et l’identité des protéines peut être retrouvée par la connais-

86

Figure 2

■ Un exemple de profil d’électrophorèse bi-dimensionnelle avec l’étiquetage de taches contenant des protéines identifiées par spectrométrie de masse (communication personnelle et résultats disponibles sur http ://www.huvec.com).

4557_2_.book Page 87 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Protéomique et métabolomique

1.2.2. Identification des protéines par spectrométrie de masse (MS) ■ Le Peptide Mass Fingerprinting (PMF) par MALDI-TOF

Les taches d’intérêt sont découpées des gels, soit manuellement au scalpel, soit de façon automatisée avec un « gel-spotter » qui travaille sur des plaques à 96 puits. Chaque tache est ensuite traitée individuellement ; notons que chacune peut contenir une ou plusieurs protéines. Le traitement, généralement par la trypsine, se fait en micro-tubes ou de façon automatisée en plaques de 96 puits dans un « digester ». Des protocoles précis d’hydrolyse trypsique ont été décrits (figure 3). La masse des peptides peut être obtenue aussi bien par MS de type MALDI-MS que ESI-MS, cette dernière étant généralement couplée à la chromatographie liquide. Dans le principe du MALDIMS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry), le mélange séché est bombardé sous vide par un laser (classiquement un laser pulsé à 337 nm) qui excite les molécules et ionise les peptides. Ceux-ci vont être entraînés dans une plume gazeuse pour entrer, sous vide, dans un champ électrique généré par un aimant accélérateur d’ions, vers un détecteur. Tous les MALDI-MS actuels permettent une acquisition automatique des données et des bombardements programmables ; ils sont tous équipés du mode de détection en temps de vol (TOF ou « Time of Flight ») et du mode Reflectron qui améliore la précision sur la masse et la résolution. Dans ce principe d’ionisation, les ions peptidiques formés majoritairement sont mono-chargés donc de masse M + 1 (M + H+). Dans le détecteur TOF, l’arrivée des peptides chargés se fait dans l’ordre croissant de masse, les plus lourds étant ralentis voire éliminés (la vitesse est une fonction inverse de la racine carrée du rapport M/Z) ; les ions mono-chargés sont analysés sous le rapport M/Z – 1 avec Z égal 1, les ions

Données expérimentales

Banques de données

doublement chargés (M + 2H+) sous le rapport M/2 – 2 et ainsi de suite. Le Reflectron permet de focaliser la distribution isotopique en favorisant l’émergence des peptides porteurs de 12C majoritairement ; les pics suivants, généralement accolés, contiennent une proportion de 13C. Ce système de détection nécessite un étalonnage par des peptides de masse connue à 10 –4 Da, souvent des angiotensines et des neuropeptides ; on utilise aussi des peptides d’autodigestion de la trypsine pour un étalonnage interne (Aebersold et Mann, 2003 ; Schevchenko et al., 2000). L’automatisation de toutes ces étapes, de la 2-DE à l’analyse par MALDI-MS, correspond à ce qu’on appelle la protéomique à haut-débit, menant à identifier plusieurs centaines de protéines dans une même série. La dernière étape, même si elle utilise des logiciels et des banques de données, reste longue et pas toujours couronnée de succès. L’interrogation de banques, reliées à différents logiciels de données, sur la base des masses des peptides déterminées par MS, demande des renseignements complémentaires tels l’emploi de réducteur et d’alkylant dans l’étape de 2DE, la précision de détermination de la masse, les gammes de pI et Mr probables. La masse d’un seul peptide ne permet pas d’identifier la protéine dont il est issu ; il en faut au moins cinq identiques aux séquences trouvées dans la protéine, ce qui doit représenter au moins 20 % de la séquence. Le logiciel donne, dans l’ordre statistique décroissant, la probabilité d’identité de la protéine. Il faut alors vérifier la cohérence de ses pI et Mr avec ceux mesurés dans le gel et si les fonctions et localisations subcellulaires de la protéine supposées correspondent à l’hypothèse de travail formulée. Il est conseillé de vérifier le résultat dans plusieurs banques de données différentes. Dans une tache d’un gel 2-DE plusieurs protéines peuvent coexister et le MALDI-MS est capable de les découvrir en même temps, le logiciel triant les peptides appartenant aux unes et aux autres protéines. On peut vérifier la présence d’une protéine dans une tache en réalisant un western-blot sur le gel 2-DE après transfert, si l’anticorps est disponible. ■ Le séquençage peptidique par spectrométrie de masse en tandem

Génome/séquençage protéique

Séquence d’AA

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Digestion enzymatique Peptides Spectrométrie de masse m/z

Masses peptidiques expérimentales

Figure 3

Digestion « in silico »

Masses peptidiques théoriques

Identification

■ Le principe du Peptide Mass Fingerprinting : du découpage des morceaux de gel 2-DE à l’interrogation des banques de données pour l’identification de protéines.

L’ESI-MS (Electro-Spray Ionization Mass Spectrometry) est une méthode de spectrométrie de masse en tandem aussi bien adaptée aux petites molécules qu’aux macromolécules, en particulier aux protéines entières. Dans ce mode d’injection en phase liquide, l’ionisation se produit lors de la vaporisation du spray formé par un courant gazeux chargé de l’échantillon, en sortie d’un chromatographe ou d’une électrophorèse capillaire. Chaque espèce moléculaire apparaît sous de multiples formes chargées et sans fragmentation ; accélérées dans le champ magnétique, elles atteindront le détecteur selon leur masse. Cette méthode permet d’atteindre une grande précision de masse mais celle-ci diminue en proportion de la masse. En protéomique, l’ESI-MS présente un intérêt double ; le premier réside dans son couplage MS/MS (dit en tandem) pour l’analyse de peptides séparés par LC (liquid chromatography) à phase inversée, la seconde MS fragmentant le peptide sélectionné en dérivés peptidiques ionisés (Dancik et al., 1999 ; Jensen et al., 1999 ; Schevchenko et al., 1996 et 2000). La mesure des masses de ces fragments, analysés un à un en interrogeant d’autres banques de données, permet de reconstruire la séquence du peptide grâce à des logiciels adaptés. On peut ainsi

87

4557_2_.book Page 88 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

vérifier des identités douteuses en MALDI-MS, découvrir des protéines inaccessibles par le PMF, et même établir la séquence d’une protéine inconnue ; cette double approche en MS augmente toujours les réussites d’identification. Le second grand intérêt de l’ESI-MS réside dans sa haute précision à identifier des modifications post-traductionnelles, en particulier les groupements phosphate (+ 39), acétate, méthyle et bien d’autres (Mann et Jensen, 2003). Des modèles évolués couplant nanoLC et nanospray permettent le séquençage à partir d’un microlitre d’échantillon. ■ Le spectromètre de masse à résonance cyclotronique ionique et transformée de Fourier (FT-ICR)

Cet analyseur, encore peu usité parce que très cher, présente une grande résolution (de l’ordre de 80 000 Da) pour les massifs isotopiques et une précision en masse extrême (de l’ordre de 0,5 ppm). Les ions produits par une source entrent dans une cellule cyclotronique dans laquelle règne un champ magnétique intense (4 à 9 Teslas). Ils y subissent une force de Lorentz qui induit leur rotation à une fréquence inversement proportionnelle à leur rapport m/z, ce qui permet la séparation des ions. Le signal obtenu ne peut pas être utilisé ; il doit subir une transformée de Fourier pour générer le spectre de masse. Différents modes de fragmentations des ions sont utilisables, apportant des renseignements de séquence peptidique comme en ESI-MS/MS.

1.3.

Les applications actuelles et nouvelles technologies

Les applications de la protéomique en biologie cellulaire sont multiples, tant en biologie fondamentale qu’en biologie appliquée, et tant dans le règne animal que végétal ou encore dans celui des micro-organismes. Plusieurs revues leurs ont été consacrées (Baudin et Bruneel, 2003 ; Celis et al., 1998 ; Hanash et Teichroew, 1998). En médecine, une approche protéomique classique concerne d’une part le développement de médicaments par la mise en évidence de nouvelles cibles protéiques et d’autre part la découverte de nouveaux marqueurs de maladies, potentiellement utiles à leurs diagnostics, pronostics, suivis évolutifs et thérapeutiques. Dans ce cadre, le fait que l’analyse protéomique ne suppose pas d’hypothèses mécanistiques permet une approche sans a priori. Son intérêt dans la recherche contre le cancer a tout de suite été évident.

1.3.1. Applications en cancérologie Deux approches sont intéressantes en protéomique des cancers, l’une consiste à analyser un fluide biologique, comme le plasma, dans le but de découvrir un marqueur mesurable dans ce milieu. L’autre approche, plus exhaustive, passe par l’étude de la tumeur elle-même, ce qui nécessite plus de préparation comme la microdissection ou des séparations cellulaires. Des études sont aussi menées sur des lignées cancéreuses, en particulier comme recherche de marqueurs de résistance aux chimiothérapies (Le Moguen et al., 2006 ; Srinivas et al., 2001). Le cancer le plus étudié par cette approche protéomique est certainement le cancer colorectal, caractérisé par son évolution à bas bruit et son incidence élevée. Une étude a, par exemple, mis

88

en évidence la diminution d’expression dans le tissu cancéreux colorectal de la selenium-binding protein 1, un facteur de survie (Kim et al., 2006). Diehl et al. (2007) ont établi le secrétome de cellules de cancer du côlon par analyse 2-DE différentielle en fluorescence ; ils ont mis en évidence une augmentation de l’expression des phosphoglycérate-kinases, une protéine-disulfure isomérase et la protéine CSJ3. Par ailleurs, Chen et al. (2007) ont proposé la protéine CLIC-1 comme marqueur pronostique de tumeurs gastriques en le validant par immunohistochimie ; ce canal chlore intracellulaire régule l’acidification de l’estomac, en relation avec la gastrine. Des marqueurs de carcinome hépatocellulaire ont été proposés par Ai et al. (2006), après microdissection laser de tumeurs hépatiques primitives, comme la peroxyrédoxine-2, enzyme antioxydante dont l’expression est diminuée dans ces tumeurs. Sarto et al. (1997) ont montré la diminution de l’expression de l’ubiquinol-cytochrome-C réductase dans des cellules de carcinome rénal, faisant de cette protéine de la chaîne respiratoire un marqueur potentiel de ce cancer souvent diagnostiqué trop tardivement. Dans le cancer du poumon, plusieurs marqueurs ont été proposés à partir d’une étude de microdissection du tissu bronchique cancéreux en comparaison du tissu épithélial sain adjacent. Il s’agit de deux produits d’oncogènes, mdm2 et c-jun, et de l’EGFR (Epidermal growth factor receptor), récepteur membranaire d’un facteur de croissance souvent incriminé dans les phénomènes de cancérisation des tissus épithéliaux ; il représente une cible thérapeutique extrêmement prometteuse (Li et al., 2006).

1.3.2. Applications à d’autres pathologies L’analyse protéomique est souvent capable de fournir une description moléculaire phénotypique des maladies. Néanmoins de nombreuses maladies font intervenir des protéines faiblement abondantes, souvent difficiles à mettre en évidence y compris par l’analyse protéomique classique couplant 2-DE et MS. Certains résultats récents sont cependant prometteurs. Dans le plasma humain, déjà plus de 300 protéines ont été identifiées par 2-DE et MS (Anderson et Anderson, 2002). Seules quelques dizaines d’entre elles sont utilisées actuellement comme marqueurs pathologiques. On retrouve les isoformes de protéines déjà connues, comme celles de l’α1-antitrypsine ; d’autres représentent probablement un intérêt pour l’avenir mais devront être validées. Par ailleurs, la Human Proteome Organization (HUPO) a publié les recommandations pour le recueil du plasma en vue d’une standardisation des résultats (Hu et al., 2006). On connaît maintenant le protéome, et même le peptidome, des urines humaines et dans certaines pathologies rénales (Park et al., 2006 ; Zerefos et al., 2006), le protéome du LCR (Liu et al., 2006), celui du liquide de lavage alvéolaire, par exemple après rejet de greffe du poumon (Zhang et al., 2006), le protéome du liquide amniotique normal (Park et al., 2006) ou celui d’un fœtus atteint de mongolisme (Tsangaris et al., 2006), ou encore les protéomes du sperme (Martinez-Heredia et al., 2006) et de la salive (Walz et al., 2006). Certaines de ces études utilisent directement la spectrométrie de masse, généralement en tandem ou la FTICRMS. Des études de conservation de ces échantillons biologiques ont aussi été menées, comme pour le plasma et les urines, même s’il est encore difficile de trouver des consensus pour chacun d’eux (Traum et al., 2006).

4557_2_.book Page 89 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Protéomique et métabolomique

Dans le liquide céphalorachidien (LCR), la protéine 14-3-3 σ a été mise en évidence comme marqueur de la maladie de Creutzfeldt-Jacob ; la présence en grande quantité dans le LCR de cette protéine signe une destruction cérébrale particulière et caractéristique de cette maladie mais aussi de l’encéphalite herpétique (Hsich et al., 1996). Par ailleurs, une diminution de son expression a été montrée dans des tumeurs du sein, cette protéine étant le produit d’un gène suppresseur de tumeur (Vercoutter-Edouard et al., 2001). Dans le cadre de la compréhension moléculaire des relations hôte/pathogène et de la réponse immunitaire induite, la protéomique semble particulièrement attractive. L’étude comparative d’agents infectieux, pour corréler expression protéique et virulence, permet de définir des cibles thérapeutiques. L’étude de la réponse immunitaire induite au cours des infections ouvre les champs de nouvelles stratégies vaccinales. Depuis peu, une méthode MALDI permet d’identifier des microorganismes, après isolement ou culture. Ces appareils dédiés devraient rapidement remplacer, au moins en partie, les galeries d’identification des bactéries étant donné que la qualité d’identification bactérienne ou parasitaire devient comparable à celle de ces galeries ou des méthodes de référence, tout en raccourcissant le délai du rendu de résultat (Fox 2006 ; Gravet 2010).

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

1.3.3. La protéomique sans gel et ses applications en biologie clinique Il existe des méthodes qui paraissent plus simples que celles décrites précédemment pour l’analyse des protéomes. Cependant, toutes ces méthodes hautement résolutives souffrent d’un défaut de capacité suggérant la nécessité d’un pré-fractionnement des échantillons et le développement d’outils bio-informatiques plus performants. Citons, par exemple, les méthodes de couplage CLHP/MS qui présentent l’avantage de garder l’échantillon en milieu liquide, donc de pouvoir l’analyser secondairement, voire de l’aliquoter pour effectuer de nouvelles analyses et de réaliser d’autres couplages plus ou moins directs (Giddings, 1987). Parmi ces méthodes, le MudPIT® (Multidimensional Protein Identification Technology) combine la CLHP bidimensionnelle (échangeur cationique fort et phase inversée) à l’ESI-MS à trappe d’ions. Cette méthode a permis de produire la plus grande analyse protéomique à ce jour avec 1 484 protéines identifiées dans une lignée de levure, mais encore sans applications cliniques à notre connaissance (Washburn et al., 2001). Selon des principes proches, la technologie ProteomeLab® (Beckman-Coulter) couple deux chromatographies sur colonne (chromatofocalisation en 1 re dimension et phase inversée en 2e) avec élution en continu des protéines et peptides de l’échantillon en fonction de leurs propriétés physicochimiques (pI et hydrophobie). Les molécules recueillies peuvent aussi être analysées par le classique PMF en MS, ou encore par électrophorèse capillaire étant donné que des couplages avec ces appareils ont été prévus (Moore et al., 1996, Tang et al., 1997). Comme une analyse différentielle est possible, des résultats en clinique sont prévisibles à court terme ; on peut déjà citer une étude sur le cancer de l’ovaire différenciant deux sous types de tumeurs (Zhu et al., 2006).

La méthode ICAT® (Isotope-Coated Affinity Tag) est basée sur le marquage différentiel des protéines de deux séries d’échantillons par conjugaison de la biotine aux thiols cystéiniques par l’intermédiaire d’un groupe léger ou lourd (enrichi en deutérium). Les protéines différemment marquées sont mélangées et traitées par la trypsine ; les peptides générés sont ensuite séparés sur colonne d’avidine (affinité en CLHP) et analysés par MS (Gygi et al., 1999 ; Han et al., 2001). Citons l’exemple d’une étude ICAT sur le liquide pancréatique provenant de tumeurs du pancréas (Chen et al., 2006). Beaucoup d’autres méthodes de quantification ont vu le jour, mais bien peu encore sont d’un usage courant ou ont donné des résultats significatifs en biologie médicale. Gageons que, dans l’avenir, elles remplaceront les méthodes actuelles, qui rappelons-le ne sont pas quantitatives. La technologie SELDI-ProteinChip® associe le couplage du SELDI (Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry), cousin du MALDI en détection TOF, avec un système de séparation des protéines et peptides par chromatographie sur surface plane (« ProteinChip® Array » Ciphergen) (Chapman, 2002). Plusieurs types de barrettes « array » sont disponibles ; pratiquement on peut effectuer de l’échange d’ions, anionique ou cationique, de la chromatographie d’adsorption en phase inversée et de l’affinité métallique. Le principe consiste à déposer un échantillon complexe sur la surface chromatographique puis à l’éluer de façon à ne laisser sur cette surface qu’un petit nombre de protéines et de peptides de l’échantillon. Ceux-ci seront directement analysés par le SELDI. Ce système est particulièrement intéressant en analyse comparative, de type patient/ témoin, pour mettre en évidence des marqueurs présents dans un échantillon par rapport à un autre (figure 4). En variant le type de barrette et le schéma d’élution (choix du pH et de la concentration ionique en échange d’ions, du taux d’acétonitrile en phase inversée, du ligand métallique en affinité sur métal), de nombreux marqueurs différentiels ont été proposés pour améliorer le diagnostic, le typage ou le pronostic de diverses maladies. Un logiciel construit des profils protéomiques à partir des données de MS et permet des superpositions de profils mettant en évidence les différences entre échantillons. Si l’on a analysé suffisamment d’échantillons auparavant, le logiciel pourra directement établir une statistique pour proposer les meilleurs marqueurs potentiels et rendre des diagrammes et autres représentations attractives déjà décrites pour les puces à ADN. Le ou les marqueurs qui semblent les plus intéressants peuvent être purifiés de l’échantillon de départ en mettant en œuvre les principes chromatographiques qui les ont mis en évidence ; une fois purifiés, ils pourront être identifiés par le SELDI après digestion protéolytique. Divers fluides biologiques ont été étudiés par cette technologie, ainsi que des extraits cellulaires. Les premiers succès de cette méthode, appliquée au plasma, ont été dans la détection des cancers de l’ovaire et leur classification pronostique (Petricoin et al., 2002), mais ces résultats n’ont pas été reproduits (Kozak et al., 2005). En effet, on sait maintenant que les différences de profils observées étaient essentiellement dues à la nature des tubes de prélèvement du sang différant entre les populations de malades et la population témoin. D’autres études ont permis l’identification de marqueurs du cancer de l’ovaire, comme la protéine SAA (Serum Amyloid A)

89

4557_2_.book Page 90 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

(O)

CBP1 Zn2+

(O)

CBP2 Zn2+

(O)

CBP3 Zn2+ LMW

(O)

CBP4 Zn2+ LMW

(O)

CBP5 Zn2+ LMW

(O)

CBP6 Zn2+ LMW

(O)

T1 Zn2+ LMW

(O)

T2 Zn2+ LMW

(O)

8000

10000

T3 Zn2+ LMW

(O)

7000

9000

T4 Zn2+ LMW

(O)

8000

T5 Zn2+ LMW

(O)

7000 20 15 10 5 0 20 15 10 5 0 20 15 10 5 0 20 15 10 5 0 20 15 10 5 0 20 15 10 5 0 20 15 10 5 0 20 15 10 5 0 20 15 10 5 0 20 15 10 5 0 20 15 10 5 0 20 15 10 5 0

T6 Zn2+ LMW

9000

10000

Figure 4 ■ Analyse de profils protéiques dans le sérum humain par SELDI-Ciphergen®. Exemple d’une étude menée sur du sérum de patients atteints de cirrhose biliaire primitive (CBP) : 6 contre 6 témoins sains (T). ProteinChip® IMAC-Zinc : mise en évidence d’un pic à 9 kDa caractéristique de la CBP (communication personnelle).

90

4557_2_.book Page 91 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Protéomique et métabolomique

pour laquelle une grande étude prospective par comparaison au marqueur utilisé actuellement, le CA-125, est en cours (Moshkovskii et al., 2007). Notons que cette protéine de l’inflammation à la phase aiguë différencie aussi l’ostéosarcome de l’ostéochondrome bénin (Li et al., 2006). Une autre étude a identifié l’ubiquitine et la ferritine (chaîne légère), dont les expressions sériques, vérifiées par immunohistochimie dans les tumeurs, sont apparues en miroir l’une de l’autre permettant d’établir un pronostic du cancer du sein (Ricolleau et al., 2006). Par ailleurs, un profiling SELDI sur plasma a proposé des profils différentiels entre nodule bénin de la thyroïde et cancer du corps thyroïdien (Wang et al., 2006). D’autres résultats semblent en faveur de profils distinctifs entre cancer de la prostate et hyperplasie bénigne (Petricoin et al., 2006), ou pour la détection du carcinome hépatocellulaire (Poon et al., 2003) en particulier après hépatite C (Lee et al., 2006 ; Paradis et al., 2005). L’analyse des protéines urinaires par SELDI devrait permettre d’améliorer le diagnostic précoce du cancer de la vessie en comparaison de l’analyse cytologique traditionnelle des urines (Vlahou et al., 2001). Le principal défaut de la technologie SELDI réside dans sa faible reproductibilité. En effet, plusieurs équipes travaillant sur la même pathologie, ont proposé des marqueurs ou des profils protéiques différents (Adam et al., 2002, Cazares et al., 2002 ; Diamantis et al., 2003 ; Wright et al., 1999). Un système basé sur la séparation des protéines et peptides sur des billes magnétiques recouvertes de phases chromatographiques des mêmes types que précédemment est également disponible pour établir des profils protéiques. Une nouvelle technologie vient de paraître avec l’analyse directe des tissus par MALDI-TOF ; elle permet de suivre l’expression d’un peptide ou d’une protéine en 3D donc d’en faire la cartographie tissulaire et même sub-cellulaire (Wisztorski et al., 2007).

et pyrimidiques et les nucléotides associés, les coenzymes vitaminiques, les neurotransmetteurs et autres amines biologiques, les hormones non polypeptidiques, les messagers intracellulaires etc. En intégrant la cascade des effets enregistrés par la transcriptomique et la protéomique lors de la perturbation d’un système biologique, la métabolomique est l’approche biologique qui rend le mieux compte des modifications du phénotype (figure 5). C’est également une méthode d’étude et de mesure des flux de métabolites dans une cellule ou un organisme ; elle a d’ailleurs donné naissance à une autre science du « omic » en appliquant la perfusion d’isotopes stables : la fluxonomique. Si les termes métabolome et métabolomique n’ont qu’une dizaine d’années d’existence (Oliver et al., 1998 et Nicholson et al., 1999), le concept est apparu à la fin des années 1960 avec l’avènement des techniques de spectrométrie de masse couplées à la chromatographie en phase gazeuse. Les deux principales applications étaient alors l’analyse des urines pour l’exploration des maladies héréditaires du métabolisme et pour la toxicologie (Horning et al., 1971). Les progrès réalisés dans la conception des outils analytiques depuis les années 1990 ont autorisé un plus large développement de la métabolomique. Le nombre de publications exponentiel rapportant les travaux réalisés depuis le début de ce millénaire en témoigne : seulement 3 articles référencés dans Pubmed avec les mots clés metabolomic ou metabonomic en 1999 et plus de 2500 en 2010. Cependant, alors que le génome humain est maintenant entièrement dévoilé, que le protéome l’est presque totalement, l’identification exhaustive et plus encore l’analyse quantitative de l’ensemble des métabolites présents chez l’Homme demeure un objectif encore irréalisé. Ce n’est pas uniquement parce que la métabolomique est la dernière née des sciences du « omique » mais c’est surtout parce qu’il n’existe aucune méthode analytique

2 ■■ MÉTABOLOMIQUE

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

2.1.

environnement

Introduction

Tout comme la génomique se définit par l’étude du génome, la métabolomique a pour objet l’étude du métabolome ; c’est-à-dire l’analyse qualitative et quantitative de tous les métabolites présents dans un système biologique (fluide, cellule, tissu voire organisme entier) dans un contexte défini (tableau 1). C’est donc la mesure de l’empreinte métabolique des perturbations biochimiques causées par toute intervention sur un système biologique. La métabonomique est elle plus restrictive puisqu’elle se limite aux variations du métabolome induites par les principes actifs exogènes (médicaments) et les toxiques exogènes. Les métabolites sont de petites molécules (masse moléculaire inférieure à ~ 2 000 Da) produites dans un système biologique par des transformations enzymatiques successives à partir d’une molécule d’origine endogène ou exogène (alimentation, médicaments, microorganismes). Parmi les métabolites se rangent notamment les petits peptides, les oligonucléotides, les principes actifs (xénobiotiques), les sucres et leurs dérivés, les lipides simples et complexes, les acides aminés et leurs dérivés, les bases puriques

Génome

Transcriptome

environnement

Protéome environnement

Métabolome

Phénotype

Figure 5

■ Place de la métabolomique dans la pyramide du gène au phénotype.

91

4557_2_.book Page 92 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

capable d’analyser simultanément tous les métabolites. Deux obstacles principaux expliquent cette difficulté : – le premier est d’ordre quantitatif, le nombre de métabolites à caractériser varie de quelques milliers à quelques dizaines (voire centaines) de milliers selon l’échelle de concentration où l’on se place. La sensibilité des méthodes d’analyse utilisées est donc un facteur limitant, d’autant plus qu’il n’existe pas de méthode d’amplification des métabolites comme dans le cas des acides nucléiques ; – le second est d’ordre qualitatif, contrairement aux protéines et aux acides nucléiques, les métabolites possèdent des structures chimiques d’une très grande diversité se traduisant par des propriétés physicochimiques tout aussi variables. C’est pour cette raison qu’il n’existe aucune technique d’extraction universelle des métabolites. À ces difficultés d’ordre technique s’ajoute, pour les études chez l’homme, la complexité d’analyser un système dynamique qui présente une très grande variabilité tant spatiale (métabolome tissuspécifique) que temporelle (chronobiologie, statut nutritionnel). Au-delà de plateformes analytiques performantes que nous décrirons sommairement plus loin, l’analyse métabolomique nécessite le recours à des outils bioinformatiques pour le traitement du signal comme des librairies (ou databases) répertoriant les métabolites, leur structure, leur masse moléculaire, leur appartenance à des voies métaboliques déterminées, leur tissu-spécificité, leur relation avec des états physiopathologiques… et des outils de biostatistiques pour des analyses multivariées, comme la PCA (Principal Component Analysis) pour une analyse globale des données, ou des analyses discriminantes (pour classer les métabolites) et univariées (pour l’identification de potentiels biomarqueurs) qui rendent cette approche difficilement accessible à la biologie clinique classique. La métabolomique est néanmoins la

Tableau 1

■

science qui rend le mieux compte des modifications phénotypiques induites dans un système biologique par une morbidité, un traitement, ou tout autre facteur perturbant le système. Ceci en fait l’outil de choix pour l’identification de biomarqueurs.

2.2.

Les méthodes d’étude

2.2.1. Méthodes de spectroscopie non destructrices ■ Le spectromètre infrarouge à transformée de Fourier

La Spectroscopie Infrarouge à Transformée de Fourier (ou FTIR : « Fourier Transformed InfraRed » spectroscopy) est basée sur le principe d’absorption d’un rayonnement infrarouge par la molécule analysée lorsque la longueur d’onde générée par le faisceau lumineux est voisine de l’énergie de vibration de la molécule. Il en résulte une diminution de l’intensité réfléchie ou transmise. Elle permet, via la détection des vibrations caractéristiques des liaisons chimiques, d’effectuer l’analyse des fonctions chimiques présentes dans l’échantillon. Pour une molécule de composition chimique et de structure donnée va correspondre un ensemble de bandes d’absorption caractéristiques permettant d’identifier la molécule. Cette méthodologie est utilisée dans les approches de type empreinte métabolique (metabolic fingerprinting) (tableau 1). Classiquement, on utilise l’infrarouge moyen (4000-400 cm–1) qui permet d’identifier l’ensemble des groupements fonctionnels chimiques. Les principaux obstacles sont la très intense absorption de l’eau qui oblige à déshydrater l’échantillon ou à corriger le bruit de fond généré par l’eau. Cette méthode simple permet le passage rapide de nombreux échantillons avec un minimum de préparation (< 30 s par échantillon). Elle est cependant moins sensible et spécifique que les méthodes de spectrométrie de masse (Ellis et al., 2006).

Définitions et approches méthodologiques en métabolomique.

Métabolome

Inventaire exhaustif des petites molécules (métabolites) présentes dans un échantillon biologique ou un organisme.

Métabolomique

Identification et quantification non biaisées de tous les métabolites d’un système biologique. Application : diagnostic, identification de marqueurs biologiques, compréhension de mécanismes physiopathologiques.

Métabonomique

Analyse quantitative et cinétique de tous les métabolites présents chez les vertébrés en réponse à un stimulus physiopathologique. Application : classiquement utilisée pour étudier à l’échelle d’un organisme les effets induits par les changements nutritionnels, des traitements thérapeutiques ou des toxiques.

Empreinte métabolique « metabolic fingerprinting »

Analyse rapide globale de tous les métabolites présents dans un échantillon biologique sans a priori sur la nature des métabolites d’intérêt, leur quantification n’est pas obligatoire. Application : discriminer les échantillons biologiques en fonction de leur statut ou de leur origine (sain/ pathologique, contrôle/induit, mâle/femelle…).

Profil métabolique « metabolic profiling »

Analyse qualitative et quantitative d’un nombre limité et prédéfini de métabolites, généralement sélectionnés pour leur appartenance à une même voie métabolique ou pour leur homologie structurale (lipidomique, glycomique…). Application : diagnostic, identification de marqueurs biologiques, compréhension de mécanismes physiopathologiques.

92

4557_2_.book Page 93 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Protéomique et métabolomique

■ Le spectromètre à diffusion Raman

La spectroscopie Raman est une méthode d’analyse basée sur la détection des photons diffusés inélastiquement suite à l’interaction de l’échantillon avec un faisceau de lumière monochromatique. Il y a un échange d’énergie entre le photon excitateur et la molécule analysée. La différence de longueur d’onde entre photon excitateur et photon diffusé qui résulte de cet échange d’énergie renseigne sur la nature chimique de la molécule à l’origine de la diffusion. S’il n’y a pas d’échange d’énergie entre la molécule et le photon incident, alors la diffusion est élastique et la longueur d’onde du photon diffusé n’est pas décalée ; on parle alors de diffusion Rayleigh (application en néphélémétrie ou turbidimétrie). Pour la diffusion Raman, la source de rayonnement monochromatique est un laser émettant dans le visible ou le proche infrarouge. Comme la méthode précédente, cette méthodologie est utilisée dans les approches de type metabolic fingerprinting, étant là aussi non destructrice ; le même échantillon analysé par FTIR peut être également analysé par diffusion Raman et réciproquement. La présence d’eau n’induit pas ici d’interférence notable ; l’analyse est toutefois plus longue et difficile à interpréter que dans le cas de la FTIR (interférence de la fluorescence des échantillons biologiques). La spectroscopie Raman, elle aussi, reste largement moins sensible et spécifique que les méthodes de spectrométrie de masse modernes (Ellis et al., 2006).

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

■ Le spectromètre par résonance magnétique nucléaire

La spectrométrie par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) est une méthode d’analyse structurale non destructrice applicable aux particules qui ont un spin nucléaire non nul, idéalement des particules ayant un spin égal à 1/2 telles que le proton ( 1H), le carbone 13 et le phosphore 31 (on parle de RMN du proton, RMN du carbone 13…). Soumis à un champ magnétique, le spin nucléaire peut s’aligner soit dans la direction du champ magnétique, soit dans une direction opposée, ce qui définit deux états énergétiques différents. À l’état naturel, les spins des différents protons qui composent une molécule ont une orientation aléatoire. Soumis à un champ magnétique de fréquence et intensité déterminées, ils se répartissent alors en deux populations d’états d’énergie différents de façon non aléatoire et équilibrée : une population majoritaire de plus faible énergie à spin parallèle à la direction du champ et une de haute énergie, légèrement moins peuplée, et dont le spin est d’orientation antiparallèle. La molécule est également soumise à un second champ électromagnétique d’orientation perpendiculaire au premier. Dans le phénomène de RMN, un noyau atomique absorbe le rayonnement électromagnétique émis par ce second champ magnétique à une fréquence spécifique, caractéristique du noyau considéré : c’est lorsque l’énergie de ce champ correspond à l’énergie de transition des spins vers le niveau d’énergie supérieur qu’ils peuvent être absorbés par le noyau. On dit alors qu’il y a résonance, c’est-à-dire schématiquement basculement des spins d’une orientation à l’autre. Un spectre RMN correspond donc à l’absorption par certains atomes de fréquences présentes dans la source électromagnétique. Dans le cas de la RMN du proton, l’échantillon doit être lyophilisé et analysé dans un solvant deutérié afin que les signaux du solvant n’interfèrent pas avec ceux des molécules à étudier. L’environnement chimique des atomes

d’hydrogène au sein des molécules influe sur la fréquence de résonance de ceux-ci et donne ainsi des informations sur la structure de la molécule (déplacements chimiques et blindages, couplages de spins). Cette méthode quantitative, robuste, reproductible et non destructrice a été très largement utilisée dans les premières études de métabolomique. Toutefois, malgré l’utilisation de champs magnétiques de plus en plus intenses, la RMN souffre encore d’un manque de sensibilité (de l’ordre de la millimole par litre) par rapport aux techniques de masse, ce qui n’autorise la détection que d’une centaine de composés dans les échantillons biologiques. La RMN est encore d’un usage courant car elle fournit des informations complémentaires de celles obtenues par la spectrométrie de masse (Duarte et al., 2009).

2.2.2. Méthodes destructrices par spectrométrie de masse Les méthodes de spectrométrie de masse combinent l’analyse précise de la masse de la molécule intacte, reflet de sa composition élémentaire, avec l’analyse des profils d’ions fragments générés par collision, caractérisant sa structure chimique. La technique repose sur le déplacement d’ions à l’état de vapeur dans un vide poussé sous l’influence de champs électriques ou magnétiques. Le déplacement des ions est fonction du rapport masse sur nombre de charges (m/z). De nombreux types de spectromètres de masse sont disponibles ; ils varient par le mode d’introduction de l’échantillon, le mode d’ionisation des molécules et le mode de séparation des ions analysés. Les plus performants de ces appareils permettent de quantifier et d’analyser la plupart des métabolites présents à des concentrations allant en deçà du dixième voire du centième de micromole par litre. Un spectromètre de masse se compose classiquement de quatre éléments : – un système d’introduction de l’échantillon (introduction directe ou indirecte) ; – une source d’ionisation dont le rôle est de vaporiser (sauf dans le cas de couplage à la chromatographie en phase gazeuse) et d’ioniser les molécules ; – un analyseur de masse qui agit comme un filtre : la séparation des ions est basée sur un principe temporel (analyseur à temps de vol) ou spatial (analyseur quadripolaire, trappe d’ions ou encore secteur magnétique) ; – un détecteur d’ions à la sortie de l’analyseur de masse. Deux stratégies d’analyses existent : l’une consiste à analyser l’échantillon biologique par introduction directe des composants de la matrice biologique dans la source sans séparation analytique préalable. Cette première approche, plus rapide, est limitée par le phénomène de suppression spectrale ; en effet, la multitude de composés, plus ou moins aisément ionisables, présents dans l’échantillon et arrivant simultanément dans la source, génère une compétition au cours de laquelle une espèce, parfois minoritaire, peut accaparer toutes les charges masquant ainsi d’autres espèces qui ne seront pas ionisées et donc non détectées. C’est pourquoi, l’analyse de masse s’opère le plus souvent après une étape de séparation analytique des composés de la matrice. Dans ce second cas, le spectromètre de masse peut être couplé à l’électrophorèse capillaire, à la chromatographie en phase liquide ou

93

4557_2_.book Page 94 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Tableau 2

■

Exemples d’applications d’études métabolomiques par une approche de type « profil métabolique ». Domaine d’application

Matrice biologique

Technique

Références

urines

LC-MS/MS

Min et al., 2010

Lipidomique Marqueurs de lésions cérébrales et neuro-imagerie du post-trauma

coupe de cerveau

MS/MS

Sparvero et al., 2010

Glycomique Diagnostic des différents types de CDG syndromes

urines

MS/MS

Vakhrushev et al., 2008

Glycomique Identification de marqueurs diagnostiques et pronostiques du cancer du poumon

sérum

MS/MS

Kyselova et al., 2008

cellules épithéliales pulmonaires

LC-MSMS GC-MS

Wetmore et al., 2010

Lipidomique Identification de marqueurs du cancer de la prostate

Mucoviscidose Compréhension de mécanismes physiopathologiques et identification de nouveaux marqueurs

gazeuse. L’analyse dure plus longtemps mais les métabolites sont caractérisés par un temps de rétention en plus de leur spectre de masse (Dettmer et al., 2007).

encore l’étude du profil des acyl-carnitines plasmatiques (une trentaine de composés sont simultanément analysés).

2.3.2. Les empreintes métaboliques

2.3.

Deux approches complémentaires sont utilisées dans l’étude du métabolome

2.3.1. Le profil métabolique Cette première approche n’est pas exactement une stratégie d’analyse de type métabolomique ; en effet, ici l’analyse est restreinte à un ensemble limité et homogène de métabolites appartenant à un même groupe structural ou à une même voie métabolique (tableau 2). Il s’agit d’établir des profils de métabolites connus et systématiquement quantifiés. C’est une méthode quantitative. La lipidomique, par exemple, se définit comme l’analyse de tous les lipides d’un système biologique et des différents facteurs qui interagissent avec les lipides. Cela comprend aussi bien des analyses restreintes à quelques familles relativement homogènes, comme les glycérolipides ou les acides gras, que d’autres plus larges incluant en plus les stérols, les sphingolipides, les éicosanoïdes etc. La spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide est particulièrement adaptée à ce type d’études (notamment la CLHP-MS/MS avec couplage d’une chromatographie liquide et d’un spectromètre de masse en tandem). Des bases de données internet telles que lipidmaps (http:// www.lipimaps.org) ou lipidlibrary (http://lipidlibrary.aocs.org) offrent de nombreux outils pour l’exploitation des résultats. L’objectif de ces études est généralement de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques ou de valider des marqueurs biologiques identifiés par l’analyse d’empreintes métaboliques (voir ci-après). Cette approche est déjà largement utilisée dans le diagnostic, notamment dans l’exploration des maladies héréditaires du métabolisme incluant, par exemple, l’analyse des acides organiques urinaires (une centaine de composés sont ainsi identifiés et une vingtaine sont systématiquement quantifiés) ou

94

Initialement, l’objectif des études d’empreintes métaboliques n’était pas d’identifier formellement tous les métabolites présents dans un système biologique, ni de les quantifier avec une grande précision mais plutôt de comparer des profils (empreintes biologiques) de métabolites les plus exhaustifs possible en réponse à une perturbation d’un système, sans a priori sur leur structure ou leur appartenance à une classe de composés biologiques, et en les comparant avec des témoins non perturbés ; c’est une approche dite chimiométrique (tableau 3). L’application de méthodes statistiques sophistiquées, comme l’analyse multivariée, permet dans un premier temps de traiter la multitude d’informations acquises, puis l’analyse uni-variée va sélectionner des métabolites considérés comme de potentiels biomarqueurs spécifiques de la perturbation du système biologique étudié. Dans un second temps, il faudra les identifier puis développer des méthodes de quantification afin de valider ces marqueurs biologiques. À ce stade, l’approche initiale par empreinte métabolique rejoint le profil métabolique (figure 6).

CONCLUSION ET PERSPECTIVES L’avènement de nouvelles technologies permettant l’étude du transcriptome, du protéome et aussi des métabolome, lipidome et glycome constitue un challenge de la biologie médicale pour le début du 21e siècle, tant dans la compréhension de la physiopathologie que dans le diagnostic et le pronostic de maladies, qu’elles soient rares ou fréquentes, monogéniques ou polygéniques. Elles permettront 1) d’affiner le classement de pathologies d’histologie et/ou de clinique similaires, 2) de pronostiquer leur évolution, 3) de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques et d’individualiser les traitements et 4) d’approfondir notre connais-

4557_2_.book Page 95 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Protéomique et métabolomique

Tableau 3

■

Exemples d’applications d’études métabolomiques par une approche de type « empreinte métabolique ». Domaine d’application

Matrice biologique

Technique

Références

Cancer du rein Identification de marqueurs précoces de diagnostic

urines

LC-MS GC-MS

Kind et al., 2007

Cancer de l’ovaire Etablissement de profils diagnostiques

sérum

RMN

Odunsi et al., 2005

Diabète de type I Identification de marqueurs précoces avant les 1ers symptômes

sérum

GC-MS

Oresic et al., 2008

Risque cardiovasculaire Identification de nouveaux marqueurs d’ischémie myocardique aiguë

plasma

LC-MS/MS

Sabatine et al., 2005

Risque cardiovasculaire Identification de marqueurs prédictifs du risque de survenue de coronaropathies à l’effort

sérum

RMN

Barba et al., 2008

Maladie d’Alzheimer Identification de marqueurs de l’état d’avancement de la maladie

plasma

LC-MS

Greenberg et al., 2009 Li et al., 2010

– étude cas/témoins : trouver des métabolites discriminants

Rechercher des biomarqueurs

Figure 6

■

– valider l’identification des métabolites – les valider sur un plus grand nombre d’échantillons

Biomarqueurs potentiels

Validation des biomarqueurs

Validation de biomarqueurs en métabolomique.

sance des mécanismes physiopathologiques. Cependant, les informations, obtenues par ces approches à haut-débit, sont sous-utilisées car produites en masse et non reliées. Grâce au développement d’une discipline que l’on appelle la biologie systémique, l’extraction rationnelle de ces données, leur interrelation, et leur connexion à des bases de données existantes (nomencla© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

– tester la robustesse sur population élargie : effet du sexe, de l’âge, de l’alimentation… – tester une autre méthode d’analyse

B I O M A R Q U E U R S

ture, topographie chromosomique ou cellulaire, ontologie des gènes…) ou à créer (relations avec l’histologie, la chimiothérapie…) permettront de mieux appréhender dans l’avenir la maladie en proposant un nouveau modèle dynamique des séquences d’altérations génétique, protéique et métabolique et de développer des thérapies potentielles.

Références bibliographiques Adam BL, Qu Y, Davis JW, Ward MD, Clements MA, Cazares LH, Semmes OJ, Schellhammer PF, Yasui Y, Feng Z, Wright GL (2002). Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men. Cancer Res, 62 : 3609-3614. Aebersold R et Mann M (2003). Mass spectrometry-based proteomics. Nature, 422 : 198-207. Ai J, Tan Y, Ying W, Hong Y, Liu S, Wu M, Qian X, Wang H (2006). Proteome analysis of hepatocellular carcinoma by laser capture microdissection. Proteomics, 6 : 538-546.

Anderson NL, Anderson NG (2002). The human plasma proteome : history, character, and diagnosis prospects. Mol Cell Proteomics, 1 : 845-867. Barba I, de León G, Martín E, Cuevas A, Aguade S, Candell-Riera J, Barrabés JA, Garcia-Dorado D (2008). Nuclear magnetic resonance-based metabolomics predicts exercise-induced ischemia in patients with suspected coronary artery disease. Magn Reson Med, 60 : 27-32. Barrier A, Boelle PY, Roser F, Gregg J, Tse C, Brault D, Lacaine F, Houry S, Huguier M, Franc B, Flahault A, Lemoine A, Dudoit S

95

4557_2_.book Page 96 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

(2006). Stage II colon cancer prognosis prediction by tumor gene expression profiling. J Clin Oncol, 24 : 4685-4691. Baudin B, Bruneel A (2003). Introduction to proteomics : goals, technical aspects and applications to fundamental biology, drug discovery and clinical chemistry. Recent Res Devel Biophys Biochem, 3 : 977-993. Brazma A, Hingamp P, Quackenbush J, Sherlock G, Spellman P, Stoeckert C, Aach J, Ansorge W, Ball CA, Causton HC, Gaasterland T, Glenisson P, Holstege FC, Kim IF, Markowitz V, Matese JC, Parkinson H, Robinson A, Sarkans U, Schulze-Kremer S, Stewart J, Taylor R, Vilo J, Vingron M (2001). Minimum information about a microarray experiment (MIAME) – towards standards for microarray data. Nature Genet, 29 : 365-371. Cazares LH, Adam BL, Ward MD, Nasim S, Schellhammer PF, Semmes OJ, Wright GL (2002). Normal, benign, preneoplastic, and malignant prostate cells have distinct protein expression profiles resolved by surface enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry. Clin Cancer Res, 8 : 2541-2552. Celis JE, Ostergaard M, Jensen N, Gromova I, Rasmussen HH, Gromov P (1998). Human and mouse databases : novel resources in the protein universe. FEBS Lett, 430 : 64-72. Chapman K (2002). The ProteinChip biomarker system from Ciphergen Biosystems : a novel proteomics plateform for rapid biomarker discovery and validation. Biochem Soc Tran, 30 : 82-87. Chee M, Yang R, Hubbell E, Berno A, Huang XC, Stern D, Winkler J, Lockhart DJ, Morris MS, Fodor SP (1996). Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science, 274 : 610-614. Chen CD, Wang CS, Huang YH, Chien KY, Liang Y, Chen WJ, Lin KH (2007). Overexpression of CLIC1 in human gastric carcinoma and its clinicopathological significance. Proteomics, 7 : 155-167. Chen R, Pan S, Yi EC, Donohoe S, Bronner MP, Potter JD, Goodlett DR, Aebersold R, Brentnall TA (2006). Quantitative proteomic profiling of pancreatic cancer juice. Proteomics, 6 : 3871-3879. Dancik V, Addona TA, Clauser KR, Vath JE, Pevzner PA (1999). De novo peptide sequencing via tandem mass spectrometry. J Comput Biol, 6 : 327-342. Dettmer K, Aronov PA, Hammock BD (2007). Mass spectrometrybased metabolomics. Mass Spectrom Rev, 26 : 51-78. Diamantis EP (2003). Proteomic patterns in biological fluids : do they represent the future of cancer diagnostics ? Clin Chem, 49 : 12721278. Diehl HC, Stühler K, Klein-Scory S, Volmer MW, Schönek A, Bieling C, Schmiegel W, Meyer HE, Schwarte-Waldhoff I (2007). A catalogue of proteins released by colorectal cancer cells in vitro as an alternative source for biomarker discovery. Proteomics Clin Appl, 1 : 47-61. Duarte IF, Lamego I, Rocha C, Gil AM (2009). NMR metabonomics for mammalian cell metabolism studies. Bioanalysis, 1 : 1597-1614. Ellis DI, Goodacre R (2006). Metabolic fingerprinting in disease diagnosis : biomedical applications of infrared and Raman spectroscopy. Analyst, 131 : 875-885. Fox A (2006). Mass spectrometry for species or strain identification after culture or without culture : past, present, and future. Journal of Clinical Microbiology, 44 : 2677-2680. Giddings JC (1987). Concepts and comparisons in multidimensional separation. J High Res Chromatogr, 10 : 319-323. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, Huard C, Gaasenbeek M, Mesirov JP, Coller H, Loh ML, Downing JR, Caligiuri MA, Bloomfield CD, Lander ES (1999). Molecular classification of cancer : class disco-

96

very and class prediction by gene expression monitoring. Science, 286 : 531-537. Görg A, Obermaier C, Boguth G, Harder A, Scheibe B, Wildgruber R, Weiss W (2000). The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis, 21 : 10371053. Gravet A (2010). Spectrométrie de masse et identification bactérienne, l’expérience de microbiologie du CH de Mulhouse. Spectra Biologie, 180 : 45-50. Greenberg N, Grassano A, Thambisetty M, Lovestone S, LegidoQuigley C (2009). A proposed metabolic strategy for monitoring disease progression in Alzheimer’s disease. Electrophoresis, 30 : 1235-1239. Gygi SP, Rist B, Gerber SA, Turecek F, Gelb MH, Aebersold R (1999). Quantitative analysis of protein mixtures using isotope coded affinity tags. Nat Biotechnol, 17 : 994-999. Hacia JG, Brody LC, Chee MS, Fodor SP, Collins FS (1996). Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high density oligonucleotide arrays and two-colour fluorescence analysis. Nature Genet, 14 : 441-447. Han DK, Eng J, Zhou H, Aebersold R (2001). Quantitative profiling of differentiation-induced microsomal proteins using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nat Biotechnol, 19 : 946-951. Hanash SM, Teichroew D (1998). Mining the human proteome : experience with the human lymphoid protein database. Electrophoresis, 19 : 2004-2009. He L, He X, Lim LP, de Stanchina E, Xuan Z, Liang Y, Xue W, Zender L, Magnus J, Ridzon D, Jackson AL, Linsley PS, Chen C, Lowe SW, Cleary MA, Hannon GJ (2007). A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature, 447 : 1130-1134. Horning EC, Horning MG (1971). Metabolic profiles : gas phase methods for analysis of metabolites. Clin Chem, 17 : 802-809. Hsich G, Kenney K, Gibbs CJ, Lee KH, Harrington MG (1996). The 14.3.3 σ brain protein in cerebrospinal fluid as a marker for transmissible spongiform encephalopathies. N Engl J Med, 335 : 924930. Hu S, Loo JA, Wong DT (2006). Human body fluid proteome analysis. Proteomics, 6 : 6326-6353. Imbeaud S, Auffray C (2005). « The 39 steps » in gene expression profiling : critical issues and proposed best practices for microarray experiments. Drug Discov Today, 1 : 1175-1182. Jafari P, Azuaje F (2006). An assessment of recently published gene expression data analyses : reporting experimental design and statistical factors. BMC Medical Informatics and Decision Making, 6 : 27. Jensen ON, Wilm M, Shevchenko A, Mann M (1999). Peptide sequencing of 2DE gel-isolated proteins by nanoelectrospray tandem mass spectrometry. Methods Mol Biol, 112 : 571-588. Kim H, Kang HJ, You KT, Kim SH, Lee KY, Kim TK, Kim C, Song SY, Kim HJ, Lee C, Kim H (2006). Suppression of human selenium-binding protein 1 is a late event in colorectal carcinogenesis and is associated with poor survival. Proteomics, 6 : 3466-3476. Kind T, Tolstikov V, Fiehn O, Weiss RH (2007). A comprehensive urinary metabolomic approach for identifying kidney cancer. Anal Biochem, 363 : 185-195. Kozak KR, Su F, Whitelegge JP, Faull K, Reddy S, Farias-Eisner R (2005). Characterization of serum biomarkers for detection of early stage ovarian cancer. Proteomics, 5 : 4589-4596.

4557_2_.book Page 97 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Protéomique et métabolomique

Kozal MJ, Shah N, Shen N, Yang R, Fucini R, Merigan TC, Richman DD, Morris D, Hubbell E, Chee M, Gingeras TR (1996). Extensive polymorphisms observed in HIV-1 clade B protease gene using high-density oligonucleotide arrays. Nature Med, 2 : 753-759. Kyselova Z, Mechref Y, Kang P, Goetz JA, Dobrolecki LE, Sledge GW, Schnaper L, Hickey RJ, Malkas LH, Novotny MV (2008). Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles. Clin Chem, 54 : 1166-1175. Le Moguen K, Lincet H, Deslandes E, Hubert-Roux M, Lange C, Poulain L, Gauduchon P, Baudin B (2006). Comparative proteomic analysis of cisplatin sensitive IGROV1 ovarian carcinoma cell line and its resistant counterpart IGROV1-10. Proteomics, 6 : 51835192. Lee IN, Chen CH, Sheu JC, Lee HS, Huang GT, Chen DS, Yu CY, Wen CL, Lu FJ, Chow LP (2006). Identification of complement C3a as a candidate biomarker in human chronic hepatitis C and HCVrelated hepatocellular carcinoma using a proteomics approach. Proteomics, 6 : 2865-2873. Li C, Xiao Z, Chen Z, Zhang X, Li J, Wu X, Li X, Yi H, Li M, Zhu G, Liang S (2006). Proteome analysis of human lung squamous carcinoma. Proteomics, 6 : 547-558. Li NJ, Liu WT, Li W, Li SQ, Chen XH, Bi KS, He P (2010). Plasma metabolic profiling of Alzheimer’s disease by liquid chromatography/ mass spectrometry. Clin Biochem, 43 : 992-997. Li Y, Dang TA, Shen J, Perlaky L, Hicks J, Murray J, Meyer W, Chintagumpala M, Lau CC, Man TK (2006). Identification of a plasma proteomic signature to distinguish pediatric osteosarcoma from benign osteochondroma. Proteomics, 6 : 3426-3435. Liu XD, Zeng BF, Xu JG, Zhu HB, Xia QC (2006). Proteomic analysis of the cerebrospinal fluid of patients with lumbar disk herniation. Proteomics, 6 : 1019-1028. Mann M, Jensen ON (2003). Proteomic analysis of post-translational modifications. Nat Biotechnol, 21 : 255-261. Martinez-Heredia J, Estanyol JM, Ballesca JL, Oliva R (2006). Proteomic identification of human sperm proteins. Proteomics, 6 : 43564369. Min HK, Lim S, Chung BC, Moon MH. Shotgun lipidomics for candidate biomarkers of urinary phospholipids in prostate cancer. Anal Bioanal Chem 2010 Oct 17. [Epub ahead of print]

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Moore AW, Larmann JP, Lemmo AV, Jorgenson JW (1996). Twodimensional liquid chromatography-capillary electrophoresis techniques for analysis of proteins and peptides. Methods Enzymol, 270 : 401-419. Moshkovskii SA, Vlasova MA, Pyatnitskiy MA, Tikhonova OV, Safarova MR, Makarov OV, Archarov AI (2007). Acute phase serum amyloid A in ovarian cancer as an important component of the proteome diagnosis profiling. Proteomics Clin Appl, 7 : 107-117. Odunsi K, Wollman RM, Ambrosone CB, Hutson A, McCann SE, Tammela J, Geisler JP, Miller G, Sellers T, Cliby W, Qian F, Keitz B, Intengan M, Lele S, Alderfer JL (2005). Detection of epithelial ovarian cancer using 1H-NMR-based metabonomics. Int J Cancer, 113 : 782-788. O’Farrell PH (1975). High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem, 250 : 4007-4021. Oresic M, Simell S, Sysi-Aho M, Näntö-Salonen K, Seppänen-Laakso T, Parikka V, Katajamaa M, Hekkala A, Mattila I, Keskinen P, Yetukuri L, Reinikainen A, Lähde J, Suortti T, Hakalax J, Simell T, Hyöty H, Veijola R, Ilonen J, Lahesmaa R, Knip M, Simell O (2008). Dysregulation of lipid and amino acid metabolism precedes islet

autoimmunity in children who later progress to type 1 diabetes. J Exp Med, 205 : 2975-2984. Paradis V, Degos F, Dargère D, Pham N, Belghiti J, Degott C, Janeau JL, Bezeaud A, Delforge D, Cubizolles M, Laurendeau I, Bedossa P (2005). Identification of a new marker of hepatocellular carcinoma by serum protein profiling of patients with chronic liver diseases. Hepatology, 41 : 40-47. Park MR, Wang EH, Jin DC, Cha JH, Lee KH, Yang CW, Kang CS, Choi YJ (2006). Establishment of a 2-D human urinary proteomic map in IgA nephropathy. Proteomics, 6 : 1066-1076. Park SJ, Yoon WG, Song JS, Kim CJ, Oh SY, Yoon BH, Jung G, Kim HJ, Nirasawa T (2006). Proteome analysis of human amnion and amniotic fluid by two-dimensional electrophoresis and matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Proteomics, 6 : 349-363. Pernet P, Bruneel A, Baudin B, Vaubourdolle M (2006). PHProteomicDB : A module for two-dimensional gel electrophoresis database creation on personal Web sites. Genomics, Proteomics and Bioinformatics, 4 : 124-136. Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Furaso VA, Steinberg SM, Mills GB, Simone C, Fishman DA, Kohn EC, Liotta LA (2002). Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet, 359 : 572-577. Petricoin EF, Ornstein DK, Paweletz CP, Ardekani AM, Hackett PS, Hitt BA, Velassco A, Trucco C, Wiegand L, Wood K, Simone CB, Levine PJ, Linehan WM, Emmert-Buck MR, Steinberg SM, Kohn EC, Liotta LA (2002). Serum proteomic patterns for detection of prostate cancer. J Natl Cancer Inst, 94 : 1576-1578. Pietu G, Alibert O, Guichard V, Lamy B, Bois F, Leroy E, MariageSampson R, Houlgatte R, Soularue P, Auffray C (1996). Novel gene transcripts preferentially expressed in human muscles revealed by quantitative hybridization of a high density cDNA array. Genome Res, 6 : 492-503. Pinkel D, Segraves R, Sudar D, Clark S, Poole I, Kowbel D, Collins C, Kuo WL, Chen C, Zhai Y, Dairkee SH, Ljung BM, Gray JW, Albertson DG (1998). High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays. Nature Genet, 20 : 207-11. Poon T, Yip TT, Chan A, Yip C, Yip V, Mok T, Lee C, Leung T, Ho S, Johnson P (2003). Comprehensive proteomic profiling identifies serum proteomic signatures for detection of hepatocellular carcinoma and its subtypes. Clin Chem, 49 : 752-760. Ricolleau G, Charbonnel C, Lodé L, Loussouarn D, Joalland MP, Bogumil R, Jourdain S, Minvielle S, Campone M, Déporte-Fety R, Campion L, Jézéquel P (2006). Surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry protein profiling identifies ubiquitin and ferritin light chain as prognostic biomarkers in node-negative breast cancer tumors. Proteomics, 6 : 19631975. Sabatine MS, Liu E, Morrow DA, Heller E, McCarroll R, Wiegand R, Berriz GF, Roth FP, Gerszten RE (2005). Metabolomic identification of novel biomarkers of myocardial ischemia. Circulation, 112 : 3868-3875. Salazar NM, Caetano-Anolles G (1996). Nucleic acid scanning-byhybridization of enterohemorrhagic Escherichia coli isolates using oligodeoxynucleotide arrays. Nucleic Acids Res, 24 : 5056-5057. Sarto C, Marocchi A, Sanchez JC, Giannone D, Frutiger S, Golaz O, Wilkins ML, Doro G, Cappellano F, Hughes G, Hochstrasser DF, Mocarelli P (1997). Renal cell carcinoma and normal kidney protein expression. Electrophoresis, 18 : 599-604.

97

4557_2_.book Page 98 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Shevchenko A, Chernushevich I, Wilm M, Mann M (2000). De novo peptide sequencing by nanoelectrospray tandem mass spectrometry using triple quadrupole and quadrupole/time-of-flight instruments. Methods Mol Biol, 146 : 1-16. Shevchenko A, Loboda A, Shevchenko A, Ens W, Standing KG (2000). MALDI quadrupole time-of-flight mass spectrometry : a powerful tool for proteomic research. Anal Chem, 72 : 2132-2141. Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, Mann M (1996). Mass spectrometry sequencing of proteins from silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem, 68 : 850-858. Sparvero LJ, Amoscato AA, Kochanek PM, Pitt BR, Kagan VE, Bayr H (2010). Mass-spectrometry based oxidative lipidomics and lipid imaging : applications in traumatic brain injury. J Neurochem, 115 : 1322-1336. Srinivas PR, Srivastava S, Hanash S, Wright GL (2001). Proteomics in early detection of cancer. Clin Chem, 47 : 1901-1911. Tang W, Harrata AK, Lee CS (1997). Two-dimensional analysis of recombinant E. Coli proteins using capillary isoelectric focusing electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem, 69 : 3177-3182. Tkatchenko AV, Le Cam G, Leger JJ, Dechesne CA (2000). Large-scale analysis of differential gene expression in the hindlimb muscles and diaphragm of mdx mouse. Biochim Biophys Acta, 1500 : 17-30. Traum AZ, Wells MP, Aivado M, Libermann TA, Ramoni MF, Schachter AD (2006). SELDI-TOF MS of quadruplicate urine and serum samples to evaluate changes related to storage conditions. Proteomics, 6 : 1676-1680. Troesch A, Nguyen H, Miyada CG, Desvarenne S, Gingeras TR, Kaplan PM, Cros P, Mabilat C (1999). Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J Clin Microbiol, 137 : 49-55. Tsangaris GT, Karamessinis P, Kolialexi A, Garbis SD, Antsaklis A, Mavrou A, Fountoulakis M (2006). Proteomic analysis of amniotic fluid in pregnancies with Down syndrome. Proteomics, 6 : 44104419. van de Vijver MJ, He YD, van’t Veer LJ, Dai H, Hart AA, Voskuil DW, Schreiber GJ, Peterse JL, Roberts C, Marton MJ, Parrish M, Atsma D, Witteveen A, Glas A, Delahaye L, van der Velde T, Bartelink H, Rodenhuis S, Rutgers ET, Friend SH, Bernards R (2002). A geneexpression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med, 347 : 1999-2009. Wang DG, Fan JB, Siao CJ, Berno A, Young P, Sapolsky R, Ghandour G, Perkins N, Winchester E, Spencer J, Kruglyak L, Stein L, Hsie L, Topaloglou T, Hubbell E, Robinson E, Mittmann M, Morris MS, Shen N, Kilburn D, Rioux J, Nusbau (1998). Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome. Science, 280 : 1077-1082.

98

Vakhrushev SY, Snel MF, Langridge J, Peter-Katalini J (2008). MALDIQTOFMS/MS identification of glycoforms from the urine of a CDG patient. Carbohydr Res, 343 : 2172-2183. Vercoutter-Edouard AS, Lemoine J, Le Bourhis X (2001). Proteomic analysis reveals that 14-3-3 sigma is down-regulated in human breast cancer cells. Cancer Res, 61 : 76-80. Vlahou A, Schellhammer PF, Mendrinos S, Patel K, Kondylis F, Gong L, Nasim S, Wright GL (2001). Development of a novel proteomic approach for the detection of transitional cell carcinoma of the bladder in urine. Am J Pathol, 158 : 1491-1502. Walz A, Stühler K, Wattenberg A, Hawranke E, Meyer HE, Schmalz G, Blüggel M, Ruhl S (2006). Proteome analysis of glandular parotid and submandibular-sublingual saliva in comparison to whole human saliva by two-dimensional gel electrophoresis. Proteomics, 6 : 1631-1639. Wang JX, Yu JK, Wang L, Liu QL, Zhang J, Zheng S (2006). Application of serum protein fingerprint in diagnosis of papillary thyroid carcinoma. Proteomics, 6 : 5344-5349. Washburn MP, Wolters D, Yates JR (2001). Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol, 19 : 242-247. Wetmore DR, Joseloff E, Pilewski J, Lee DP, Lawton KA, Mitchell MW, Milburn MV, Ryals JA, Guo L (2010). Metabolomic profiling reveals biochemical pathways and biomarkers associated with pathogenesis in cystic fibrosis cells. J Biol Chem, 285 : 30516-30522. Wisztorski M, Lemaire R, Stauber J, Menguellet SA, Jardin-Mathé O, Day R, Salzet M, Fournier I (2007). Imagerie MALDI : une nouvelle technologie pour découvrir et valider de nouveaux biomarqueurs. Médecine Sciences, 23 : 31-36. Wright GL, Cazares LH, Leung SM, Nasim S, Adam BL, Yip TT, Schellhammer PF, Gong L, Vlahou A (1999). ProteinChipR surface enhanced laser desorption/ionization (SELDI) mass spectrometry : a novel protein biochip technology for detection of prostate cancer biomarkers in complex protein mixtures. Prostate Cancer Prostate Dis, 2 : 264-276. Zerefos PG, Vougas K, Dimitraki P, Kossida S, Petrolekas A, Stravodimos K, Giannopoulos A, Fountoulakis M, Vlahou A (2006). Characterization of the human urine proteome by preparative electrophoresis in combination with 2-DE. Proteomics, 6 : 4346-4355. Zhang Y, Wroblewski M, Hertz MI, Wendt CH, Cervenka TM, Nelsestuen GL (2006). Analysis of chronic lung transplantation rejection by MALDI-TOF profiles of bronchoalveolar lavage fluid. Proteomics, 6 : 1001-1010. Zhu Y, Wu R, Yoo C, Cho KR, Shedden KA, Katabuchi H, Lubman DM (2006). Classifications of ovarian cancer tissues by proteomic patterns. Proteomics, 6 : 5846-5856.

4557_2_.book Page 99 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

7 Les marqueurs biochimiques de l’inflammation Jean-Louis Beneytout, Pascale Vergne-Salle, Bertrand Liagre

1 ■■ PHYSIOPATHOLOGIE DE LA RÉACTION INFLAMMATOIRE 2 ■■ LES MARQUEURS BIOCHIMIQUES DE LA RÉACTION INFLAMMATOIRE 2.1. 2.2. 2.3. 2.4.

Critères d’un bon marqueur biochimique de l’inflammation La vitesse de sédimentation Les protéines de l’inflammation Électrophorèse des protéines

3 ■■ EXAMENS COMPLÉMENTAIRES, RECOMMANDATIONS ET PERSPECTIVES 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5.

Dépistage d’un syndrome inflammatoire Diagnostic d’une pathologie associée Suivi thérapeutique de maladies inflammatoires ou infectieuses Variations divergentes de certaines protéines de l’inflammation Actualités et perspectives

4 ■■ PRINCIPALES ÉTIOLOGIES À L’ORIGINE DU SYNDROME INFLAMMATOIRE

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

4.1. 4.2. 4.3. 4.4.

Pathologies infectieuses Les maladies systémiques Les pathologies néoplasiques Les autres causes

CONCLUSION Remerciements Références bibliographiques

99

4557_2_.book Page 100 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4557_2_.book Page 101 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Les marqueurs biochimiques de l’inflammation

e nombreuses molécules voient leur concentration varier au cours de l’inflammation aiguë ou chronique mais le nombre de vrais marqueurs, en particulier biochimiques est limité. Le marqueur idéal de l’inflammation n’existe pas. Dans ce chapitre, l’accent sera mis sur la réaction inflammatoire (RI) essentiellement aiguë qui fera l’objet d’un bref rappel sur son déroulement dans le temps (phases d’initiation, d’amplification et de résolution et réparation). Ensuite, les principaux marqueurs biochimiques de l’inflammation aiguë et chronique seront étudiés en fonction de leurs différentes significations dans les principales pathologies inflammatoires en sachant que le marqueur idéal de l’inflammation n’existe pas. Enfin, les marqueurs de la phase de résolution et de réparation seront également évoqués.

D

1 ■■ PHYSIOPATHOLOGIE DE LA RÉACTION

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

INFLAMMATOIRE La réaction inflammatoire (RI) est un des modes de réponse de l’organisme à une agression, agression qui peut être physique, infectieuse, chimique, immunologique, tumorale ou traumatique. (Godeau et al., 2004) La RI est un processus fortement contrôlé par de nombreux systèmes régulateurs. En général, elle protège l’organisme en participant à la réaction immunitaire naturelle, en favorisant la réponse immune spécifique et la réparation des tissus lésés. La RI peut être aiguë en cas de choc septique, de brûlures, de pancréatite aiguë… mais elle peut être aussi chronique et se situer au niveau des articulations, de la muqueuse digestive, de la muqueuse respiratoire ou du tissu nerveux. La RI peut être locale avec par exemple au niveau d’une plaie, une vasodilatation et un afflux local de cellules inflammatoires mais aussi systémique avec des signes généraux comme la fièvre et la synthèse par les cellules hépatiques des protéines de la phase aiguë. La RI est classiquement caractérisée par quatre signes cliniques : rougeur, chaleur, douleur et œdème. On distingue trois phases dans le déroulement de la RI : a) une phase d’initiation qui est fonction de la nature du facteur déclenchant (plaie, infection ou hypersensibilité) et qui implique des facteurs primaires : – une activation des plaquettes, des cellules endothéliales, – une activation de la fibrinolyse et du complément avec libération d’anaphylatoxines C3a, C5a… – la libération d’amines vasoactives comme l’histamine, la sérotonine ou la bradykinine qui favorisent la vasodilatation, augmentent la perméabilité des capillaires et induisent l’expression de molécules d’adhérence. b) une phase d’amplification qui mobilise et active des facteurs secondaires par : – l’expression de molécules d’adhérence, de récepteurs de cytokines, de chémokines, – un afflux de cellules (polynucléaires neutrophiles, macrophages) au niveau du foyer inflammatoire sous l’effet de facteurs

chimiotactiques (C3a, C5a, cytokines, leucotriène (LT) B4, PAFacether) et une activation de ces cellules qui produisent des facteurs pro-inflammatoires (interleukine (IL-1, IL-6, tumor necrosis factor TNF-α…), le recrutement rapide des polynucléaires neutrophiles qui vont pouvoir assurer sur le site inflammatoire la phagocytose des agents pathogènes exogènes ou des cellules infectées. Les macrophages vont libérer des substances vaso-actives, participer à la phagocytose et initier la réponse immunitaire de type spécifique, – une libération de protéases comme les serine-protéases (plasmine, granzyme B), les métalloprotéases (MMPs) activées par les cytokines pro-inflammatoires. Ces protéases sont contrôlées par des anti-protéases (α1-antitrypsine, α2-antiplasmine), des inhibiteurs des métalloprotéases (TIMPs), – une libération de médiateurs néoformés comme les cytokines qui sont pour certaines pro-inflammatoires (IL-1, IL-6, TNF-α) et pour d’autres anti-inflammatoires (IL-10, transforming growth factor TGF-β, récepteur antagoniste à l’IL-1 (IL-1Ra)), – une libération de médiateurs lipidiques synthétisés à partir de l’acide arachidonique libéré des phospholipides par la phospholipase A2 : PAF-acether et eicosanoïdes (prostaglandines, leucotriènes). Ces composés sont pro-inflammatoires, chimiotactiques pour certains (LTB4), – une synthèse et une libération de radicaux libres oxygénés et nitrés dans les polynucléaires neutrophiles, éosinophiles et dans les macrophages. c) une phase de résolution et de réparation qui permet une reconstruction du tissu lésé : – la phase d’amplification est limitée dans le temps par la mise en place de systèmes de contrôle tels que les antiprotéases, les cytokines anti-inflammatoires, les systèmes antiradicalaires. La sécrétion de facteurs de croissance, de cytokines et la néovascularisation facilitée par les chémokines vont participer à la reconstruction des tissus lésés. Si les systèmes de réparation ont été efficaces et si le facteur déclenchant a été éliminé, la reconstitution tissulaire est totale. Dans le cas contraire (persistance du facteur déclenchant, défaillance des systèmes de réparation), la RI persiste sous forme chronique.

2 ■■ LES MARQUEURS BIOCHIMIQUES DE LA RÉACTION INFLAMMATOIRE Le syndrome inflammatoire témoigne de la présence d’une pathologie organique mais n’est spécifique d’aucune cause précise. Il est un marqueur de l’activité de nombreuses maladies. (Devulder et al., 2002 ; Godeau et al., 2004) Parmi les marqueurs biochimiques du syndrome inflammatoire, il faut distinguer les examens qui apportent une information utile pour le diagnostic (vitesse de sédimentation, hémogramme, électrophorèse des protéines sériques, protéines de l’inflammation) et les examens réservés aux protocoles de recherche clinique qui ne sont pas encore validés (dosage des eicosanoïdes, des cytokines et chémokines…).

101

4557_2_.book Page 102 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

2.1.

Critères d’un bon marqueur biochimique de l’inflammation

Un bon marqueur de l’inflammation doit répondre à plusieurs critères : – il doit être la conséquence de la RI, donc dépendre de celle-ci ; – il doit être indépendant de l’étiologie de la RI ; – il doit présenter une cinétique rapide d’évolution ; – on doit observer une augmentation significative de ce marqueur en cas de RI modérée, proportionnelle au degré de l’inflammation ; – enfin, son dosage doit être précis, rapide, standardisable et peu cher. Le marqueur biochimique idéal, c’est-à-dire celui qui répondrait à l’ensemble de ces critères, n’existe pas.

Le marqueur idéal de l’inflammation n’existe pas.

2.2.

La vitesse de sédimentation

2.2.1. Principe et signification La VS est un examen de routine de première intention, indispensable et simple à effectuer. La mesure de la VS repose sur la méthode de Westergreen (1920) : lecture à une heure de la hauteur de la colonne de plasma au-dessus des hématies qui ont sédimenté dans un tube à hémolyse. Le résultat de la VS dépend du nombre, de la forme et du volume des hématies et des facteurs plasmatiques qui modifient la répulsion des hématies entre elles. La VS est augmentée par certaines protéines de l’inflammation (fibrinogène, β- et γ-globulines) qui modifient la répulsion électrique des hématies entre elles et favorisent l’empilement en rouleaux de ces hématies qui sédimentent plus vite.

2.2.2. Interprétation du résultat La VS normale est plus élevée chez la femme que chez l’homme en raison d’une concentration d’hémoglobine plus élevée chez l’homme ; la VS augmente également avec l’âge à cause d’une augmentation de la concentration en fibrinogène. Des valeurs limites normales ont donc été fixées : Valeurs normales supérieures (1 et le sexe.

re

heure) de la VS selon l’âge

homme

femme

Avant 50 ans

15 mm

20 mm

Après 50 ans

20 mm

30 mm

La lecture de la VS à la deuxième heure n’apporte aucune information supplémentaire. D’autres facteurs physiologiques comme la grossesse ou la prise d’oestroprogestatifs modifient la VS : – la grossesse : au cours du troisième trimestre de grossesse, la VS peut atteindre 40 à 50 mm à la 1re heure, suite à une augmentation de la concentration plasmatique en fibrinogène, puis elle se normalise un mois après l’accouchement. Cette

102

augmentation de la VS n’indique pas le développement d’une RI ; – la prise d’oestroprogestatifs : elle entraîne une augmentation de la synthèse hépatique du fibrinogène qui provoque une augmentation de la VS. La VS est un paramètre de la RI de cinétique lente. En effet, la modification de la VS dépend de la variation de la synthèse de fibrinogène qui en cas de RI, augmente en 3 à 4 jours mais en cas d’insuffisance hépatique, la concentration sérique de fibrinogène diminue rapidement. Enfin, la VS peut être augmentée par des pathologies non inflammatoires comme : – l’anémie : si la concentration d’hémoglobine est faible, l’hématocrite est faible et provoque une sédimentation plus rapide que la normale des globules rouges. La VS est souvent de 40 à 50 mm à la 1re heure dans les anémies sévères ; elle se normalise avec la normalisation de l’anémie ; – les syndromes néphrotiques : au cours de ces pathologies, les protéines de faible poids moléculaire comme l’albumine ou l’orosomucoïde passent dans les urines, ce qui provoque une augmentation de la synthèse des protéines hépatiques qui augmentent la VS ; – l’hémodilution observée dans l’insuffisance cardiaque ; – l’insuffisance rénale chronique : elle augmente la VS sous l’effet de plusieurs facteurs comme l’anémie, l’augmentation de la concentration en fibrinogène ou l’hypocalcémie ; – les hypergammaglobulinémies monoclonales bénignes ou malignes (myélome) ou les hypergammaglobulinémies polyclonales (maladies auto-immunes, infections chroniques, hépatopathies chroniques ou pathologies ganglionnaires, infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) ou le virus de l’hépatite C) : elles favorisent la formation de rouleaux globulaires et augmentent la VS ; – une forte hyperlipidémie avec augmentation soit des triglycérides, soit du cholestérol : elle peut induire une augmentation de la VS. Les variations physiologiques et pathologiques peuvent être résumées dans le tableau suivant : Facteurs augmentant la VS

Facteurs diminuant la VS

Âge et sexe féminin

Anomalies des globules rouges

Grossesse et oestrogènes

Polyglobulie

Maladies inflammatoires

Cryoglobulinémies

Syndromes néphrotiques

Anémie hémolytique

Insuffisance rénale chronique

Hypofibrinogénémie

Hyperlipidémie

Insuffisance hépatocellulaire

Hypergammaglobulinémies

Certains médicaments modifient la VS : – les contraceptifs oraux l’augmentent ; – les dextrans l’augmentent ; – les produits de contraste iodés la diminuent ;

4557_2_.book Page 103 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Les marqueurs biochimiques de l’inflammation

Tableau 1

■

Principe général de l’immunonéphélométrie et protéines variant au cours de la réaction inflammatoire. Dosage des protéines de l’inflammation par immunonéphélométrie

Faisceau laser

Précipité Ag/Ac en suspension

– – – –

PRI positives

PRI négatives

CRP PCT protéine sérique amyloïde A α1-antichymotrypsine Haptoglobine Orosomucoïde Fibrinogène α1-antitrypsine C3 du complément Ferritine

Albumine Préalbumine Transferrine

la cortisone la diminue ; les AINS la diminuent ; les salicylés à forte dose la diminuent ; l’acide valproïque la diminue.

La VS est un examen simple, rapide, peu coûteux mais peu spécifique. La VS est un paramètre de la RI de cinétique lente et un marqueur global et indirect de l’inflammation.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

2.3.

Photomultiplicateur (diffraction de la lumière)

Les protéines de l’inflammation

Les protéines de la réaction inflammatoire ou PRI ont une concentration qui varie au cours de cette RI. Certaines sont appelées PRI positives car leur synthèse est stimulée par des cytokines comme l’IL-1, l’IL-6 et le TNF-α. D’autres sont appelées PRI négatives car leur catabolisme est supérieur à leur synthèse (tableau 1). Leur dosage s’effectue par immunonéphélométrie. Parmi ces protéines dont la concentration varie au cours de la RI, un petit nombre d’entre elles peut être utilisé comme marqueur biochimique de l’inflammation. En effet, ces dernières doivent présenter une cinétique particulière (rapide, intermédiaire ou lente), leur variation de concentration doit être proportionnelle au degré de la RI et leur dosage doit être précis, rapide et standardisable. Ces marqueurs biochimiques seront les seuls traités dans ce chapitre (tableau 2).

Tableau 2

■

Principaux marqueurs biochimiques. PRI cinétique rapide

CRP PCT

cinétique intermédiaire

Orosomucoïde Haptoglobine

cinétique lente

Transferrine Ferritine Fraction C3 du complément

2.3.1. La CRP ou C-réactive protéine La CRP fait partie de la famille des pentraxines, ensemble de protéines très anciennes et très conservées entre les espèces, comprenant notamment la CRP, la SAP (« serum amyloïde protein C component ») et l’APP, précurseur du peptide β-amyloïde. Elle est constituée de cinq monomères identiques (207 acides aminés) qui s’organisent en anneau et constituent un pore central. Le gène de la CRP est situé sur le chromosome 1 (en 1q21 – 1q23). Dans le promoteur du gène, on trouve des sites de liaisons de facteurs de transcription sensibles aux cytokines (NF-κB, C/EBPβ, C/EBPγ, AP-1, APRF). L’IL-6 est l’inducteur principal mais son action nécessite une synergie avec d’autres inducteurs tels que

103

4557_2_.book Page 104 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

l’IL-1β ou certaines fractions du complément. Le transcrit étant très instable, la synthèse de la CRP est très vite diminuée et cesse dès que la concentration d’IL-6 se normalise. Aucune déficience en CRP n’est connue chez l’homme. La CRP n’est pas seulement un marqueur biochimique de l’inflammation. Elle possède des capacités de liaison aux groupements phosphorylcholine des membranes bactériennes, des lipoprotéines et des cellules apoptotiques. Elle a une action opsonisante en favorisant la phagocytose des bactéries. Elle est également capable de reconnaître des constituants nucléaires, d’activer la voie classique du complément et de se lier aux récepteurs des IgG (Dupuy et al., 2003). La CRP fait partie du groupe des protéines de la réaction inflammatoire dont la concentration sérique augmente au moins de 25 % au cours de cette réaction. Elle est principalement synthétisée dans les cellules hépatiques sous l’action de cytokines pro-inflammatoires, surtout l’IL-6 et elle est non glycosylée. La CRP n’est pas impliquée dans la VS. La CRP native pentamérique peut se dissocier en sous unités monomériques lorsqu’elle est associée à la membrane cellulaire pour former une forme monomérique (CRPm). Cette forme monomérique est stable mais indétectable dans le sérum. La CRP monomérique est retrouvée à la surface des cellules. Il a été montré récemment que la CRP pouvait avoir une synthèse extrahépatique. Les ARNm et/ou la protéine ont été mis en évidence dans les macrophages, les cellules épithéliales du tractus respiratoire, dans les neurones, les adipocytes, les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses. La CRP synthétisée au niveau extrahépatique est la plupart du temps non sécrétée et sous forme monomérique. De même, la CRP retrouvée au niveau des plaques d’athérome ne semble pas être la conséquence de dépôts de CRP circulante mais provenir plutôt d’une synthèse locale au niveau vasculaire. Toutefois ces cellules ne semblent pas produire une forme pentamérique sécrétée mais plutôt une forme monomérique localisée au niveau intracellulaire ou membranaire ou qui se dépose dans la matrice extracellulaire de ces cellules. ■ Délai de réponse et demi-vie

Sa concentration sérique augmente très rapidement (entre 6 et 12 heures) après le début de la RI et sa demi-vie est courte (12 heures). Sa concentration sérique physiologique est inférieure à 10 mg/ L et peut être multipliée par 30 dans certains syndromes inflammatoires ou infectieux. Le retour à la normale s’effectue en 3 à 4 jours.

La CRP est un marqueur très précoce de la réaction inflammatoire et constitue un examen d’urgence dans certaines pathologies. ■ Variations physiologiques

Sa concentration sérique n’est pas modifiée par l’âge ni le sexe, ni la race mais elle est augmentée durant la grossesse, après la prise d’œstrogènes, après inhalation de fumée de cigarette ou en postopératoire. La prise de statines, de fibrates, de glitazones,

104

d’aspirine est associée à une diminution de la concentration de CRP. La concentration en CRP ne subit pas de cycle nycthéméral et n’est pas influencée par la prise de repas, ce qui permet sa détermination même chez un sujet non à jeun. La CRP présente une faible variabilité intra-individuelle chez les sujets sains mais une variabilité interindividuelle qui peut s’expliquer par le polymorphisme des séquences GT dans l’intron du gène. ■ Variations pathologiques et intérêt • CRP et maladies inflammatoires

Le dosage de la CRP est aussi utile dans le suivi de la maladie de Horton dans laquelle sa concentration sérique peut atteindre une valeur de 100 mg/L, avec une correction assez rapide sous corticothérapie. La CRP constitue un marqueur d’efficacité des traitements de la maladie à l’origine du syndrome inflammatoire. Elle permet de vérifier le contrôle de l’inflammation par la corticothérapie, les immunosuppresseurs ou plus récemment les biothérapies au cours des pathologies rhumatismales inflammatoires. Cependant, devant la découverte d’un syndrome inflammatoire, une concentration très élevée de CRP oriente plutôt vers une étiologie infectieuse. Si une concentration sérique augmentée de CRP est associée à une anémie ferriprive, il est important de rechercher un cancer digestif.

La concentration sérique de la CRP est augmentée dans les rhumatismes inflammatoires (polyarthrite rhumatoïde, spondylarthropathies) et dans les maladies systémiques (lupus érythémateux systémique, vascularites…).

• CRP et maladies infectieuses

La CRP est utilisée pour le diagnostic précoce des maladies infectieuses. En effet, sa concentration sérique augmente fortement (d’un facteur 100 en 24 heures) en cas d’infection bactérienne (intérêt dans les méningites bactériennes) et plus faiblement en cas d’infection virale ou parasitaire. Elle est utilisée dans le dépistage d’une infection de fin de grossesse, d’une infection néonatale ou d’une infection post-opératoire. Étant donné sa cinétique rapide, elle représente un bon marqueur biochimique de l’efficacité des anti-infectieux dans ces pathologies.

La CRP est un marqueur biochimique précoce des maladies infectieuses et de leur suivi thérapeutique.

2.3.2. La procalcitonine ou PCT La calcitonine est synthétisée sous forme d’une prohormone, la procalcitonine ou PCT. La PCT est plutôt un marqueur biochimique de l’infection que de l’inflammation. En 1993, Assicot et al. rapportent l’existence de concentrations sériques élevées d’un précurseur de la calcitonine, la PCT, chez des patients souffrant d’une infection locale ou d’une septicémie

4557_2_.book Page 105 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Les marqueurs biochimiques de l’inflammation

Procalcitonine (PCT), 116 acides aminés, 13 kDa Région N-terminale

Région C-terminale N-PCT (57 acides aminés) Calcitonine (32 acides aminés) Carboxyterminal peptide-1 ou CCP-1 ou katacalcine (21 acides aminés) CT:CCP-1 ou « free conjoined » CT:CCP-1 peptide Formes retrouvées chez les sujets normaux

Région N-terminale

Région C-terminale 8 kDa 10 kDa Formes retrouvées dans les états septiques

Figure 1

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

■ Représentation schématique de la procalcitonine et de ses produits de dégradation retrouvés dans le sérum de sujets normaux et dans le sérum de patients septiques.

sans pathologie thyroïdienne (un groupe de nouveaux-nés et de jeunes enfants et un groupe d’adultes grands brûlés). Depuis, de nombreux travaux ont montré une augmentation de la concentration sérique de PCT lors de pathologies infectieuses. Dans les conditions physiologiques, la PCT n’est produite que par les cellules C de la thyroïde mais en cas d’infection sévère ou de choc septique, elle est synthétisée par de nombreux organes comme le foie mais aussi le tube digestif, le cerveau et le poumon sous l’effet d’une endotoxine bactérienne. La PCT est un peptide de 116 acides aminés (13 kDa) qui est clivé en calcitonine (32 acides aminés) mais aussi en d’autres peptides : la N-PCT, le CCP-1 ou carboxyterminal peptide-1 encore appelé katacalcine de 21 acides aminés et un peptide appelé CT : CCP-1 ou « free conjoined CT : CCP-1 », peptide constitué de calcitonine et CCP-1 (figure 1). Toutes ces formes sont retrouvées dans le sérum des sujets normaux, la concentration en N-PCT étant deux fois plus élevée que celle de la calcitonine (Becker et al., 2004). Enfin, dans les états septiques, la PCT peut perdre les deux premiers acides aminés N-terminaux (12 kDa) et se cliver en deux fragments de 8 et 10 kDa (figure 1). On ne connaît pas de rôle précis de la PCT dans les états septiques. Face à une infection, la PCT pourrait jouer un rôle dans la réponse inflammatoire de l’organisme en favorisant la synthèse par les monocytes de cytokines pro-inflammatoires (IL-1β, TNF-α et IL-8). Elle est actuellement dosée de deux manières : une méthode quantitative avec des anticorps monoclonaux lors d’une réaction de type « sandwich » avec marquage luminescent, une autre semi-quantitative par immunochromatographie.

■ Délai de réponse et demi-vie

Sa concentration sérique physiologique est inférieure à 0,5 μg/L. Elle augmente dès la 3e heure suivant le début de l’infection et des concentrations de PCT supérieures à 5 μg/L orientent vers une infection bactérienne, quel que soit le syndrome inflammatoire qui peut être associé. Sa demi-vie de 24 heures permet de suivre l’évolution de la pathologie infectieuse. ■ Variations pathologiques et intérêt • PCT et sepsis

Le sepsis est défini comme la présence concomitante d’un syndrome inflammatoire systémique (SIRS) et d’une bactériémie. Le diagnostic précoce et le traitement adapté et rapide du sepsis sont un challenge en pratique clinique. Chez le patient septique, les signes cliniques ou les symptômes sont peu spécifiques et les analyses microbiologiques demandent du temps et ne sont pas toujours positives. La PCT plasmatique est un bon marqueur de la RI associée à l’infection bactérienne (Simon et al., 2004). Des valeurs élevées sont corrélées à la présence d’une infection bactérienne et à l’expression clinique de l’intensité de la RI. Le dosage de PCT est particulièrement indiqué : en réanimation, lorsque le sepsis est suspecté chez les patients avec des critères de réponse inflammatoire systémique, des anomalies de la perfusion ou chez des patients en état de choc inexpliqué ou ayant une dysfonction viscérale (Schröder et al., 1999 ; Clec’h et al., 2004 ; Aikawa et al., 2005 ; Annane, 2006). Des valeurs de PCT > 2 ng/mL sont associées à une forte probabilité de sepsis bactérien chez le nouveau-né, à chaque fois qu’un sepsis peut être suspecté en rapport avec un risque d’infection materno-fœtale. Au cours des deux premiers jours de

105

4557_2_.book Page 106 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

vie, les concentrations de PCT sont physiologiquement augmentées et, pour cette période, des valeurs de référence doivent être appliquées en fonction du temps de vie. À partir du troisième jour de vie, les valeurs de référence sont les mêmes que celles de l’adulte : une PCT < 0,5 ng/mL permet de récuser le diagnostic d’infection systémique. La PCT peut aider au monitorage des patients septiques car la persistance d’une concentration élevée de PCT (> 2 ng/mL) rend compte de l’absence de contrôle du processus infectieux. Cette concentration élevée en PCT est corrélée à un mauvais pronostic et justifie une réévaluation de la stratégie diagnostique et thérapeutique. • PCT et méningite

Dans les cas de méningite bactérienne, la concentration sérique de PCT est un indicateur très utile pour différencier les méningites bactériennes de celles qui ne le sont pas. La PCT plasmatique permet de diagnostiquer une méningite bactérienne avec une sensibilité et une spécificité de 100 %, si le seuil décisionnel est placé à 0,2 ng/ml (Viallon et al. 1999). • PCT et infections respiratoires

Le dosage de la PCT plasmatique est également intéressant pour le diagnostic précoce et le pronostic des pneumonies sous ventilation mécanique, ce qui n’est pas le cas de la PCT dosée dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire. Les travaux de Christ-Crain et al. (2006) ont permis de définir un algorithme de prise en charge des patients atteints d’infections pulmonaires en fonction de la valeur de la PCT : – Traitement antibiotique déconseillé si la concentration plasmatique de la PCT est comprise entre 0,1 et 0,25 ng/ml. – Traitement antibiotique fortement conseillé si la concentration plasmatique de PCT est comprise entre 0,25 et 0,5 ng/ml. – Traitement antibiotique fortement conseillé si la concentration plasmatique de PCT est supérieure à 0,5 ng/ml. Dans cette étude, le dosage de la PCT a permis de réduire d’environ 50 % le taux de prescription d’antibiotiques et la durée de traitement. • Augmentation de la PCT en absence d’infection bactérienne

Il existe quelques situations décrites dans la littérature où l’augmentation de la PCT est en rapport avec une cause non bactérienne : – les premiers jours suivant un polytraumatisme, une brûlure grave, une intervention chirurgicale majeure (chirurgie cardiaque, œsophagectomie…) pour la concentration en PCT peut atteindre des valeurs de 1 à 2 ng/ml puis revient à la normale en 4 à 5 jours. Une augmentation plus importante (5-20 ng/ml) est associée à un risque de complication infectieuse et à une augmentation de la mortalité ; – chez le nouveau-né dans les premiers jours suivant la naissance, la concentration en PCT peut dépasser 20 ng/ml en absence de toute infection ; – chez les patients présentant un état de choc cardiogénique prolongé ou les patients présentant des anomalies circulatoires prolongées ; – chez les patients se présentant au Service d’accueil des Urgences, afin de mettre en évidence biologiquement l’existence d’une infection bactérienne dans un contexte de syndrome fébrile (Hausfater et al., 2007).

106

• La PCT est un marqueur biochimique spécifique de l’infection bactérienne, mais une concentration sérique de PCT < 0,25 ng/ ml n’exclut pas une infection bactérienne locale. Une valeur > 2 ng/ml est fortement suggestive d’un état septique. • Le dosage de la PCT est ainsi un examen d’urgence. • De plus, la concentration sérique de PCT est d’autant plus élevée que l’infection est plus sévère (cinétique rapide).

2.3.3. L’orosomucoïde ou α1-glycoprotéine acide ■ Demi-vie et variations physiologiques

L’orosomucoïde est une glycoprotéine fortement glycosylée (45 %) qui a une masse moléculaire compris entre 41 et 43 kDa. Étant donné la forte proportion d’acides sialiques (12 % de la partie glucidique), l’orosomucoïde est chargée négativement (pH isoélectrique compris entre 2,7 et 3,2). Sa synthèse est principalement hépatique et sa demi-vie est de 3 à 6 jours. La concentration sérique normale de l’orosomucoïde est de 0,3 à 0,9 mg/mL et augmente avec l’âge. ■ Variations pathologiques

L’orosomucoïde aurait un effet inhibiteur sur l’agrégation plaquettaire, l’activation des polynucléaires neutrophiles et sur la stimulation de la production de cytokines pro- ou anti-inflammatoires. Cet effet varierait en fonction de la concentration sérique en orosomucoïde et du type cellulaire avec lequel cette protéine interagirait (Hochepied et al., 2003). La concentration sérique en orosomucoïde augmente dans un délai de 2 à 4 jours après le début de la RI. Cette augmentation est parallèle à l’augmentation de la concentration sérique en haptoglobine en cas d’inflammation. Sa concentration sérique est élevée en cas d’insuffisance rénale mais elle est diminuée dans les syndromes inflammatoires par fuite urinaire protéique car sa masse moléculaire est faible. Enfin, sa concentration sérique est diminuée lors des traitements par les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) ou les corticoïdes. L’orosomucoïde est utilisé comme un marqueur d’évolution vers la chronicité avec des concentrations qui restent souvent élevées dans ce contexte physiopathologique.

2.3.4. L’haptoglobine L’haptoglobine est une α2-glycoprotéine synthétisée par les hépatocytes. Elle est constituée d’un monomère formé de quatre chaînes polypeptidiques : deux chaînes β identiques et des chaînes α différentes, α1 et α2. L’haptoglobine fixe l’hémoglobine libre pour former des complexes de forte affinité. Ils disparaissent en quelques minutes du plasma car ils sont métabolisés par le système réticulo-endothélial, permettant ainsi la récupération du fer et évitant une hémoglobinurie. ■ Délai de réponse et demi-vie

La cinétique de variation de sa concentration sérique est lente et suit de très près celle de l’orosomucoïde en cas de RI. Sa concentration sérique normale est de 1 à 2 g/L. Elle augmente 3 à 4 jours après le début de la réaction inflammatoire. Sa demi-vie est de 3

4557_2_.book Page 107 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Les marqueurs biochimiques de l’inflammation

à 6 jours et le retour à une concentration sérique normale s’effectue en 10 à 15 jours. ■ Variations physiologiques et pathologiques

Sa concentration sérique baisse chez le nouveau-né et augmente avec l’âge. L’haptoglobine est une protéine majeure de l’inflammation : sa concentration sérique peut être multipliée par un facteur 2 à 4. Elle permet avec la CRP, soit de confirmer soit d’infirmer un syndrome inflammatoire lorsque la VS a déjà été pratiquée. Sa concentration sérique est abaissée en cas d’hémolyse intravasculaire et d’insuffisance hépatique.

2.3.5. La transferrine et la ferritine ■ La transferrine • Demi-vie et variations physiologiques

Il s’agit d’une protéine de transport du fer qui est synthétisée par le foie. Sa cinétique est lente : sa concentration sérique baisse 3 ou 4 jours après le début de la RI et sa demi-vie est de 8 jours. Sa concentration sérique est régulée par les concentrations en fer des tissus de l’organisme. La concentration sérique normale est de 2 à 3 g/L ; elle augmente pendant la grossesse sous l’influence des œstrogènes. • Variations pathologiques

Dans le syndrome inflammatoire, la concentration sérique de transferrine baisse comme celle de l’albumine, les deux protéines variant de façon très parallèle. La concentration sérique de transferrine baisse également en cas de dénutrition mais aussi dans l’insuffisance hépatocellulaire et en cas de fuite protéique (atteinte glomérulaire, brûlures). Elle augmente en cas de carence en fer, d’hépatite virale ou d’oestrogénothérapie. L’intérêt de doser la transferrine réside dans le diagnostic des carences en fer qui peuvent accompagner un syndrome inflammatoire : dans ces cas-là, la baisse de la concentration sérique de transferrine n’est pas parallèle à celle de l’albumine. ■ La ferritine

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

• Demi-vie et variations physiologiques

La ferritine est une macromolécule de masse moléculaire élevée (440 kDa) constituée d’une coque sphérique et d’un noyau renfermant du fer (en moyenne 2 000 à 2 500 ions ferreux). La coque protéique est formée de 24 sous-unités immunologiquement distinctes, appelées H (« heavy ») ou L (« light »). Les ferritines acides contiennent une forte proportion de chaînes H et sont présentes dans le rein, le cœur, l’érythroblaste et le placenta. Les ferritines basiques sont riches en chaînes L et se retrouvent dans le foie, la rate et le plasma. Les modifications de concentration de la ferritine sérique sont lentes. La concentration normale se situe entre 30 et 300 μg/L chez l’homme et 20 à 200 μg/L chez la femme. La concentration sérique de ferritine est basse à la puberté et augmente avec l’âge. • Variations pathologiques

La concentration sérique en ferritine baisse en cas de carence en fer et augmente dans les syndromes inflammatoires, les anoma-

lies de l’érythropoïèse, la cirrhose, l’hyperthyroïdie ou l’hémochromatose. De façon physiologique, le fer, libéré par l’hémolyse, est phagocyté par les macrophages pour être transféré sur la sidérophiline et de là aux érythroblastes. En cas de syndrome inflammatoire, le fer est piégé dans les macrophages. Cette captation anormale empêche son passage dans le plasma et explique la baisse du fer sérique. Cependant, les réserves en fer ne sont pas diminuées et il existe un hypercatabolisme protéique. Ainsi la concentration de sidérophiline n’augmente pas. Par contre, la concentration de ferritine est habituellement augmentée. Au cours de la RI, la durée de vie des globules rouges est légèrement diminuée et la production médullaire est diminuée car la production d’érythropoïétine n’est pas adaptée et diverses cytokines inhibitrices de l’érythropoïèse sont libérées. Le tout aboutit à une anémie sans carence en fer et associée à une augmentation de la ferritine. L’intérêt spécifique du dosage de la ferritine est de diagnostiquer des carences ou des surcharges en fer mais la ferritine n’est pas un marqueur biochimique majeur de l’inflammation.

2.3.6. La fraction C3 du complément Les protéines du complément sont synthétisées par l’hépatocyte et les macrophages. Dans la RI, on observe une augmentation de la concentration sérique des protéines du complément et de leur activité fonctionnelle. Cela peut être mis en évidence par une augmentation du taux de CH 50 qui est un test hémolytique qui explore l’activité fonctionnelle de la voie classique et de la voie finale commune. L’activité fonctionnelle de chaque composant peut être mesurée individuellement par des tests hémolytiques. La fraction C3 est située au niveau du tronc commun entre les deux voies d’activation, directe et alterne. C’est une protéine de l’inflammation, de cinétique lente comme l’haptoglobine ou l’orosomucoïde. La concentration sérique est de 0,15 à 2 g/L ; elle ne varie pas avec l’âge. Cette fraction augmente dans le syndrome inflammatoire et la cirrhose biliaire primitive. Elle baisse lors de l’activation du complément en cas de polyarthrite rhumatoïde à un stade avancé, de lupus érythémateux systémique, d’anémie hémolytique, de certaines infections ou d’insuffisance hépatocellulaire sévère. L’intérêt de doser cette protéine vient du fait que lorsqu’elle diminue, cela indique la présence de complexes immuns circulants.

2.4.

Électrophorèse des protéines

Les protéines sériques peuvent être séparées par électrophorèse sur un support solide. Si on se place à un pH supérieur au pH isoélectrique de toutes les protéines (pH = 8,6), celles-ci vont toutes migrer de la cathode vers l’anode. On peut donc individualiser cinq fractions en partant de l’anode vers la cathode : l’albumine (33 à 50 g/L), les α1-globulines (1,5 à 4 g/L) dans lesquelles on trouve l’α1-antitrypsine, l’α1-antichymotrypsine et l’orosomucoïde, les α2-globulines (6 à 10 g/L) constituées notamment de l’α2-macroglobuline, l’haptoglobine, les β2-globulines contenant notamment la transferrine, le fibrinogène, la fraction C3 du complément et les γ-globulines (7,5 à 16 g/L).

107

4557_2_.book Page 108 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Les concentrations sériques de fibrinogène et de CRP ne modifient pas le tracé. L’hyper α-globulinémie évoque un syndrome inflammatoire surtout si l’albuminémie est en même temps abaissée. Mais la modification du profil électrophorétique est lente et peu spécifique. L’électrophorèse des protéines explorant également le foie et l’état nutritionnel, son interprétation est délicate dans le cas d’une malnutrition protéique. Elle présente tout de même l’intérêt de permettre de déceler, à la vue du profil protéique, certaines pathologies : – une hypoalbuminémie sévère (< 22 g/L) qui indique une fuite urinaire ou une insuffisance hépatocellulaire sévère ; – un bloc béta-gamma qui évoque une cirrhose ; – une gammapathie polyclonale surtout au-delà de 30 g/L qui peut évoquer, soit une infection (parasitaire, virale ou bactérienne), soit une hépatite chronique active, soit une maladie auto-immune (Gougerot-Sjögren), soit un lymphome ; – une gammapathie monoclonale qui peut être bénigne (IgA < 10 g/L, IgG < 20 g/L) ou maligne (un myélome à IgA ou IgG) ou une maladie de Waldenström (IgM) ; – une hypoalphaglobulinémie (hépatopathie) ; – une hypogammaglobulinémie qui doit faire rechercher une hémopathie lymphoïde ou un myélome à chaînes légères kappa ou lambda.

Comme la VS, l’électrophorèse des protéines est un marqueur global et indirect de l’inflammation mais cet examen permet, par une simple lecture, d’identifier une hypoalbuminémie, un bloc béta-gamma, une gammapathie polyclonale ou un pic monoclonal, une dénutrition sévère.

bine. Le tableau ci-dessous résume ce que l’on peut déduire de ces trois combinaisons. CRP

Orosomucoïde Haptoglobine

Syndrome inflammatoire Aigu, débutant

+++

+

Normal ou +

Aigu en phase d’état

+++

+++

+++

Normal ou +

+ ou ++

++

Régressif ou chronique

3.2.

Diagnostic d’une pathologie associée

3.2.1. Électrophorèse des protéines sériques L’électrophorèse des protéines sériques permet de confirmer le syndrome inflammatoire si on observe une augmentation des fractions α1 et α2 mais elle peut être également normale. L’intérêt de l’électrophorèse permet de rechercher une hypergammaglobulinémie monoclonale (myélome, Waldenström ou lymphome), polyclonale (Syndrome de Gougerot-Sjögren, infections), une hyperproduction d’IgA (infections au niveau des muqueuses, maladie de Horton, maladie de Crohn, cancer ORL, purpura rhumatoïde…), une hyperproduction d’IgM (infections à un stade précoce), une hépatopathie (cirrhose éthylique) avec baisse des PRI et augmentation des IgA, une hépatite chronique active avec augmentation des IgG.

3.2.2. Détection de maladies organiques

3 ■■ EXAMENS COMPLÉMENTAIRES, RECOMMANDATIONS ET PERSPECTIVES

3.1.

Dépistage d’un syndrome inflammatoire

Une RI aiguë est habituellement accompagnée de signes généraux tels que la fièvre, l’anorexie et l’asthénie. Cette RI peut être associée à une pathologie facilement identifiée. Dans d’autre cas, il est difficile de retrouver la pathologie à l’origine de la RI avec l’examen clinique et aux examens de dépistage. Il faut alors, avec des examens supplémentaires, rechercher la cause de ce syndrome inflammatoire qui peut être une infection, une pathologie cancéreuse, une maladie de système ou une maladie thromboembolique. Par exemple, la maladie de Horton peut ne s’exprimer que par un syndrome inflammatoire biologique. En pratique, les marqueurs biochimiques de l’inflammation sont utiles au diagnostic et au suivi évolutif de certaines affections. Leur choix dépend essentiellement du contexte clinique. La VS est un marqueur de cinétique lente qui est souvent utilisé en raison de sa simplicité. Mais pour établir un profil protéique inflammatoire, il faut associer la recherche d’une protéine à cinétique rapide, par exemple la CRP à deux protéines de cinétique lente comme l’orosomucoïde (ou le fibrinogène) et l’haptoglo-

108

a) La concentration sérique de la CRP est élevée dans les pathologies suivantes : – traumatismes, chirurgie ou brûlures ; – pathologies infectieuses : la CRP est élevée mais la PCT étant un marqueur plus spécifique de l’infection bactérienne, elle permettrait de différencier ce type d’infection d’une infection virale dans laquelle la PCT reste normale ; – maladies inflammatoires : polyarthrite rhumatoïde, spondylarthrite ankylosante, maladie de Crohn, vascularite systémique… – néoplasies : maladie de Hodgkin, lymphome, carcinome… – nécroses : infarctus du myocarde, infarctus mésentérique ; – infection bactérienne post-chirurgicale (chirurgie cardiaque, abdominale ou après transplantation) : des concentrations élevées de CRP mais surtout de PCT sont les signes de l’existence de complications infectieuses ; – néo-natalogie et pédiatrie : les concentrations sériques de CRP mais surtout de PCT sont très élevées en cas d’infections bactériennes ; – infections parasitaires : dans les infections fongiques comme les candidoses, la CRP est très augmentée. b) Le syndrome inflammatoire est un facteur de risque cardiovasculaire et un facteur prédictif de survenue d’un diabète de type 2 : – la concentration sérique de CRP ultra sensible (dosage immunoturbidimétrique) est considérée comme un facteur de risque cardiovasculaire. Elle peut être utilisée en association avec les

4557_2_.book Page 109 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Les marqueurs biochimiques de l’inflammation

autres facteurs de risque pour estimer un risque global d’événements cardiovasculaires (Torres et Ridker, 2003 ; Shah et Newby, 2003 ; Bard et al., 2005 ; Yeh, 2005). L’American Heart Association (AHA) recommande de réaliser deux dosages de CRP espacés d’au moins deux semaines dont la moyenne des valeurs sera utilisée pour estimer le risque vasculaire.

• Si concentration sérique de CRP < 1 mg/L : pas de risque cardiovasculaire. • Si 1 mg/L < concentration sérique de CRP < 3 mg/L : risque modéré. • Si concentration sérique de CRP > 3 mg/L : risque élevé d’infarctus ou angor. – il existerait une corrélation entre la concentration sérique de CRP ultrasensible et soit l’obésité soit l’insulino-résistance, soit le risque de développer un diabète de type 2 (Nash et al., 2005 ; Bastard et al., 2006 ; Sjoholm et Nystrom, 2006). c) CRP et sévérité de l’atteinte tissulaire : Dans les cancers, une concentration élevée de CRP sans infection associée est de mauvais pronostic. Dans les maladies inflammatoires comme la polyarthrite rhumatoïde ou la maladie de Crohn, on observe une corrélation entre la gravité de la maladie et la concentration de CRP.

3.3.

Suivi thérapeutique de maladies inflammatoires ou infectieuses

Dans les pathologies infectieuses, la PCT est un marqueur d’efficacité d’une antibiothérapie (Christ-Crain et al., 2006). La persistance d’une concentration sérique très élevée après 3 jours de traitement constitue un facteur pronostique défavorable qui est corrélé à plusieurs scores de gravité. Sa diminution est, au contraire, un marqueur d’efficacité thérapeutique et d’évolution favorable de l’infection. Le dosage de la CRP permet de suivre l’efficacité du traitement d’une polyarthrite rhumatoïde, d’une maladie de Horton. Le dosage de l’haptoglobine présente un intérêt car, dans la rectocolite hémorragique, la CRP est fréquemment normale.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

3.4.

Variations divergentes de certaines protéines de l’inflammation

Si le rapport haptoglobine/orosomucoïde est faible (< 1,3), cela signifie soit l’existence d’une hémolyse intravasculaire (concentration sérique d’haptoglobine diminuée), soit l’existence d’une insuffisance rénale (concentration sérique d’orosomucoïde élevée car non filtré par le glomérule). Si le rapport haptoglobine/orosomucoïde est fort (> 1,3), cela signifie une baisse de la concentration d’orosomucoïde due soit à une atteinte tubulaire rénale, soit à une imprégnation œstrogénique, soit à l’action de certains médicaments. Les protéines PRI négatives (sérumalbumine, transferrine, préalbumine) sont encore appelées protéines de la nutrition. Leur concentration plasmatique baisse au cours d’une dénutrition ou d’une malnutrition (cf. chapitre Marqueurs de la dénutrition).

En conclusion :

• Intérêt du dosage de la PCT dans le diagnostic et le suivi des infections bactériennes. • Intérêt du dosage de la CRP comme facteur de risque cardiovasculaire. • Intérêt du couple CRP/orosomucoïde ou CRP/fibrinogène dans le diagnostic du syndrome inflammatoire.

3.5.

Actualités et perspectives

La RI aiguë se déroule selon trois phases : une phase d’initiation et une phase d’amplification, phases que l’on peut suivre grâce à des marqueurs biochimiques, et enfin une phase de résolution qui fait intervenir des systèmes de réparation qui, s’ils sont efficaces, permettent la reconstitution tissulaire totale. Dans le cas contraire, la RI persiste sous forme chronique. Actuellement, cette phase de réparation n’est pas réellement prise en compte par elle-même : en effet, on se contente de suivre le retour à la normale des marqueurs biochimiques témoins de la RI aiguë. À moyen terme, des axes de recherche devraient se développer dans le cadre de l’étude de la physiopathologie de la réaction inflammatoire : l’identification de marqueurs biochimiques plus sensibles de la RI aiguë, de marqueurs de la phase de réparation et de marqueurs spécifiques de chaque milieu biologique.

3.5.1. Identifier des marqueurs biochimiques plus sensibles et plus spécifiques de l’inflammation aiguë proprement dite ■ Dosage des cytokines

L’implication des cytokines dans la RI est très complexe : il faut distinguer l’action des cytokines pro-inflammatoires (IL-1, TNF-α, IL-6 et IL-8) du groupe des cytokines anti-inflammatoires (IL-4, IL10, IL-13 et TGF-β). Par technique ELISA, on dose toutes les cytokines et les récepteurs solubles des cytokines en recherche, mais il faudra à l’avenir standardiser les techniques, le recueil et le traitement des échantillons pour interpréter les résultats et surtout établir l’intérêt de leur dosage sérique en pratique clinique. Toutefois la détermination de certaines cytokines telles que l’interleukine-6 ou l’interleukine-8 montrent des résultats prometteurs dans l’exploration des infections materno-fœtales précoces. Le développement de techniques multiplex permettant la mesure simultanée de plusieurs marqueurs sur un très petit volume d’échantillon de sérum (6 à 40 marqueurs sur 10 à 50 μL de sérum) pourrait trouver son indication en néonatalogie. ■ Dosage des médiateurs lipidiques

En recherche, il est également possible de doser en routine la concentration de certains médiateurs de l’inflammation comme la prostaglandine E2, le thromboxane B2, le LTC4, mais également l’activité d’enzymes telles que la cyclooxygénase-2… à partir de cultures cellulaires. Mais ces médiateurs ayant une durée de vie très courte et une activité locale, il est encore difficile de les doser dans le sang et surtout d’interpréter les résultats obtenus.

109

4557_2_.book Page 110 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

■ Combinaisons de marqueurs

La combinaison de plusieurs marqueurs de l’inflammation permet d’améliorer la sensibilité et la spécificité pour diagnostiquer une infection (Kofoed et al., 2007).

3.5.2. Identifier des marqueurs de la phase de réparation La RI aiguë est limitée dans le temps par des systèmes de contrôle qui se mettent en place au cours du développement de la RI aiguë. Parmi les facteurs impliqués, on trouve : – des composés qui limitent la RI : antiprotéases, systèmes antiradicalaires, cytokines anti-inflammatoires ; – des facteurs de croissance produits par différentes cellules : vascular endothelial growth factor (VEGF) (cellules endothéliales), epidermal growth factor (EGF) (fibroblastes et kératinocytes), fibroblast growth factor (FGF) (fibroblastes), platelet-derived growth factor (PDGF) (plaquettes). Les fibroblastes synthétisent des composants de la matrice extra-cellulaire comme le collagène, la fibronectine, les protéoglycannes. Enfin, les macrophages et les cellules endothéliales produisent des facteurs angiogéniques qui favorisent une régénération vasculaire. Parmi tous ces facteurs, certains pourraient constituer des marqueurs biochimiques de la phase de résolution si les variations de leurs concentrations sériques étaient suffisamment élevées et spécifiques de cette phase.

3.5.3. Marqueurs biochimiques présents dans d’autres milieux biologiques ■ Selles

Le développement de marqueurs fécaux non invasifs est un secteur en évolution rapide car il permet d’évaluer par exemple le degré d’infiltration inflammatoire de la muqueuse digestive. La calprotectine (Kapel et al., 2004) est libérée des polynucléaires neutrophiles et des monocytes/macrophages lors de leur activation ou de leur apoptose. La mesure de la concentration fécale en calprotectine pourrait permettre d’évaluer le degré de sévérité des colites inflammatoires chez l’adulte et chez l’enfant. ■ Liquide synovial

L’analyse cytologique et biochimique conventionnelle du liquide synovial permet de distinguer des pathologies articulaires inflammatoires et non inflammatoires. Parmi les arthrites (pathologies inflammatoires), l’analyse du liquide synovial ne permet pas de diagnostic précis en dehors des arthrites septiques où le germe a pu être identifié en culture. Le liquide synovial contient un grand nombre de protéines provenant du tissu synovial, du cartilage et du sérum. Son analyse protéomique permet d’identifier des marqueurs protéiques plus spécifiques de chaque pathologie notamment de la polyarthrite rhumatoïde (PR) et de l’arthrose. Si ces données sont vérifiées, elles permettraient un diagnostic différentiel précoce avec ainsi une prise en charge thérapeutique optimisée.

110

Les marqueurs protéiques spécifiques de la PR sont : « calgranulin B », « calgranulin C », « serum amyloïde A (SAA) » et « myeloid-related protein 8 ». Dans l’arthrose, les marqueurs potentiels sont « trappin-2 » et l’anticorps anti-triosephosphate isomérase (TPI) (Hu et al., 2006). ■ Liquide broncho-alvéolaire (LBA) et liquide d’expectoration induite

L’expectoration induite permet d’évaluer une inflammation bronchique. Ce test consiste à faire expectorer un sujet à l’aide d’une nébulisation d’une solution saline hypertonique. L’expectoration recueillie contient des cellules d’origine bronchique et des médiateurs de l’inflammation. Par exemple, dans l’asthme professionnel, l’inflammation bronchique peut être évaluée par l’expectoration induite dans laquelle on peut compter le nombre et le pourcentage de polynucléaires éosinophiles et neutrophiles ainsi que la concentration en IL-8, myéloperoxidase et éotaxine, ce dernier composé étant un facteur chimiotactique pour les polynucléaires éosinophiles dans une situation aiguë mais non chronique (Lemière et Malo, 2006). Cette méthode améliore la sensibilité et la précision du diagnostic. L’analyse protéomique comparative du sérum et du LBA montre que certaines protéines sont plus abondantes dans le LBA suggérant une production spécifique dans les voies aériennes. Ces protéines pourraient être des marqueurs biochimiques spécifiques des maladies pulmonaires. Ainsi, les patients souffrant de sarcoïdose, une maladie pulmonaire inflammatoire, ont un profil protéomique du LBA pertubé (Hu et al., 2006). L’analyse du profil protéomique du LBA dans les maladies respiratoires pourrait permettre d’avancer dans la compréhension de la physiopathologie ou avoir un intérêt diagnostique. De nombreuses analyses du profil protéomique ont déjà été réalisées dans le lupus érythémateux systémique, la maladie de Wegener, les pneumonies bactériennes, les cancers pulmonaires…

3.5.4. Nouvelles techniques de grande sensibilité Dans le lupus érythémateux systémique et notamment dans l’atteinte rénale, il est difficile d’évaluer le degré d’activité de la maladie par les examens disponibles en dehors de la biopsie rénale qui est un geste invasif. Mosley et al. (2006) ont réalisé une analyse protéomique des urines de patients souffrant de néphropathie lupique active et inactive, et plusieurs analyses en série chez six patients qui ont eu également une biopsie. Certaines protéines permettent de séparer les néphropathies actives des néphropathies non actives avec une sensibilité et une spécificité de 92 %. Chez les patients biopsiés, le score de régression multiple calculé à partir de l’analyse protéomique des urines permet de prédire une rechute de la maladie beaucoup plus tôt que les marqueurs traditionnels. Tilleman et al. (2005) ont réalisé une analyse protéomique du tissu synovial de différents rhumatismes inflammatoires (spondylarthrites ankylosantes, PR) et du tissu synovial d’arthrose. Le profil protéique obtenu contenant 640 spots permet de séparer spondylarthrites, PR et arthrose. Sinz et al. (2002) avaient obtenu auparavant des résultats identiques avec le plasma et le liquide synovial de PR et d’arthrose.

4557_2_.book Page 111 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Les marqueurs biochimiques de l’inflammation

4 ■■ PRINCIPALES ÉTIOLOGIES À L’ORIGINE DU SYNDROME INFLAMMATOIRE

4.1.

Pathologies infectieuses

La plupart des infections aiguës bactériennes peuvent être responsables d’un syndrome inflammatoire. Les infections chroniques s’accompagnent d’un syndrome inflammatoire comme la tuberculose sous toutes ses formes, l’endocardite subaiguë, les foyers infectieux pulmonaires, urinaires, digestifs, ORL, dentaires, gynécologiques, osseux ou hépato-biliaires.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

4.2.

Les maladies systémiques

Elles sont pour la plupart accompagnées d’un syndrome inflammatoire (Kahn et al., 2000 ; COFER, 2005) : – les vascularites comme la maladie de Horton ou la périartérite noueuse ; – les connectivites auto-immunes comme le lupus érythémateux systémique et les rhumatismes inflammatoires chroniques comme la polyarthrite rhumatoïde. Dans ces pathologies, la recherche des autoanticorps est courante mais actuellement il n’existe pas de techniques standardisées et les résultats dépendent des techniques utilisées. D’autre part, la spécificité et la sensibilité des autoanticorps ne sont jamais parfaites. Enfin, la concentration des autoanticorps n’est en général pas corrélée à l’activité de la maladie. Dans le diagnostic du lupus érythémateux systémique, on recherche des anticorps antinucléaires comme les anticorps antiADN natif, anti-antigènes nucléaires solubles (anti-ECT ou antiENA). La présence d’anticorps anti-ADN natif étant un marqueur de l’activité de la maladie, il est justifié de renouveler ce dosage. Dans le diagnostic du syndrome de Gougerot-Sjögren, on recherche les anticorps anti-nucléaires et les anticorps anti-antigènes nucléaires solubles de type SSA (Ro) et SSB (La). Dans le diagnostic de la PR, on dispose de deux types d’anticorps. Les facteurs rhumatoïdes représentent le seul marqueur biologique retenu à ce jour par l’American College of Rheumatology mais leur absence ne permet pas d’éliminer le diagnostic car leur sensibilité ne dépasse pas 80 %. Leur spécificité n’est pas bonne car ils peuvent être présents dans de nombreuses autres affections : lupus érythémateux systémique, Gougerot-Sjögren, connectivites mixtes, hépatites chroniques, cryoglobulinémies… De plus, la positivité peut être tardive dans l’évolution de la PR.

Les anticorps anti-protéines ou peptides citrullinés, appelés anti-CCP (la source antigénique est constituée de peptides cycliques citrullinés), sont des marqueurs plus précoces de la PR et sont souvent détectés (30 % des cas) avant le diagnostic de la maladie et en l’absence des facteurs rhumatoïdes. Leur spécificité pour la PR est beaucoup plus élevée que les facteurs rhumatoïdes car elle approche 95 %. Ils sont utilisés en pratique clinique courante. Ils semblent également avoir une bonne valeur pronostique car des concentrations élevées sont associées aux formes les plus graves.

4.3.

Les pathologies néoplasiques

La maladie de Hodgkin et les lymphomes malins non hodgkiniens s’accompagnent souvent d’un syndrome inflammatoire. Environ un cancer sur deux est associé à un syndrome inflammatoire biologique : il s’agit surtout des cancers du poumon et du rein et des cancers digestifs.

4.4.

Les autres causes

– maladies cardiovasculaires : thromboses veineuses profondes, – maladies intestinales inflammatoires comme la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique.

CONCLUSION La découverte d’un syndrome inflammatoire a plusieurs intérêts : – orientation vers une maladie infectieuse, inflammatoire ou néoplasique dans certaines situations de diagnostic difficile (altération de l’état général, fièvres prolongées, arthralgies inflammatoires, amaigrissement, asthénie…) ; – suivi de l’efficacité de certains traitements. Le choix des marqueurs biochimiques de l’inflammation doit se faire en fonction du contexte clinique, et la normalisation des marqueurs permet de s’assurer du contrôle de l’infection ou de l’inflammation par le traitement : – intérêt des marqueurs biochimiques PCT-CRP-orosomucoïde (ou fibrinogène) dans le diagnostic des infections bactériennes néonatales ou post-opératoires et dans le suivi thérapeutique de ces infections ; – intérêt de la CRP comme facteur de risque cardiovasculaire ; – intérêt parfois du dosage de la CRP comme facteur pronostique de certaines maladies comme le myélome ou la PR.

Remerciements Les auteurs remercient Madame le Docteur Monique DEHOUX, Praticien hospitalier, Laboratoire de Biochimie A, Hôpital Bichat-Claude Bernard, Paris, pour ses documents sur l’épidémiologie des syndromes septiques. Nous remercions également Monsieur le Professeur Patrice VIROT, Chef de service de Cardiologie, CHRU de Limoges, Monsieur le Professeur Philippe VIGNON, service de Réanimation, CHRU de Limoges, et Monsieur le docteur Didier BORDERIE, service de Biochimie, Hôpital Cochin – APHP, pour leur aide précieuse et efficace.

111

4557_2_.book Page 112 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Références bibliographiques Aikawa N, Fujishima S, Endo S, Sekine I, Kogawa K, Yamamoto Y, Kushimoto S, Yukioka H, Kato N, Totsuka K, Kikuchi K, Ikeda T, Ikeda K, Harada K, Satomura S (2005). Multicenter prospective study of procalcitonin as an indicator of sepsis. J Infect Chemother, 11 : 152-159. Annane D (2006). Place de la procalcitonine dans la stratégie diagnostique et thérapeutique du sepsis. Réanimation, 15 : S291-S294. Assicot M, Gendrel D, Carsin H, Raymond J, Guilbaud J, Bohuon C (1993). High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection. Lancet, 341 : 515-518. Bard RL, Rubenfire M, Eagle K, Clarke NS, Brook RD (2005). Utility of C-reactive protein measurement in risk stratification during primary cardiovascular disease prevention. Am J Cardiol, 95 : 1378-1379. Bastard JP, Maachi M, Lagathu C, Kim MJ, Caron M, Vidal H, Capeau J, Feve B (2006). Recent advances in the relationship between obesity, inflammation, and insulin resistance. Eur Cytokine Netw, 17 : 4-12. Becker KL, Nylén ES, White JC, Müller B, Snider Jr RH (2004). Procalcitonin and the calcitonin gene family of peptides in inflammation, infection, and sepsis : a journey from calcitonin back to its precursors. J Clin Endocrinol Metab, 89 : 1512-1525. Christ-Crain M, Stolz D, Bingisser R, Müller C, Miedinger D, Huber PR, Zimmerli W, Harbarth S, Tamm M, Müller B (2006). Procalcitonin guidance of antibiotic therapy in community-acquired pneumonia. A randomized trial. Am J Resp Crit Care Med, 174 : 84-93. Clec’h C, Ferriere F, Karoubi P, Fosse JP, Cupa M, Hoang P, Cohen Y (2004). Diagnostic and pronostic value of procalcitonin in patients with septic shock. Crit Care Med, 32 : 1166-1169. COFER (Collège Français des Enseignants en Rhumatologie) (2005). Rhumatologie. Masson, Paris. Devulder B, Hatron PY, Hachula E (2002). Médecine interne. Masson, Paris. Dupuy AM, Terrier N, Sénécal L, Morena M, Leray H, Canaud B, Cristol JP (2003). La CRP est-elle plus qu’un marqueur de l’inflammation ? Néphrologie, 24 : 337-341. Godeau P, Herson S, Piette JC (2004). Traité de Médecine. MedecineSciences Flammarion, Paris. Hausfater P, Juillien G, Madonna-Py B, Haroche J, Bernard M, Riou B (2007). Serum procalcitonin measurement as diagnostic and prognostic marker in febrile adult patients presenting to the emergency department). Critical Care, 11 : R60. Hochepied T, Berger FG, Baumann H, Libert C (2003). α1-acid glycoprotein : an acute phase protein with inflammatory and immunomodulating properties. Cytokine & Growth Factor Reviews, 14 : 25-34. Hu S, Loo JA, Wong DT (2006). Human body fluid proteome analysis. Proteomics, 6 : 6326-6353. Kahn HF, Peltier AP, Meyer O, Piette JC (2000). Maladies et syndromes systémiques. Medecine-Sciences Flammarion, Paris.

112

Kapel N, Barbot L, Gobert JG (2004). Physiopathologie digestive et coprologie fonctionnelle. Les nouveaux marqueurs disponibles en coprologie fonctionnelle et perspectives. Ann Pharm Fr, 62 : 371375. Kofoed K, Andersen O, Kronborg G, Tvede M, Petersen J, EugenOlsen J, Larsen K (2007). Use of plasma C-reactive protein, procalcitonin, neutrophils, macrophage migration inhibitory factor, soluble urokinase-type plasminogen activator receptor and soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in combinaison to diagnose infections : a prospective study. Crit Care, 11 : R38. Lemière C, Malo JL (2006). Use of induced sputum in the investigation of occupational asthma. Med Sci (Paris), 22 : 595-600. Mosley K, Tam FWK, Edwards RJ, Crozier J, Pusey CD, Lightstone L (2006). Urinary proteomic profiles distinguish between active and inactive lupus nephritis. Rheumatology, 45 : 1497-1504. Nash DT (2005). Relationship of C-reactive protein, metabolic syndrome and diabetes mellitus : potential role of statins. J Natl Med Assoc, 97 : 1600-1607. Schröder J, Staubach KH, Zabel P, Stüber F, Kremer B (1999). Procalcitonin as a marker of severity in septic shock. Langenbeck’s Arch Surg, 384 : 33-38. Shah SH, Newby LK (2003). C-reactive protein : a novel marker of cardiovascular risk. Cardiol Rev, 11 : 169-179. Sjoholm A, Nystrom T (2006). Inflammation and the etiology of type 2 diabetes. Diabetes Metab Res Rev, 22 : 4-10. Simon L, Gauvin F, Amre DK, Saint-Louis P, Lacroix J (2004). Serum procalcitonin and C-reactive protein levels as markers of bacterial infection : a systematic review and meta-analysis. Clin Infect Dis, 39 : 206-217. Sinz A, Bantscheff M, Mikkat S, Ringel B, Drynda S, Kekow J, Thiesen HJ, Glocker MO (2002). Mass spectrometric proteome analyses of synovial fluids and plasmas from patients suffering from rheumatoid arthritis and comparison to reactive arthritis or osteoarthritis. Electrophoresis, 23 : 3445-3456. Tilleman K, Van Beneden K, Dhondt A, Hoffman I, De Keyser F, Veys E, Elewaut D, Deforce D (2005). Chronically inflamed synovium from spondyloarthropathy and rheumatoid arthritis investigated by protein expression profiling followed by tandem mass spectrometry. Proteomics, 5 : 2247-2257. Torres JL, Ridker PM (2003). Clinical use of high sensitivity C-reactive protein for the prediction of adverse cardiovascular events. Curr Opin Cardiol, 18 : 471-478. Viallon A, Zeni F, Lambert C. Pozzetto B, Tardy B, Venet C, Bertrand JC (1999). High sensitivity and specificity of serum procalcitonin levels in adults with bacterial menigitis. Clin Infect Dis, 28 : 13131316. Yeh ET (2005). High-sensitivity C-reactive protein as a risk assessment tool for cardiovascular disease. Clin Cardiol, 28 : 408-412.

4557_2_.book Page 113 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

8 Marqueurs d’oxydation des biomolécules et systèmes de défense antioxydants Dominique Bonnefont-Rousselot, Jean-Louis Beaudeux, Patrice Thérond

1 ■■ RAPPELS PHYSIOLOGIQUES ET PHYSIOPATHOLOGIQUES 2 ■■ MARQUEURS BIOCHIMIQUES DE L’OXYDATION DES LIPIDES, DES PROTÉINES ET DES ACIDES NUCLÉIQUES

2.1. 2.2. 2.3. 2.4.

Schéma général Marqueurs de l’oxydation des lipides Marqueurs de l’oxydation des protéines Marqueurs de l’oxydation des acides nucléiques

3 ■■ SYSTÈMES DE DÉFENSE ANTIOXYDANTS 3.1. 3.2.

Systèmes enzymatiques Systèmes non enzymatiques

4 ■■ STRATÉGIE D’UTILISATION DES BIOMARQUEURS © Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

5 ■■ BIOMARQUEURS EN PROSPECTIVE Références bibliographiques

113

4557_2_.book Page 114 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4557_2_.book Page 115 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs d’oxydation des biomolécules et systèmes de défense antioxydants

1 ■■ RAPPELS PHYSIOLOGIQUES

2 ■■ MARQUEURS BIOCHIMIQUES DE L’OXYDATION DES LIPIDES,

ET PHYSIOPATHOLOGIQUES Le stress oxydant est un état caractérisé par un déséquilibre entre la production des espèces réactives de l’oxygène et les capacités antioxydantes de l’organisme (enzymes antioxydantes et systèmes antioxydants non enzymatiques) (Delattre et al., 2005). Cet état est observé physiologiquement au cours du vieillissement et il accompagne également de nombreuses pathologies (athérosclérose, diabète, maladies neurodégénératives…). Il se traduit par l’accumulation de produits d’oxydation des biomolécules (lipides, protéines, acides nucléiques) au niveau plasmatique et au niveau cellulaire, ce qui permet d’évaluer ce stress oxydant par la détermination de ces produits d’oxydation. Ce chapitre sera consacré aux marqueurs de l’oxydation des cibles biologiques, et aux principaux systèmes de défense (enzymatiques et non enzymatiques). Les marqueurs de stress oxydant doivent pouvoir être mesurés en tant qu’indicateurs de processus biologiques physiologiques, de processus pathologiques ou de réponses pharmacologiques à une intervention thérapeutique. En ce qui concerne les marqueurs d’oxydation, il s’agit généralement de biomolécules dont la structure chimique a été modifiée par les espèces réactives de l’oxygène (ERO), et éventuellement par les espèces réactives de l’azote (ERN), on parle alors de stress nitrosant. Ces marqueurs doivent pouvoir être utilisés pour apprécier de façon fiable l’état d’oxydation chez l’homme, afin de permettre d’élucider les mécanismes physiopathologiques d’une attaque oxydante et d’orienter éventuellement vers le choix d’un traitement dans les stades précoces d’une maladie, ou d’optimiser les stratégies thérapeutiques au cours de pathologies induites par un stress oxydant (Dalle-Donne et al., 2006 ; Ziech et al., 2010).

DES PROTÉINES ET DES ACIDES NUCLÉIQUES

2.1.

Schéma général

L’attaque des cibles cellulaires dans un contexte de stress oxydant peut être schématisée selon les espèces moléculaires concernées, à savoir lipides, protéines, et acides nucléiques (figure 1).

2.2.

Marqueurs de l’oxydation des lipides

L’oxydation des lipides polyinsaturés en présence d’oxygène est connue sous le nom de peroxydation lipidique (figure 2). L’initiation est due à l’attaque d’une espèce radicalaire suffisamment réactive pour arracher un hydrogène à partir d’un groupement méthylène (- CH2-) situé en α d’une double liaison (hydrogène plus labile), conduisant à la formation d’un radical centré sur l’atome de carbone (-•CH-). Ce radical se stabilise par réarrangement intramoléculaire en formant un diène conjugué capable de réagir facilement avec l’oxygène pour donner un radical peroxyle ROO •. Ce dernier peut à son tour arracher un hydrogène d’une autre molécule d’acide gras adjacente, créant ainsi une réaction en chaîne (propagation) ; la combinaison du radical peroxyle avec l’atome d’hydrogène conduit à la formation d’un hydroperoxyde lipidique (ROOH). Les radicaux peroxyles peuvent aussi conduire à des peroxydes cycliques. Des phases terminales de dégradation et coupures peuvent conduire à des aldéhydes, parmi lesquels le dialdéhyde malonique (ou malondialdéhyde ou MDA). La peroxydation

Stress oxydant ERO et/ou ERN

Attaque des cibles cellulaires

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Lipides

• Hydroperoxydes (ROOH) (produits précoces d’oxydation des AGPI)

• Aldéhydes (RCHO) (produits précoces d’oxydation des AGPI)

Protéines

Acides nucléiques

• Protéines carbonylées • Produits de glycooxydation → produit de glycation avancée (AGE)

• Bases oxydées

• Oxystérols (produits d’oxydation du cholestérol)

• Isoprostanes (produits terminaux d’oxydation de l’acide arachidonique)

• LDL oxydées

Figure 1

■

Représentation schématique de l’origine des marqueurs d’oxydation des cibles biologiques au cours du processus de stress

oxydant. AGE : produit de glycation avancée ; ERO : espèces réactives de l’oxygène ; ERN : espèces réactives de l’azote ; LDL : lipoprotéines de basse densité ; R : résidu d’acide gras.

115

4557_2_.book Page 116 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

COOH Acide gras poly-insaturé RH (exemple : acide arachidonique)

H

COOH Radical stabilisé par résonance R° (diène conjugué) O2

+ RH

RO2 Radical R

R

OOH

O

O

COOH ROOH Hydroperoxyde

et/ou

Peroxyde cyclique

Métaux de transition Produits de décomposition Éthane Aldéhydes Isoprostane

RO Radical alcoxyle

Figure 2

■

Schéma de la peroxydation lipidique de l’acide arachidonique.

lipidique des lipides membranaires peut créer des altérations des propriétés biologiques de la membrane telles que le degré de fluidité mais aussi l’inactivation de récepteurs liés à la membrane ou d’enzymes. Les produits de peroxydation lipidique, en particulier les produits terminaux stables, tels que des aldéhydes α, β-insaturés (MDA, 4-hydroxynonénal ou HNE) ou les isoprostanes, peuvent être mesurés dans le plasma et l’urine en tant que marqueurs du stress oxydant. Il faut noter que les aldéhydes constituent des produits stables comparativement aux espèces radicalaires, susceptibles de diffuser hors de la cellule et d’attaquer des cibles relativement éloignées de leur lieu de formation primaire ; ils peuvent ainsi représenter des seconds messagers cytotoxiques (Dalle-Donne et al., 2006). La mise à disposition de méthodes sensibles et exactes pour mesurer les produits de peroxydation lipidique est essentielle ; à ce titre, des améliorations technologiques voient le jour, en particulier concernant les oxystérols, les F2-isoprostanes et les phospholipides oxydés, grâce à la CPG ou la CLHP couplée à la spectrométrie de masse, mais aussi à des immunoanalyses permettant de doser le 4-hydroxynonénal (Spickett et al., 2010).

116

2.2.1. Hydroperoxydes La première phase de la peroxydation lipidique est caractérisée par la présence des hydroperoxydes que l’on appelle les « produits primaires » de la peroxydation lipidique. Ces molécules oxydées peuvent se décomposer en « produits secondaires » et « terminaux » pour former des endoperoxydes cycliques et finalement des aldéhydes comme le malondialdéhyde, le 4-hydroxynonénal ou des isoprostanes. Parmi les lipides, les acides gras libres, les phospholipides, les triglycérides, les esters de cholestérol et le cholestérol peuvent conduire à la formation d’hydroperoxydes. ■ Principe analytique et interférences

De nombreuses méthodes peuvent être utilisées pour déterminer la concentration de ces lipides oxydés. Les hydroperoxydes peuvent être mesurés par la méthode iodométrique. Cependant, cette méthode n’est pas applicable aux milieux biologiques car de nombreuses biomolécules non lipidiques sont susceptibles

4557_2_.book Page 117 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Marqueurs d’oxydation des biomolécules et systèmes de défense antioxydants

d’oxyder les iodures. De plus, cette méthode exige de grands volumes de solvants organiques. Une autre méthode s’appuie quant à elle sur l’oxydation des ions ferreux en ions ferriques à pH acide en présence de xylénol orange (acide diacétique-o-crésolsulfonephtaléine-3,3'-bisméthylimino). Gay et Gebicki ont publié en 2003 une méthode permettant de mesurer séparément les hydroperoxydes issus des lipides et des protéines. Ils proposent d’extraire les lipides de l’échantillon biologique (sérum ou cellules) avec un mélange chloroforme, méthanol (2 : 1 ; v/v) contenant du butylhydroxytoluène (BHT). Les hydroperoxydes sont mesurés sur l’extrait obtenu. L’inconvénient de cette méthode est qu’elle nécessite une étape de centrifugation pour séparer la phase organique du précipité de protéines, interdisant ainsi toute automatisation. En 2004, Arab et Steghens ont proposé une variante sans phase d’extraction des lipides et ne nécessitant que 10 μL de plasma (prélevé sur héparine et non hémolysé) ou de sérum. Récemment, cette méthode a été appliquée à la détermination des hydroperoxydes de phosphatidylcholine en solution ou dans des membranes. Enfin, parmi ces méthodes d’oxydo-réduction, Auerbach et al. ont décrit en 1992 une méthode basée sur l’oxydation du bleu de leucométhylène en bleu de méthylène en présence d’hémoglobine. D’autres méthodes utilisent des séparations chromatographiques (CLHP) couplées à des détections UV [mais dans ce cas on ne peut pas faire la différence entre les lipides natifs non oxydés, les hydroperoxydes et les formes réduites (hydroxydes)], électrochimiques, fluorimétriques, de chimiluminescence ou de spectrométrie de masse. La spectrométrie de masse pouvant aussi être couplée à la chromatographie en phase gazeuse. En règle générale il est nécessaire de séparer au préalable les lipides du reste des molécules non lipidiques par des phases d’extraction utilisant des solvants organiques. Ce prétraitement des échantillons limitera les interférences analytiques et rendra la mesure plus spécifique. Une des méthodes les plus sensibles pour déterminer la concentration des hydroperoxydes lipidiques est la CLHP couplée à la chimiluminescence (Thérond et al., 1993). La CLHP permet dans un premier temps de séparer, en fonction de leur plus grande hydrophilie, les hydroperoxydes des autres lipides non oxydés puis de les faire réagir en sortie de colonne avec une molécule contenant du fer (microperoxydase). Cette enzyme décompose les hydroperoxydes présents en radicaux peroxyles qui réagiront à leur tour avec une sonde de chimiluminescence émettant des photons (luminol ou isoluminol). La quantification des hydroperoxydes est le point le plus délicat car l’intensité de luminescence dépend de plusieurs facteurs : la nature chimique des hydroperoxydes (phospholipides, esters de cholestérol, acides gras non estérifiés, cholestérol), le type de sonde, la nature du complexe de fer (microperoxydase ou cytochrome c), le débit du réactif de chimiluminescence et le volume mort de la cellule de mélange à la cellule de lecture. Il est donc indispensable de réaliser au préalable des essais avec des hydroperoxydes étalons de différentes natures afin de trouver les meilleures conditions expérimentales pour obtenir la meilleure sensibilité. La diphénylpyrénylphosphine (DPPP) est une autre molécule qui réagit avec les hydroperoxydes pour donner un DPPP oxyde

très fluorescent. Cette méthode peut être appliquée aux cultures cellulaires et aux tissus. ■ Valeurs usuelles

Il existe une grande variabilité de la concentration plasmatique des hydroperoxydes lipidiques chez l’homme « sain », allant de la picomole à la micromole. Ces variations s’expliquent par le mode de préparation des échantillons ou la méthode employée. Dans le plasma, chez l’homme, la concentration d’hydroperoxydes exprimés en acide hydroxyoctadécadiénoïque (HODE) est de 207 ± 15 nmol/L en GS/MS (Yoshida et Niki, 2004). Ayaori et al. (2000) présentent des concentrations plasmatiques d’hydroperoxydes totaux, dosés par la méthode au bleu de leucométhylène, de 15,6 ± 6,4 nmol/L ou 56,6 ± 28,3 nmol/g de lipides. ■ Indications et limites

L’acide linoléique et le cholestérol sont très abondants dans le plasma et l’attaque radicalaire de ces molécules aboutit à la formation de produits primaires de la peroxydation lipidique, respectivement l’acide hydroperoxyoctadécadiènoïque (HPODE) et le 7hydroperoxycholestérol. Des auteurs ont proposé de déterminer la concentration totale en HODE et 7-hydroxycholestérol comme marqueur du stress oxydant in vivo. Les échantillons biologiques (plasma, urines, tissus, érythrocytes) sont d’abord réduits par le borohydrure de sodium puis saponifiés avec de la potasse. Le borohydrure de sodium permet la réduction des hydroperoxydes en hydroxydes (HODE et 7-hydroxycholestérol) et la saponification libère les acides gras estérifiés sur les phospholipides, les esters de cholestérol et les triglycérides. On obtient donc les hydroxydes des lipides totaux des échantillons biologiques ainsi traités (HODE et 7-hydroxycholestérol totaux). ■ Apport dans l’investigation bioclinique

L’utilisation de tests non invasifs pour apprécier le statut oxydant d’un patient en situation normale ou pathologique a pour but de donner une image globale du niveau du stress oxydant en mesurant des marqueurs dans le plasma, les urines, la salive et l’air expiré. Une des principales limites de ces tests dans ces milieux biologiques est qu’ils ne renseignent pas sur l’origine tissulaire du stress oxydant. En effet, une augmentation de ces marqueurs dans le plasma chez un patient peut être la conséquence d’une augmentation du stress oxydant dans tous les tissus, dans certains tissus ou spécifiquement dans le système vasculaire. Pour essayer de répondre à cette question, Argüelles et al. (2004) ont mesuré simultanément deux marqueurs principaux de la peroxydation lipidique (hydroperoxydes lipidiques (HL) et substances réagissant avec l’acide thiobarbiturique (TBARS)) et un marqueur de l’oxydation des protéines (protéines carbonylées) dans le plasma et les tissus de rats soumis ou non à un régime riche en métaux (fer, manganèse). Un test global de protection contre le stress oxydant, le pouvoir antioxydant total du plasma (PATP), a également été utilisé. Les principales conclusions de ce travail sont les suivantes : – Les TBARS plasmatiques ne reflètent pas le niveau du stress oxydant dans les tissus mais uniquement celui du plasma. De plus, leur concentration plasmatique n’est pas spécifique de la seule attaque des lipides, d’autres biomolécules pouvant

117

4557_2_.book Page 118 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

interférer. Les hydroperoxydes lipidiques ne représenteraient qu’environ 30 % des TBARS. – Comme les TBARS, les HL ne sont pas spécifiques. Cependant leur augmentation plasmatique est parallèle à celle des tissus. – Les protéines carbonylées sont un ensemble de produits oxydés incomplètement définis et comme pour les TBARS elles ne reflètent pas le stress oxydant tissulaire. Une augmentation du PATP n’est pas non plus le témoin d’une protection plus importante de tous les tissus contre un stress oxydant. D’une manière générale on observe qu’il n’y a pas de corrélation entre les marqueurs lipidiques (TBARS, HL) et les marqueurs protéiques (protéines carbonylées) dans un même milieu biologique. En conclusion, la mesure d’un stress oxydant dans la circulation générale (plasma) doit être interprétée avec la plus grande prudence car elle ne reflète pas systématiquement la situation au niveau des tissus. Des travaux ont démontré que la détermination des hydroperoxydes lipidiques plasmatiques pouvait constituer un nouveau marqueur dans différentes situations pathologiques. Par exemple, Adachi et al. ont montré que les PCOOH (hydroperoxydes de la phosphatidylcholine) plasmatiques mesurés par CLHP et chimiluminescence étaient significativement augmentés chez des patients alcooliques et corrélés positivement avec la γGT, le cholestérolHDL, l’alcoolémie et les triglycérides. De plus, une abstinence de six semaines permet une diminution significative de ces concentrations de PCOOH (88,0 ± 10,5 nmol/L chez les alcooliques avant sevrage, 22,8 ± 3,1 nmol/L après sevrage) (Adachi et al., 2004).

2.2.2. Aldéhydes, TBARS ■ Origine et réactivité

Le MDA est un cétoaldéhyde produit par décomposition oxydative de lipides insaturés, comme produit secondaire du métabolisme de l’acide arachidonique (figure 3). L’excès de MDA produit dans un tissu peut se combiner aux groupements aminés libres des protéines (essentiellement les résidus lysines), conduisant à la formation de produits d’addition susceptibles d’altérer les propriétés biologiques des protéines concernées. En outre, les protéines modifiées par le MDA sont immunogènes et peuvent conduire à la formation d’anticorps dirigés en particulier contre les résidus lysines modifiés par le MDA, comme il en a déjà été détecté chez l’homme, notamment en association avec les maladies cardiovasculaires (Stocker et al., 2004).

O

O MDA

OH HNE

Figure 3

118

■

Structures chimiques du MDA et du 4-HNE.

Le 4-hydroxynonénal (4-HNE) est un aldéhyde (figure 3) formé par l’attaque radicalaire d’acides gras polyinsaturés (AGPI) ω-6 (acides arachidonique, linoléique et linolénique) et il est considéré comme un second messager toxique des ERO (Esterbauer et al., 1991 ; Eckl et al., 1993). Le 4-HNE est très réactif vis-à-vis des protéines, et donne en particulier des produits d’addition stables avec His, Lys et Cys ; ces produits d’addition sont aussi dénommés produits de lipoxydation avancée (ALE) et conduisent à l’apparition de groupements carbonyles dans les protéines (Uchida et Stadtman, 1992). ■ Principe analytique

La plupart des dosages visant à déterminer la concentration de MDA ont été développés sur la base de sa dérivatisation avec l’acide thiobarbiturique (TBA). La condensation de ces deux molécules donne naissance à un produit facilement dosable par spectrophotométrie en raison de sa forte absorbance. Malheureusement, la spécificité de ce dosage est faible, en raison de la réactivité du TBA avec des composés d’oxydation autres que le MDA (Knight et al., 1988). En outre, le traitement des échantillons biologiques permettant d’obtenir cette réaction de condensation est généralement effectué à haute température (voisine de 100 °C), pouvant ainsi occasionner la génération de produits d’oxydation et entraînant une surestimation des résultats. Afin de minimiser cette oxydation de la matrice, la plupart des méthodes comportent la précipitation des protéines avant la réaction avec le TBA. La première méthode décrite par Yagi (1976) est ainsi menée sur un précipité de lipides et protéines, à 95 °C, en milieu acide, et conduit à la détermination d’un ensemble de « substances réagissant avec l’acide thiobarbiturique » (TBARS : « TBA reactive substances ») et non de MDA à proprement parler. Les concentrations plasmatiques de TBARS obtenues par les méthodes dérivées de celle de Yagi varient de 0 à 50 μmol/L (Esterbauer et al., 1991), ce qui suggère qu’une oxydation des échantillons survient au cours de l’analyse et justifie les critiques relatives à la signification biologique de ce dosage. Bien qu’encore largement utilisé du fait de sa facilité de mise en œuvre, ce test doit donc faire l’objet d’une analyse soigneuse des résultats avant de pouvoir tirer des conclusions. En effet, dans ces conditions, ce test mesure davantage l’oxydabilité des échantillons que leur niveau basal d’oxydation. Par ailleurs, la notion de MDA libre et de MDA lié aux protéines ou aux autres biomolécules, bien que peu de données soient disponibles concernant la signification physiopathologique de ces deux formes, peut être importante à prendre en compte ; les méthodes comportant une hydrolyse acide précipitent la fraction protéique et permettent donc l’estimation du MDA total (en l’absence de cette hydrolyse, seule est évaluée la fraction libre). Il est intéressant de noter que des kits ont été commercialisés (LPO586, Bioxytech ; kit MDA, Sobioda). Dans les dernières années, de nombreuses améliorations de cette technique ont vu le jour (Del Rio et al., 2005), afin notamment d’en accroître la spécificité. Ces méthodes sont ou non basées sur une dérivatisation par le TBA. Parmi les méthodes basées sur cette dérivatisation, la CLHP couplée à une détection UV/visible permet la séparation et l’identification du produit de condensation MDA-TBA (Templar et al., 1999). Dans ces conditions, les valeurs de MDA plasmatique

4557_2_.book Page 119 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs d’oxydation des biomolécules et systèmes de défense antioxydants

obtenues se situent entre 0,1 et 1 μmol/L, bien que le protocole opératoire comporte toujours une incubation à haute température (90 °C). Si l’on veut faire abstraction de la dérivatisation, la méthode proposée par Karatas et al. (2002) ne requiert pas d’autre prétraitement préanalytique de l’échantillon que l’hydrolyse acide conduisant à la précipitation des protéines. Le plasma dépourvu de protéines est ensuite injecté sur une colonne CLHP (détection à 254 nm) ; l’électrophorèse capillaire est également utilisable sans précipitation des protéines (Wilson et al., 1997), avec une sensibilité 10 fois plus grande que la CLHP. Enfin, pour limiter les problèmes liés à l’utilisation du TBA, certaines méthodes proposent une dérivatisation par un autre composé ; c’est le cas par exemple de la méthode de Sim et al. (2003) qui permet de mesurer la concentration de MDA plasmatique par CLHP avec détection UV après réaction avec la 2,4-dinitrophénylhydrazine, ou de la méthode de Steghens et al. (2001) qui utilise le diaminonaphtalène. Cette dernière méthode conduit à des valeurs de MDA total de 0,162 μmol/L chez l’homme et 0,138 μmol/L chez la femme, dont 15 % reviennent à la forme libre. Une méthode plus rapide, plus simple et plus sensible que la classique méthode de Yagi a également été proposée par Conti et al. (1991) ; elle est basée sur une dérivatisation par l’acide diéthylthiobarbiturique en milieu acide, suivie d’une extraction du composé fluorescent par le butanol, et quantification par fluorescence synchrone ; cette méthode évite donc les étapes de précipitation et lavage, et présente une bonne corrélation avec la détermination par CLHP. Il faut également noter l’importance de l’étape préanalytique dans la détermination de la concentration de MDA : en effet, le choix de l’anticoagulant n’est pas anodin puisque par exemple l’EDTA conduit à des concentrations plus basses que le citrate (Suttnar et al., 2001).

Le dosage du 4-HNE est beaucoup moins répandu que celui du MDA en biologie clinique ; toutefois, le 4-HNE peut être mesuré par des méthodes de chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse.

Pour en savoir plus : Free Radicals In Biology and Medicine, Halliwell B and Gutteridge JMC, 3rd Edition, Oxford University Press, New York, 1999.

■ Valeurs fréquentes

Dans le sérum ou le plasma, les valeurs fréquentes varient, nous l’avons vu, avec le type de méthode employée, les premières méthodes utilisées conduisant généralement à des valeurs significativement plus élevées que les méthodes par CHLP (tableau 1). Les méthodes de détection améliorées conduisent à des valeurs comprises entre 0 et 1 μmol/L dans le plasma de sujets sains. Il faut également noter que le choix de l’anticoagulant n’est pas anodin (Suttnar J et al., 2001). Ainsi, l’EDTA conduit à des concentrations plus basses que le citrate. L’urine peut être éventuellement utilisée comme matériel biologique, et les valeurs obtenues sont voisines de 2 μmol MDA/mg créatinine (Agarwal et Chase, 2002). ■ Apport dans l’investigation bioclinique

Des concentrations élevées de MDA ont été observées dans de très nombreuses pathologies, parmi lesquelles le diabète sucré (Slatter et al., 2000), mais aussi la pré-éclampsie (Yoneyama et al., 2002) ou l’asthme (Wood et al., 2003). Des concentrations plasmatiques élevées de TBARS ont été observées dans des maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer ou la sclérose latérale amyotrophique (Barnham et al., 2004 ; Bonnefont-Rousselot et al., 2000a). Au cours d’un stress oxydant élevé (observé dans la polyarthrite rhumatoïde, le lupus, l’insuffisance rénale chronique…), les concentrations sériques de 4-HNE peuvent être multipliées par 3 à 10 comparativement aux concentrations physiologiques (Siems et Grune, 2003).

Pour en savoir plus : Lefèvre G, Beljean-Leymarie M, Beyerle F, Bonnefont-Rousselot D, Cristol JP, Thérond P, Torreilles J. Évaluation de la peroxydation lipidique par le dosage des substances réagissant avec l’acide thiobarbiturique. Ann Biol Clin 1998 ; 56 : 305-319.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Tableau 1 ■ Exemples de variabilité des valeurs moyennes (± écart-type) obtenues selon les méthodologies utilisées et le type d’anticoagulant employé (d’après Del Rio et al., 2005). Référence

Dérivatisation

Méthodologie

MDA (μmol/L)

Anticoagulant

Templar et al., 1999

TBA

Déprotéinization acide, CLHP UV/visible

0,11 ± 0,03

EDTA

Agarwal et Chase, 2002

TBA

CLHP-fluorimétrie

0,69 ± 0,13

Non précisé

Del Rio et al., 2003

TBA

Conditions douces, fluorimétrie

0,112 ± 0,034

EDTA

Karatas et al., 2002

Aucune

Déprotéinisation acide douce, CLHP UV/visible

0,50 ± 0,04

Aucun (sérum)

Wilson et al., 1997

Aucune

Déprotéinisation par l’acétonitrile

Indétectable

Héparine

Sim et al., 2003

DNPH

Déproténisation acide forte, CLHP UV/visible

13,8 ± 1,32

EDTA

0,162 ± 0,051

Héparine

Steghens et al., 2001

Diaminonaphtalène

Déprotéinisation acide forte

119

4557_2_.book Page 120 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Il faut remarquer que les aldéhydes (tout comme les hydroperoxydes) peuvent également provenir de l’alimentation et être excrétés dans l’urine. De ce fait, les mesures de ces composés dans le plasma ou les urines peuvent être perturbées par le régime et ne devraient être utilisées comme marqueurs de peroxydation lipidique de l’organisme que sous un régime bien contrôlé (Draper et al., 2000 ; Wilson et al., 2002).

2.2.3. Oxystérols Les oxystérols sont les produits d’oxydation du cholestérol formés de manière non-enzymatique après attaque radicalaire. Les principaux composés sont le 7β-hydroxycholestérol et le 7-cétocholestérol et proviennent principalement des lipoprotéines de faible densité (LDL). Ces molécules sont des marqueurs potentiels du stress oxydant in vivo et différentes méthodes ont été proposées pour les quantifier. Parmi celles-ci les méthodes chromatographiques liquide haute performance ou gazeuse (CPG) couplées respectivement à la chimiluminescence ou à la spectrométrie de masse sont les plus utilisées. La détermination plasmatique de ces produits est délicate si l’on ne dispose pas de méthodes sensibles comme la CPG/spectrométrie de masse (la simple utilisation de la CPG est insuffisante pour les détecter). Les concentrations plasmatiques des oxystérols chez des sujets « sains » sont de 12,2 ± 7,0 ng/mL pour le 7cétocholestérol et de 4,7 ± 1,3 ng/mL pour le 7β-hydroxycholestérol (Arca et al., 2007). Il est recommandé de mesurer également le cholestérol total afin d’établir le rapport cholestérol oxydé sur cholestérol total comme marqueur du stress oxydant. Des observations similaires ont été faites chez des patients atteints d’hyperlipidémie mixte au niveau plasmatique avec un effet bénéfique d’un traitement par fibrate ou statine. La majorité des études ont été réalisées sur des tissus et utilisent la CPG couplée à la masse. En particulier, le tissu hépatique de patients cirrhotiques contient des concentrations importantes de cholestérol et de 7β-hydroxycholestérol comparées à celles de sujet témoin. Compte tenu des difficultés analytiques que rencontre ce dosage, nous ne développerons pas davantage ce marqueur.

2.2.4. Isoprostanes ■ Origine et réactivité

Parmi les biomarqueurs de stress oxydant, les isoprostanes ont été reconnus comme étant les plus fiables, en particulier les F2isoprostanes (Milne et al., 2007). Ces derniers sont des isoprostanes comportant un noyau prostanique de type F. Ils constituent théoriquement une famille de 64 composés produits in vivo par oxydation radicalaire non enzymatique d’esters de l’acide arachidonique qui sont formés in situ puis clivés et libérés dans la circulation par l’action de phospholipases avant d’être excrétés dans l’urine sous forme d’isoprostanes libres. Ils constituent la classe la plus étudiée d’isoprostanes et, du fait de leur stabilité, permettent une mesure plus juste du stress oxydant. La 8-isoprostaglandine F2α (8-isoPGF2α, figure 4) est un isoprostane excrété dans l’urine chez l’homme et représente l’isoprostane le plus étudié. En fait, une certaine controverse existe sur la formation non enzymatique ou enzymatique de cet isoprostane : en effet, il pour-

120

OH COOH

OH

Figure 4

■

OH

Structure de la 8-isoPGF2α.

rait être aussi formé par action de la cyclooxygénase (Tsikas et al., 2003). Toutefois, on peut considérer que la 8-isoPGF2α et les autres isoprostanes F2α chez l’homme proviennent de la peroxydation radicalaire de l’acide arachidonique présent sous forme estérifiée dans les lipides (Tsikas et al., 2003). ■ Principe analytique

Les isoprostanes ont été dosés dans de nombreux milieux biologiques (plasma, urine, liquide synovial, liquide bronchoalvéolaire, bile…) mais ce sont le plasma et l’urine qui sont les plus couramment utilisés (Basu, 2004 ; Morrow, 2005). Les F2-isoprostanes sont présents dans le plasma sous deux formes : estérifiés à des lipides (forme la plus abondante), et libres ; en revanche, seuls les isoprostanes hydrolysés (donc sous forme libre) sont excrétés dans l’urine (Tsikas et al., 2003). Plusieurs méthodes de dosage sont disponibles (Cracowski et al., 2002 ; Schwedhelm et Boger, 2003 ; Montine et al., 2005). La mesure des F2-isoprostanes et de leurs métabolites est assez délicate et comporte certaines limitations (Schwedhelm et Boger, 2003). Ces composés sont en effet assez stables chimiquement, mais peuvent être métabolisés rapidement une fois libérés dans la circulation, puis éliminés, et disparaissent donc du plasma. Pour le dosage, des méthodes par chromatographie en phase gazeuse ou liquide couplée à la spectrométrie de masse peuvent permettre de déterminer leur concentration dans de nombreux milieux. Des méthodes immunologiques (RIA et ELISA) ont été développées, et certains kits ELISA ont été commercialisés (Morrow, 2005), par exemple la méthode par compétition proposée par Cayman Chemical. Un inconvénient majeur de ces méthodes, bien qu’elles soient d’un accès plus simple que les précédentes, est leur exactitude et leur précision. Peu de données sont disponibles confrontant les résultats obtenus par spectrométrie de masse avec ceux obtenus pas ELISA. La sensibilité et la spécificité varient selon les fabricants. Certains chercheurs ont développé leurs propres immunodosages et ont observé une bonne corrélation avec la spectrométrie de masse (Wang et al., 1995). Dans tous les cas, l’utilisation d’une méthode ELISA pour le dosage plasmatique des isoprostanes nécessite une purification préalable des échantillons sur colonne (purification non nécessaire pour un dosage urinaire). La prise en charge préanalytique des prélèvements doit être rigoureuse, afin d’éviter une formation artéfactuelle d’isoprostanes au cours du stockage et du traitement des échantillons (congélation immédiate des échantillons à – 80 °C sous atmosphère d’azote et éventuellement addition d’antioxydants tels que le butylhydroxytoluène) (Schwedhelm et Boger, 2003). En effet, les

4557_2_.book Page 121 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs d’oxydation des biomolécules et systèmes de défense antioxydants

échantillons plasmatiques contiennent de grandes quantités d’acide arachidonique, essentiellement sous forme estérifiée aux phospholipides membranaires. En outre, afin de distinguer les isoprostanes présents sous forme « libre » et sous forme estérifiée, une hydrolyse alcaline est nécessaire. ■ Valeurs fréquentes

La concentration de 8-isoPGF2α dans le plasma des sujets sains est de 40-100 pg/mL. Dans l’urine, les valeurs usuelles rapportées à la concentration urinaire de créatinine sont comprises entre 50 et 100 ng/mmol créatinine.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

■ Apport dans l’investigation bioclinique

Les isoprostanes constituent actuellement les meilleurs marqueurs de stress oxydant au cours de diverses situations cliniques, telles que l’inflammation aiguë et chronique, l’ischémiereperfusion, le diabète de type 2, l’athérosclérose, différents types de cancer (Cracowski et al., 2002 ; Basu, 2004 ; Montuschi et al., 2004 ; Montine et al., 2005 ; Morrow 2005 ; Akbulut et al., 2003 ; Nobecourt et al., 2005). Leur concentration plasmatique a même été évoquée comme marqueur potentiel du risque cardiovasculaire (Stojiljkovic et al., 2002) ; récemment, la 8-isoPGF2α urinaire, mesurée par GC-MS/MS, a été proposée comme marqueur de risque sensible et indépendant chez des patients coronariens, en plus des facteurs de risque connus (diabète sucré, hypercholestérolémie, hypertension, obésité, tabagisme) (Schwedhelm et al., 2004). Les isoprostanes plasmatiques et urinaires sont également augmentés dans la maladie d’Alzheimer, et il a été évoqué que leur concentration pourrait être en partie corrélée avec le degré de dommages cognitifs (Pratico et al., 2000), bien que cela n’ait pas été retrouvé dans d’autres études (Montine et al., 2002). La quantification des isoprostanes dans le plasma ou l’urine constitue un index précis et fiable de stress oxydant. En effet, leur formation in vivo croît en conditions de stress oxydant (Pratico et al., 2004a ; Pratico et al., 2004b ; Morrow 2005). De plus, ce sont des produits stables de la peroxydation lipidique ; la limite de détection du dosage ELISA est de 4 pg/mL (Wood et al., 2000). Leur concentration ne présente pas de variations nycthémérales et n’est pas affectée par le contenu alimentaire en lipides (à l’inverse, comme nous l’avons vu, du dosage des TBARS ou des hydroperoxydes) (Richelle et al., 1999). Pour le dosage urinaire, si des urines de 24 heures sont préférables, il est toutefois possible de doser les isoprostanes sur les urines du matin ou sur des échantillons, la concentration d’isoprostanes étant dans tous les cas rapportée à celle de la créatinine dans le même échantillon (Roberts et al., 2000 ; Basu et Helmersson, 2005). Enfin, il s’agit de produits spécifiques de la peroxydation lipidique, présents en quantités détectables chez les sujets sains, ce qui permet d’établir des valeurs usuelles. L’apport des isoprostanes dans l’investigation bioclinique est d’autant plus important qu’ils doivent être considérés non seulement comme des biomarqueurs, mais aussi comme des « médiateurs » de certaines pathologies, en particulier pulmonaires (Janssen, 2001) ; toutefois, la concentration de la fraction « libre » de 8-isoPGF2α dans le plasma humain, seule fraction active, est inférieure à 10 ng/L (Tsikas et al., 2003), ce qui est faible pour développer une action biologique considérable. L’action

des isoprostanes en tant que médiateurs ferait probablement intervenir des récepteurs proches de ceux du thromboxane A 2 (Comporti et al., 2008). Enfin, la 8-isoPGF2α a été utilisée comme marqueur biochimique stable permettant de suivre la réduction du stress oxydant in vivo après traitement pharmacologique (Troost et al., 2000 ; Fliser et al., 2005).

Pour en savoir plus : Spickett CM, Wiswedel I, Siems W, Zarkovic K, Zarkovic N. Advances in methods for the determination of biologically relevant lipid peroxidation products. Free Radic Res 2010 ; 44 : 1172-1202.

2.2.5. LDL oxydées En relation avec la théorie oxydative de l’athérosclérose, la recherche et le dosage de LDL modifiées ont été proposés comme marqueur du stress oxydant in vivo (pour revue, Fraley et Tsimikas, 2006). Le suivi des concentrations plasmatiques des formes oxydées des LDL peut avoir un intérêt à la fois pour mettre en évidence un processus oxydatif accru (augmentation de la concentration plasmatique par rapport à une population sans pathologie cardiovasculaire par exemple), pour le suivi de l’évolution de la pathologie athéromateuse, mais aussi pour évaluer l’efficacité d’un traitement. Rodenburg a en effet récemment montré que le traitement par une statine induit une augmentation des concentrations plasmatiques des LDL oxydées, traduisant ainsi une augmentation de la clairance pariétale vasculaire de ces lipoprotéines (Rodenburg et al., 2006). L’oxydation des lipides et de la protéine constitutifs de la lipoparticule LDL modifie de façon notable les propriétés physiques, chimiques et immunologiques des LDL. Ces modifications sont des indicateurs de l’étendue de l’oxydation des LDL et sont exploitées pour séparer les formes oxydées des LDL natives (non modifiées), et déterminer la concentration plasmatique des LDL oxydées in vivo. L’électronégativité des LDL oxydées est mise à profit pour leur séparation et quantification ; différentes méthodes ont été proposées : la CLHP d’échange d’ions avec détection UV à 280 nm (Hodis et al., 1994), l’électrophorèse en gel d’agarose après isolement des LDL par ultracentrifugation, l’électrophorèse capillaire haute pression (Stocks et Miller, 1998), l’isotacophorèse capillaire. L’avantage de ces deux dernières méthodologies utilisant l’électrophorèse capillaire est l’automatisation de la technique, de plus en plus fréquente, la rapidité d’analyse et le volume réduit d’échantillon biologique nécessaire. Dans une récente synthèse des données de la littérature, Mello et al. ont rassemblé les données actuelles sur les LDL électronégatives, qu’il faut distinguer des LDL oxydées par leur état d’oxydation minimal (« Minimally Oxidized LDL ») dont les propriétés biologiques apparaissent assez différentes de celles des LDL oxydées (Mello et al., 2011). Durant ces dernières années, plusieurs immunodosages ont été développés afin de déterminer, par voie immunologique, la concentration plasmatique des LDL oxydées. La spécificité de ces dosages est éminemment dépendante de l’anticorps de capture (primaire) utilisé, qui peut être dirigé contre les LDL modifiées par le

121

4557_2_.book Page 122 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Tableau 2

■

Comparaison des méthodologies décrites et/ou commercialisées pour le dosage des LDL oxydées (d’après Itabe et Ueda, 2007).

Technique

Itabe

Kyowa Medex MX

Witztum

Holvoet

Mercodia

Système analytique

ELISA

Sandwich

Sandwich

Compétition

Compétition

Ac primaire

DLH3

DLH3

E06

4E6

4E6

Ac secondaire

Anti-apoB polyclonal

Anti-apoB polyclonal

MB47

–

–

Détection

Colorimétrie

Colorimétrie

Chimioluminescence

Colorimétrie

Colorimétrie

Échantillon

LDL isolées

Plasma dilué

Plasma dilué

Plasma dilué

Plasma dilué

Étalon

LDL oxydées par le cuivre

LDL oxydées par le cuivre

Aucun

LDL modifiées par le MDA

Mélange de plasmas de patients

Concentration chez le sujet sain

0,1 ng/μg LDL

10 U/mL plasma

0,027-0,42 RLU

0,7 mg/dL

70 U/L

Avantage majeur

Sensibilité

Rapidité (1 jour)

Spécifique de différents degrés d’oxydation

Rapidité (1 jour)

Compétition en microplaques

Inconvénient majeur

Long (4 jours)

Coûteux

Lecture chimioluminométrique

Peu spécifique

Coûteux

Commercialisation

Non

Oui

Non

Non

Oui

dialdéhyde malonique (MDA-LDL) (Holvoet et al., 1995), oxydées par les ions cuivriques (Holvoet et al., 1998), reconnaissant des produits d’oxydation de la phosphatidylcholine (Shoji et al., 2000) ou de l’acide arachidonique (Cerne et al., 2002). La détermination peut alors être réalisée sur le plasma (pour une meilleure praticabilité) ou sur les LDL préalablement isolées par ultracentrifugation (pour une meilleure sensibilité, à condition d’éviter les processus d’oxydation pendant les étapes de purification). À ce jour, cinq méthodologies ont été développées, et pour certaines d’entre elles, sont commercialisées. Elles sont décrites dans le tableau 2. Les résultats obtenus avec les différentes méthodes sont pour l’instant peu transférables, les études de comparaison étant fragmentaires. Il semble acquis aujourd’hui que la quantité de LDL oxydées présentes au niveau des lésions carotidiennes d’athérosclérose est représentative de la maladie carotidienne et de l’instabilité des plaques (Sigal et al., 2010), mais la controverse subsiste sur l’intérêt du dosage au niveau circulant (Ishigaki et al., 2009), même si leur concentration plasmatique apparaît corrélée au profil lipidique, alors qu’elle ne l’est pas avec d’autres marqueurs du stress oxydant, tels que les F2-isoprostanes (Burgos Alves et al., 2010).

Malgré une association certaine entre des concentrations plasmatiques élevées de LDL oxydées et certaines pathologies, aujourd’hui démontrée par les études précliniques et cliniques, il n’apparaît pas aujourd’hui justifié de proposer le dosage à une large échelle de ce biomarqueur en pratique clinique.

2.2.6. Anticorps anti-LDL modifiées L’existence des LDL oxydées (ou modifiées par des processus non oxydatifs) a justifié l’étude de leur immunoréactivité, et la possibilité d’utiliser les auto-anticorps (Ac) anti LDL modifiées comme

122

biomarqueurs du stress oxydant. Les processus de modification des LDL étant multiples (glycation, oxydation lipidique et protéique à différents degrés, captation d’aldéhydes eux-mêmes issus de la peroxydation lipidique…), l’immunoréactivité des anticorps est elle-même spécifique, ou a minima sélective, de la molécule devenue antigénique qui à conduit à leur formation. De nombreux travaux de recherche ont décrit et utilisé des méthodes de détection d’Ac anti-LDL oxydées par les ions cuivriques (Ac antiLDLox) ou des Ac anti-LDL modifiées par le dialdéhyde malonique (Ac anti-LDL-MDA) ou les AGE (Ac anti-LDL-AGE – pour revue, Virella et Lopes-Virella, 2003). Les Ac anti-LDLox, anti-LDL-AGE ont pu être détectés dans le plasma de sujets sains et au cours de pathologies métaboliques (diabète, athérosclérose) ; il en est de même pour des Ac anti-IgG ou anti-albumine modifiées par les AGE au cours de la maladie diabétique. L’isolement par des techniques chromatographiques d’affinité et la caractérisation (distribution isotypique, avidité) de ces Ac ont également été réalisés. La grande majorité des méthodes de dosage de ces Ac qui ont été décrites et utilisées en recherche clinique sont des techniques immunoenzymatiques non compétitives directes en phase solide (ELISA), et ne sont pas commercialisées. La transférabilité entre ces techniques n’est pas assurée, essentiellement en raison des substrats très différents utilisés pour capturer les Ac dans l’immuno-essai mis en œuvre. De même, la correction du résultat obtenu en fonction d’interactions non spécifiques avec les LDL modifiées utilisées comme ligand n’est pas effectuée par les deux méthodes de dosage commerciales des Ac anti-LDLox (Alpco Diagnostics et Kamiya Biomedical Co). De plus, l’importance du mode d’oxydation de LDL oxydées utilisées pour doser les Ac anti-LDLox a longtemps été discutée, tant pour la validité analytique des dosages que pour l’interprétation des résultats, et aucune standardisation n’a été proposée à ce jour.

4557_2_.book Page 123 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs d’oxydation des biomolécules et systèmes de défense antioxydants

De façon générale, la signification clinique d’Ac anti-LDL modifiées a été freinée par la variabilité analytique des techniques proposées, les discordances observées selon la nature du ligand et l’absence de standardisation permettant des comparaisons valables d’études cliniques entre elles. De plus, les études expérimentales réalisées chez l’animal tendent à montrer un effet protecteur de l’existence d’Ac anti-LDLox (Hansson, 2002), alors que les études épidémiologiques et cliniques ont donné des résultats plus contradictoires. Certains travaux semblent en effet relier les concentrations systémiques de ces auto-Ac à la sévérité de la maladie athéroscléreuse, à la progression de l’athérosclérose carotidienne ou au risque de survenue d’un infarctus du myocarde (pour exemple, Tsimikas et al., 2003), alors que d’autres indiquent l’absence de relation (Tsouli et al., 2006) ou confirment le rôle potentiellement protecteur de ces Ac vis-à-vis de l’atteinte cardiovasculaire (Hulthe et al., 2001). Dans une récente étude, les Ac anti-LDLox ont été présentés comme biomarqueurs prédictifs de morbidité et mortalité chez des patients atteints d’insufisance cardiaque chronique (Charach et al., 2009). En pratique, seuls deux fournisseurs proposent aujourd’hui des trousses adaptées au dosage en biologie spécialisée des Ac antiLDLox (Alpco Diagnostics, Windham USA et Kamiya Biomedical Co, Seattle, USA) avec une reproductibilité et un suivi au long cours qui restent à évaluer. La difficulté de mise en œuvre et d’interprétation biologique ne permet pas aujourd’hui de conseiller ce marqueur dans le cadre du diagnostic, du suivi de l’évaluation pronostique de pathologies, y compris dans le cadre des maladies cardiovasculaires. Enfin, signalons que, parallèlement au dosage biologique d’Ac anti-LDL modifiées, l’interaction in vivo au niveau systémique de l’Ac et du ligand ayant conduit à sa formation génère la formation d’immuns complexes circulants qui ont pu être détectés, isolés et caractérisés, mais sans qu’une application diagnostique, pronostique ou pour le suivi de pathologies n’ait été proposée.

Les études cliniques sont encore insuffisantes et leurs résultats trop peu probants pour envisager l’utilisation du dosage des Ac anti-LDL modifiées en pratique clinique.

■ Principe analytique

Le dosage de la Lp-PLA2 peut être effectué par mesure de la masse par un test en immunoturbidimétrie [Plac ® turbidimetric immunoassay (TIA) (dia-Dexus Inc., CA)] adapté sur un automate Thermo Konelab 30i (Thermo Electron Corporation) et distribué en France par les Laboratoires Eurobio. Le prélèvement de sang est conservé à 4 °C puis centrifugé précocement (< 2 heures). Le dosage peut être fait immédiatement ou après conservation à – 80 °C. ■ Valeurs usuelles

La concentration usuelle de Lp-PLA2 est inférieure à 200 μg/L. Le risque de complications cardiovasculaires est d’autant plus grand que la concentration de Lp-PLA2 est élevée, avec une valeur-seuil estimée à 230 μg/L. ■ Apport dans l’investigation bioclinique

La Lp-PLA2 est un biomarqueur de l’inflammation vasculaire qui permet d’estimer le risque d’événements cardiovasculaires tant en prévention primaire que secondaire, que ce soit chez le coronarien, l’insuffisant cardiaque ou lors d’un accident vasculaire cérébral. Ainsi, une récente méta-analyse de 32 études prospectives, comprenant 79 036 patients, a analysé le risque de survenue d’une coronaropathie, d’un accident vasculaire cérébral (AVC) et de la mortalité coronaire. La Lp-PLA2 est corrélée significativement avec le risque de coronaropathie [RR = 1,11 (1,071,16)], d’AVC [RR = 1,14 (1,02-1,27)] et de mortalité [RR = 1,13 (1,05-1,22)] (Lp-PLA2 Studies Collaboration, 2010). L’interprétation de la concentration de Lp-PLA2 doit tenir compte des traitements. Par exemple, des études, réalisées sur de petites populations, montrent que la concentration de LpPLA2 baisse de 47 % chez les patients traités par statines et de 43 % lors d’un traitement par les fibrates, sans bénéfice additionnel lors de l’association de ces deux traitements (Muhlestein et al., 2006). Ce dosage pourrait permettre d’optimiser la prise en charge des patients, avec un renforcement des règles hygiénodiététiques et la nécessité de traiter de façon plus agressive les dyslipidémies, notamment avec l’emploi de statines.

2.3. 2.2.7. Lp-PLA2 (phospholipase A2 associée aux lipoprotéines) © Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

2+

La Lp-PLA2 est une phospholipase A2 Ca -indépendante de 50 kDa, synthétisée par les macrophages et les cellules spumeuses présents dans la plaque d’athérosclérose (Sudhir, 2005). L’augmentation de Lp-PLA2 est corrélée à l’instabilité de la plaque (Kolodgie et al., 2006). Dans le sang, la Lp-PLA2 est majoritairement transportée par les LDL, fixée à la partie C-terminale de l’apoB-100. Lors de l’oxydation des LDL, la Lp-PLA2 est activée. Au niveau de l’intima, la Lp-PLA2 hydrolyse les phospholipides en position 2-sn et produit deux entités : de la lysophosphatidylcholine (Lyso-PC) et des acides gras (AG) libres oxydés. Les Lyso-PC ont une action pro-inflammatoire, stimulant notamment l’expression de molécules d’adhésion, la production de cytokines, entraînant le recrutement et l’adhésion des monocytes au niveau de l’endothélium.

Marqueurs de l’oxydation des protéines

Les protéines, de par leur abondance au sein des systèmes biologiques et du fait de leur rôle fonctionnel majeur au sein de la cellule, constituent des cibles majeures des ERO et ERN. Il a ainsi été estimé que les protéines piègent 50 à 75 % des espèces radicalaires générées (Davies et al., 1999).

2.3.1. Protéines carbonylées ■ Principe analytique et interférences

Les carbonyles sont des molécules ubiquitaires de l’oxydation de la chaîne latérale des acides aminés ou des produits de fragmentation des protéines après attaque radicalaire (Dalle-Donne et al., 2003). Les méthodes utilisées pour leur détermination vont des méthodes immunologiques (ELISA) aux méthodes spectrophotométriques et de Western blot.

123

4557_2_.book Page 124 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Le principe des méthodes spectrophotométriques est le suivant, les carbonyls réagissent avec la dinitrophénylhydrazine (DNPH) pour former une dinitrophénylhydrazone colorée qui absorbe à 366 nm (coefficient d’absorption molaire de 22 000 mol–1.L.cm–1). Cette méthode nécessite au préalable de précipiter les acides nucléiques par le sulfate de streptomycine à 1 % si l’échantillon biologique est tissulaire et de vérifier que le rapport d’absorbance à 280/260 nm est supérieur à 1. Pour les dosages plasmatiques le sérum est dilué au 1/40 e dans un tampon PBS (pH 7,4) puis précipité par de l’acide trichloracétique à 20 % à froid. On ajoute au précipité recueilli une solution de DNPH 10 mM dans de l’acide chlorhydrique 2N afin d’obtenir une concentration finale de protéines égale à 1-2 mg/ mL. Les échantillons sont laissés à l’obscurité et à température ambiante pendant 1 heure et vortexés toutes les dix minutes. Ils sont ensuite précipités par de l’acide trichloracétique à 10-20 % et centrifugés. Le précipité est à nouveau lavé par la solution d’acide trichloracétique puis, trois fois, par un mélange d’éthanol/ acétate d’éthyle (vol./vol) pour éliminer l’excès de DNPH et les lipides. Enfin il est dissous dans une solution de chlorure de guanidine acide 6M à 37 °C pendant 15 minutes. L’absorbance des carbonyls est ensuite lue à 366 nm. Une courbe d’étalonnage est réalisée avec de l’albumine oxydée par l’acide hypochloreux et de l’albumine réduite par le borohydrure de sodium pour maintenir une concentration constante en protéines. Cette méthode peu coûteuse présente cependant quelques inconvénients. Elle ne permet pas d’identifier la ou les protéines oxydées dans un milieu complexe (comme le plasma ou les tissus), elle nécessite un volume d’échantillon important et elle est consommatrice de temps (nombreuses phases de lavage). Afin de lever en partie ces inconvénients cette méthode a été couplée à la chromatographie de filtration sur gel. Des méthodes immunologiques sont également applicables à la détermination des protéines carbonylées. Il s’agit de méthodes ELISA ou de Western blot. L’anticorps utilisé est dirigé contre le DNP rendant ces techniques très sensibles, reproductibles et corrélées avec la colorimétrie décrite précédemment. Après réaction de l’échantillon protéique avec le DNPH 10 mM (en solution dans le chlorure de guanidine 6M, tampon phosphate 0,5 M), celui-ci est adsorbé sur une microplaque. Un anticorps anti-DNP biotinylé est alors ajouté puis une peroxydase couplée à la streptavidine. La méthode ELISA a l’avantage de ne nécessiter que d’une très faible quantité de protéines (60 μg comparés aux 10 mg de la méthode colorimétrique). Un coffret réactif existe sur le marché (ELISA analysis, ZENTECH PC test, Zenith Technology, Dunedin, New Zealand). Le seul inconvénient des méthodes ELISA est qu’elles ne donnent pas d’information sur l’intensité de la carbonylation d’une protéine donnée. C’est pour cette raison que des techniques électrophorétiques (SDS-PAGE) suivi d’un Western blot ont été développées. Le principe de dérivatisation est le même que pour la technique ELISA et elle est en général réalisée avant l’électrophorèse. Le transfert est ensuite réalisé sur une membrane de nitrocellulose et les bandes de protéines carbonylées sont révélées par les anticorps anti-DNP marqués. Une trousse existe sur le marché (Oxyblot, Intergen). Une identification de ces protéines

124

carbonylées peut ensuite être réalisée par spectrométrie de masse (MALDI-TOF). ■ Valeurs usuelles

Les valeurs usuelles en spectrophotométrie dans le plasma sont de 0,69 ± 0,34 nmol/mg protéines selon Alamdari et al. (2005) et de 1,16 ± 0,13 nmol/mg protéines selon Cakatay (2005). La technique ELISA donne des valeurs usuelles de 0,86 ± 0,43 nmol/mg protéines (Alamdari et al., 2005). ■ Apport dans l’investigation bioclinique

La concentration plasmatique des protéines carbonylées a été particulièrement étudiée dans deux pathologies humaines : le syndrome de détresse respiratoire aiguë et les maladies inflammatoires intestinales. Le plasma ne reflétant pas exactement un stress oxydant au niveau pulmonaire ou intestinal, la même analyse a été effectuée sur des liquides de lavage broncho-alvéolaire ou des biopsies intestinales de région enflammée. Le choix d’une méthode globale de quantification des protéines carbonylées (spectrophotométrique ou ELISA) ou plus spécifique d’une protéine donnée (Western blot) dépendra du but recherché. D’une manière générale, les méthodes globales sont suffisantes pour mettre en évidence un stress oxydant plasmatique dans différentes pathologies. De plus l’oxydation des protéines est un phénomène constant et précoce, les carbonyles formés sont plus stables, à la différence des produits de la peroxydation lipidique. Leur stabilité est également plus importante (conservation possible des échantillons plus de trois mois à – 80 °C). Un autre avantage est que ces produits d’oxydation protéique peuvent provenir de n’importe quelle attaque radicalaire et donc qu’ils ne sont pas spécifiques de telles ou telles espèces réactives de l’oxygène. L’identification d’une protéine oxydée spécifique d’une pathologie donnée nécessitera d’utiliser la technique de Western blot couplée à la spectrométrie de masse afin de déterminer les conséquences fonctionnelles de cette oxydation sur la physiopathologie de cette maladie (un exemple peut être donné par l’oxydation de la glutamine synthétase dont l’activité est diminuée dans la maladie d’Alzheimer). Une excellente revue générale fait le point sur ce sujet aussi bien sur le plan analytique que sur les applications en pathologie (Dalle-Donne et al., 2003).

2.3.2. Produits de glycation avancée résultant de réactions de glyco-oxydation (pentosidine, carboxyméthyllysine) et leurs précurseurs (glyoxal, méthylglyoxal) ■ Origine et réactivité

À côté de l’oxydation des protéines à proprement parler, des modifications peuvent se produire suite à la réaction des groupements aminés libres des protéines avec un ose tel que le glucose : c’est le processus de glycation, auquel peut s’associer une oxydation, on parle alors de glyco-oxydation. Avec des protéines à durée de vie longue, comme le collagène, les protéines glyquées donnent naissance à des produits de glycation avancée ou AGE (« Advanced Glycation Endproducts »), dont certains sont obtenus par voie oxydative. Ainsi, la pentosidine ou la N-ε-carboxyméthyllysine sont des exemples d’AGE (figure 5).

4557_2_.book Page 125 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs d’oxydation des biomolécules et systèmes de défense antioxydants

O R

NH

C H2

CR'

Protéine glyquée (céto-amine) (produit d’Amadori) Voie oxydante

Voie non oxydante

Fe2+/O2

R

NH

C H2

COOH

CHO

CH2OH N

Peroxydation lipidique

Nε-carboxyméthyllysine (CML)

R Pyrraline

N NH

Arg α-oxo-aldéhydes : Glyoxal, Méthylglyoxal, 3-désoxyglucosone

NH + N

CML, GOLD (dimère glyoxal-lysine)

Lys

Pyrraline, DOLD (dimère désoxyglucosone-lysine)

Pentosidine CEL (Nε-(carboxyméthyllysine)) MOLD (dimère méthylglyoxal-lysine)

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Figure 5

■

Formation des produits de glycation avancée (les noms des AGE sont notés en gras).

■ Principe analytique

■ Valeurs fréquentes

La concentration des AGE peut être déterminée par dosage immunologique, mais, en raison notamment de l’adsorption des anticorps sur des épitopes d’AGE utilisés pour bloquer la laison non spécifique des anticorps, et de la non spécificité de certains anticorps utilisés, ce type de dosage ne fournit généralement pas de concentrations absolues mais exprimées en unités arbitraires, sans toujours de normalisation par rapport à un AGE protéique de référence (Hammes et al., 1999). Une mesure de fluorescence globale est également possible (longueur d’onde d’excitation 350 nm, longueur d’onde d’émission 450 nm), mais elle se heurte au niveau plasmatique avec l’interférence de la N-formylkynurénine, produit d’oxydation des protéines (Fukunaga et al., 1982). Des techniques chromatographiques permettent la quantification des AGE après hydrolyse des substrats protéiques : CLHP avec détection fluorimétrique pour les AGE fluorescents (Odetti et al., 1992), ou dérivatisation chimique suivie d’une chromatographie en phase gazeuse couplée à la SM (Verzijl et al., 2000). Enfin, une très récente technique basée sur l’autofluorescence de la peau a été proposée afin de suivre plus aisément et de façon non invasive l’accumulation des AGE au niveau de la peau de l’avant-bras (AGE-Reader, DiagnOptics B.V., Groningen, The Netherlands) (Mulder et al., 2006) ; cette autofluorescence est calculée comme le rapport des intensités moyennes détectées au niveau de la peu entre 420-600 nm et 300-420 nm ; les concentrations d’AGE obtenues par cette technique sont bien corrélées avec celles détectées dans des biopsies de peau chez des sujets témoins sains, des diabétiques et des insuffisants rénaux.

Les protéines des tissus, du plasma et de la matrice extracellulaire renferment des concentrations d’AGE de l’ordre de 0,001 à 15 mmol/mol d’acide aminé modifié in vivo, cette valeur dépendant de la localisation et du type d’AGE (Thornalley, 2005). Ainsi, chez les sujets sains, les valeurs moyennes (± écart à la moyenne) rapportées par Thornalley (2005) sont respectivement de 18,9 ± 3,1 et 0,92 ± 0,46 nmol/L pour la carboxyméthyllysine et la pentosidine. ■ Apport dans l’investigation bioclinique

Les AGE d’origine cellulaire sont libérés dans le plasma et excrétés dans l’urine. La plupart des AGE ont une clairance urinaire élevée, de l’ordre de 35 à 93 mol/min, qui décroît en cas d’insuffisance rénale (Thornalley, 2005). Les concentrations d’AGE sont ainsi augmentées dans le plasma de sujets insuffisants rénaux, les valeurs pouvant être multipliées jusqu’à 40 fois chez des sujets en hémodialyse. Les concentrations plasmatiques et l’excrétion urinaire de certains AGE sont aussi accrues chez des patients diabétiques dont la fonction rénale est normale et le contrôle glycémique modéré, en relation avec une glycation augmentée des protéines suivie d’une protéolyse (Ahmed et al., 2005). Du fait du caractère irréversible des modifications des protéines par la carboxyméthyllysine, cet AGE a pu être proposé en tant que marqueur intégratif du stress oxydant appliqué aux protéines ; il pourrait constituer un marqueur intéressant de la glycoxydation et serait corrélé avec le développement des lésions microvasculaires du diabétique (Wautier et al., 2003 ; Tan et al., 2007).

125

4557_2_.book Page 126 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

2.4.

Marqueurs de l’oxydation des acides nucléiques

■ Origine et réactivité

Les attaques oxydatives sur l’ADN sont considérées comme importantes dans les études touchant au vieillissement et au développement de cancers (Olinski et al., 2003 ; Bohr 2002). Les espèces réactives de l’oxygène, en particulier le radical hydroxyle, peuvent attaquer le squelette désoxyribose-phosphate, en provoquant des liaisons croisées ADN-protéines, et en modifiant les bases puriques et pyrimidiques. La réparation de l’ADN in vivo est effectuée par des glycosylases (pour les bases) et des endonucléases (pour les désoxynucléotides). L’intérêt de la mesure des bases oxydées dans l’urine repose sur le fait que les bases et nucléosides oxydés libérés par des enzymes de réparation à partir d’acides nucléiques ou de précurseurs endommagés pourraient être éliminés dans les liquides biologiques (Cadet et al., 2005). Parmi les bases, la guanine est plus sensible à l’oxydation car elle possède le plus bas potentiel d’oxydation. C’est la raison pour laquelle le nucléoside 8-hydroxy-2'-désoxyguanosine (8OHdG) est le biomarqueur des dommages oxydatifs de l’ADN le plus étudié (Chiou et al., 2003) (figure 6). O N

HN

OH H2N

N

N

de détecteurs puissants tels que la fluorescence induite par le laser, l’électrochimie ou la spectrométrie de masse (pour revue, voir Peoples et Karnes, 2005). L’emploi de méthodologies différentes a conduit à l’obtention d’importantes variations des concentrations de 8-OHdG d’un laboratoire à un autre (Ziech et al., 2010). En pratique courante, il est plus aisé d’avoir recours à des kits ELISA commercialisés, utilisant soit des anticorps polyclonaux, soit des anticorps monoclonaux. L’anticorps monoclonal N45.1 est hautement spécifique de la 8-OHdG (Toyokuni et al., 1997). Des auteurs ont comparé les résultats de 8-OHdG urinaire obtenus soit par CLHP (détection électrochimique), soit par technique ELISA utilisant cet anticorps. Après normalisation des résultats (rapportés à la concentration urinaire de créatinine), et lorsque les échantillons urinaires ont été purifiés sur une première colonne de CLHP, les résultats sont très similaires par les deux méthodes ; en revanche, sans purification préalable, les résultats obtenus par ELISA sont deux fois plus élevés que ceux observés par CLPH et la corrélation est plus faible, suggérant une possible interférence de certaines substances urinaires avec l’anticorps du dosage ELISA. D’autres comparaisons ont été faites entre le kit ELISA et la CLHP couplée à la spectrométrie de masse (LC/MS/MS) (Hu et al., 2004).

Pour en savoir plus : Cadet C, Douki T, Gasparutto D, Ravanat JL. Réactions d’oxydation et cibles biologiques : acides nucléiques. In : Delattre J, Beaudeux J-L, BonnefontRousselot D. Radicaux libres et stress oxydant. Aspects biologiques et pathologiques. Lavoisier, Paris, 2005, p. 169243.

désoxyribose

Figure 6

■

Structure de la 8-hydroxy-2'-désoxyguanosine.

■ Principe analytique

Le problème majeur du dosage de la 8-OHdG est préanalytique. En effet, il est très difficile de détecter des lésions oxydatives sans oxyder artificiellement l’ADN au cours de la préparation des échantillons ; l’expression des résultats de 8-OHdG à partir d’ADN nucléaire provenant de cellules ou de tissus est ainsi souvent normalisée par rapport à la base non modifiée (8-OHdG/dG). En revanche, l’analyse de 8-OHdG en tant que produit de réparation de l’ADN dans l’urine pourrait refléter l’ensemble des dégâts oxydatifs appliqués à l’ADN dans l’organisme entier (Halliwell et Whiteman, 2004). Il est souvent nécessaire de recourir à des méthodes de purification en raison des interférences provenant de la matrice urinaire. Ce traitement préanalytique fait souvent intervenir des colonnes SPE (« solid phase extraction »), avant séparation par CLHP avec détection électrochimique (Helbock et al., 1998). Les concentrations basses de 8-OHdG dans les milieux biologiques (de l’ordre de la nmol/L) ont nécessité l’emploi

126

■ Valeurs fréquentes

Les concentrations urinaires de 8-OHdG déterminées par CLHP couplée à une détection électrochimique sont d’environ 10 à 30 nmol/L chez les sujets sains (Pilger et al., 2002). Par une méthode de chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse, Ravanat et al. (1999) ont retrouvé des valeurs très proches (30 ± 15 nmol/L). ■ Apport dans l’investigation bioclinique

Plusieurs études ont eu pour but de suivre les effets modulateurs d’agents pro- ou antioxydants sur les concentrations urinaires en particulier de 8-OHdG, ou de tenter de corréler des facteurs alimentaires ou des comportements humains avec un risque de cancer sur la base de variations de ces concentrations, sans toutefois permettre de dégager de conclusions convaincantes. La variabilité des valeurs, le manque de fiabilité de certaines méthodes de mesure, ainsi que l’origine réelle des bases oxydées dans l’urine (implication des enzymes de réparation par excision de bases, mais aussi contribution des cellules mortes, voies métaboliques oxydatives…) pourraient expliquer cette pauvreté dans la signification des résultats obtenus.

4557_2_.book Page 127 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs d’oxydation des biomolécules et systèmes de défense antioxydants

3 ■■ SYSTÈMES DE DÉFENSE ANTIOXYDANTS 3.1.

Systèmes enzymatiques

3.1.1. Superoxydes dismutases Les superoxydes dismutases (SOD) sont des métalloenzymes qui catalysent la dismutation des ions superoxydes en molécules de peroxyde d’hydrogène et d’oxygène. Ces enzymes sont ubiquitaires chez les eucaryotes et on distingue trois isoenzymes (SOD1, à cuivre et à zinc cytosolique ; SOD2, à manganèse, mitochondriale, et SOD3, à cuivre et à zinc, extracellulaire) qui diffèrent selon la localisation chromosomique du gène, leur contenu métallique, leur structure quaternaire et leur localisation cellulaire. La dismutation spontanée de l’ion superoxyde dépend du pH. À pH 7, la constante de vitesse est de 6 × 105 mol–1.l.s–1 alors que la dismutation catalysée par les SOD se produit avec une constante de vitesse voisine de 1,6 × 109 mol–1.l.s–1. Malgré la formation de peroxyde d’hydrogène les SOD permettront d’en diminuer la concentration en évitant que les ions superoxydes agissent comme des initiateurs d’oxydation de réaction en chaîne vis-à-vis d’autres molécules biologiques (catécholamines, tétrahydroptérines…).

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

■ Principe analytique

La plupart des méthodes mesurant l’activité enzymatique de la SOD sont indirectes. L’ion superoxyde est généré soit par voie chimique soit par voie enzymatique avec une vitesse constante. Il réagira sur une molécule (nitrobleu de tétrazolium, luminol, pyrogallol…) qui, après réduction, sera colorée (chlorure de 2-(4iodophényl)-3-(4-nitrophénol)-5-phényltétrazolium, INT donnant un formazan de couleur rouge) ou émettra de la lumière (luminol). La source d’ions superoxydes la plus fréquemment utilisée est le système enzymatique xanthine-xanthine oxydase (méthode originale de Mc Cord et Fridovich, 1969). En transformant les ions superoxydes en peroxyde d’hydrogène, la SOD de l’échantillon biologique inhibe leur action sur la molécule réactive ce qui empêchera, par exemple, la formation d’un dérivé coloré dans le cas de l’utilisation de l’INT (kit SD 125®, Randox Laboratory, Crumlin, North Ireland). L’activité SOD sera donc fonction du degré d’inhibition de cette réaction exprimé en pourcentage. Le pourcentage d’inhibition est ensuite transformé en unité SOD qui correspond à la quantité d’enzyme qui inhibe 50 % de la formation du dérivé coloré. Dans le cas des érythrocytes (SOD1), cette activité est rapportée à la concentration en hémoglobine, Hb (activité spécifique) d’un hémolysat (dilution au 1/500 e avec un tampon phosphate 0,01 mol/L, pH 7,8). On peut conserver ces hémolysats pendant 2 ans à – 80 °C sans perte d’activité SOD (Abiaka et al., 2000). L’activité de la SOD2 (mitochondriale à manganèse) des cellules peut être mesurée en soustrayant de l’activité SOD totale (obtenue en utilisant un tampon à pH 7), l’activité SOD obtenue en ajoutant dans le milieu réactionnel 2 mM de cyanure qui inhibe la SOD1. L’activité spécifique de la SOD2 est exprimée en U/mg de protéines.

■ Valeurs fréquentes

Les valeurs usuelles de la SOD érythrocytaire (SOD1, les érythrocytes ne possédant pas de mitochondries il n’y a pas de SOD2) sont d’environ 790 ± 31 U/g Hb (Thérond et al., 1996). Il existe une corrélation négative avec l’âge (sujets âgés de 1 mois à 67 ans) (Ceballos-Picot et al., 1992) mais cette corrélation n’existe plus dans la tranche d’âge comprise entre 18 et 65 ans. Il n’y a pas non plus de différence d’activité enzymatique entre des sujets fumeurs et non fumeurs. Compte tenu du rôle de la SOD de former du peroxyde d’hydrogène (dans les limites des concentrations physiologiques), des auteurs ont mis en évidence une corrélation positive entre la SOD et la catalase érythocytaire (Guemouri et al., 1991). La SOD2 à manganèse (mitochondriale) peut être dosée dans divers tissus et cellules. Par exemple, dans les fibroblastes de peau cette activité est de 58 ± 8 mU/mg protéines alors que celle de la SOD1 est de 210 ± 38 mU/mg protéines (Thérond et al., 1996).

3.1.2. Glutathion peroxydases L’ensemble des glutathion peroxydases (GPx) catalysent la réduction des hydroperoxydes minéraux (peroxyde d’hydrogène) ou organiques (hydroperoxydes lipidiques) en molécule d’eau ou alcool couplée à l’oxydation d’un substrat comportant une fonction thiol (glutathion). On distingue cinq isoenzymes de la GPx chez les eucaryotes : la GPx1 cytoplasmique et mitochondriale, la GPx2 gastrointestinale, la GPx3 plasmatique, la GPx4 ou PHGPx (phospholipid hydrperoxide glutathione peroxidase) localisée à l’interface de la membrane interne du cytoplasme et la GPx5 épididymaire. ■ Principe analytique

La méthode la plus couramment utilisée pour mesurer l’activité enzymatique de la GPx est basée sur la cinétique de l’oxydation du NADPH en NADP+ à 340 nm. Elle consiste à ajouter au milieu biologique (plasma, érythrocytes traités au préalable par un agent réducteur pour réduire la GPx et le réactif de Drabkin’s contenant du cyanure pour inhiber l’effet peroxydasique de l’hémoglobine) un substrat (peroxyde d’hydrogène, cumène hydroperoxyde, tbutyl hydroperoxyde), un agent réducteur (glutathion), de la glutathion réductase et du NADPH, H+ (Paglia et Valentine, 1967). Selon le substrat utilisé on pourra également mesurer l’activité des GPx non séléno-dépendantes encore appelées glutathion Stransférases. Par exemple si on utilise le peroxyde d’hydrogène ou le t-butyl hydroperoxyde comme substrats, seules les GPx séléno-dépendantes (GPx1, 2, 3 et 4) seront actives alors que le cumène hydroperoxyde est réduit par les deux formes de GPx, séléno-dépendantes et non séléno-dépendantes (Glutathion Stransférases) (St Clair et Chow, 1996). Un kit est actuellement commercialisé qui utilise le cumène hydroperoxide comme substrat (Ransel, Randox Laboratories, Crumlin, North Ireland). Cette remarque peut être importante selon le milieu biologique à analyser. En effet, les érythrocytes ne contiennent que de la GPx sélénodépendante alors que le plasma contient 80 % de forme séléno-dépendante et 20 % de forme non séléno-dépendante.

127

4557_2_.book Page 128 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Ces différences entre ces deux formes de Gpx existent également dans les tissus selon l’organe étudié. ■ Valeurs fréquentes

Dans les érythrocytes l’activité GPx est de 28 ± 1 U/g Hb, et dans les fibroblastes de peau de 6 ± 0,5 mU/mg de protéines (Thérond et al., 1996).

3.1.3. Catalase La catalase est une enzyme héminique capable de transformer le peroxyde d’hydrogène en eau et en oxygène moléculaire. Elle est essentiellement présente dans les peroxysomes, les érythrocytes, les hépatocytes et les reins. ■ Principe analytique

Deux types de méthodes peuvent être utilisés pour mesurer l’activité de la catalase, soit la diminution de la concentration de peroxyde d’hydrogène, soit la formation d’oxygène. Ces méthodes sont très sensibles mais nécessitent des conditions expérimentales strictes comme par exemple l’absence d’oxygène. Une autre méthode est basée sur le mécanisme en deux temps de la réaction catalysée par la catalase. L’enzyme oxyde dans un premier temps un donneur d’hydrogène (en excès par rapport la concentration de peroxyde d’hydrogène du milieu) comme le méthanol en formaldéhyde puis ce dernier réagit avec le 4-amino3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4- triazole (Purpald ®) pour donner un composé qui absorbe à 550 nm (Johanson et Borg, 1988). ■ Valeurs fréquentes

Dans les érythrocytes les valeurs usuelles (en utilisant la méthode de Johanson et Borg) sont de 9 ± 1 U/mg de protéines et dans les fibroblastes de peau de 4,5 ± 0,5 U/mg de protéines (Thérond et al., 1996). ■ Enzymes antioxydantes, myéloperoxydase et maladies cardiovasculaires

La myéloperoxydase (MPO) est impliquée dans la physiopathologie des maladies cardiovasculaires par ses propriétés inflammatoire et oxydante. Elle est sécrétée par les polynucléaires neutrophiles et les monocytes quand ces cellules sont activées au cours d’une inflammation. Le peroxyde d’hydrogène généré par la SOD est utilisée par la MPO pour former de l’acide hypochloreux, des radicaux hydroxyles, du dioxyde d’azote et du peroxynitrite qui sont des oxydants vis-à-vis des protéines. En particulier ces oxydants réagissent avec les lipoprotéines de basse et de haute densité (LDL et HDL) au sein de la plaque d’athérome et la MPO est à l’origine de la formation de di-tyrosine et de 3-chlorotyrosine (Hazen et Heinecke, 1997). Il est difficile de donner des valeurs usuelles de MPO dans le plasma compte tenu des grandes variabilités de concentration dans une population « saine » et des nombreuses méthodes utilisées (méthodes ELISA : Assay Design ou Calbiochem et CardioMPO® de PrognostiX Inc.). Les valeurs usuelles varient de 320 à 1755 pmol/L selon les études avec le kit CardioMPO ® et de 20 à 179 ng/ml avec la même méthode ELISA (Assay Design) dans deux études différentes (Strobel et al., 2011). Parmi les études longitudinales étudiant la MPO comme un facteur prédictif de maladies cardiovasculaires (infarctus du myo-

128

carde fatal et non fatal), la plupart d’entre elles montrent que la concentration de MPO dans le sérum ou le plasma est, à l’admission des patients pour douleurs thoraciques, prédictive d’une augmentation du risque d’infarctus du myocarde et des complications mortelles 3 mois et 6 mois après l’accident coronarien (Brennan et al., 2003). Une autre étude a montré, dans une population de patients similaire, que le dosage de la GPx1 érythrocytaire était un facteur de risque indépendant associé à une augmentation du risque cardiovasculaire alors que le dosage de la SOD érythrocytaire ne l’était pas (Blankenberg et al., 2003).

3.2.

Systèmes non enzymatiques

Outre les antioxydants non enzymatiques exogènes bien connus tels que vitamine E, vitamine C, caroténoïdes (qui seront traités dans le chapitre 15), les autres systèmes antioxydants non enzymatiques présents dans l’organisme humain comprennent le glutathion, les protéines à groupements thiols, la bilirubine, les hormones sexuelles (œstrogènes), l’acide urique, le coenzyme Q, la mélanine, la mélatonine et l’acide lipoïque (figure 7). Certains peuvent être considérés comme biomarqueurs du statut antioxydant, soit dans les compartiments lipidiques (α-tocophérol, β-carotène, ubiquinol), soit en phase aqueuse (acide ascorbique, glutathion). Ces composés peuvent être dosés dans le plasma mais aussi dans les érythrocytes et les plaquettes. Véhiculés dans le sang par les lipoprotéines, les antioxydants lipophiles peuvent également être déterminés dans les différentes classes de lipoprotéines (VLDL, LDL, HDL). Toutefois, une interprétation rigoureuse du statut en antioxydants lipophiles nécessite de rapporter leur concentration à celle d’un constituant lipidique de l’échantillon à analyser, tel que le cholestérol. L’évaluation de ces systèmes antioxydants est considérée par certains auteurs comme utile en tant que biomarqueurs pouvant contribuer notamment au choix de stratégies thérapeutiques au cours de pathologies induites par le stress oxydant, en particulier en cancérologie (Ziech et al., 2010). De nouvelles techniques chromatographiques ont été proposées (Lee et Ong, 2009), permettant une détermination simultanée et plus rapide d’un ensemble d’antioxydants lipophiles (coenzyme Q10) sous les formes ubiquinone et ubiquinol, vitamine A, vitamine E (tocophérols et tocotriénols) et caroténoïdes (lutéine, zéaxanthine, β-cryptoxanthine, lycopène et β-carotène) à partir d’un faible volume de plasma (30 μL) ; toutefois, cette détermination est essentiellement utile dans le cadre de l’évaluation d’un statut d’une population ou pour suivre des complémentations. Nous ne développerons ici que le pouvoir antioxydant total du plasma (qui permet une évaluation globale des capacités antioxydantes), le glutathion et le β-carotène. La vitamine E (dont l’isomère principal est l’α-tocophérol) et la vitamine C (acide ascorbique) sont deux antioxydants majeurs (traités dans le chapitre 15), le premier agissant en milieu lipophile (membranes et lipoprotéines), le second en phase hydrophile, et ceci de façon synergique. En effet, l’α-tocophérol est principalement connu pour piéger les radicaux peroxyles (RO2•), cette réaction conduisant à la formation d’un radical tocophéroxyle, lui-même réduit en retour en αtocophérol grâce à l’acide ascorbique ; cette régénération est favorisée par la présence du noyau chromanol de l’α-tocophérol

4557_2_.book Page 129 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs d’oxydation des biomolécules et systèmes de défense antioxydants

Gly

Gly

Cys

Cys

Glu

Glu

Glutathion réduit

Gly S

S

Cys Glu

Glutathion oxydé

COOH COOH

O

O

N H

N H

N H

N H

NHCOCH3

O

N H

Bilirubine

Mélatonine

OH

O

OH OH

Oestradiol

Oestrone

HO

Oestriol

HO

O

HO

OH

HO MeO

H N

HN

N H

HO O

N H

N H

O

CH3 CH3

O

MeO

(CH2CH

CCH2)10H

OH

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Acide urique

O

N H

Coenzyme Q10 (forme réduite)

Mélanine

S

SH

S

SH COOH

COOH Acide lipoïque

Figure 7

■

Acide dihydrolipoïque

Structure de quelques antioxydants non enzymatiques, à l’exception des vitamines qui sont traitées dans le chapitre 15.

129

4557_2_.book Page 130 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

à l’interface entre phases lipidique et aqueuse, et explique donc l’action synergique des deux vitamines. La détermination de ces vitamines en tant que marqueurs du stress oxydant chez l’homme est relativement peu contributive et est essentiellement utilisée pour mettre en évidence des déficits dans certaines populations ou pour suivre des complémentations. • Pouvoir antioxydant total du plasma (TRAP : « total radical trapping parameter »)

Il s’agit d’une approche globale simple pour évaluer la capacité antioxydante, mais sans individualiser les antioxydants mis en jeu ; cette détermination peut donc constituer une première étape, suivie, si le pouvoir antioxydant est abaissé, de dosages spécifiques de certains antioxydants. ■ Principe analytique

Plusieurs méthodes ont été développées pour mesurer le pouvoir antioxydant du plasma. Leur principe est basé sur la production de radicaux libres qui vont oxyder les substances oxydables du plasma. Cette oxydation est suivie par la consommation d’oxygène. Durant une période d’induction, l’oxydation est inhibée par l’ensemble des substances antioxydantes du plasma. La longueur de la période d’induction peut être comparée avec celle d’un standard interne, un dérivé hydrosoluble de la vitamine E (Trolox) ; dans ce cas, les résultats sont exprimés (μmoles/L de plasma) en équivalents de la capacité antioxydante du Trolox (TEAC : « Trolox Equivalent Antioxidant Capacity »). Certaines de ces méthodes sont commercialisées sous forme de kits (Pryor et Cao, 1999). Certaines méthodes utilisent le piégeage de radicaux stables DPPH• (1,1-diphényl-2-picrylhydrazyl) ou ABTS • (acide 2,2-azobis-3-éthylbenzthiazoline-6-sulfonique) par les antioxydants contenus dans le plasma, d’autres utilisent l’inhibition de la peroxydation lipidique, d’autres enfin la mesure en fluorescence de la phycoérythrine (dans le dosage ORAC : « Oxygen Radical Absorbance Capacity »). La méthode FRAP (« Ferric Reducing Ability of Plasma ») (Benzie et Strain, 1996) semble apporter une certaine supériorité sur les précédentes car elle ne dépend pas d’un système générateur d’espèces radicalaires. Une revue récente (Bartosz, 2010) met l’accent sur l’appellation impropre de ces dosages, et propose le terme de capacité antioxydante non enzymatique (« Non-enzymatic antioxidant capacity » ou NEAC), du fait que ce type de dosage ne mesure qu’une partie de la capacité antioxydante, en excluant les systèmes enzymatiques. Une revue des différentes méthodes disponibles et de leur application est présentée par Pryor et Cao (1999).

50 ans, de 51 à 74 ans et > 75 ans). Pour les sujets de sexe féminin, le pouvoir antioxydant total du plasma augmente en fonction de l’âge, puisqu’il est de 988 ± 36 μmol/L pour le premier sousgroupe (< 34 ans) et de 1 288 ± 42 μmol/L pour le dernier sousgroupe (> 75 ans). Pour les sujets de sexe masculin, un profil différent est observé, puisque le pouvoir antioxydant total du plasma augmente de 1 050 ± 84 μmol/L chez les moins de 34 ans à 1 300 ± 53 μmol/L entre 51 et 74 ans, mais décroît ensuite (1 126 ± 43 μmol/L) dans le groupe le plus âgé (75 à 96 ans). À l’aide des dosages des principaux antioxydants du plasma des patients (urates, groupements SH des protéines, vitamines antioxydantes), les auteurs ont pu déduire la part qui revenait à ces substances et celle due aux substances antioxydantes non identifiées. Ainsi, chez les femmes, l’accroissement du TRAP en fonction de l’âge est principalement dû à l’acide urique et à une fraction d’antioxydants non identifiés. Chez les hommes, la diminution de la valeur du TRAP est la conséquence de la baisse de la fraction antioxydante non identifiée. Il faut noter que les différentes méthodes utilisées pour déterminer la capacité antioxydante totale conduisent à des valeurs usuelles variables et ne présentent donc pas toujours de corrélation satisfaisante (Bartosz, 2010). ■ Apport dans l’investigation bioclinique

Ce type de dosage, quoique de réalisation aisée, doit être interprété avec prudence car des augmentations des concentrations plasmatiques de l’albumine, de l’acide urique et de la bilirubine, dues à certaines pathologies, pourraient masquer le déficit en d’autres antioxydants. Ainsi, dans ces circonstances, il est impératif de comparer les résultats expérimentaux avec ceux calculés qui tiennent compte du pouvoir antioxydant de l’albumine, l’acide urique et la bilirubine ; ainsi, dans le plasma, le TRAP calculé = [albumine] × 60,63 + [acide urique] × 61,02 + [bilirubine] × 61,50, les concentrations étant exprimées en nmol/L (Thérond et al., 2000). La mesure du pouvoir antioxydant total permet d’évaluer le niveau de stress oxydant au cours de plusieurs situations physiopathologiques, telles que le vieillissement, le diabète, les maladies cardiovasculaires et le cancer (Pandey et Rizvi, 2010). La mesure du pouvoir antioxydant du plasma s’est révélé un bon marqueur du stress oxydant dans plusieurs pathologies et en particulier dans le diabète sucré, qu’il soit de type 1 ou de type 2 (Bonnefont-Rousselot et al., 2000b). En revanche, la capacité antioxydante totale semble peu sensible à des complémentations par des antioxydants ou à une alimentation riche en antioxydants (Collins, 2005).

■ Valeurs fréquentes

• Glutathion

Le potentiel réducteur du plasma diminue avec l’âge (Pandey et Rizvi, 2010). Par ailleurs, l’ingestion d’antioxydants naturels (contenus dans les fraises, le vin rouge, les épinards…) est susceptible d’augmenter de 7 à 25 % la capacité antioxydante du plasma pendant les 4 heures suivant cette prise alimentaire (Cao et al., 1998). Pour le dosage FRAP (Benzie et Strain, 1996), les valeurs usuelles proposées chez des sujets sains sont de 1017 ± 206 μM. Une étude présentée par Aejmelaeus et al. (1997) a porté sur 87 sujets dont l’âge était compris entre 18 ans et 96 ans (52 du sexe masculin et 35 du sexe féminin), chaque sexe étant subdivisé en quatre sous-groupes selon l’âge (< 34 ans, de 35 à

Le glutathion est un tripeptide (L-γ-glutamyl-L-cystéinylglycine) qui joue des rôles essentiels au niveau intracellulaire, où il est présent à des concentrations de l’ordre de la mmol/L et où il représente le principal thiol non protéique chez les espèces aérobies. Le glutathion est un antioxydant impliqué dans de nombreux processus. Son rôle dans la détoxication de xénobiotiques et d’ERO a été bien établi. Par ailleurs, c’est un coenzyme de plusieurs enzymes telles que la glutathion peroxydase, qui joue un rôle protecteur essentiel contre le stress oxydant. Le mécanisme protecteur du glutathion conduit à l’accumulation intracellulaire de sa forme oxydée (disulfure) (DeLeve et al., 1991). C’est pourquoi il

130

4557_2_.book Page 131 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs d’oxydation des biomolécules et systèmes de défense antioxydants

est intéressant de déterminer le statut en glutathion à la fois sous les formes réduite et oxydée, ce qui fournit un indicateur fiable du potentiel redox intracellulaire (Thérond et al., 2000). ■ Principe analytique

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

De nombreuses méthodes sont disponibles, leur choix dépend de la nature de l’échantillon, de l’équipement disponible et de la volonté ou non de déterminer les formes réduites (GSH) et oxydée (GSSG) plutôt que la concentration totale de glutathion. De plus, la préparation de l’échantillon est importante afin de minimiser l’activité γ-glutamyl transpeptidase qui clive la liaison γ-glutamyl-peptide du GSH, la réduction du GSSG par la glutathion réductase ou l’oxydation du GSH. Plusieurs procédures ont été développées pour inhiber ces réactions. Ainsi, l’acidification inhibe à la fois la γglutamyl transpeptidase et la glutathion réductase, tandis que les agents chélateurs tels que l’acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) limite l’oxydation du GSH. Pour le dosage plasmatique, Anderson (1996) propose d’utiliser l’acide 5-sulfosalicylique contenant de l’EDTA pour précipiter les protéines, les échantillons devant être préparés dans les minutes suivant le prélèvement sanguin. La concentration de glutathion total (formes réduite et oxydée) peut être mesurée en utilisant l’acide 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoïque) et la glutathion réductase. La vitesse de réduction de l’acide 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoïque) est suivie par spectrophotométrie à 412 nm. La même méthode peut être utilisée pour déterminer la concentration de GSSG en suivant l’absorbance du NADPH à 340 nm ; cependant, avant le dosage, le glutathion réduit (GSH) doit être masqué par dérivatisation, soit par le N-éthylmaléimide, soit par la 2-vinylpyridine. Le surnageant obtenu après dérivatisation est passé sur une cartouche Sep-Pak C18 pour éliminer le N-éthylmaléimide, un inhibiteur de la glutathion réductase, avant l’analyse (Buhl et al., 1989). La quantité de GSH est ensuite obtenue en soustrayant la quantité de GSSG de la quantité de glutathion total. Afin de déterminer à la fois les formes réduite et oxydée du glutathion, les méthodes chromatographiques (chromatographie d’échange d’ions) avec détection électrochimique ne nécessitent pas de dérivatisation. Ainsi, après déprotéinisation de l’échantillon et centrifugation, le surnageant est injecté dans la CLHP pour séparer GSH et GSSG, puis en fonction du potentiel appliqué à la cellule électrochimique (électrodes coulométriques), les deux analytes sont transformés en une forme oxydée. Le courant produit par cette réaction redox est mesuré. La détection coulométrique est très sensible (détection de l’ordre de la pmole).

stress oxydant. Une baisse de sa concentration a été rapportée dans de nombreuses conditions pathologiques, telles que le diabète, le cancer, l’infection par le VIH, les maladies neurodégénératives et hépatiques (Franco et al., 2007). L’intérêt du dosage du glutathion a été par ailleurs noté pour juger de la réponse au traitement chez des patients atteints de cancer, l’état le plus favorable étant lorsque les concentrations de GSH érythrocytaire (donc également de GSH tumoral) étaient basses. L’exercice physique conduit à des variations du statut en glutathion dans le sang, le foie et les muscles. Une diminution de la concentration de GSH intracellulaire est notée avec l’âge, corrélée avec la baisse de la capacité antioxydante totale plasmatique (Pandey et Rizvi, 2010). • β-carotène

Le β-carotène appartient à la grande famille des caroténoïdes, constituée de plus de 600 pigments identifiés dans de nombreux fruits et légumes, dotés de propriétés antioxydantes. Le β-carotène est notamment capable de piéger les radicaux hydroxyles (•OH) et peroxyles (RO2•), et ainsi d’inhiber les chaînes de peroxydation lipidique ; il neutralise également l’oxygène singulet ( 1O2) (Halliwell et Gutteridge, 1999). Le β-carotène protège ainsi les lipoprotéines de basse densité (LDL), dans lesquelles il est transporté à raison d’environ 0,3 molécule par particule LDL. En outre, le β-carotène, tout comme l’α-carotène et la β-cryptoxanthine, sont des caroténoïdes précurseurs de la vitamine A (ou rétinal) chez l’homme, de sorte que le β-carotène est une provitamine A (Tee, 1992). ■ Principe analytique

Le GSH intracellulaire est compartimentalisé en « pools redox » distincts, cytosolique, mitochondrial, au niveau du réticulum endoplasmique et du noyau. Dans le cytosol, les concentrations de GSH se situent entre 2 et 10 mM dans la plupart des types cellulaires. Le rapport GSH/GSSG dans la cellule en conditions physiologiques est en faveur du GSH (environ 100/1 dans le foie) et se trouve diminué au cours d’un stress oxydant ou de processus apoptotiques (Circu et Aw, 2010).

Le dosage du β-carotène est préférentiellement réalisé sur sérum ou sur plasma hépariné, car la présence d’EDTA, oxalate ou citrate diminue les concentrations de β-carotène, peut-être en catalysant des réactions d’isomérisation ou d’oxydation (Nierenberg, 1985). Il est important de souligner que toutes les étapes du dosage nécessitent une protection vis-à-vis de la lumière. La méthode la plus couramment utilisée pour déterminer la concentration sérique de β-carotène est la CLHP en phase inverse, qui permet d’ailleurs la séparation de l’ensemble des caroténoïdes (Hart et Scott, 1995). La précipitation des protéines est effectuée par l’addition d’éthanol, puis les caroténoïdes sont extraits par un solvant organique (généralement l’hexane) avant le dosage. L’acétate de tocophérol est souvent utilisé comme étalon interne, avec une détection à 292 nm, alors que les caroténoïdes absorbent à 450 nm, ce qui nécessite un détecteur UV/visible. Il est d’ailleurs possible de mesurer simultanément sept caroténoïdes (lutéine, zéaxanthine, canthaxanthine, β-cryptoxanthine, lycopène, α-carotène et β-carotène), le rétinol et l’α-tocophérol dans le sérum par CLHP. Le suivi à quatre longueurs d’onde (292, 325, 450 et 473 nm) avec un détecteur à barrette de diodes permet d’augmenter la spécificité et la sensitivité, ce qui peut présenter un intérêt dans les études nutritionnelles et épidémiologiques (Thérond et al., 2000).

■ Apport dans l’investigation bioclinique

■ Valeurs fréquentes

Le GSH constitue un marqueur du statut redox intracellulaire extrêmement sensible, et sa diminution est précoce lors d’un

La concentration usuelle sérique de β-carotène est comprise entre 0,20 et 0,80 μmol/L. Des variations de la concentration

■ Valeurs fréquentes

131

4557_2_.book Page 132 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

sérique des caroténoïdes, et donc en particulier du β-carotène, peuvent survenir chez un même individu, notamment au cours des saisons, ce qui peut nécessiter d’adapter la taille des populations étudiées au cours d’études épidémiologiques afin de tenir compte de cette variabilité (Cantilena et al., 1992). La concentration sérique de β-carotène constitue un reflet de la consommation de végétaux (Su et Arab, 2006). ■ Apport dans l’investigation bioclinique

Une étude récente suggère que les concentrations sériques de β-carotène, ainsi que celles de deux autres caroténoïdes, le lycopène et la lutéine, constituent des biomarqueurs d’un régime riche en fruits et légumes ; ils pourraient jouer un rôle important dans la protection contre l’oxydation des LDL, impliquée dans les premiers stades de l’athérogenèse et leur détermination pourrait ainsi présenter un intérêt sur le plan clinique (Karppi et al., 2010). Un risque plus faible de cancer du poumon serait également associé à des concentrations sériques plus élevées (hors supplémentation) de β-carotène (19 %), ainsi que d’autres caroténoïdes : lycopène (28 %), lutéine et zéaxanthine (17 %), β-cryptoxanthine (15 %), et rétinol (27 %). Ces observations suggèrent que la consommation de fruits et légumes riches en caroténoïdes pourrait réduire le risque de cancer du poumon (Holick et al., 2002). Les fumeurs présentent d’ailleurs une concentration abaissée de β-carotène (ainsi que de lycopène) (Graham et al., 2010). Très récemment, une relation inverse entre la concentration circulante de β-carotène et l’incidence de syndrome métabolique a été montrée dans une population japonaise, suggérant que les caroténoïdes pourraient également jouer un rôle dans la prévention de cette pathologie (Suzuki et al., 2011).

4 ■■ STRATÉGIE D’UTILISATION DES BIOMARQUEURS Il n’est pas clairement établi que les ERO ou les ERN aient un rôle causal ou de propagation dans des pathologies humaines impliquant un stress oxydant. Cependant, la mise en évidence d’un stress oxydant accru au cours de certaines conditions pathologiques a conduit à utiliser des biomarqueurs de stress oxydant et/ ou nitrosant afin de développer des stratégies diagnostiques, thérapeutiques et préventives visant à retarder ou empêcher le développement de complications. Ces biomarqueurs devraient ainsi permettre d’aider au diagnostic d’une pathologie et fournir des éléments pour montrer l’efficacité de nouveaux traitements (figure 8). Rappelons qu’en théorie un biomarqueur devrait posséder plusieurs propriétés : être un produit stable, ne subissant pas de modifications artéfactuelles de sa concentration (par induction, oxydation, au cours du stockage ou de l’analyse) ; être un produit majeur des dommages oxydants et/ou nitrosants pouvant être impliqués dans l’initiation et/ou la progression d’une maladie ; être accessible dans un tissu cible et refléter l’oxydation de ce tissu ; être présent à des concentrations suffisamment importantes ; être spécifique des ERO et/ou ERN et ne pas dépendre de facteurs confondants tels que le régime alimentaire ; être non

132

invasif ; être mesurable par un dosage spécifique, sensible et reproductible ; être facile à détecter et mesurer dans des populations, avec une faible variabilité intra-individuelle. Aucun des marqueurs actuellement disponibles ne remplit les conditions de ce marqueur idéal. L’utilisation d’un ensemble de biomarqueurs augmente leur valeur prédictive. La validation d’un marqueur utilisable dans le domaine du stress oxydant/nitrosant se heurte à une dernière étape qui est sa validation dans une étude épidémiologique, souvent difficile à mener à bien. En effet, du fait de la complexité des pathologies humaines associées au stress oxydant, il est généralement impensable qu’un seul marqueur suffise. Ces biomarqueurs devraient être capables de fournir une évaluation exacte du degré de stress oxydant dans des études cliniques visant à évaluer l’efficacité d’une thérapeutique antioxydante afin de prévenir ou diminuer les risques de complications (figure 8). Toutefois, ce type d’investigations nécessite une parfaite connaissante du mode d’action pharmacologique des antioxydants, ce qui n’est pas toujours le cas. Ainsi, bien que des modèles in vitro démontrent un effet protecteur d’antioxydants, les preuves cliniques du pouvoir protecteur des antioxydants sont extrêmement controversées (Lonn et al., 2005 ; Bjelakovic et al., 2007). Jusqu’à présent, peu d’efforts ont été menés pour valider des marqueurs sensibles et spécifiques de stress oxydant. Une étude américaine menée par le « National Institute of Environmental Health Sciences » (NIEHS) a examiné plusieurs marqueurs dans un même système modèle (administration de CCl 4 à des rats), afin de déterminer les plus spécifiques, sensibles et sélectifs (Kadiiska et al., 2005a ; Kadiiska et al., 2005b). Les auteurs concluent que les concentrations plasmatiques de MDA et de 8-isoPGF2α (mesurées toutes les deux par CG-NICI-MS) et les concentrations urinaires de 8-isoPGF2α (mesurées par immunoanalyse ou par LC-MS/MS) sont des candidats prometteurs en tant que biomarqueurs généraux du stress oxydant, mais ils ne sont toujours pas validés dans des circonstances pathologiques fréquentes dans lesquelles le stress oxydant est une composante bien établie, par exemple les pathologies cardiovasculaires (Strobel et al., 2011). En revanche, d’autres marqueurs tels que les produits d’oxydation des protéines plasmatiques ou de l’ADN leucocytaire ne sont pas des marqueurs fiables de l’attaque radicalaire induite par CCl4. Bien sûr, d’autres modèles nécessitent d’être testés. Dans

Biomarqueur de stress oxydant et/ou nitrosant

Évaluation exacte du degré de stress oxydant Aide au diagnostic précoce de la pathologie Indication de la progression de la pathologie Évaluation de l’efficacité d’une thérapeutique antioxydante

Figure 8

■ Stratégie d’utilisation potentielle des biomarqueurs de stress oxydant et/ou nitrosant.

4557_2_.book Page 133 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs d’oxydation des biomolécules et systèmes de défense antioxydants

cette même approche, et de façon un peu paradoxale par rapport à leur utilisation dans un cadre diagnostique, les marqueurs de stress oxydant pourraient trouver un intérêt comme marqueurs d’exposition à des toxiques de la vie quotidienne, par exemple la pollution de l’air ambiant (pour revue, Møller et Loft, 2010). Il peut s’agir là d’une « niche », qui donnerait à ces biomarqueurs un intérêt en termes de Santé Publique non négligeable. L’évolution vers un panel de biomarqueurs utilisables en évaluation clinique est connue sous le nom d’analyses multiplexées, permettant de tester des biomarqueurs candidats sur une plus large échelle, dans des groupes de pathologies variées (Granger et al., 2004).

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

5 ■■ BIOMARQUEURS EN PROSPECTIVE Les difficultés analytiques ou d’interprétation biologique (ou les deux) que nous avons décrites pour les marqueurs actuels ont stimulé la recherche d’une meilleure évaluation du stress oxydant biologique in vivo et, à ce titre, trois approches complémentaires ont pu être développées : – l’évaluation de nouveaux biomarqueurs plus pertinents car plus spécifiques et d’approche analytique plus précise. Après l’étude des produits d’oxydation des lipides, c’est celle des produits d’oxydation des protéines et des bases nucléotidiques qui pourrait être dans l’avenir plus informative. Le dosage de la 3-nitrotyrosine peut compléter l’évaluation de l’oxydation protéique déjà appréciée par les protéines carbonylées : la quantification de ce produit d’oxydation de la tyrosine par le peroxynitrite, lui-même issu de la combinaison d’un anion superoxyde avec le monoxyde d’azote, est déjà proposée sous la forme d’une trousse ELISA commerciale, dont la sensibilité est cependant très insuffisante pour une utilisation dans les fluides biologiques. De même, les méthodes de dosage par CLHP ont été décrites et validées, mais pour l’instant dans le cadre de la recherche uniquement. On peut imaginer que les années à venir verront apparaître des méthodes ayant une limite de détection beaucoup plus faible, permettant l’évaluation quantitative des concentrations plasmatiques de la 3-nitrotyrosine dans les fluides biologiques. Néanmoins, à ce jour, les dosages posent toujours des problèmes de fidélité, transférabilité et, pour certains, d’une certaine incertitude sur la nature-même de la (des) molécule(s) effectivement dosée(s). L’oxydation des bases nucléotidiques de l’ADN et/ou de l’ARN conduit à de très nombreux produits d’oxydation. En complément de la 8OHdG, d’autres bases oxydées pourront certainement être détectées et dosés au niveau sanguin et urinaire par des méthodologies de plus en plus sophistiquées et disponibles dans les laboratoires d’analyses spécialisées, en particulier la CLHP couplée à la spectrométrie de masse (simple ou le plus souvent en tandem, CLHP-SM/SM). – l’application de nouvelles méthodologies analytiques. Ces nouvelles méthodologies devraient permettre à la fois une meilleure caractérisation de produits d’oxydation jusque-là non révélés

par les techniques habituelles, et une évaluation quantitative plus spécifique et plus sensible. L’analyse protéomique de fluides biologiques (sang, urines, LCR) par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF ou sa version dérivée SELDI-TOF et les méthodologies qui en sont issues pourraient permettre d’identifier les profils d’expression protéomique caractéristiques d’états pathologiques associant un stress oxydant aigu ou chronique. Après cette mise en évidence, la démarche protéomique classique permettra alors d’identifier les protéines dont l’expression est modifiée par le stress oxydant et, dans un deuxième temps, de développer des méthodologies de dosage habituelles (type ELISA) pour leur dosage dans les mêmes fluides biologiques. L’analyse chromatographique de type CLHP couplée à la spectrométrie de masse a déjà été citée précédemment ; elle s’adresse préférentiellement à l’identification et au dosage de molécules (produits d’oxydation de macromolécules) de petite taille et présente l’avantage, par rapport à l’analyse protéomique, d’être plus accessible aux laboratoires d’analyse. Comme dans d’autres domaines, le couplage en série de deux masses (spectrométrie de type masse-masse) permet en plus d’identifier les fragments des molécules initiales et donc d’affiner/ confirmer la nature des molécules initialement détectées. – L’application de nouvelles stratégies d’exploration biologique, en particulier l’analyse combinée de biomarqueurs et l’établissement de profils biologiques de stress oxydant doit être privilégiée, mais de manière raisonnée, scientifique et rationnelle. À l’image du développement de profils protéomiques associant la détermination quantitative de multiples protéines par une puce à protéines, le dosage multiple de biomarqueurs du stress oxydant, explorant à la fois les défenses antioxydantes et les produits d’oxydation, devra mieux appréhender le stress oxydant dans sa globalité au sein d’un organisme. Cependant, une telle démarche doit être concertée et plus « qualitative » dans le choix rigoureux des biomarqueurs que « quantitative » dans l’addition (parfois à outrance) de marqueurs mal maîtrisés. Ainsi, les panels associant 10 à 15 (ou plus encore) biomarqueurs peu informatifs ou analytiquement peu fiables sont à proscrire impérativement ; en revanche, on peut imaginer, et le travail reste encore à faire, le couplage de 4 ou 5 biomarqueurs explorant différentes facettes du potentiel antioxydant de l’organisme et différents processus d’oxydation de macromolécules, dont l’analyse sous forme d’un algorithme, pondérant les marqueurs les uns par rapport aux autres selon leur importance biologique, fournirait une appréciation globale et cependant réelle d’un stress oxydant accru ou d’une déplétion de protection antioxydante.

Les perspectives dans l’évaluation biologique précise du statut antioxydant sont fondées sur trois approches : – l’évaluation de nouveaux biomarqueurs ; – l’application de nouvelles méthodologies analytiques ; – l’application de nouvelles stratégies d’exploration biologique, par combinaison de biomarqueurs.

133

4557_2_.book Page 134 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Références bibliographiques Abiaka C, Al-Awadi F, Olusi S (2000). Effect of storage on the activities of superoxide dismutase, glutathione reductase and glutathione peroxidase. Clin Chem, 46 : 566-567. Adachi J, Matsushita S, Yoshioka N, Funae R, Fujita T, Higuchi S, Ueno Y (2004). Plasma phosphatidylcholine hydroperoxide as a new marker of oxidative stress in alcoholic patients. J Lipid Res, 45 : 967-971. Aejmelaeus RT, Holm P, Kaukinen U, Metsä-Ketelä TJ, Laippala P, Hervonen AL, Alho HE (1997). Age-related changes in the peroxyl radical scavenging capacity of human plasma. Free Radic Biol Med, 23 : 69-75. Agarwal R, Chase SD (2002). Rapid, fluorometric-liquid chromatographic determination of malondialdehyde in biological samples. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 775 : 121-126. Ahmed N, Babaei-Jadidi R, Howell SK, Beisswenger PJ, Thornalley PJ (2005). Degradation products of proteins damaged by glycation, oxidation and nitration in clinical type 1 diabetes. Diabetologia, 48 : 1590-1603. Akbulut H, Akbulut KG, Icli F, Buyukcelik A (2003). Daily variations of plasma malondialdehyde levels in patients with early breast cancer. Cancer Detect Prev, 27 : 122-126. Alamdari DH, Kostidou E, Paletas K, Sarigianni M, Konstas AG, Karapiperidou A, Koliakos G (2005). High sensitivity enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method for measuring protein carbonyl in samples with low amounts of protein. Free Radic Biol Med, 39 : 1362-1365. Anderson ME (1996). Glutathione. In : Punchard NA, Kelly FJ (editors). Free radicals : a practical approach. First Edition. New York : Oxford University Press ; p. 213-226. Arab K, Steghens JP (2004). Plasma lipid hydroperoxides measurement by an automated xylenol orange method. Anal Biochem, 325 : 158-163. Arca M, Natoli S, Micheletta F, Riggi S, Di Angelantonio E, Montali A, Arguelles S, Garcia S, Maldonado M, Machado A, Ayala A (2004). Do the serum oxidative stress biomarkers provide a reasonable index of the general oxidative stress status ? Biochim Biophys Acta, 1674 : 251-259. Auerbach BJ, Kiely JS, Cornicelli JA (1992). A spectrophotometric microtiter-based assay for the detection of hydroperoxy derivatives of linoleic acid. Anal Biochem, 201 : 375-380. Ayaori M, Hisada T, Suzukawa M, Yoshida H, Nishiwaki M, Ito T, Nakajima K, Higashi K, Yonemura A, Ohsuzu F, Ishikawa T, Nakamura H (2000). Plasma and redox status of ascorbic acid and levels of lipid peroxidation products in active and passive smokers. Environ Health Perspect, 108, 2 : 105-108. Barnham KJ, Masters CL, Bush AI (2004). Neurodegenerative diseases and oxidative stress [Review]. Nat Rev Drug Discov, 3 : 205-214. Bartosz G (2010). Non-enzymatic antioxidant capacity assays : Limitations of use in biomedicine. Free Radic Res., 44 : 711-20. Basu S, Helmersson J (2005). factors regulating isoprostane formation in vivo [Review]. Antiox Redox Signal, 7 : 221-235. Basu S. Isoprostanes : novel bioactive products of lipid peroxidation [Review] (2004). Free Radical Res, 38 : 105-122. Benzie IFF, Starin JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of « antioxidant power » : the FRAP assay. Anal Biochem 1993 ; 58 : 3521-3532.

134

Bjelakovic G, Nikolova D, Gluud LL, Simonetti RG, Gluud C (2007). Mortality and randomized trials of antioxidant supplements for primary and secondary prevention. Sytematic review and meta-analysis. JAMA, 297 : 842-857. Blankenberg S, Rupprecht HJ, Bickel C, Torzewski M, Hafner G, Tiret L, Smieja M, Cambien F, Meyer J, Lackner KJ (2003). Glutathione peroxidase 1 activity and cardiovascular events in patients with coronary artery disease. N Engl J Med, 349 : 1605-1612. Bohr VA (2002). Repair of oxidative DNA damage in nuclear and mitochondrial DNA, and some changes with aging in mammalian cells. Free Radic Biol Med, 32 : 804-812. Bonnefont-Rousselot D, Lacomblez L, Jaudon MC, Lepage S, Salachas F, Bensimon G, Bizard C, Doppler V, Delattre J, Meininger V (2000a). Blood oxidative stress in amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci, 178 : 57-62. Bonnefont-Rousselot D, Bastard JP, Jaudon MC, Delattre J (2000b). Consequences of the diabetic status on the oxidant/antioxidant balance. Diabetes Metab, 26 : 163-176. Cadet J, Douki T, Gasparutto D, Ravanta JL (2005). Réactions d’oxydation et cibles biologiques : acides nucléiques. In : Delattre J, Beaudeux J-L, Bonnefont-Rousselot D (Eds). Radicaux libres et stress oxydant. Aspects biologiques et pathologiques. Lavoisier, Paris. Brennan ML, Penn MS, Van Lente F (2003). Prognostic value of myeloperoxidase in patients with chest pain. N Engl J Med, 349 : 15951604. Ceballos-Picot I, Trivier JM, Nicole A, Sinet PM, Thevenin M (1992). Age-correlated modifications of copper-zinc superoxide dismutase and glutathione-related enzyme activities in human erythrocytes. Clin Chem, 38 : 66-70. Buhl R, Holroyd K, Mastrangeli A, Cantin AM, Jaffe AH, Wells FB (1989). Systemic glutathione deficiency in symptom-free HIV-seropositive individuals. Lancet, i : 1294-1298. Burgos Alves MI, Avilès Plaza F, Martinez-Tomas R, Sanchez-Campillo M, Larqué E, Perez-Llamas F, Martinez-Hernandez P, Parra Pallares S (2010). Oxidized LDL and its correlation with lipid profile and oxidative stress biomarkers in young healthy Spanish subjects. J Physiol Biochem, 66 : 221-227. Cakatay U (2005). Protein oxidation parameters in type 2 diabetic patients with good and poor glycaemic control. Diabetes Metabolism, 31 : 551-557. Cantilena LR, Stukel TA, Greenberg ER, Nann S, Nierenberg DW (1992). Diurnal and seasonal variation of five carotenoids measured in human serum. Am J Clin Nutr, 55 : 659-663. Cao G, Booth SL, Sadowski JA, Prior RL. Increases in human plasma antioxidant capacity after consumption of controlled diets high in fruits and vegetables. Am J Clin Nutr 1998, 68 : 1081-1087. Cerne D, Jurgens G, Ledinski G, Kager G, Greilberger J, Lukac-Bajalo J (2002). Relationship between the sialic acid content of low density lipoprotein (LDL) and autoantibodies to oxidized LDL in the plasma of healthy subjects and patients with atherosclerosis. Clin Chem Lab Med, 40 : 15-20. Charach G, George J, Afek A, Waexler D, Sheps D, Keren G, Rubinstein A (2009). Antibodies to oxidized LDL as predictors of morbidity and mortality in patients with chronic heart failure. J Card Fail, 15 : 770-774.

4557_2_.book Page 135 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs d’oxydation des biomolécules et systèmes de défense antioxydants

Chiou CC, Chang PY, Chan EC, Wu TL, Tsao KC, Wu JT (2003). Urinary 8-hydroxydeoxyguanosine and its analogs as DNA markers of oxidative stress : development of an ELISA and measurement in both bladder and prostate cancers. Clin Chim Acta, 334 : 87-94. Circu ML, Aw TY (2010). Reactive oxygen species, cellular redox systems, and apoptosis. Free Radic Biol Med, 48 : 749-762. Collins AR (2005). Assays for oxidative stress and antioxidant status : applications to research into the biological effectiveness of polyphenols. Am J Clin Nutr, 81 : 261S-267S. Comporti M, Signorini C, Arezzini B, Vecchio D, Monaco B, Gardi C (2008). F2-isoprostanes are not just markers of oxidative stress. Free Radic Biol Med, 44 : 247-256. Conti M, Morand PC, Levillain P, Lemonnier A (1991). Improved fluorometric determination of malonaldehyde. Clin Chem, 37 : 1273-1275. Cracowski JL, Durand T, Bessard G (2002). Isoprostanes as a biomarker of lipid peroxidation in humans : physiology, pharmacology and clinical implications [Review]. Trends Pharmacol Sci, 23 : 360366. Dalle-Donne I, Rossi R, Giustarini D, Milzano A, Colombo R (2003) Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress. Clin Chim Acta, 329 : 23-38. Dalle-Donne I, Rossi R, Colombo R, Giustarini D, Milzani A (2006). Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin Chem, 52 : 601-623. Davies MJ, Fu S, Wang H, Dean RT (1999). Stable markers of oxidant damage to proteins and their application in study of human disease [Review]. Free Radic Biol Med, 27 : 1151-1161. Delattre J, Beaudeux J-L, Bonnefont-Rousselot D (2005). Radicaux libres et stress oxydant. Aspects biologiques et pathologiques. Lavoisier, Paris. DeLeve LD, Kaplowitz N (1991). Glutathione metabolism and its role in hepatotoxicity. Pharm Ther, 52 : 287-305.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Del Rio D, Pellegrini N, Colombi B, Bianchi M, Serafini M, Torta F, Tegoni M, Musci M, Brighenti F (2003). Rapid fluorimetric method to detect total plasma malondialdehyde with mild derivatization conditions. Clin Chem, 49 : 690-692.

Franco R, Schoneveld OJ, Pappa A, Panayiotidis MI (2007). The central role of glutathione in the pathophysiology of human diseases. Arch Physiol Biochem., 113 : 234-258. Fukunaga Y, Katsuragi Y, Izumi T, Sakiyama F (1982). Fluorescence characteristics of kynurenine and N’-formylkynurenine. Their use as reporters of the environment of tryptophan 62 in hen egg-white lysozyme. J Biochem, 92 : 129-141. Fukuzawa K, Fujisaki A, Akai K, Tokumura A, Terao J, Gebicki JM (2006) Measurement of phosphatidylcholine hydroperoxides in solution and in intact membranes by the ferric-xylenol orange assay. Anal Biochem, 359 : 18-25. Gay CA, Gebicki JM (2003). Measurement of protein and lipid hydroperoxides in biological systems by the ferric-xylenol orange method. Anal Biochem, 315 : 29-35. Graham DL, Carail M, Caris-Veyrat C, Lowe GM (2010). Cigarette smoke and human plasma lycopene depletion. Food Chem Toxicol, 48 : 2413-2420. Granger CB, Van Eyk JE, Mockrin SC, Anderson NL (2004). National Heart, Lung, and Blood Institute Clinical Proteomics Working Group report. Circulation, 109 : 1697-1703. Guemouri L, Artur Y, Herberth B, Jeandel C, Cuny G, Siest G (1991). Biological variability of superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase in blood. Clin Chem, 37 : 1932-1937. Halliwell B, Gutteridge JMC (1999). Free Radicals in Biology and Medicine, 3rd Edition, Oxford University Press. Halliwell B, Whiteman M (2004). Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture : how should you do it and what do the results mean ? Br J Pharmacol, 142 : 231-255. Hammes H-P, Brownlee M, Liu J, Schleicher E, Bretzel RG (1999). Diabetic retinopathy risk correlates with intracellular concentrations of the glycoxidation product Nε-(carboxymethyl)lysine independently of glycohaemoglobin concentrations. Diabetologia, 42 : 603-607. Hansson GK (2002). Vaccination against atherosclerosis : science or fiction ? Circulation, 106 : 1599-1601.

Del Rio D, Stewart AJ, Pellegrini N (2005). A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr Metab Cardiovasc Dis, 15 : 316-328.

Hart DJ, Scott KJ (1995). Development and evaluation of an HPLC method for the analysis of carotenoids in foods, and the measurement of the carotenoid content of vegetables and fruits commonly consumed in the UK. Food Chemistry, 54 : 101-111.

Dhaouadi A, Monser L, Sadok S, Adhoum N (2006). Flow-injection methylene blue-based spectrophotometric method for the determination of peroxide values in edible oils. Anal Chim Acta, 576 : 270-274.

Hazen SL, Heinecke JW (1997). 3-Chlorotyrosine, a specific marker of myeloperoxidase-catalyzed oxidation, is markedly elevated in low density lipoprotein isolated from human atherosclerotic intima. J Clin Invest, 99 : 2075-2081.

Draper HH, Csallany AS, Hadley M (2000). Urinary aldehydes as indicators of lipid peroxdation in vivo. Free Radic Biol Med, 29 : 10711077.

Helbock HJ, Beckman KB, Shigenaga MK, Walter PB, Woodall AA, Yeo HC, Ames BN (1998). DNA oxidation matters : the HPLC-electrochemical detection assay of 8-oxo-deoxyguanosine and 8-oxoguanine. Proc Natl Acad Sci USA, 95 : 288-293.

Eckl PM, Ortner A, Esterbauer H (1993). Genotoxic properties of 4hydroxyalkenals and analogous aldehydes. Mutat Res, 290 : 183192. Esterbauer H, Schaur RJ, Zollner H (1991). Cbiochemistry of 4hydroxynonenal, malondialdehyde and related aldehydes. Free Radic Biol Med, 11 : 81-128.

Hodis HN, Kramsch DM, Avogaro P, Bittolon-Bon G, Cazzolato G, Hwang J, Peterson H, Sevanian A (1994). Biochemical and cytotoxic characteristics of an in vivo circulating oxidized low density lipoprotein (LDL). J Lipid Res, 35 : 669-677.

Fliser D, Wagner KK, Loos A, Tsikas D, Haller H (2005). Chronic angiotensin II receptor blockade reduces (intra)renal vascular resistance in patients with type 2 diabetes. J Am Soc Nephrol, 16 : 11351140.

Holick CN, Michaud DS, Stolzenberg-Solomon R, Mayne ST, Pietinen P, Taylor PR, Virtamo J, Albanes D (2002). Dietary carotenoids, serum beta-carotene, and retinol and risk of lung cancer in the alpha-tocopherol, beta-carotene cohort study. Am J Epidemiol, 156 : 536-547.

Fraley Ae, Tsimikas S (2006). Cilincal applications of circulating oxidized low density lipoprotein biomarkers in cardiovascular diseases. Curr Opin Lipidol, 17 : 502-509.

Holvoet P, Perez G, Zhao Z, Brouwers E, Bernar H, Collen D (1995). Malondialdehyd-modified low density lipoproteins in patients with atherosclerotic disease. J Clin Invest, 95 : 2611-2619.

135

4557_2_.book Page 136 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Hu CW, Wu MT, Chao MR, Pan CH, Wang CJ, Swenberg JA, Wu KY (2004). Comparison of analyses of urinary 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine by isotope-dilution-liquid chromatography with electrospray tandem mass spectrometry and by enzyme-linked immunosorbent assay. Rapid Commun Mass Spectrom, 18 : 505-510. Hulthe J, Wiklund O, Hurt-Camejo E, Bondjers G (2001). Antibodies to oxidized LDL in relation to carotid atherosclerosis, cell adhesion molecules, and phopholipase A2. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 21 : 269-274.

Danesh J. (2010). Lipoprotein-associated phospholipase A(2) and risk of coronary disease, stroke, and mortality : collaborative analysis of 32 prospective studies. Lancet, 375 : 1536-1544. Lonn E, Bosch J, Yusuf S, Sheridan P, Pogue J, Arnold JM, Ross C, Arnold A, Sleight P, Probsfield J, Dagenais GR, HOPE and HOPETOO Trial Investigators (2005). Effects of long-term vitamin E supplementation on cardiovascular events and cancer : a randomized controlled trial. JAMA, 293 : 1338-1347.

Ishigaki Y, Oka Y, Katagiri H (2009). Circulating oxidized LDL : a biomarker and a pathogenic factor. Curr Opin Lipidol, 20 : 363-369.

Mc Cord J, Fridovich I (1969). Superoxide dismutase, an enzymatic function for eythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem, 244 : 60496055.

Itabe H, Ueda M (2007). Measurement of plasma oxidized Low-density lipoprotein and its clinical implications. J Ather Thromb, 14 : 111.

Møller P, Loft S (2010). Oxidative damage to DNA and lipids as biomarkers of exposure to air pollution. EnvironHealth Perspect, 118 : 1126-1136.

Iuliano L, Micheletta F, Natoli S, Ginanni Corradini S, Jappelli M, Elisei W, Giovanelli L, Violi F, Diczfalusy U (2003). Measurement of oxysterols and alpha-tocopherol in plasma and tissue samples as indices of oxidant stress status. Anal Biochem, 312 : 217-223.

Mello AP, da Silva IT, Abdalla DS, Damasceno NR (2011). Electronegative low-density lipoprotein : origin and impact on health and disease. Atherosclerosis, 215 : 257-265.

Janssen LJ. Isoprostanes : an overview and putative roles in pulmonary pathophysiology [Review] (2001). Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 280 : L1067-L1082. Johanson L, Borg L (1988). A spectrophotometric method for determination f catalase activity in small tissue samples. Anal Biochem, 174 : 331-336. Kadiiska MB, Gladen BC, Baird DD, Germolec D, Graham LB, Parker CE, Nyska A, Wachsman JT, Ames BN, Basu S, Brot N, Fitzgerald GA, Floyd RA, George M, Heinecke JW, Hatch GE, Hensley K, Lawson JA, Marnett LJ, Morrow JD, Murray DM, Palstaras J, Roberts LJ 2nd, Rokach J, Shigenaga MK, Sohal RS, Sun J, Tice RR, Van Thiel DH, Wellner D, Walter PB, Tomer KB, Mason RP, Barrett JC (2005a). Biomarkers of oxidative stress study II. Are oxidation products of lipids, proteins, and DNA markers of CCl4 poisoning ? Free Radic Biol Med, 38 : 698-710. Kadiiska MB, Gladen BC, Baird DD, Graham LB, Parker CE, Ames BN, Basu S, Fitzgerald GA, Lawson JA, Marnett LJ, Morrow JD, Murray DM, Plastaras J, Roberts LJ 2nd, Rokach J, Shigenaga MK, Sun J, Walter PB, Tomer KB, Barrett JC, Mason RP (2005b). Biomarkers of oxidative stress study III. Effects of the nonsteroidal anti-inflammatory agents indomethacin and meclofenamic acid on measurements of oxidative products of lipids in CCl4 poisoning. Free Radic Biol Med, 38 : 711-718. Karatas F, Karatepe M, Baysar A (2002). Determination of free malondialdehyde in human serum by high-performance liquid chromatography. Anal Biochem, 311 : 76-79. Karppi J, Nurmi T, Kurl S, Rissanen TH, Nyyssönen K (2010). Lycopene, lutein and β-carotene as determinants of LDL conjugated dienes in serum. Atherosclerosis, 209 : 565-572. Knight JA, Pieper RK, McClellan L (1988). Specificity of the thiobarbituric acid reaction : its use in studies of lipid peroxidation. Clin Chem, 34 : 2433-2438.

Milne GL, Sanchez SC, Musiek ES, Morrow JD (2007). Quantification of F2-isoprostanes as a biomarker of oxidative stress. Nature Protocols, 2 : 221-226. Montine TJ, Quinn JF, Milatovic D, Silbert LC, Dang T, Sanchez S, Terry E, Roberts LJ 2nd, Kaye JA, Morrow JD (2002). Peripheral F2isoprostanes and F4-neuroprostanes are not increased in Alzheimer’s disease. Ann Neurol, 52 : 175-179. Montine TJ, Montine KS, McMahan W, Markesbery WR, Quinn JF, Morrow JD (2005). F2-isoprostanes in Alzheimer and other neurodegenerative diseases [Review]. Antioxid Redox Signal, 7 : 269275. Montuschi P, Barnes PJ, Roberts LJ (2004). Isoprostanes : markers and mediators of oxidative stress [Review]. FASEB J, 18 : 17911800. Morrow JD (2005). Quantification of isoprostanes as indices of oxidant stress and the risk of atherosclerosis in humans [Review]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 25 : 279-286. Muhlestein JB, May HT, Jensen JR, Horne BD, Lanman RB, Lavasani F, Wolfert RL, Pearson RR, Yannicelli HD, Anderson JL. (2006). The reduction of inflammatory biomarkers by statin, fibrate, and combination therapy among diabetic patients with mixed dyslipidemia : the DIACOR (Diabetes and Combined Lipid Therapy Regimen) study. J Am Coll Cardiol, 48 : 396-401. Mulder DJ, Water TV, Lutger s HL, Graaff R, Gans RO, Zijlstra F, Smit AJ (2006). Skin autoluorescence, a novel marker for glycemic and oxidative stress-derived advanced glycation endproducts : an overview of current clinical studies, evidence, and limitations. Diabetes Technol Ther, 8 : 523-535. Nierenberg DW (1985). Serum and plasma beta-carotene levels measured with an improved method of high-performance liquid chromatography. J Chromatogr, 339 : 273-284.

Kolodgie FD, Burke AP, Skorija KS, Ladich E, Kutys R, Makuria AT, Virmani R (2006). Lipoprotein-associated phospholipase A2 protein expression in the natural progression of human coronary atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 26 : 2523-2529.

Nobecourt E, Jacqueminet S, Hansel B, Chantepie S, Grimaldi A, Chapman MJ, Kontush A (2005). Defective antioxidative activity of small dense HDL3 particles in type 2 diabetes : relationship to elevated oxidative stress and hyperglycaemia. Diabetologia, 48 : 529538.

Lee BL, Ong CN (2009). Comprehensive high-performance liquid chromatographic method for the measurements of lipophilic antioxidants in human plasma. J Chromatogr A, 1216 : 3131-3137.

Odetti P, Fogarty J, Sell DR, Monnier VM (1992). Chromatographic quantitation of plasma and erythrocyte pentosidine in diabetic and uremic subjects. Diabetes, 41 : 153-159.

Lp-PLA2 Studies Collaboration, Thompson A, Gao P, Orfei L, Watson S, Di Angelantonio E, Kaptoge S, Ballantyne C, Cannon CP, Criqui M, Cushman M, Hofman A, Packard C, Thompson SG, Collins R,

Olinski R, Gackowski D, Rozalski R, Foksinski M, Bialkowski K (2003). Oxidative DNA damage in cancer patients : a cause or a consequence of the disease development ? Mutat Res, 531 : 177-190.

136

4557_2_.book Page 137 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs d’oxydation des biomolécules et systèmes de défense antioxydants

Paglia DE, Valentine WN (1967). Studies on quantitative and qualitative characterization of erythrocyte gluatathione peroxidase activity. J Lab Clin Med, 70 : 158-169.

liquid chromatography using methyl malondialdehyde as an internal standard. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 785 : 337-344.

Pandey KB, Rizvi SI. Markers of oxidative stress in erythrocytes and plasma during aging in humans. Oxid Med Cell Longev 2010, 3 : 212.

Slatter DA, Bolton CH, Bailey AJ (2000). The importance of lipid-derived malondialdéhyde in diabetes mellitus [Review]. Diabetologia, 43 : 550-557.

Peoples MC, Karnes HT (2005). Recent developments in analytical methodology for 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine and related compounds. J Chromatogr B, 827 : 5-15.

Spickett CM, Wiswedel I, Siems W, Zarkovic K, Zarkovic N (2010). Advances in methods for the determination of biologically relevant lipid peroxuidation products. Free Radic Res, 44 : 1172-1202.

Pilger A, Ivancsits S, Germadnik D, Rudiger HW (2002). Urinary excretion of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine measured by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. J Chromatogr B, 778 : 393-401.

St Clair DK, Chow CK (1996). Glutathione peroxidase : activity and steady-state level of mRNA. In : Punchard NA, Kelly FJ. Free radicals : a practical approach. Oxford University Press, New York, pp. 227-240.

Pratico D, Clark CM, Lee VM, Trojanowski JQ, Rokach J, Fitzgerald GA (2000). Increased 8,12-iso-iPF2alpha-VI in Alzheimer’s disease : correlation of a non-invasive index of lipid peroxidation with disease severity. Ann Neurol, 48 : 809-812.

Steghens JP, van Kappel AL, Denis I, Collombel C (2001). Diaminonaphtalene, a new highly specific reagent for HPLC-UV measurement of total and free malondialdehyde in human plasma or serum. Free Radic Biol Med, 31 : 242-249.

Pratico D, Lawson JA, Rokach J, Fitzgerald GA (2001). The isoprostanes in biology and medicine [Review]. Trends Endocrinol Metab, 12 : 243-247.

Stocker R, Keaney JF Jr (2004). Role of oxidative modification in atherosclerosis [Review]. Physiol Rev, 84 : 1381-1478.

Pratico D, Rokach J, n Lawson J, Fitzgerald GA (2004). F2-isoprostanes as indices of lipid peroxidation in inflammatory diseases [Review]. Chem Phys Lipids, 128 : 165-171. Pryor RL, Cao G (1999). In vivo total antioxidant capacity : comparison of different analytical methods. Free Radic Biol Med, 27 : 11731181.

Stojiljkovic MP, Lopes HF, Zhang D, Morrow JD, Goodfriend TL, Egan BM (2002). Increasing plasma fatty acids elevates F2-isoprostanes in humans : implications for the cardiovascular risk factor cluster. Circulation, 20 : 1215-1221.

Ravanat JL, Guicherd P, Tuce Z, Cadet J (1999). Simultaneous determination of five oxidative DNA lesions in human urine. Chem Res Toxicol, 12 : 802-808.

Strobel NA, Fassett RG, Marsh SA, Coombes JS (2011). Oxidative stress biomarkers as predictors of cardiovascular disease. Int J Cardiol, 147 : 191-201.

Richelle M, Turini ME, Guidoux R, Tavazzi I, Metairon S, Fay LB (1999). Urinary isoprostane excretion is not confounded by the lipid content of the diet. FEBS Lett, 459 : 259-262.

Su LJ, Arab L (2006). Salad and raw vegetable consumption and nutritional status in the adult US population : results from the Third National Health and Nutrition Examination Survey. J Am Diet Assoc, 106 : 1394-1404.

Roberts LJ, Morrow JD. Measurement of F2-isoprostanes as an index of oxidative stress in vivo [Review] (2000). Free Radic Biol Med, 28 : 505-13. Rodenburg J, Vissers MN, Wiegman A, Miller ER, Ridker PM, Witztum JL, Kastelein JJ, Tsimikas S (2006). Oxidized low density lipoprotein in children with familial hypercholesterolemia and unaffected siblings : effect of pravastatin. J Am Coll Cardiol, 47 : 1803-1810. Schwedhelm E, Bartling A, Lenzen H, Tsikas D, Mass R, Brummer J, Gutzki FM, Berger J, Frolich JC, Boger RH (2004). Urinary 8-isoprostaglandin F2α as a risk marker in patients with coronary heart disease : a matched case-control study. Circulation, 109 : 843-848.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Stocks J, Miller NE (1998). Capillary electrophoresis to monitor the oxidative modification of low density lipoproteins. J Lipid Res, 39 : 1305-1309.

Schwedhelm E, Boger RH (2005). Application of gas chromatographymass spectrometry for analysis of isoprostanes : their role in cardiovascular disease [Review]. Clin Chem Lab Med, 7 : 269-275. Shoji T, Nishizawa Y, Fukumoto M, Shimamura K, Kimura J, Kanda H, Emoto M, Kawagishi T, Morii H (2000). Inverse relationship between circulating oxidized low density lipoprotein (oxLDL) and anti-oxLDL antibody levels in healthy subjects. Atherosclerosis, 14 : 171-177. Siems W, Grune T (2003). Intracellular metabolism of 4-hydroxynonenal [Review]. Mol Aspects Med, 24 : 167-175.

Sudhir K (2005). Clinical review : Lipoprotein-associated phospholipase A2, a novel inflammatory biomarker and independent risk predictor for cardiovascular disease. J Clin Endocrinol Metab, 90 : 3100-3105. Suttnar J, Masova L, Dyr JE (2001). Influence of citrate and EDTA anticoagulants on plasma malondialdehyde concentrations estimated by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Bioled Sci Appl, 751 : 193-197. Suzuki K, Ito Y, Inoue T, Hamajima N (2011). Inverse association of serum carotenoids with prevalence of metabolic syndrome among Japanese. Clin Nutr, 30 : 369-375 Tan AL, Forbes JM, Cooper ME. AGE, RAGE, and ROS in diabetic nephropathy. Semin Nephrol, 27 : 130-143. Tee ES (1992). Carotenoids and retinoids in human nutrition. Crit Rev Food Sci Nutr, 31 : 103-163. Templar J, Kon SP, Milligan TP, Newman DJ, Raftery MJ (1999). Increased plasma malondialdehyde levels in glomerular disease as determined by a fully validated HPLC method. Nephrol Dial Transplant, 14 : 946-951.

Sigala F, Kotsinas A, Filis K, Markantonis S, Iliodromitis EK, Gorgoulis VG, Andreadou I (2010). Oxidized LDL in human carotid plaques is related to symptomatic carotid disease and lesion instability. J Vasc Surg, 52 : 704-713.

Thérond P, Couturier M, Demelier JF, Lemonnier F (1993). Simultaneous determination of the main molecular species of soybean phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine and their corresponding hydroperoxides obtained by lipoxygenase treatment. Lipids, 28 : 245-249.

Sim AS, Salonikas C, Naidoo D, Wilcken DE (2003). Improved method for plasma malondialdehyde measurement by high-performance

Thérond P, Bonnefont-Rousselot D (2005). Systèmes antioxydants endogènes. In : Delattre J, Beaudeux J-L, Bonnefont-Rousselot D.

137

4557_2_.book Page 138 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Radicaux libres et stress oxydant. Aspects biologiques et pathologiques. Lavoisier, Paris, p. 87-111. Thérond P, Bonnefont-Rousselot D, Davit-Spraul A, Conti M, Legrand A (2000). Biomarkers of oxidative stress : an analytical approach. Curr Opin Clin Metab Care, 3 : 373-384. Thornalley PJ (2005). Glycation free adduct accumulation in renal disease : the new AGE. Pediatr Nephrol, 20 : 1515-1522. Toyokuni S, Tanaka T, Hattori Y, Nishiyama Y, Yoshida A, Uchida K, Hiai H, Ochi H, Osawa T (1997). Quantitative immunohistochemical determination of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine by a monoclonal antibody N45.1 : its application to ferric nitriloacetate-induced renal carcinogenesis model. Lab Invest, 76 : 365-374. Troost R, Schwedhelm E, Rojcczyk S, Tsikas D, Frolich JC (2000). Nebivolol decreases systemic oxidative stress in healthy volunteers. Br J Clin Pharmacol, 50 : 377-379. Tsikas D, Schwedhelm E, Suchy MT, Niemann J, Gutzki FM, Erpenbeck VJ, Hohlfeld JM, Surdacki A, Frolich JC (2003). Divergence in urinary 8-iso-PGF(2α) (iPF(2α)-III, 15-F(2t)-IsoP) levels from gas chromatography-tandem mass spectrometry quantification after thin-layer chromatography and immunoaffinity column chromatography reveals heterogeneity of 8-iso-PGF(2α). Possible methodological, mechanistic and clinical implications. J Chromatogr B, 794 : 237-255. Tsimikas S, Bergmark C, Beyer RW, Patel R, Pattison J, Miller E, Juliano J, Witztum JL (2003). Temporal increases in plasma markers of oxidized low-density lipoprotein strongly reflect the presence of acute coronary syndromes. J Am Coll Cardiol, 41 : 360-370. Tsouli SG, Kiortsis DN, Xydis V, Argyropoulou MI, Elisaf M, Tselepis AD (2006). Antibodies against various forms of midly oxidized lowdensity lipoprotein are not associated with carotid intima-media thickness in patients with primary hyperlipidemia. Angiology, 57 : 616-622. Uchida K (2003). 4-hydroxy-2-nonenal : a product and mediator of oxidative stress [Review]. Prog Lipid Res, 42 : 318-343. Uchida K, Stadtman ER (1992). Modification of histidine residues in proteins by reaction with 4-hydroxynonenal. Proc Natl Acad Sci USA, 89 : 4544-4548.

138

Verzijl N, DeGroot J, Thorpe SR, Bank RA, Shaw JN, Lyons TJ, Bijlsma JWJ, Lafeberi FPJG, Baynes JW, TeKoppele JM (2000). Effect of collagen turnover on the accumulation of advanced glycation endproducts. J Biol Chem, 275 : 39027-39031. Virella G, Lopes-Virella MF (2003). Lipoprotein autoantibodies : measurement and siginifcance. Clin Diag Lab Immunol, 10 : 499-505. Wang Z, Ciabattoni G, Creminon C, Lawson J, Fitzgerald GA, Patrono C, Maclouf J (1995). Immunological characterization of urinary 8-epi-prostaglandin F2α excretion in man. J Pharmacol Exp Ther, 275 : 94-100. Wautier MP, Massin P, Guillausseau PJ, Huijberts M, Levy B, Boulanger E, Laloi-Michelin M, Wautier JL (2003). N(carboxymethyl)lysine as a biomarker for microvascular complications in type 2 diabetic patients. Diabetes Metab, 29 : 44-52. Wilson DW, Metz HN, Graver LM, Rao PS (1997). Direct method for quantification of free malondialdehyde with high-performance capillary electrophoresis in biological samples. Clin Chem, 43 : 1982-1984. Wilson R, Lyall K, Smyth L, Fernie CE, Riemersma RA (2002). Dietary hydroxy fatty acids are absorbed in humans : implications fro the measurement of « oxidative stress » in vivo. Free Radic Biol Med, 32 : 162-168. Wood LG, Fitzgerald DA, Gibson PG, Cooper DM, Garg ML (2000). Lipid peroxidation as determined by plasma isoprostanes is related to disease severity in mild asthma. Lipids, 35 : 967-974. Wood LG, Gibson PG, Garg ML (2003). Biomarkers of lipid peroxidation, airway inflammation and asthma [Review]. Eur Respir J, 21 : 177-186. Yagi K (1976). A simple fluorometric assay for lipoperoxide in blood plasma. Biochem Med, 15 : 2433-2438. Yoneyama Y., Sawa R, Suzuki S, Doi D, Yoneyama K, Otsubo Y, Araki T (2002). Relationship between plasma malondialdéhyde levels and adenosine deaminase activities in preeclampsia. Clin Chim Acta, 322 : 169-173. Ziech D, Franco R, Georgakilas AG, Georgakila S, Malamou-Mitsi V, Schoneveld O, Pappa A, Panayiotidis MI (2010). The role of reactive oxygen species and oxidative stress in environmental carcinogenesis and biomarker development. Chem Biol Interact, 188 : 334-339.

4557_2_.book Page 139 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

9 Mise en évidence et exploration des dyslipoprotéinémies Dominique Bonnefont-Rousselot, Alain Legrand

OBJECTIFS DE L’EXPLORATION 1 ■■ RAPPELS SUR LA COMPOSITION, LE MÉTABOLISME ET LE RÔLE DES LIPOPROTÉINES 1.1. 1.2.

Structure des lipoprotéines Métabolisme des lipoprotéines

2 ■■ EXPLORATION USUELLE DES DYSLIPOPROTÉINÉMIES 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5.

Aspect du sérum Dosage du cholestérol total et des triglycérides Dosage du cholestérol-HDL et du cholestérol-LDL Dosage des apolipoprotéines A-I et B Analyses complémentaires du bilan d’exploration usuelle

3 ■■ EXPLORATION SPÉCIALISÉE DES DYSLIPOPROTÉINÉMIES 3.1. 3.2.

Analyse des lipoprotéines Caractérisation et analyse des causes des dyslipoprotéinémies

CONCLUSION

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Références bibliographiques

139

4557_2_.book Page 140 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4557_2_.book Page 141 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Mise en évidence et exploration des dyslipoprotéinémies

OBJECTIFS DE L’EXPLORATION Les dyslipoprotéinémies correspondent aux variations de concentrations des lipoprotéines usuelles et/ou l’apparition de lipoprotéines anormales. La mise en évidence et le typage des dyslipoprotéinémies et plus particulièrement des hyperlipoprotéinémies seront fondamentaux pour la bonne adaptation de toute démarche diététique et/ou thérapeutique appropriée. Afin de pouvoir interpréter correctement les anomalies du métabolisme lipidique, il est nécessaire, tout d’abord, de faire quelques rappels sur la composition, le métabolisme et le rôle des lipoprotéines. L’exploration des dyslipoprotéinémies présentée ensuite comportera deux parties : – l’exploration usuelle mettant en œuvre les tests classiques pratiqués dans tout laboratoire de biologie clinique et qui sont pratiquement tous inscrits à la nomenclature des actes de biologie médicale. Cette exploration bien conduite et interprétée permettra de mettre en évidence les dyslipoprotéinémies et de typer une hyperlipoprotéinémie éventuellement constatée, selon les critères de la classification internationale de Fredrickson (rappelée dans le tableau 4) ; – l’exploration spécialisée effectuée dans un deuxième temps nécessitera pour sa mise en œuvre ciblée un dialogue clinicobiologique. Elle aura pour but dans le cas d’une hyperlipoprotéinémie de la classification de Fredrickson de caractériser la cause de l’anomalie métabolique, et dans le cas d’une autre dyslipoprotéinémie (hypolipoprotéinémie, lipoprotéines anormales) de l’analyser et de tenter d’en trouver l’origine.

1 ■■ RAPPELS SUR LA COMPOSITION, LE MÉTABOLISME ET LE RÔLE DES LIPOPROTÉINES

1.1.

Structure des lipoprotéines

Les lipides circulant dans le sang ne sont pas solubles dans l’eau : certains sont totalement insolubles et hydrophobes (cholestérol

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Cholestérol libre

estérifié et triglycérides) alors que d’autres ont une partie de leur structure polaire et hydrophile (phospholipides et cholestérol non estérifié). Ils sont associés avec des protéines spécifiques (apolipoprotéines) sous forme de complexes solubles, les lipoprotéines. Les lipoprotéines ont une structure sphérique dans laquelle le noyau (« core » lipidique) est constitué des lipides hydrophobes (triglycérides et cholestérol estérifié) entourés par une couche de phospholipides, de cholestérol non estérifié et d’apolipoprotéines (figure 1), ces deux constituants ayant la partie polaire de leur structure orientée vers l’extérieur.

1.1.1. Les constituants des lipoprotéines ■ Les lipides

Les lipides des lipoprotéines sont présents dans les cellules intestinales à partir des apports alimentaires ou synthétisés dans les cellules hépatiques (origine endogène). L’alimentation apporte environ 100 g par jour de triglycérides (40 % de l’énergie) et 0,30 à 0,50 g de cholestérol. L’organisme synthétise environ 1 g de cholestérol par jour. Ces lipides sont indispensables à l’organisme et aux cellules jouant un rôle de structure (lipides membranaires), ou de précurseur pour le cholestérol (hormones stéroïdiennes, acides biliaires…) ou de source d’énergie (acide gras des triglycérides…). ■ Les apolipoprotéines

Les apolipoprotéines participent à la structure et aux différents processus du métabolisme des lipoprotéines. Il y a 10 apolipoprotéines principales bien caractérisées et classées selon une nomenclature alphabétique, dont les principales caractéristiques et propriétés sont rappelées dans le tableau 1. Parmi les principales fonctions des apolipoprotéines, on peut citer : – un rôle de structure ; – un rôle d’activation des enzymes du métabolisme des lipoprotéines : Lécithine Cholestérol Acyltransférase (LCAT) pour l’apolipoprotéine A-I et Lipoprotéine Lipase (LPL) pour l’apolipoprotéine C-II ; – un rôle de reconnaissance des lipoprotéines par les récepteurs cellulaires (récepteurs E, B/E et A-I).

Apolipoprotéines

Phospholipides Esters de cholestérol Triglycérides

Figure 1

■

Structure d’une lipoprotéine.

141

4557_2_.book Page 142 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Tableau 1

■

Les principales apolipoprotéines (Couderc et Legrand, 1996).

Apolipoprotéine

Concentration plasmatique (g/L)

Lieu de synthèse

Masse mol. apparente (× 103)

A-I

1,0-1,2

Foie, Intestin

28

Activateur de la LCAT, Efflux de cholestérol

HDL, Chylomicrons

A-II

0,3-0,5

Foie, Intestin

17

Transport… ?

HDL, Chylomicrons

A-IV

0,16

Intestin

46

Efflux de cholestérol

Chylomicrons, HDL

B-100

0,7-1,00

Foie

550

Sécrétion des VLDL, Ligand du récepteur LDL

VLDL, IDL, LDL

B-48

0,03-0,05

Intestin

275

Sécrétion des chylomicrons

Chylomicrons

CI

0,04-0,06

Foie

7

Activateur de la LCAT (in vitro)

Chylomicrons, VLDL, HDL

CII

0,03-0,05

Foie

9

Activateur LPL

Chylomicrons, VLDL, HDL

CIII

0,12-0,14

Foie

9

Inhibiteur LPL

Chylomicrons, VLDL, HDL

D

0,06-0,07

Foie

33

Transport du cholestérol

Chylomicrons, HDL

E

0,03-0,05

Foie, Intestin, Surrénale, Macrophages

38

Ligand du récepteur LDL et du récepteur des chylomicrons résiduels

IDL, Chylomicrons, VLDL, HDL

(a)

< 0,01

Foie

300-800

Transport – Réparation des brèches vasculaires ?

Lp(a)

Fonction

1.1.2. La classification des lipoprotéines Les lipoprotéines sont classées en fonction de leur densité (VLDL : lipoprotéines de très basse densité, LDL : lipoprotéines de basse densité, HDL : lipoprotéines de haute densité) ou de leur migration électrophorétique (respectivement pré-β, β et α). Suivant leur composition lipidique et protéique, les lipoprotéines ont des densités différentes permettant de les isoler par ultracentrifugation : la densité croît avec la teneur en protéines. En ce qui concerne la composition en lipides et en apolipoprotéines il est important de noter que : – pour les lipides, tous les constituants sont présents dans toutes les lipoprotéines et qu’il existe une spécialisation de transport pour chaque lipoprotéine correspondant au rôle de cette lipoprotéine ; – pour les apolipoprotéines il y a une spécificité de répartition, directement en rapport avec les fonctions des apolipoprotéines dans le métabolisme des lipoprotéines. Le tableau 2 donne la composition des lipoprotéines ainsi que leurs principales propriétés physico-chimiques. On observe que les deux lipoprotéines les plus légères donc les plus riches en lipides (chylomicrons et VLDL) sont aussi les plus riches en triglycérides alors que les lipoprotéines les moins légères et les plus denses assurent surtout le transport du cholestérol et des phospholipides. La lipoprotéine (a) ou Lp(a) est une lipoprotéine particulière : elle présente une composition similaire aux LDL avec une molécule d’apolipoprotéine (a) en plus pour chaque molécule d’apoB100, ces deux apolipoprotéines étant reliées par un pont disulfure. Une concentration plasmatique élevée de Lp(a), indépen-

142

Association aux lipoprotéines

dante de celle du LDL, constitue un facteur indépendant de risque cardiovasculaire.

1.2.

Métabolisme des lipoprotéines

Le métabolisme des lipoprotéines est réalisé par un ensemble de réactions nombreuses et complexes qui contrôlent la synthèse des constituants lipidiques et apolipoprotéiniques, l’assemblage des lipoprotéines, leur sécrétion hors des cellules et leur dégradation plasmatique ou tissulaire. Les grandes étapes du métabolisme des lipoprotéines sont sous la dépendance d’enzymes assurant la transformation ou la dégradation des lipoprotéines, de protéines de transfert qui accélèrent l’échange de lipides entre les lipoprotéines et de récepteurs qui assurent la captation cellulaire des lipoprotéines. Il existe deux types d’enzymes intervenant dans le métabolisme des lipoprotéines : les lipoprotéines lipases (Lipoprotéine Lipase LPL et Triglycéride Lipase Hépatique TGLH) qui assurent l’hydrolyse des triglycérides des lipoprotéines qui en sont riches (chylomicrons, VLDL et IDL) et la Lécithine Cholestérol Acyltransférase (LCAT) qui permet l’estérification du cholestérol au niveau des HDL. Différents récepteurs cellulaires permettant la captation des lipoprotéines ont été mis en évidence : il s’agit des récepteurs E, B/E et A-I reconnaissant spécifiquement les apolipoprotéines des lipoprotéines. Les concentrations plasmatiques des lipoprotéines dépendent du bon équilibre métabolique entre les différentes lipoprotéines

4557_2_.book Page 143 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Mise en évidence et exploration des dyslipoprotéinémies

Tableau 2

■

Propriétés physicochimiques et composition des principales lipoprotéines (Couderc et Legrand, 1996). Masse Diamètre moléculaire (nm) moyenne (Da)

Migration électrophorétique en agarose

Apos majeures

5 109

Dépôt

B-48

2-4

1-3

80-95

3-6

1-2

30-70

7,5.106

Pré-β

B-100,CII, E

15

5

50-60

15-20

10

1,019-1,063

15-25

2,5.106

β

B-100

37

8

10

22

25

HDL

1,063-1,21

6-14

3 105

α

A-I, A-II

14

3

8

22

45-55

Lp(a)

1,05-1,08

≥ 25

5,5.106

entre pré-β et β

B-100, (a)

32

7

9

23

29

Lipoprotéine

Densité (kg/L)

CM

< 0,94

100-1 000

VLDL

0,94-1,006

LDL

CM : chylomicrons. VLDL : lipoprotéines de très faible densité.

LDL : lipoprotéine de faible densité. HDL : lipoprotéine de forte densité.

permanentes qui est régulièrement modifié par les apports cycliques des lipides alimentaires.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

1.2.1. Lipoprotéines transportant les lipides alimentaires : chylomicrons Les chylomicrons constituent les formes de transport des lipides alimentaires (100 g de triglycérides et 0,30 à 0,50 g de cholestérol par jour en moyenne). Ils sont synthétisés par les entérocytes, qui synthétisent aussi les apolipoprotéines A-I et B48, pendant les périodes de digestion ; après sécrétion dans les capillaires lymphatiques, ils gagnent la circulation sanguine par le canal lymphatique. Ces lipoprotéines, après transfert d’apolipoprotéine C-II des HDL, subissent rapidement une hydrolyse de leurs triglycérides par les lipoprotéines lipases synthétisées par les tissus adipeux et musculaire. Au cours de cette hydrolyse, des éléments de l’enveloppe des chylomicrons se détachent et rejoignent le pool des HDL. Les acides gras libérés sont utilisés comme élément énergétique (muscle) ou recombinés sous forme de triglycérides de réserve (tissu adipeux). Ce catabolisme est « explosif » (durée de demi-vie de 10 à 20 minutes) ; cela explique que les chylomicrons soient normalement absents de la circulation sanguine après 12 heures de jeûne lipidique Il conduit à la libération d’édifices résiduels (« remnants ») qui, pour certains, participeront à la formation de HDL et pour d’autres, seront captés par le foie (récepteurs E).

1.2.2. Lipoprotéines légères contenant l’apolipoprotéine B-100 : VLDL-LDL La synthèse des VLDL, lipoprotéines riches en triglycérides (endogènes) est réalisée de façon continue par les cellules hépatiques. La dégradation plasmatique des VLDL est identique, dans un premier temps, à celle des chylomicrons, sous l’influence des lipoprotéines lipases adipocytaire ou musculaire. Elle aboutit après hydrolyse des triglycérides à la formation d’IDL (« Intermediate

Cholestérol Cholestérol estérifié non estérifié (%) (%)

Triglycérides (%)

PhosphoProtéines lipides (%) (%)

Lp(a) : lipoprotéine (a).

Density Lipoproteins ») qui sont, pour une partie, internalisées par les récepteurs hépatiques E et B/E (reconnaissance de l’apoE) et pour le reste, dégradées par la Triglycéride Lipase Hépatique (TGLH) aboutissant à la formation de LDL, lipoprotéines riches en cholestérol et ne renfermant au point de vue protéique que l’apolipoprotéine B-100. Les LDL ainsi formées ont pour rôle de transporter aux tissus périphériques les constituants lipidiques (cholestérol) dont ils ont besoin. Les LDL sont reconnues par leur apoB (récepteur B/E) et après endocytose, sont dégradées en tous leurs constituants moléculaires. La concentration du cholestérol intracellulaire déclenche les mécanismes régulant la concentration des LDL circulantes (voir figure 2) : – rétroinhibition de la biosynthèse du cholestérol au niveau de l’HMGCoA réductase, enzyme clé de cette biosynthèse ; – contrôle négatif de la synthèse des récepteurs LDL ; – mise en réserve du cholestérol sous forme d’ester par stimulation de l’enzyme intracellulaire Acyl-Coenzyme A-CholestérolAcyl-Transférase (ACAT). La majorité des LDL est captée par le foie qui est le seul organe capable d’éliminer le cholestérol (sous forme de sels biliaires). Si les VLDL sont rapidement catabolisées (durée de demi-vie de 4 à 6 h), il n’en est pas de même des LDL dont la durée de vie dépasse plusieurs jours. Lorsque la persistance des LDL dans la circulation se prolonge, ces lipoprotéines peuvent subir diverses modifications (oxydation, glycation…) affectant l’apolipoprotéine B et rendant impossible la reconnaissance par les récepteurs B/E. Les LDL ainsi modifiées sont alors reconnues et internalisées par des récepteurs spécifiques (récepteurs « scavenger » = éboueurs) au niveau des macrophages issus des monocytes circulants. Ce processus intervient « physiologiquement » à concentration normale en LDL et il est majoré en cas d’augmentation de concentration de cette lipoprotéine : quand les macrophages sont surchargés en esters de cholestérol (absence de régulation), ils se transforment en cellules spumeuses à l’origine de la formation des stries lipidiques et des plaques d’athérome.

143

4557_2_.book Page 144 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Recyclage du récepteur

Endosome

Lysosome

Digestion lysosomale

AA

(2) Synthèse de récepteur (1)

CHOLESTÉROL

(3) ⊕ ACAT Esters de cholestérol

HMG-CoA Synthèse réductase endogène Acétyl-CoA

Figure 2

■

Captation et catabolisme des LDL.

1.2.3. Lipoprotéines impliquées dans l’épuration en cholestérol des tissus périphériques : HDL Les HDL naissantes, d’origine hépatique ou provenant du catabolisme des chylomicrons, contiennent du cholestérol très peu estérifié et ont une structure discoïdale. Sous l’influence de la Lécithine Cholestérol Acyltransférase (LCAT), les esters de cholestérol formés migrent au centre des édifices et transforment les HDL discoïdales en HDL sphériques. Les sites de surface du cholestérol non estérifié étant ainsi libérés grâce à l’action de la LCAT, la particule peut à nouveau accepter du cholestérol non estérifié à partir des lipoprotéines à apoB (chylomicrons, VLDL, LDL) et des membranes cellulaires des tissus périphériques. Une fois estérifié, le cholestérol des HDL est en partie échangé avec des triglycérides des chylomicrons et des VLDL. Cet échange est facilité par une protéine spécifique : la CETP (« Cholesteryl Ester Transfer Protein »). La figure 3 résume le métabolisme des lipoprotéines chez l’homme. Le tableau 3 résume les principales caractéristiques métaboliques et fonctionnelles des lipoprotéines, leurs durées de demi-vie ainsi que les proportions qui en découlent dans le sérum d’un sujet normolipémique.

2 ■■ EXPLORATION USUELLE DES DYSLIPOPROTÉINÉMIES L’exploration d’une anomalie lipidique (Legrand et Beucler, 2000) comprend dans un premier temps la détermination du cholestérol

144

total (CT) et des triglycérides (TG). Dans le cadre du dépistage d’une anomalie lipidique, les dosages du cholestérol total et des triglycérides, compte tenu de leur présence dans toutes les lipoprotéines mais en proportions différentes, doivent être associés. C’est en effet la comparaison des résultats obtenus qui permettra d’orienter vers un type ou un autre de dyslipoprotéinémie. Afin d’apprécier les proportions des LDL et HDL, l’évaluation du risque athérogène lipidique mettra en outre en œuvre le dosage du cholestérol-HDL (CHDL) et le cholestérol-LDL (CLDL) sera calculé par la formule de Friedewald (CLDL = CT – CHDL – TG/5 en g/L ou TG/2,2 en mmol/L). Les dosages des apolipoprotéines AI, B ainsi que de la Lp(a) et le lipoprotéinogramme apporteront un bon complément notamment en présence d’hypertriglycéridémies importantes qui rendent certains dosages ou interprétations difficiles ou impossibles. En dépistage et surtout en vérification d’un premier bilan, les analyses doivent impérativement être exécutées à partir d’un sérum prélevé après 12 heures de jeûne. La période de jeûne pourra être réduite à 10 heures pour les prélèvements ultérieurs si la pathologie ne concerne pas les triglycérides.

2.1.

Aspect du sérum

L’aspect du sérum doit être systématiquement analysé. C’est un examen très simple, préliminaire à toute autre investigation. Son interprétation correctement effectuée, permet de typer d’emblée certaines dyslipoprotéinémies ou d’éviter (confrontée aux autres tests) une erreur d’interprétation. L’aspect du sérum découle directement de l’aspect des lipoprotéines en solution : les HDL et les LDL du fait de leur petite taille ne modifient pas la limpidité du

4557_2_.book Page 145 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Mise en évidence et exploration des dyslipoprotéinémies

HDL naissantes Lipides alimentaires

B LDL 100

LDL modifiées

LH Sels biliaires

Intestin

Foie

E

E

B 100

Tissus périphériques

Macrophages

LP L

IDL

LCAT

Cholestérol tissulaire VLDL

E "Remnants"

C

A HDL3

B 48 Chylomicrons

LCAT

B 48

LP L

E

B 100

CNE PL APO

C

HDL2

LH

TG Échange et transfert

CE CETP

: récepteur B, E des LDL

CETP : protéine de transfert de cholestérol estérifié

CNE : cholestérol non estérifié

: récepteur E des remnants

LH : lipase hépatique

CE : cholestérol estérifié

: récepteur des HDL (apo AI)

LPL : lipoprotéine lipase

Apo : apolipo protéine

: récepteur des LDC modifiés

LCAT : lécithine cholestérol acyltransférase

PL : phospholipides TG : triglycérides

Figure 3

■

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Tableau 3

Métabolisme normal des lipoprotéines chez l’homme (Couderc et Legrand, 1996).

■

Caractéristiques fonctionnelles des lipoprotéines circulantes (Couderc et Legrand, 1996).

Lipoprotéines

Origine

Durée de demi-vie plasmatique

Proportion Sérum N après 12 h de jeûne

Fonction principale

Chylomicrons

Intestin

10 à 20 min

0

Transport des TG exogènes

VLDL

Foie

4à6h

5 à 10 %

Transport des TG endogènes et précurseurs des LDL

LDL

Catabolisme des VLDL via les IDL

3 à 4 jours

50 à 55 %

Transport du cholestérol

HDL

Foie-Intestin : Catabolisme des chylomicrons et VLDL

3 à 4 jours

40 à 45 %

Transport inverse du cholestérol

145

4557_2_.book Page 146 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

sérum lorsque leur concentration est augmentée ; au contraire, du fait de leur grande taille, les chylomicrons et les VLDL confèrent un aspect trouble quand ces fractions sont augmentées. En outre les chylomicrons, de par leur très faible densité, auront la propriété de remonter spontanément à la surface du sérum à + 4 °C (test de crémage). Ainsi, un sérum opalescent ou lactescent peut correspondre à une augmentation des VLDL et/ou à un défaut d’épuration des chylomicrons (test de crémage positif). Un sérum d’aspect limpide traduit un bilan lipidique normal ou, en cas d’hyperlipoprotéinémie, une augmentation des LDL ou des HDL. L’aspect du sérum permet en outre de s’assurer que la valeur des triglycérides est cohérente. En effet un aspect limpide ne peut pratiquement pas coexister avec une hypertriglycéridémie importante (supérieure à 3 g/L ou 3,45 mmol/L) qui évoque une augmentation des VLDL et/ou la présence de chylomicrons. En cas de discordance il conviendra d’envisager de doser le glycérol libre du sérum dont l’augmentation sera responsable d’une fausse hypertriglycéridémie (voir dosage des triglycérides).

2.2.

Dosage du cholestérol total et des triglycérides

Le cholestérol total est actuellement dosé dans la totalité des laboratoires d’analyses médicales par des méthodes enzymatiques, utilisant une estérase et une oxydase : la cholestérol estérase réalise l’hydrolyse des esters du cholestérol puis la cholestérol oxydase effectue l’oxydation du cholestérol non estérifié, pour

aboutir à la formation de peroxyde d’hydrogène. La quantification du peroxyde d’hydrogène est le plus souvent effectuée, en présence de peroxydase et d’un chromogène phénolique par la réaction de Trinder (méthode sélectionnée par la SFBC). Ces méthodes donnent des résultats très proches de ceux fournis par la méthode de référence SFBC (séparation chromatographique gaz liquide utilisant une colonne capillaire). Dans les conditions d’utilisation actuelle de ces techniques, les réactions enzymatiques mises en œuvre pour l’hydrolyse des stérides et l’oxydation du cholestérol sont spécifiques (les autres stérols pouvant interférer sont présents en trop faible proportion). Cependant les réactions de révélation du peroxyde d’hydrogène et notamment la réaction de Trinder sont sujettes à plusieurs interférences ou causes d’erreurs (hémolyse, bilirubine, certaines substances réductrices comme l’acide ascorbique par exemple). Ces interférences affectent tous les dosages dont la réaction de révélation utilise une peroxydase et un chromogène phénolique (glucose, acide urique, cholestérol, triglycérides et phospholipides…) (Steinmetz, 1990). Les triglycérides sont dosés par des méthodes enzymatiques dans tous les laboratoires. Toutes les méthodes enzymatiques de dosage des triglycérides reposent sur la mesure du glycérol libéré après action d’une lipase. La réaction de dosage du glycérol consiste : – soit à mesurer l’absorbance à 340 nm après action d’une glycérol-deshydrogénase en présence de NADH,H + (15 % des participants au dernier échange interlaboratoires de contrôle de qualité) ;

Fausse hypertriglycéridémie par hyperglycérolémie Monsieur S., 46 ans, est suivi régulièrement pour une hypertriglycéridémie toujours comprise entre 4 et 5 mmol/L dépistée depuis 10 ans, malgré un régime pauvre en graisses. Il présente un bon état général, pas de surpoids, un régime alimentaire équilibré, pas d’autre facteur de risque cardiovasculaire, en particulier une bonne activité physique, pas de tabagisme et une pression artérielle normale. L’exploration de sa fonction cardiovasculaire ne révèle aucune anomalie, notamment en ce qui concerne les ECG de repos et d’effort, l’échographie des artères cervicales et des membres inférieurs est normale. Il n’existe pas d’antécédents familiaux de maladie métabolique, que ce soit sur le plan lipidique ou glucidique. Son bilan lipidique effectué après 12 heures de jeûne montre par ailleurs un sérum limpide, une cholestérolémie comprise dans les valeurs usuelles (5,2 mmol/L) et un cholestérol-HDL également normal (1,5 mmol/L). L’association d’un sérum limpide avec une nette hypertriglycéridémie (4,0 mmol/L) est inhabituelle et fait suspecter une hyperglycérolémie. Un laboratoire spécialisé pratique alors le dosage du glycérol, dont la concentration est élevée (3,5 mmol/L). En parallèle est réalisé un lipoprotéinogramme, qui met en évidence l’absence d’augmentation des pré-β-lipoprotéines et une absence de chylomicrons. Il s’agissait donc d’une fausse hypertriglycéridémie par hyperglycérolémie, la concentration des triglycérides vrais étant seulement alors de 0,5 mmol/L. Chez l’adulte, le déficit en glycérol-kinase à l’origine de cette hyperglycérolémie est totalement asymptomatique, ne présente pas de caractère de gravité et ne nécessite aucun régime ni traitement hypolipémiant.

146

4557_2_.book Page 147 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Mise en évidence et exploration des dyslipoprotéinémies

– soit à procéder à une mesure colorimétrique après action d’une glycérol kinase et d’une glycérol phosphate oxydase, aboutissant à la formation de peroxyde d’hydrogène apprécié, comme précédemment pour le cholestérol, par la réaction de Trinder (85 % des laboratoires participants). Ces techniques mesurent donc le glycérol provenant de l’hydrolyse des triglycérides, mais aussi le glycérol présent sous forme libre dans le plasma. Les valeurs physiologiques du glycérol libre dépassent rarement 0,1 mmol/L, mais une élévation de sa concentration peut s’observer dans : – les déficits congénitaux en glycérol kinase (affections très rares et non graves où la glycérolémie peut atteindre des valeurs très élevées, à plus de 10 mmol/L) ; – les troubles du rythme cardiaque et le diabète (on peut observer des glycérolémies allant jusqu’à 2-3 mmol/L) ; – certaines thérapeutiques : héparine (comme activateur de la lipoprotéine lipase assurant l’hydrolyse des triglycérides), glycérol (utilisé en neurologie), les dérivés trinitrés… ; – certains états physiologiques comme le jeûne. Dans ces circonstances, avec les techniques dosant le glycérol total, il en résulte de fausses « hypertriglycéridémies » que le biologiste peut détecter par l’aspect du sérum limpide incohérent avec des « triglycérides » élevés avec l’absence d’augmentation des VLDL ou pré-bêta lipoprotéines à l’électrophorèse. Dans ces conditions, un dosage du glycérol libre devra être pratiqué (en supprimant l’hydrolyse par la lipase) afin d’obtenir, par déduction du glycérol total, la concentration de triglycérides « vrais ».

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

2.3.

Dosage du cholestérol-HDL et du cholestérol-LDL

Les dosages du cholestérol-HDL et du cholestérol-LDL permettent une très bonne appréciation des lipoprotéines correspondantes. Ces paramètres sont essentiels et leurs valeurs, notamment pour le cholestérol-LDL constituent les seuils d’intervention ou les cibles pour le traitement des hypercholestérolémies (recommandations de l’Afssaps) (Agence française de sécurité sanitaire des produits de santé, 2005) (Encarts 1 et 2). Les méthodes utilisant la précipitation sélective des lipoprotéines pour le dosage du cholestérol-HDL ont été très utilisées : elles sont simples à mettre en œuvre, peu coûteuses et fiables si elles sont correctement pratiquées. Parmi les différents agents précipitants décrits (héparine/Ca2+ ou Mn2+, sulfate de dextrane/Ca2+ ou Mg2+, acide phosphotungstique/Mg2+, PEG 6 000), c’est l’acide phosphotungstique en présence d’ions Mg 2+ qui est la technique recommandée par l’ARCOL et la SFBC. Ces méthodes de dosage du cholestérol-HDL dites « de précipitation », sont semi-automatisées car toutes les étapes de distribution des échantillons et réactifs, de précipitation, de centrifugation sont manuelles : La reproductibilité inter-laboratoires des techniques de précipitation n’est pas satisfaisante : les coefficients de variation inter-laboratoires sont supérieurs à 10 % et pour plusieurs systèmes supérieurs à 20 %. Pour une bonne réalisation des dosages du cholestérol-HDL et pour obtenir une meilleure qualité dans les résultats, l’ARCOL et la SFBC avaient précisé un certain nombre de précautions à suivre (Legrand et Beucler, 2000) :

– la centrifugation des lipoprotéines précipitées doit être effectuée à 5 000 g pendant au moins 10 minutes ; – après précipitation des LDL-VLDL et centrifugation, le surnageant contenant les HDL doit être séparé rapidement du précipité ; – il est nécessaire de s’assurer que le surnageant de précipitation est limpide ; – la technique de dosage utilisée pour la détermination du cholestérol dans le surnageant doit être adaptée aux concentrations mesurées (entre 0 et 2 mmol/L soit 0 à 0,80 g/L) ; – les résultats obtenus ne sont fiables que si la précipitation des lipoprotéines légères est totale. En cas d’hyperVLDLémies importantes ou en présence de chylomicrons, la précipitation est incomplète et le surnageant de centrifugation, outre les HDL, peut renfermer des lipoprotéines très légères ce qui conduit à un résultat erroné. Dans ces circonstances le surnageant de précipitation n’est pas limpide mais opalescent ou lactescent (présence de VLDL et/ou de chylomicrons). La limite de validité de la technique a été fixée à une valeur de la triglycéridémie inférieure à 4 mmol/L. Malgré toutes ces recommandations, les résultats sont restés médiocres, ce qui a amené le développement de méthodes pour le dosage du cholestérol-HDL direct. Dans ces méthodes, un premier réactif (R1) masque l’accessibilité des lipoprotéines qui possèdent l’apolipoprotéine B (chylomicrons, VLDL et LDL), au réactif du dosage du cholestérol (R2). Le réactif R1 contient soit des sulfates d’alpha-cyclodextrine et de dextrane (α-CD), soit des polyanions détergents (PA-D) ou encore des anticorps anti-β lipoprotéines (AC). Ces méthodes sont simples, précises et reproductibles. Selon des travaux menés par l’ARCOL, elles sont bien corrélées avec la méthode recommandée de précipitation à l’acide phosphotungstique pour de nombreux automates (r ≥ 0,98) pour les méthodes α-CD et PA-D. Les méthodes α-CD et PA-D sont linéaires pour des valeurs du C-HDL de 0,9 à 6 mmol/L. Les résultats ne sont pas modifiés par des ajouts de VLDL (TG < 8 mmol/L pour α-CD et TG < 6 mmol/L pour PA-D) et de LDL (C-LDL < 11,5 mmol/L, α-CD et < 8,8 mmol/L, PA-D). Aucune interférence n’est observable avec des ajouts de chylomicrons (TG < 12 mmol/L) (Egloff et al., 1999). Ces méthodes, de par leurs qualités vérifiées par différents experts de l’ARCOL et la SFBC, sont maintenant recommandées. Compte tenu de l’apparition sur le marché de nouvelles méthodes par dosage direct, et des recommandations internationales et nationales en matière de diagnostic et de suivi des dyslipidémies (Afssaps, NCEP), l’Afssaps a mis en place entre 2004 et 2006 un contrôle du marché portant sur les dispositifs de dosage du cholestérol-HDL. Cette évaluation est disponible sur le site de l’Afssaps (www.afssaps.sante.fr). Le cholestérol-LDL est habituellement calculé par la formule de Friedewald (Friedewald et al., 1972) : C-LDL = CT – C-HDL – TG/ 2,2 mmol/L (ou TG/5 g/L). Dans de nombreuses études ces valeurs sont très bien corrélées à celles obtenues par la bêtaquantification des LDL (combinant une ultracentrifugation et le dosage du C-HDL par précipitation). Cette méthode de référence inapplicable en pratique quotidienne est donc très avantageusement remplacée par ce calcul. Cependant cette estimation a des limites, l’extrapolation du C-VLDL étant obtenue par le calcul de

147

4557_2_.book Page 148 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Encart 1

■

Prise en charge thérapeutique du patient dyslipidémique. Facteurs de risque cardiovasculaire devant être pris en compte pour le choix de l’objectif thérapeutique selon les valeurs de LDL-cholestérol.

Facteurs de risque • Âge – homme de 50 ans ou plus – femme de 60 ans ou plus • Antécédents familiaux de maladie coronaire précoce – infarctus du myocarde ou mort subite avant 55 ans chez le père ou chez un parent du 1er degré de sexe masculin ; – infarctus du myocarde ou mort subite avant 65 ans chez la mère ou chez un parent du 1er degré de sexe féminin ; • • • •

Tabagisme actuel ou arrêté depuis moins de 3 ans Hypertension artérielle permanente traitée ou non (se reporter aux recommandations spécifiques) Diabète de type 2 traité ou non (se reporter aux recommandations spécifiques) HDL-cholestérol < 0,40 g/L (1,0 mmol/L) quel que soit le sexe

Facteur protecteur • HDL-cholestérol ≥ 0,60 g/L (1,5 mmol/L) : soustraire alors « un risque » au score de niveau de risque Exemple : une femme de 60 ans ayant une concentration de HDL-cholestérol égale à 0,70 g/L (1,8 mmol/L), est considérée comme sans facteur de risque.

Les trois catégories de patients à haut risque cardiovasculaire pour lesquels le LDL-cholestérol doit être inférieur à 1 g/L. 1/ Les patients ayant des antécédents : • de maladie coronaire avérée (angor stable et instable, revascularisation, IDM, IDM silencieux documenté), • de maladie vasculaire avérée (accident vasculaire cérébral ischémique, artériopathie périphérique à partir du stade II). 2/ Les patients ayant un diabète de type 2, sans antécédent vasculaire mais ayant un haut risque cardiovasculaire défini par : • une atteinte rénale*, • ou au moins deux des facteurs de risque suivants : Âge – homme de 50 ans ou plus – femme de 60 ans ou plus Antécédents familiaux de maladie coronaire précoce – infarctus du myocarde ou mort subite avant 55 ans chez le père ou chez un parent du 1er degré de sexe masculin ; – infarctus du myocarde ou mort subite avant 65 ans chez la mère ou chez un parent du 1er degré de sexe féminin ; Tabagisme actuel ou arrêté depuis moins de 3 ans Hypertension artérielle permanente traitée ou non (se reporter aux recommandations spécifiques) HDL-cholestérol < 0,40 g/L (1,0 mmol/L) quel que soit le sexe microalbuminurie (> 30 mg/24 heures). 3/ Les patients ayant un risque > 20 % de faire un événement coronarien dans les 10 ans (risque calculé à partir d’une équation de risque)** (140 − âge ans ) × poids (kg ) × K en mL/min/1,73 m2 créatininémie en μmol / L K = 1,23 chez l’homme et 1,04 chez la femme

Cockroft-Gault : Clairance de la créatinine =

* Protéinurie > 300 mg/24 h ou clairance de la créatinine estimée par la formule de Cockcroft-Gault < 60 mL/min. ** Cf. ANAES : Recommandations sur les méthodes d’évaluation des risques cardio-vasculaire global.

Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé, mars 2005.

TG/5 g/L (ou TG/2,2 mmol/L). Cette extrapolation est parfaitement corrélée aux valeurs obtenues par la bêta-quantification pour des sérums avec des concentrations normales ou modérées de VLDL et en absence de chylomicrons. Par contre les auteurs de ce calcul en ont eux-mêmes souligné les limites car il devient progressivement inexact en cas d’hypertriglycéridémie et totalement dès le seuil de 4 g/L (4,55 mmol/L). En fait dans une étude

148

d’un groupe de travail de la SFBC/ARCOL qui a exploité les résultats de 2 000 bilans lipidiques cette valeur de 4 g/L paraît trop élevée et la prudence consisterait à ne plus appliquer cette formule à partir de 3,4 g/L (3,9 mmol/L). Toutefois cette mesure ne devrait pas s’appliquer à tous les sérums car cette imprécision varie beaucoup selon la cause de l’hypertriglycéridémie (VLDL et/ ou chylomicrons).

4557_2_.book Page 149 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Mise en évidence et exploration des dyslipoprotéinémies

Encart 2

■

Prise en charge thérapeutique du patient dyslipidémique. Prise en charge thérapeutique du patient dyslipidémique Prise en charge du patient dyslipidémique - Patient à risque et/ou - LDL-cholestérol > 1,6 g/L

Quand modifier son mode de vie et son alimentation ?

Quel est l’objectif thérapeutique ? Patient à haut risque cardiovasculaire : - Antécédents de maladie cardiovasculaire avérée - Diabète de type 2 à haut risque** - Risque de survenue d’un événement coronarien dans les 10 ans ≥ 20 %

≥ 3 facteurs de risque*

2 facteurs de risque*

1 seul facteur de risque*

Aucun facteur de risque

LDL-cholestérol < 2,2 g/L LDL-cholestérol < 1,9 g/L LDL-cholestérol < 1,6 g/L LDL-cholestérol < 1,3 g/L LDL-cholestérol < 1,0 g/L Facteurs de risque cardiovasculaire associés à une dyslipidémie • Âge : - homme de 50 ans ou plus - femme de 60 ans ou plus • Antécédents familiaux de maladie coronaire précoce - infarctus du myocarde ou mort subite avant 55 ans chez le père ou chez un parent du 1er degré de sexe masculin - infarctus du myocarde ou mort subite avant 65 ans chez le mère ou chez un parent du 1er degré de sexe féminin • Tabagisme actuel ou arrêté depuis moins de 3 ans • Hypertension artérielle permanente traitée ou non traitée (se reporter aux recommandations spécifiques) • Diabète de type 2 traité ou non trait (se reporter aux recommandations spécifiques) • Cholestérol-HDL < 0,40 g/L (1,0 mmol/L) quel que soit le sexe Facteur protecteur • Cholestérol-HDL ≥ 0,60 g/L (1,5 mmol/L) : soustraire alors « un risque » au score de niveau de risque

** Diabète de type 2 à haut risque * atteinte rénale * ou au moins deux des facteurs de risques suivants : âge, antécédents familiaux de maladie coronaire précoce, tabagisme, hypertension artérielle, Cholestérol-HDL < 0,40 g/L, microalbuminurie (> 30 mg/24h)

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé, mars 2005.

C’est pourquoi, comme pour le cholestérol-HDL, il est apparu depuis quelque temps des méthodes de dosage du cholestérolLDL direct. Il s’agit là aussi de la mise en œuvre dans un premier temps, de réactifs masquant certaines lipoprotéines (chylomicrons, VLDL et HDL) et ne permettant l’accessibilité des réactions enzymatiques de dosage du cholestérol qu’à la seule fraction LDL dans un deuxième temps. Les résultats d’évaluation de ces techniques sont encourageants. Les perspectives offertes par ces techniques sont grandes : elles sont automatisables et ne semblent pas sujettes à interférence pour les hypertriglycéridémies jusqu’à des concentrations en triglycérides de 10 g/L (11,4 g/L) (Benlian et al., 2000 ; Bayer et al., 2005). Ce dosage dont le développement est recommandé par le NCEP américain (National Cholesterol Education Program) devrait prendre dans les années à venir une place importante dans les investigations liées à l’exploration des lipides et lipoprotéines.

2.4.

Dosage des apolipoprotéines A-I et B

Les apolipoprotéines A-I et B du fait de leur spécificité de répartition dans les lipoprotéines sont des bons marqueurs des lipoprotéines LDL et VLDL athérogènes (apoB) et HDL antiathérogènes (apoA-I). Les dosages des apolipoprotéines A-I et B mettent en œuvre des méthodes immunologiques. Toutes les techniques actuellement utilisées sont réalisées en milieu liquide avec lecture turbidimétrique ou néphélémétrique et sont automatisées. Ces dosages ont bénéficié durant ces quinze dernières années de très gros efforts de la part des industriels pour en améliorer la qualité. Une standardisation internationale a été initiée par l’IFCC, aboutissant pour chaque apolipoprotéine au choix d’un standard primaire unique. Elle a été relayée en France dans un travail collaboratif, par l’ARCOL, la SFBC et le SFRL (Steinmetz et al., 1997). Cette standardisation a abouti à une amélioration très sensible de la qualité des résultats se situant à un niveau légèrement inférieur à celui des triglycérides mais supérieur à celui du cholestérol-

149

4557_2_.book Page 150 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

HDL. Ceci a amené à proposer le maintien de ces dosages dans l’exploration des lipides et lipoprotéines en compléments des constituants lipidiques précédemment décrits notamment lors de difficultés ou impossibilités rencontrées lors des dosages du cholestérol-HDL et/ou cholestérol-LDL, ou lors de vérifications souhaitées. Toutefois, la Haute Autorité de Santé (HAS), en septembre 2008, a restreint la réalisation des dosages d’apolipoprotéines (www.has-sante.fr). Ainsi le dosage de l’apolipoprotéine B est conseillé en cas d’hypertriglycéridémie importante (supérieure à 3,4 g/L ou 3,9 mmol/L) rendant impossible l’application de la formule de Friedewald pour le calcul du cholestérol-LDL. Dans ces conditions, avec l’apoB (en g/L), le cholestérol total et les triglycérides (en mmol/L), le LDL-cholestérol peut être calculé avec la formule de Planella (Planella et al., 1997) : Cholestérol-LDL = (0,41 × CT) – (0,32 × TG) + (1,70 × apoB)

Hormis ce cas, le dosage de l’apoB est indiqué, sur prescription médicale, dans le cas de maladies génétiques rares (dyslipidémies d’origine génétique…) et de formes extrêmes de dyslipidémies complexes. Le dosage de l’apolipoprotéine A-I sera utile pour contrôler un cholestérol-HDL pour les valeurs basses (< 0,30 g/L ou 0,77 mmol/L) ou s’il y a suspicion d’interférence analytique, et de façon plus spécifique dans le cas de maladies génétiques rares (dyslipidémies d’origine génétique…) ou de formes extrêmes de dyslipidémies complexes (sur prescription médicale). La nomenclature des actes de biologie médicale (NABM) (JORF n° 0249 du 27 octobre 2009) pour la prescription des analyses dans le domaine des lipides (chapitre 13 – sous chapitre 13.01) et reproduite ci-dessous définit les bonnes règles de ces prescriptions et d’utilisation des différents actes décrits précédemment.

Nomenclature des Actes de Biologie Médicale Chapitre 13 Biochimie Sous chapitre 13.01 Sang Lipides Les analyses de cette rubrique doivent être réalisées sur du sérum prélevé chez un patient à jeun depuis 12 heures. Si le patient n’est pas à jeun, il est nécessaire de différer le prélèvement. 0580 Cholestérol total B5 0590 Triglycérides B8 Les cotations des actes 0580 et 0590 ne sont pas cumulables avec celle de l’acte 0996. 0996 Exploration d’une anomalie lipidique (EAL) B 36 L’EAL comprend l’ensemble indissociable des analyses suivantes : Aspect du sérum, cholestérol total, triglycérides, cholestérol-HDL et le calcul du cholestérol-LDL. • Aspect du sérum, au moment de la décantation du sérum. En cas d’opalescence ou de lactescence, vérifier l’aspect du sérum conservé à 4 °C pendant 12 heures ; • Cholestérol total (CT) ; • Triglycérides (TG) ; • Cholestérol-HDL (C-HDL) : Dosage direct du cholestérol-HDL par une méthode enzymatique, standardisée et automatisable ou dosage indirect du cholestérol-HDL dans le surnageant obtenu après précipitation des lipoprotéines contenant de l’apolipoprotéine B. Quand le dosage du cholestérol-HDL est inférieur à 0,77 mmol/L (0,30 g/L), le biologiste pourra contrôler ce résultat en réalisant et cotant, à son initiative, le dosage de l’apolipoprotéine A1 (1603). Un commentaire sur le compte rendu devra alors indiquer le motif de réalisation de ce dosage. • Calcul du cholestérol-LDL (C-LDL) : Quand le taux des triglycérides est inférieur à 3,9 mmol/L (3,4 g/L), le cholestérol-LDL est exclusivement obtenu par calcul à partir de la formule de Friedewald : – C-LDL=(CT)-(C-HDL)-(TG/2,2) pour les dosages exprimés en mmol/L – C-LDL=(CT)-(C-HDL)-(TG/5) pour les dosages exprimés en g/L. Quand le taux des triglycérides est supérieur à 3,9 mmol/L (3,4 g/L), le calcul du cholestérol-LDL par la formule de Friedewald est inexact. Dans ce cas, le biologiste pourra réaliser et coter à son initiative : – soit le dosage de l’apolipoprotéine B (1602), – soit le dosage du cholestérol-LDL par une méthode directe enzymatique automatisable (2001). Un commentaire sur le compte rendu devra alors indiquer le motif de réalisation de l’acte 1602 ou 2001. Nota. Toute prescription partielle de C-HDL amène le biologiste à réaliser – et à coter – l’ensemble des examens de l’EAL (aspect, CT, TG, C-HDL et C-LDL calculé).

150

4557_2_.book Page 151 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Mise en évidence et exploration des dyslipoprotéinémies

1603 Apolipoprotéines A1 B 10 L’acte est indiqué dans les situations suivantes : • maladies génétiques rares (dyslipidémies d’origine génétique…) ; • formes extrêmes de dyslipidémies complexes ; • si, au cours d’une exploration d’une anomalie lipidique (EAL), la concentration en C-HDL est inférieure à 0,77 mmol/L (0,30 g/L) et/ou si suspicion d’interférence analytique. Une prescription médicale explicite est nécessaire pour les deux premières indications. Pour la troisième indication, l’acte pourra être réalisé à l’initiative du biologiste. Un commentaire sur le compte rendu devra alors indiquer le motif de réalisation de ce dosage. En dehors de ces indications, il n’y a pas d’utilité clinique actuellement démontrée de ce dosage dans la prise en charge thérapeutique des dyslipidémies courantes. 1602 Apolipoprotéines B B 10 L’acte est indiqué dans les situations suivantes : • maladies génétiques rares (dyslipidémies d’origine génétique…) ; • formes extrêmes de dyslipidémies complexes ; • si, au cours d’une exploration d’une anomalie lipidique (EAL), la concentration en triglycérides est supérieure à 3,9 mmol/L (3,4 g/L). Une prescription médicale explicite est nécessaire pour les deux premières indications. Pour la troisième indication, l’acte pourra être réalisé à l’initiative du biologiste. Un commentaire sur le compte rendu devra alors indiquer le motif de réalisation de ce dosage. En dehors de ces indications, il n’y a pas d’utilité clinique actuellement démontrée de ce dosage dans la prise en charge thérapeutique des dyslipidémies courantes. 2001 Dosage du cholestérol-LDL (C-LDL) B 25 Par une méthode enzymatique, directe, standardisée et automatisable à l’exception de toute autre méthode. L’acte est indiqué dans la situation suivante : si, au cours d’une exploration d’une anomalie lipidique (EAL), la concentration en triglycéridesest supérieure à 3,9 mmol/L (3,4 g/L). L’acte pourra être réalisé à l’initiative du biologiste. Un commentaire sur le compte rendu devra alors indiquer le motif de réalisation de ce dosage. Les cotations des actes 1602 et 2001 ne sont pas cumulables lorsqu’ils font suite à la réalisation d’une EAL (cotation 0996) ayant abouti à une concentration en triglycérides supérieure à 3,9 mmol/L (3,4 g/L).

2.5.

Analyses complémentaires du bilan d’exploration usuelle

Le calcul du cholestérol-LDL vrai utilise la formule de Dahlen qui tient compte du cholestérol Lp(a) qui représente 30 % de la lipoprotéine, c’est-à-dire :

Il s’agit d’analyses qui sont pratiquées pour compléter une interprétation.

CLDL = CT – CHDL – CVLDL – C Lp(a)

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

2.5.1. Dosage de la lipoprotéine Lp(a) La lipoprotéine Lp(a), dont la concentration génétiquement contrôlée varie de manière importante d’un patient à l’autre, constitue un facteur de risque athérogène indépendant des autres facteurs de risque lorsque la concentration plasmatique de cette lipoprotéine est supérieure à 0,30 g/L. Comme pour les autres apolipoprotéines, le dosage de la Lp(a) est réalisé par la mise en œuvre de méthodes immunologiques utilisant un anticorps anti-apo(a) spécifique de cette lipoprotéine. Outre l’évaluation du facteur de risque cardiovasculaire spécifique à la concentration de cette lipoprotéine, l’intérêt du dosage de la Lp(a) est de permettre une évaluation plus exacte du cholestérol-LDL, car les traitements usuels qui abaissent le cholestérolLDL, à l’exception du traitement par l’acide nicotinique, ont peu d’effet sur la concentration en Lp(a).

en g/L

en mmol/L

CLDL = CT – CHDL –

CLDL = CT – CHDL –

TG – 0,3 Lp(a) 5 TG – 0,75 Lp(a) 2, 2

Les règles de validité de ces formules sont bien entendu les mêmes que pour la formule de Friedewald : absence de chylomicrons et triglycérides < 3,9 mmol/L ou 3,4 g/L.

2.5.2. Le lipoprotéinogramme Le lipoprotéinogramme reste à la base de la classification de Fredrickson (tableau 4). Les lipoprotéines sont séparées en fonction de leur charge (proportion de protéines) et sont révélées par un colorant spécifique des lipides. Il s’agit d’une analyse qualitative ou pseudoquantitative des lipoprotéines (les enregistrements densitométriques

151

4557_2_.book Page 152 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Tableau 4

■

Classification des dyslipoprotéinémies familiales selon Fredrickson.

Type de la dyslipidémie

Caractéristiques biochimiques

Fraction lipoprotéinique augmentée

I (hypertriglycéridémie exogène)

Sérum lactescent (crémage) cholestérol normal ou légèrement augmenté et triglycérides augmentés + à ++

Chylomicrons

IIa (hypercholestérolémie essentielle)

Sérum clair à jeun ; cholestérol augmenté, triglycérides normaux

LDL

IIb (hyperlipidémie mixte ou combinée)

Sérum opalescent à jeun ; cholestérol et triglycérides augmentés

LDL et VLDL

III (dysbetalipoprotéinémie)

Sérum opalescent à jeun ; cholestérol et triglycérides augmentés

IDL

IV (hypertriglycéridémie endogène)

Sérum opalescent à jeun ; cholestérol normal ou modérément élevé VLDL et triglycérides augmentés

V (hypertriglycéridémie mixte)

Sérum opalescent à lactescent ; cholestérol normal ou légèrement augmenté et triglycérides augmentés

représentent les quantités de colorant fixé par les lipides des lipoprotéines et non les proportions de lipoprotéines). L’intérêt de cette analyse, qui n’est plus inscrite à la nomenclature, est d’aider dans des interprétations délicates de l’exploration des lipoprotéines et notamment en cas d’hypertriglycéridémies, pour la mise en évidence d’IDL (« Intermediate Density Lipoprotein » : « broad bêta » ou bêta large) et de lipoprotéines particulières (Lp(a)) ou anormales (LPX).

3 ■■ EXPLORATION SPÉCIALISÉE DES DYSLIPOPROTÉINÉMIES L’exploration usuelle bien menée permet à tout laboratoire de caractériser les dyslipoprotéinémies dans la majorité des situations (typage des hyperlipoprotéinémies, hypolipoprotéinémies, lipoprotéines anormales). Cette exploration est suffisante pour mettre en place une intervention diététique et/ou une thérapeutique adéquates. Cependant il est nécessaire dans certaines situations : – de mettre en évidence l’anomalie métabolique responsable afin d’assurer la meilleure prévention de sa transmission (hyperlipoprotéinémies familiales présentées selon la classification de Fredrickson (tableau 4)) ; – de bien caractériser les autres situations de dyslipoprotéinémies par une analyse de la composition des lipoprotéines après isolement (hypolipoproteinémies, HDL anormales) et de leur fonctionnalité (HDL). Pour répondre à ces objectifs il faut mettre en œuvre une exploration spécialisée plus ou moins complète et complexe, réservée à quelques laboratoires. Cette exploration ne peut pas être effectuée de manière systématique et sa mise en œuvre qui doit être ciblée nécessite une parfaite collaboration entre le clinicien et le biologiste, pour le choix des tests à mettre en œuvre parmi ceux décrits, et pour leur bonne interprétation.

152

3.1.

Chylomicrons et VLDL

Analyse des lipoprotéines

Cette analyse, souvent indispensable et faite en premier, consiste en l’isolement des lipoprotéines par ultracentrifugation, suivi de l’établissement de leur composition pondérale.

3.1.1. Isolement des lipoprotéines par ultracentrifugation Les lipoprotéines sont isolées à partir du sérum ou du plasma par ultracentrifugation de flottation, méthode permettant de préparer de grandes quantités de lipoprotéines pour leur étude ultérieure ou de petites quantités en vue d’études cliniques. Le sérum peut être utilisé directement ou être congelé à – 80 °C en vue d’un isolement ultérieur des lipoprotéines. Avant l’ultracentrifugation, la densité du sérum est accrue par addition de NaCl et/ou de KBr, de sorte qu’au cours de l’ultracentrifugation, les lipoprotéines flottent en fonction de leur densité et de la densité des solutions utilisées (figure 4). Si l’on désire l’isolement d’un seul type de fraction, on utilisera préférentiellement l’ultracentrifugation séquentielle (Havel et al., 1955), avec des rotors à angle fixe ; en revanche, si l’obtention de plusieurs fractions lipoprotéiniques est souhaitée de façon simultanée (figure 5), on privilégiera l’ultracentrifugation en gradient (Chapman et al., 1981), nécessitant des rotors à godets oscillants dits « swinging rotors ». Après isolement, les fractions lipoprotéiniques doivent être dialysées pour éliminer les sels (NaCl, KBr) ajoutés.

3.1.2. Établissement de leur composition pondérale Les concentrations des protéines totales et des constituants lipidiques (triglycérides, phospholipides, cholestérol non estérifié et esters de cholestérol – cette dernière concentration étant estimée par la concentration du cholestérol estérifié multipliée par 1,67 pour tenir compte de la masse moyenne des acides gras estérifiant le cholestérol –) sont exprimées en g/L pour permettre le calcul de la composition des lipoprotéines isolées qui est comparée aux compositions théoriques.

4557_2_.book Page 153 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Mise en évidence et exploration des dyslipoprotéinémies

Densité (g/mL)

Classe de lipoprotéine 0

Composition (% en masse) 40 60

20

Concentration relative 80

100

CM 0,95

s

de

éri

c gly

VLDL

Tri

1,006

ifié

ér

t es

n

IDL 1,019

ol ér

no

t

les

LDL

o Ch

ié

rif

té

s le

ro té

es ol

1,063 Ch

HDL2 éi ne

s

es

HDL3

id

ip

Pr ot

1,125

l ho

p

os

Ph

1,21

Figure 4

■

Classification, composition et densité des lipoprotéines isolées par ultracentrifugation (d’après Mackness et Durrington, 1992).

CM : chylomicrons ; VLDL : lipoprotéines de très basse densité ; IDL : lipoprotéines de densité intermédiaire ; LDL : lipoprotéines de basse densité, HDL : lipoprotéines de haute densité.

Avant ultracentrifigation

Après ultracentrifigation

2,5 mL de solution à 1,006 g/mL

VLDL IDL LDL

2,5 mL de solution à 1,019 g/mL

2,0 mL de solution à 1,063 g/mL

2,5 mL de plasma à 1,21 g/mL

LP(a), HDL1 HDL2

HDL3

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

VHDL 2,0 mL de solution à 1,25 g/mL

Figure 5

■

Protéines plasmatiques

Tubes d’ultracentrifugation en gradient de densité avant et après ultracentrifugation.

153

4557_2_.book Page 154 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

3.2.

Caractérisation et analyse des causes des dyslipoprotéinémies

En ce qui concerne les dyslipoprotéinémies familiales (hyperlipoprotéinémies de type I, de type III, de type IIa ; hypoLDLémies ; hypoHDLémies), leur exploration approfondie nécessite des analyses moléculaires des apolipoprotéines constitutives de chaque lipoprotéine mise en cause dans l’anomalie lipidique, pour aboutir à une caractérisation phénotypique qui sera confrontée si possible à une caractérisation génotypique. Selon les situations, une étude de certaines enzymes du métabolisme des lipoprotéines et/ou de leurs apolipoprotéines sera mise en œuvre.

3.2.1. Dyslipoprotéinémies familiales (hyperlipoprotéinémies de type I, de type III, de type IIa ; hypoLDLémies ; hypoHDLémies) ■ Exploration d’anomalies du métabolisme des chylomicrons (type I de la classification de Fredrickson)

Cette hyperlipoprotéinémie se traduit par une présence anormale de chylomicrons dans le sérum d’un sujet après 12 heures de jeûne. Elle peut être due à un déficit en lipoprotéine lipase (LPL), enzyme du catabolisme des particules riches en triglycérides, ou en son cofacteur (apoC-II) ; en effet, une absence de synthèse de l’apoC-II ou une apoC-II anormale peut entraîner l’absence d’activité de la LPL, même si l’enzyme est en concentration et de structure normales.

• Activité de la lipoprotéine lipase (LPL)

Les activités LPL et triglycéride lipase hépatique (TGLH) sont mesurées indépendamment selon la méthode de Nilsson-Else et Ekman (1977) : il s’agit de l’activité PHLA (« post heparin lipase activity »). L’héparine entre en compétition avec les glycosaminoglycanes retenant les lipases à la membrane plasmique des cellules endothéliales et permet le détachement et la libération des enzymes dans le sang circulant. L’activité LPL est mesurée en utilisant du trioléoylglycérol marqué au tritium en tant que substrat dans une émulsion tamponnée à pH 8 contenant également de la lysophosphatidylcholine (Sich et al., 1998b). L’activité LPL est exprimée en Unités correspondant au nombre de micromoles d’acides gras libres relargués par millilitre de plasma post-hépariné et par heure (μmol acides gras/mL par heure). Les valeurs usuelles sont de l’ordre de 10 à 16 unités, et sont exprimées également en pourcentage d’activité par rapport à un sujet témoin normolipidémique. Sur le plan moléculaire, que nous ne traiterons pas ici, parmi les anomalies monogéniques du métabolisme des triglycérides, ce sont les altérations de la lipolyse intra-vasculaire, responsables de l’hyperchylomicronémie (dyslipidémie de type I), éventuellement associée à une augmentation des VLDL (dyslipidémie de type V), qui ont été à l’origine de l’implication du plus grand nombre de gènes (LPL, apoC2, apoA5, GPI-HBP1, LMF1) (Couvert et al., 2010). De nombreuses mutations ont été décrites sur le gène de la LPL (Lalouel et al., 1992 ; Hu et al., 2007). La déficience en LPL est une maladie autosomique récessive caractérisée par une hypertriglycéridémie majeure, une augmentation de la

Hypertriglycéridémie de type I Mademoiselle R., 16 ans, est hospitalisée en urgence pour douleurs abdominales avec vomissements. L’examen clinique révèle quelques xanthomes éruptifs jaunes, de petite taille, au niveau du thorax et de l’abdomen, ainsi qu’une hépato-splénomégalie. Le bilan lipidique effectué après 12 heures de jeûne montre un sérum lactescent, qui, après 24 heures à 4 °C, présente une couche blanche supérieure avec un sérum sousnageant clair. La cholestérolémie est à 6 mmol/L, la triglycéridémie à 61 mmol/L (les dosages de cholestérol-HDL et d’apolipoprotéines A1 et B donnent des valeurs erronées compte tenu de cette hypertriglycéridémie majeure). Le lipoprotéinogramme permet d’observer une présence importante de chylomicrons restant dans le puits de dépôt. L’ensemble de ces résultats oriente vers un diagnostic d’hyperchylomicronémie (type I de la classification de Fredrickson), qui est une hypertriglycéridémie majeure exogène dépendante des graisses alimentaires, affection rare mais dont le risque majeur est la pancréatite aiguë. Une analyse plus poussée met en évidence un effondrement de l’activité LPL, malgré une apoC-II de concentration normale. L’analyse génétique révèle la présence une mutation sur le gène de la LPL. La patiente devra suivre un régime alimentaire sévère, très pauvre en graisses saturées, mono- ou poly-insaturées, mais comportant seulement 20 g par jour de triglycérides à chaîne moyenne (dont le métabolisme ne conduit pas à la formation de chylomicrons). Le but est de maintenir la triglycéridémie à une concentration inférieure à 10 g/L (11,4 mmol/L), seuil au-dessous duquel les risques de pancréatite sont limités.

154

4557_2_.book Page 155 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Mise en évidence et exploration des dyslipoprotéinémies

Contrôle HDL

pH : 6

E4 Pro apoA-1

E3

Prépro apoA-1

E2 Apo E mutée

ApoA-l1

ApoA-l2 ApoA-l3 ApoA-l4

ApoA-II

CIIIO CII CIII1 CIII2 pH : 4 E3/E3

E3/E3

E4/E3

E3/E3

E3/E3

E3/Emutée E2/E2

Figure 6

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

■ Gel d’isoélectrofocalisation pour le phénotypage des apoC et apoE. Un témoin constitué par des HDL est déposé en parallèle, la pro-apoA-I des HDL migrant au niveau de l’apoE3, et la prépro-apoA-I au niveau de l’apoE2.

concentration des chylomicrons et des VLDL, et une diminution de la concentration plasmatique du cholestérol-HDL. Des activités LPL diminuées peuvent aussi être observées dans le cadre de dyslipidémies secondaires, chez les sujets diabétiques, hypothyroïdiens ou présentant un syndrome néphrotique (Nikkilä, 1983). Les hyperchylomicronémies et, de façon générale, toute hypertriglycéridémie supérieure à 10 mmol/L, doivent être prises en charge rapidement car elles peuvent induire des pancréatites aiguës. • Phénotypage des apoC

Afin d’interpréter une hypertriglycéridémie exogène, il est intéressant d’évaluer le rapport des concentrations de l’apoCII (activateur de la LPL) et de l’apoC-III (inhibiteur de la LPL). Ces apolipoprotéines peuvent être dosées par immunonéphélémétrie laser ou par immunoturbidimétrie à l’aide d’anticorps polyclonaux. Une alter-

native consiste à étudier le phénotype de l’apoC par isoélectrofocalisation (gel à 7,5 % de polyacrylamide en présence d’urée 8 M et d’ampholines pH 4-6) des VLDL et IDL préalablement isolées par ultracentrifugation. Les lipoprotéines sont délipidées par un mélange éthanol/acétone 1:1 (v/v) et les apolipoprotéines subissent une resolubilisation dans une solution d’urée/dithiothréitol (DTT). Les apoC se séparent en fonction de leur charge ionique (la migration électrophorétique de la protéine s’arrête lorsqu’elle a atteint son point isoélectrique), ce qui permet d’étudier les isoformes d’apoC : C-II, C-III0, C-III1, C-III2 (selon le nombre de molécules (de 0 à 3) d’acide sialique présentes sur la protéine). Le rapport apoCII/apoCIII est usuellement compris entre 0,15 et 0,30. Cette technique permet aussi de mettre en évidence d’éventuelles anomalies de sialylation des apoC-III (rapport apoCII1/apoCIII2 habituellement compris entre 1,10 et 1,75) (figure 6).

155

4557_2_.book Page 156 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

■ Exploration d’anomalies du métabolisme des IDL (type III de la classification de Fredrickson)

L’hyperlipidémie de type III (ou dysbêtalipoprotéinémie) est caractérisée sur le plan biologique par des concentrations élevées de cholestérol et de triglycérides du fait de l’accumulation de lipoprotéines, les IDL ou βVLDL, qui différent des VLDL normales par leur richesse en cholestérol, leur composition en apolipoprotéines et leur mobilité β en électrophorèse (aspect en « broad beta » sur le lipoprotéinogramme). La détermination du phénotype de l’apoE est un élément important du diagnostic car 95 % des sujets ayant une hyperlipidémie de type III ont un phénotype E2/E2 (contre 1 % dans la population générale). • Phénotypage de l’apoE

Comme pour le phénotypage d’apoC, il se pratique par électrofocalisation des VLDL et IDL dans un gradient d’ampholines 4-6, après leur isolement par ultracentrifugation et leur délipidation ; il permet d’étudier les isoformes d’apoE (E2, E3, E4) (Warnick et al., 1979) (figure 6). La confirmation biochimique d’un phénotype E2/ E2 (de même que celui de la présence d’une apoE mutée) se fera par électrophorèse bidimensionnelle, dans une première dimension dans un gradient d’ampholines (isoélectrofocalisation), suivie d’une deuxième séparation électrophorétique en fonction de la masse moléculaire en gel de polyacrylamide SDS à 15 % (Sprecher et al., 1984). Ce phénotypage d’apoE constitue une alternative au génotypage. ■ Exploration d’anomalies du métabolisme des LDL

Les anomalies du métabolisme des LDL se divisent en hyperLDLémies, pathologies fréquemment rencontrées et se manifestant sur le plan biologique par une hypercholestérolémie, et en hypoLDLémies, maladies rares lorsqu’elles sont d’origine génétique et se traduisant par une hypocholestérolémies. En ce qui concerne les hyperLDLémies, elles se manifestent soit par une hypercholestérolémie pure (type IIa), soit par une hypercholestérolémie combinée à une hypertriglycéridémie (type IIb). • Dans le cadre des hyperLDLémies (type IIa de la classification de Fredrickson)

L’hypercholestérolémie familiale est la conséquence d’un défaut de capture et de dégradation des LDL par la voie du récepteur aux LDL (récepteur B/E), résultant d’une mutation au niveau du gène de ce récepteur (LDLR) (muté dans environ 80 % des cas, avec plus de 1 000 mutations décrites réduisant la fonctionnalité du récepteur) ou d’une mutation dans le gène codant l’apoB (APOB) (moins de 10 mutations décrites, touchant toutes le domaine de liaison au LDLR). Classiquement, il s’agit d’une forme autosomale dominante. Une forme récessive peut résulter de mutations de LDLRAP1, codant une protéine adaptatrice nécessaire à l’internalisation du récepteur aux LDL par les cellules hépatiques. Plus récemment, des mutations de PCSK9, gène codant une famille de proprotéines convertases qui diminue donc la quantité de récepteur présent à la surface des cellules, ont été décrites associées à un gain de fonction de PCSK9 et conduisant à un phénotype d’hypercholestérolémie familiale (voir pour revue Dedoussis et al., 2004 ; Widhalm et al., 2007 ; Soutar et Naoumova, 2007 ; Marduel et al., 2010). L’ensemble de ces anomalies aboutissent à une réduction de la vitesse d’épuration de la circulation des particules

156

LDL, entraînant ainsi une hypercholestérolémie qui favorise la rétention des LDL dans l’intima artérielle, processus à l’origine du développement de l’athérosclérose. Le bilan lipidique chez les parents est important pour le dépistage ainsi que pour l’étude du mode de transmission ; ainsi, il permet d’orienter vers la forme autosomique récessive (gène LDLRAP1) si aucun des deux parents ne présente d’hypercholestérolémie, ou vers une forme autosomique dominante (gènes LDLR, apoB ou PCSK9) si les deux parents ont un cholestérolLDL au-dessus des valeurs usuelles (Couvert et al., 2010).

Démarche diagnostique d’une hypercholestérolémie de type IIa 1 – Confirmer le caractère primaire de l’hypercholestérolémie : éliminer une cause médicamenteuse, une hypothyroïdie, une néphropathie (syndrome néphrotique), voire plus rarement une hépatopathie cholestatique (hypercholestérolémie en relation avec la présence de LPX). 2 – Confirmer l’hypercholestérolémie familiale par : – l’examen clinique (xanthomes, habituellement présents après la deuxième décennie) ; – l’enquête familiale (bilan lipidique, antécédents cardiovasculaires) ; – si possible, la recherche de mutations (LDLR, apoB 3500, dans un premier temps). 3 – Réaliser un bilan cardiovasculaire en fonction du contexte : – symptômes suspects cardiovasculaires (souffle, douleur…) ; – le plus souvent si patient de plus de 40 ans. 4 – Prise en charge thérapeutique – selon les recommandations de l’Afssaps (2005), l’hypercholesterolémie familiale doit être traitée précocement et les seuils de cholestérol-LDL ne concernent pas cette forme particulière de dyslipidémie ; – la prise en charge repose sur la diététique associée à un traitement par statines. L’objectif thérapeutique est fonction de chaque patient. Si les statines ne suffisent pas, il est possible de leur associer des résines ou plus souvent de l’ézétimibe (inhibiteur de l’absorption intestinale du cholestérol) ; – le traitement par LDL-aphérèse est pratiqué en prévention secondaire chez des sujets dont le cholestérol-LDL reste supérieur à 2,2 g/L (5,7 mmol/L) sous traitement oral maximum. • Dans le cadre des hypoLDLémies

Certaines mutations dans le gène de l’apoB peuvent conduire à des hypobêtalipoprotéinémies familiales (HBLF), transmises selon un mode semi-dominant, ce qui signifie que les hétérozygotes ne sont pas normaux mais ont un phénotype moins sévère que les homozygotes. Ces formes sont caractérisées par une hypocholestérolémie et par l’apparition de formes tronquées d’apoB circulantes. D’autres mutations, situées sur le gène de la MTP (« microsomal triglyceride transfer protein »), sont responsables d’abétalipoprotéinémie (ABL) pathologie autosomique récessive très rare (pour revue, voir Whitfield et al., 2004 ; Hooper et al., 2005). Des mutations décrites sur PCSK9 (gène déjà évoqué dans les hypercholestérolémies familiales) peuvent conduire à des

4557_2_.book Page 157 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Mise en évidence et exploration des dyslipoprotéinémies

hypoLDLémies (Soutar et Naoumova, 2007). Ces hypoLDLémies d’origine génétique constituent des formes rares qui se manifestent sur le plan clinique par des signes en rapport direct avec la diminution de cholestérol et le déficit associé en vitamines liposolubles type vitamine E (diarrhée liée à la malabsorption, hépatomégalie, syndrome neurologique…) (Sassolas et al., 1999). Chez les patients ABL, la cholestérolémie à jeun est très basse (cholestérol total < 0,5 g/L ou 1,29 mmol/L) et associée à une triglycéridémie souvent inférieure à 0,1 g/L (0,11 mmol/L). Les concentrations circulantes d’apoB sont quasiment indétectables, les seules lipoprotéines présentes dans le sérum sont les HDL, dont la concentration est diminuée. Les sujets ABL se différencient des patients HBLF homozygotes sans apoB plasmatique détectable, grâce au bilan lipidique tout à fait normal de leurs parents. Les homozygotes HBLF avec apoB plasmatique détectable ont en outre un cholestérol-LDL sérique détectable ainsi qu’un cholestérol-HDL et des triglycérides proches des valeurs usuelles. Enfin, il ne faut pas confondre l’hypobêtalipoprotéinémie hétérozygote avec la maladie d’Anderson (maladie de rétention des chylomicrons, pathologie rare à transmission autosomique récessive pour laquelle les deux parents ont un bilan lipidique normal et où l’on constate une baisse simultanée du cholestérol-LDL et du cholestérol-HDL). De plus, l’absence complète d’apoB48 dans le sérum contraste avec une diminution modérée de la concentration plasmatique totale d’apoB (Samson-Bouma et al., 2009 ; Couvert et al., 2010). La recherche de formes tronquées d’apoB peut donc se poser face à une hypocholestérolémie majeure liée à une hypobêtalipoprotéinémie, caractérisée par la présence d’apoB incomplète (de 2 à 89 % de la taille de l’apoB-100) avec ou sans apoB-100 visible en électrophorèse SDS-PAGE (Sassolas et Cartier, 1999). Il est toutefois important de bien faire la distinction entre une hypocholestérolémie acquise et une forme familiale, afin de ne pas entreprendre inutilement ces examens spécialisés. La migration électrophorétique est suivie d’un transfert sur membrane de nitrocellulose, puis d’un immunoblot avec des anticorps monoclonaux spécifiques de l’extrémité N-terminale de l’apoB-100, de l’extrémité C-terminale de l’apoB-100 et de l’apoB-48 (Pease et al., 1990). Compte tenu de la masse moléculaire très importante de l’apoB, cette détermination constitue une étape préalable qui permettra de cibler la région du gène apoB à séquencer (13 689 paires de bases codantes).

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

■ Exploration des hypoHDLémies

De par leur rôle central dans le métabolisme des lipoprotéines, les HDL constituent un vaste terrain d’étude. L’exploration spécialisée des HDL fera ainsi appel à des analyses portant sur leur composition (depuis l’évaluation de l’estérification du cholestérol, la quantification de l’apoAII et des lipoparticules LpA-I et LpA-I : A-II, jusqu’à la recherche d’anomalies moléculaires des apolipoprotéines). Par ailleurs, il est possible de faire appel à une approche plus fonctionnelle, permettant de relier ces analyses au contexte pathologique (taille des HDL, recherche des préβ-HDL, détermination d’activités enzymatiques intervenant dans le métabolisme des HDL), approche que nous présenterons plus loin (paragraphe 3.2.2.).

D’un point de vue quantitatif, l’hypoalphalipoprotéinémie est définie par un cholestérol-HDL inférieur à 0,35 g/L (0,90 mmol/L), facteur indépendant de risque cardiovasculaire. Elle est souvent associée à une hypertriglycéridémie, mais, lorsque les concentrations de triglycérides et de LDL-cholestérol sont normales, une exploration spécialisée est nécessaire, afin de préciser l’origine de l’anomalie : déficit en LCAT, anomalies moléculaires de l’apoA-I et/ou de l’apoA-II… L’hypoHDLcholestérolémie sévère est définie par une concentration de cholestérol-HDL inférieure à 0,1 g/L (0,26 mmol/L). À ce jour, trois gènes dont les mutations sont responsables de formes monogéniques d’hypoHDLémie ont été identifiés : apoA1, ABCA1 et LCAT. Notons qu’à l’opposé, une hyperalphalipoprotéinémie (cholestérol-HDL supérieur à 0,80 g/L ou 2 mmol/L) est a priori un facteur protecteur dans le cadre des pathologies cardiovasculaires ; toutefois, il peut être intéressant de ne pas limiter cette appréciation à la notion quantitative de concentration des HDL, mais à leur fonctionnalité, en particulier sur le plan de l’efflux de cholestérol mais aussi des capacités protectrices antioxydantes des HDL (Hansel et al., 2006). • Détermination du pourcentage d’estérification du cholestérol au niveau du sérum total

Ce pourcentage d’estérification peut bien sûr être déterminé au niveau des HDL, mais il est plus simplement pratiqué au niveau du sérum total. Après dosages du cholestérol total et du cholestérol non estérifié (mêmes techniques de dosages que celles précédemment décrites pour l’établissement de la composition des lipoprotéines, le réactif destiné au dosage du cholestérol non estérifié ne comportant pas de cholestérol estérase, à la différence de celui destiné au dosage du cholestérol total), le pourcentage d’estérification du cholestérol est déterminé par le rapport (cholestérol total – cholestérol non estérifié)/cholestérol total. Ce rapport doit être compris entre 0,60 et 0,70. Des valeurs inférieures à 0,60 signent un défaut d’estérification du cholestérol, tel qu’il peut être observé dans les déficits en LCAT ou dans les insuffisances hépatocellulaires sévères. Ce dosage doit être réalisé sur sérum frais ; si l’analyse doit être reportée, le prélèvement doit être conservé congelé jusqu’au moment du dosage. • Dosage de l’apoAII

L’apoAII est mesurée par des techniques classiques d’immunonéphélémétrie (Albers et al., 1992), comparables à celles utilisées pour le dosage de l’apoA-I. Cette détermination doit être couplée au dosage de l’apoA-I dans le cadre des hypoHDLémies. • Dosage des lipoparticules LpA-I et LpA-I : A-II

Cette évaluation des lipoparticules, qui a connu un grand développement il y a une quinzaine d’années, permet de subdiviser les HDL en fonction de leur contenu en apolipoprotéines A-I et A-II, en deux classes majeures : les LpA-I qui contiennent de l’apoA-I sans apoA-II, et les LpA-I : A-II qui contiennent à la fois l’apoA-I et l’apoA-II. Les LpA-I peuvent être subdivisées en fonction de leur taille en trois sous-classes : les LpA-I de grande taille (10,8 ± 0,5 nm), les LpA-I moyennes (8,9 ± 0,5 nm) et les petites LpA-I (7,5 ± 0,3 nm) (Cheung et Albers, 1984). Les LpA-I de grande taille, particulièrement efficaces au niveau de l’efflux du cholestérol cellulaire, peuvent contenir jusqu’à 4 molécules

157

4557_2_.book Page 158 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

d’apoA-I, les LpA-I moyennes 2 ou 3, alors que les LpA-I plus petites n’en contiennent qu’une (Duverger et al., 1993). La concentration des particules LpA-I (exprimée en apoAI) est déterminée dans le sérum par immunoélectrophorèse sur des plaques commercialisées (Hydragel LpA-I kit, Sebia, Issy-les-Moulineaux, France) (Parra et al., 1990). La concentration de LpA-I : A-II est calculée en soustrayant la concentration de LpA-I de la concentration d’apoA-I obtenue par dosage néphélémétrique (Rader et al., 1991).

séparation des différentes isoformes, suivie d’une coloration par le bleu de Coomassie, et un immunoblot par un anticorps antiapoA-I. Enfin, une électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS à 15 % est pratiquée, selon une procédure identique à celle décrite pour la recherche d’apoB tronquée. Un transfert sur nitrocellulose est réalisé sur deux plaques, l’une étant ultérieurement révélée par un anticorps anti-apoA-I, l’autre par un anticorps antiapoA-II.

• Recherche d’anomalies moléculaires de l’apoA-I et de l’apoA-II (phénotypages)

3.2.2. Autres explorations

La recherche des mutations du gène de l’apoA-I, de ABCA1 et de la LCAT ne sera pas traitée ici (pour revue, voir Miller et Zhan, 2004). Notons seulement que les mutations du transporteur ABCA1 sont le plus fréquemment identifiées dans les hypoHDLémies pures. Les défauts structuraux des apoA-I et A-II peuvent modifier la charge et/ou la masse moléculaire de ces protéines, modifications pouvant être mises en évidence par électrophorèse bidimensionnelle (Sprecher et al., 1984). Les isoformes d’apoA-I, A-II et A-IV sont séparées par isoélectrofocalisation des HDL selon la technique de Menzel et al. (1982) dans un gradient d’ampholines pH 4-6, après leur isolement par ultracentrifugation suivi de leur délipidation par un mélange éthanol/acétone et de leur solubilisation dans une solution d’urée/dithiothréitol (DTT) ; le but est de chercher à mettre en évidence la présence anormale de ponts disulfures dans la molécule d’apoA-I, secondairement à une mutation qui aurait pu faire apparaître une cystéine. La technique est donc globalement la même que celle décrite pour le phénotypage d’apoE (figure 6). Comme pour l’apoE, une électrophorèse bidimensionnelle peut être pratiquée, permettant une meilleure

■ Recherche et mise en évidence de lipoprotéines anormales : la Lipoprotéine X (LPX)

La LPX est classiquement un bon marqueur de cholestase, mais elle peut parfois être aussi présente dans le cas de déficit en LCAT ou chez des sujets soumis à une administration parentérale de lipides (Legrand et Beucler, 2000). La LPX présente une structure et une composition très différentes de celle des lipoprotéines normales, avec une double couche phospholipidique entourant un compartiment hydrophile. Elle est caractérisée par une très grande richesse en phospholipides (60-65 % en masse) et en cholestérol (25-29 %) presque totalement sous forme non estérifiée ; ces deux composants sont donc présents dans la LPX en proportion sensiblement équimoléculaire. La recherche de la LPX peut se faire en mettant à profit son comportement électrophorétique particulier, caractérisé par une migration cathodique en gel d’agarose. Sa caractérisation peut être effectuée par un immunsérum anti-LPX. Une méthode de dosage basée sur l’élimination des LDL et VLDL par immunoprécipitation puis séparation de la LPX des HDL par précipitation par le phosphotungstate/MgCl2 a été proposée (Bos et al., 1983).

HypoHDLémie due à une maladie de Tangier Mademoiselle V., 15 ans, est hospitalisée pour exploration d’une neuropathie périphérique avec paresthésie, associée à une hépato-splénomégalie. Ses amygdales présentent une coloration jaune orangée. Son bilan lipidique après 12 heures de jeûne révèle une légère hypertriglycéridémie (1,91 mmol/L) associée à un sérum opalescent, une cholestérolémie abaissée (3,25 mmol/L), un cholestérol-HDL effondré (0,15 mmol/L) et une apoA-I quasiment indétectable (0,05 g/L). Une exploration plus poussée montre également un effondrement des concentrations sériques d’apoA-II et des lipoparticules LpA-I et LpA-I/A-II. Le dosage de cholestérol non estérifié montre que le pourcentage d’estérification du cholestérol est normal (rapport cholestérol estérifié/cholestérol total = 0,70), ce qui exclut un déficit en LCAT. L’analyse approfondie des apolipoprotéines A-I et A-II montre l’absence d’anomalies moléculaires évidentes à leur niveau. En revanche, l’analyse du gène ABCA1 met en évidence une substitution homozygote, à l’origine de cette hypoHDLémie majeure. Une enquête familiale montre la présence de cette mutation à l’état hérérozygote chez chacun des parents, qui sont asymptomatiques et présentent un bilan lipidique normal.

158

4557_2_.book Page 159 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Mise en évidence et exploration des dyslipoprotéinémies

■ Détermination de la taille des LDL

• Recherche de pré-β-HDL

La détermination de la taille des LDL peut présenter un intérêt dans différents contextes (hypercholestérolémie, syndrome métabolique…) en tant qu’élément d’appréciation du risque cardiovasculaire. En effet, les LDL représentent une population hétérogène de particules variant dans leur densité, diamètre et compositions lipidique et protéique, les LDL les plus petites et les plus denses étant considérées comme les plus athérogènes (Campos et al., 1992). Les LDL peuvent ainsi être séparées en fonction de leur densité par ultracentrifugation (préparative ou en gradient de densité) en cinq sous-fractions majeures : LDL1 (de 1,019 à 1,023 g/mL), LDL2 (de 1,023 à 1,029 g/mL), LDL3 (de 1,029 à 1,039 g/mL), LDL4 (de 1,039 à 1,050 g/mL) et LDL5 (de 1,050 à 1,063 g/mL) (Chapman et al., 1988). Chez un individu normolipidémique, les LDL1 et LDL2 représentent la fraction principale des LDL. Les LDL peuvent aussi être subdivisées par électrophorèse en conditions non dénaturantes sur gel de polyacrylamide en fonction de leur diamètre particulaire (Krauss et al., 1982). Par cette technique, les tailles des sous-classes de LDL (LDL1 (28,5 à 27,0 nm), LDL2 (27,0 à 25,5 nm), LDL3 (25,5 à 24,2 nm) et LDL4 (24,2 à 22,0 nm)) sont déterminées par leur diamètre apparent, comparativement à des courbes de calibration construites avec des protéines de diamètres de Stokes connus. Deux phénotypes de LDL peuvent être définis : le phénotype A, caractérisé par une prédominance de LDL de grande taille (diamètre supérieur à 25,5 nm) et le phénotype B, caractérisé par des LDL plus petites et donc plus athérogènes (diamètre inférieur à 25,5 nm). Le phénotype A est le plus couramment observé chez les sujets normolipidémiques (Austin et al., 1988). La comparaison des deux méthodes de séparation des sous-fractions de LDL a montré que les LDL de densité légère sont de grande taille et qu’inversement les LDL les plus denses sont de plus petite taille.

Les pré-β-HDL correspondent à un sous-groupe d’HDL petites, discoïdales et de faible masse moléculaire (60 à 70 kDa), pauvres en lipides et de mobilité pré-β en électrophorèse. Ces pré-β-HDL ont pour seul composant protéique l’apoA-I et constituent les accepteurs initiaux de cholestérol cellulaire dans les liquides interstitiels (Castro et al., 1988). Les pré-β-HDL s’insinuent en effet dans les espaces interstitiels au contact des membranes cellulaires et au cours de cette étape la LCAT estérifie les molécules de cholestérol ; les esters de cholestérol ainsi formés, de nature hydrophobe, vont ainsi progressivement constituer un noyau dans les édifices discoïdaux des pré-β-HDL qui vont se transformer en structures sphériques de type HDL3. Ces dernières vont se transformer en incorporant d’autres éléments discoïdaux en acceptant du cholestérol qui sera estérifié par la LCAT : les HDL3 se transforment ainsi en HDL2a, de plus grande taille et riches en esters de cholestérol. L’étude des pré-β-HDL présente donc un intérêt particulier chez les patients déficients en LCAT, chez lesquels on n’observe pas de HDL matures migrant en position α à l’électrophorèse (α-HDL), mais seulement des formes pré-β. Dans la maladie de Tangier, caractérisée par des mutations au niveau du transporteur ABCA1 responsables d’un défaut d’efflux du cholestérol cellulaire, les homozygotes présentent uniquement des formes pré-β1-HDL (sans formes α), alors que les hétérozygotes ont des proportions très faibles de particules α1-HDL et α2-HDL (Asztalos et al., 2000). La séparation des pré-β-HDL nécessite une électrophorèse bidimensionnelle, la première en gel d’agarose à 0,75 %, la deuxième en gel de polyacrylamide (gradient de 4 à 15 %) en conditions non dénaturantes (Saïdi et al., 1998). Les lipoprotéines sont ensuite transférées sur des feuilles de nitrocellulose. L’immunodétection est réalisée grâce à un anticorps monoclonal anti-apoA-I humaine (Petit et al., 1987).

■ Analyses en rapport avec la fonctionnalité des HDL

• Activités enzymatiques : LCAT, PLTP, CETP, TGLH

Dans certaines circonstances la simple détermination de la concentration du cholestérol-HDL s’avère insuffisante. Une analyse de la taille des HDL et de l’activité des enzymes intervenant dans leur métabolisme apporteront alors des informations complémentaires intéressantes.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

• Détermination de la taille des HDL

Les HDL peuvent être subdivisées (par ultracentrifugation analytique, préparative ou en gradient de densité) en 2 sous-fractions majeures : HDL2 de 1,085 à 1,125 g/mL, HDL3 de 1,125 à 1,21 g/ mL. Les HDL3 sont majoritaires chez l’homme normolipidémique, mais chez la femme les HDL2 et HDL3 sont en égale concentration. La détermination de la taille des HDL peut aussi se faire par électrophorèse en gel de PAA sur les gels commercialisés précédemment évoqués pour la détermination de la taille des LDL, ou sur des gels préparés extemporanément (Blanche et al., 1981). Cinq sous-fractions d’HDL sont ainsi identifiées : HDL2b (9,71 à 12,9 nm), HDL2a (8,77 à 9,71 nm), HDL3a (8,17 à 8,77 nm), HDL3b (7,76 à 8,17 nm) et HDL3c (7,21 à 7,76 nm). Chez le sujet normolipidémique, on note une prédominance des sous-classes HDL2a et HDL3a.

La distribution et les concentrations des sous-fractions d’HDL sont sous le contrôle de plusieurs facteurs plasmatiques, tels que la LCAT, la PLTP, la CETP et la TGLH, et la détermination de leur activité présente donc un intérêt sur le plan métabolique. L’activité de la LCAT est déterminée par la capacité du plasma à estérifier le cholestérol présent dans un substrat exogène, alors que la détermination de la masse de la LCAT peut se faire par méthode ELISA utilisant un anticorps de lapin dirigé contre un peptide de la LCAT (Murakami et al., 1995). Il a été décrit plusieurs mutations de la LCAT (Assmann et al., 1991 ; Kuivenhoven et al., 1997), dont la plupart conduisent à une déficience familiale. Le déficit en LCAT est une pathologie pour laquelle moins de 100 cas familiaux ont été décrits. Sur le plan clinique, les mutations sont caractérisées par de nombreuses atteintes oculaires, une anémie normochrome avec diminution de la durée de vie des érythrocytes et une protéinurie évoluant secondairement en insuffisance rénale. Les concentrations de cholestérol et de lysolécithine sont diminuées. Toutes les lipoprotéines sont anormales, on retrouve majoritairement des HDL de structure discoïdale apparaissant sous forme de piles ou de rouleaux, et des HDL dont le diamètre, compris entre 4,5 et 6 nm, est inférieur à celui des HDL3 (lui-même compris entre 7,1 et

159

4557_2_.book Page 160 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

8,77 nm). Les LDL sont de grande taille, enrichies en cholestérol non estérifié (Guérin et al., 1993) ; les VLDL sont également anormales et migrent comme les β-lipoprotéines en électrophorèse. L’activité PLTP peut être mesurée par le transfert de phosphatidylcholines (PC) marquées au 14C à partir de liposomes de [14C]PC vers la fraction HDL plasmatique (Lagrost et al., 1994), selon une procédure dérivée de celle de Damen et al. (1982), en présence d’iodoacétate (inhibiteur de la LCAT). La PLTP a un rôle important dans le remodelage des particules HDL, puisqu’elle induit la conversion des HDL de taille moyenne (HDL3a et 3b) en HDL de petit diamètre (de type préβ-HDL) d’une part, et de grande taille (de type HDL2b) d’autre part (Albers et al., 1995). De même, les LpA-I (9,8 et 8,2 nm) et les LpA-I : A-II (8,2 nm) sont respectivement converties en LpA-I de taille plus grande (10,9 nm) et de plus petit diamètre (7,2 nm), et en LpA-I : A-II de taille plus grande (9,4 nm) et de plus petit diamètre (7,2 nm) (von Eckardstein et al., 1996). Chez les sujets alcooliques dont le cholestérol-HDL est significativement élevé (0,76 ± 0,42 g/L, soit 1,97 ± 1,09 mmol/L), une augmentation de l’activité de la PLTP et une corrélation positive et significative entre la concentration de cholestérol-HDL et l’activité PLTP ont été observées (Lagrost et al., 1996). La détermination de l’activité CETP peut être effectuée par différentes méthodes ; celle de l’activité exogène repose sur le dosage du transfert d’esters de cholestérol marqué au tritium entre un donneur exogène (esters de cholestérol des HDL 3 marqués au 3H) et un accepteur non marqué, des LDL (Sich et al., 1998a). Le test est dit exogène car il se déroule en présence de quantités fixées et en excès de donneurs et accepteurs d’esters de cholestérol ; dans ce contexte, le facteur limitant de la réaction de transfert est la concentration plasmatique de CETP active. Un dosage de la masse de CETP au niveau plasmatique (exprimée en microgrammes par mL de plasma) peut être mis en œuvre, par une méthodologie ELISA développée par GuyardDangremont et al. (1994). L’activité de la CETP a été étudiée dans de nombreuses pathologies associées à des désordres du métabolisme des lipoprotéines. Plusieurs études ont ainsi montré que l’activité CETP était augmentée chez les sujets hypercholestérolémiques (hyperlipidémie de type IIa), les sujets présentant une hyperlipidémie combinée, les sujets hypertriglycéridémiques et les sujets diabétiques non insulino-dépendants (Bagdade et al., 1991 ; McPherson et al., 1991 ; Murakami et al., 1995 ; Durlach et al., 1996). Plusieurs mutations ont été décrites, en particulier dans la population japonaise, où deux d’entre elles atteignent, dans leur forme hétérozygote, 7 % de la population totale et 2 % dans la forme homozygote (Inazu et al., 1994). Les mutations sur le gène de la CETP se retrouvent aussi dans la population caucasienne et de nouvelles mutations ont été découvertes chez des sujets allemands (Assmann et al., 1994 ; Nagano et al., 2004). L’interprétation d’un déficit en CETP est discutable : s’il est classiquement associé à un faible risque de maladie cardiovasculaire et à une longévité accrue (Barzilai et al., 2003), on note par exemple que la prévalence du déficit en CETP est plus élevée chez les moins de 80 ans que chez les patients plus âgés (Hirano et al., 1997) et, aux États-

160

Unis, les sujets japonais porteurs de mutations de la CETP ont un risque cardiovasculaire plus élevé que les sujets sains (Zhong et al., 1996), ce qui suggère un rôle anti-athérogène de la CETP. La détermination de l’activité de la Triglycéride Lipase Hépatique (TGLH) repose sur le même principe que celui précédemment décrit pour la LPL. On différencie l’activité de la lipase hépatique de celle de la LPL en opérant à pH 9, en présence d’albumine bovine à 1 % (au lieu de 4 %) et en milieu NaCl 4M (qui inhibe la LPL). Comme pour la LPL, l’activité TGLH est exprimée en Unités correspondant au nombre de micromoles d’acides gras libres relargués par millilitre de plasma post-hépariné et par heure (μmol acides gras/mL par heure). Les valeurs usuelles sont de l’ordre de 15 à 30 unités, et sont exprimées également en pourcentage d’activité par rapport à un sujet témoin normolipidémique. L’activité TGLH est perturbée dans de nombreuses hyperlipidémies (Blades et al., 1993). Les déficiences génétiques en TGLH ne peuvent actuellement apporter des réponses claires quant à l’athérogénicité de la TGLH ; le phénotype lipidique des sujets déficients en TGLH est apparenté à une dyslipidémie de type III, caractérisée par une augmentation des triglycérides et du cholestérol plasmatique ; les anomalies incluent également une augmentation de la concentration des VLDL, la présence de β-VLDL et l’enrichissement des LDL et des HDL en triglycérides (Hegele et al., 1993). Dans le cadre des hyperalphalipoprotéinémies, Sich et al. (1998b) ont mis en évidence deux profils : l’un avec une faible incidence de lésions athéromateuses, caractérisés par l’augmentation des concentrations d’HDL2b et des LpA-I associée à une diminution de l’activité de la TGLH ; l’autre avec une incidence de lésions athéromateuses significativement plus élevées, caractérisé par l’augmentation des concentrations d’HDL2 et HDL3 et de toutes les sous-classes de HDL, ainsi que par une prédominance des LpA-I : A-II, et avec une activité TGLH située dans les valeurs usuelles.

CONCLUSION En pratique courante, l’exploration des dyslipoprotéinémies est basée sur l’EAL (« Exploration d’une Anomalie Lipidique ») qui comprend l’aspect du sérum, le dosage du cholestérol total, des triglycérides et du cholestérol-HDL, permettant de calculer le cholestérol-LDL par la formule de Friedewald en l’absence d’une triglycéridémie supérieure à 3,4 g/L (3,9 mmol/L). Tous les adultes doivent être dépistés, mais il n’est pas nécessaire de répéter ce bilan lorsqu’il est normal, sauf en cas d’apparition d’un facteur de risque cardiovasculaire. La décision d’une prise en charge thérapeutique sera fonction des analyses biochimiques effectuées dans le cadre d’une prise en charge globale du risque cardiovasculaire. Les examens spécialisés sont quant à eux pour beaucoup d’entre eux du domaine de la recherche clinique et sont réservés à des indications très précises. Dans les pathologies familiales, ils constituent souvent un préalable à l’investigation moléculaire visant à rechercher des mutations impliquées dans ces types de dyslipidémies.

4557_2_.book Page 161 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Mise en évidence et exploration des dyslipoprotéinémies

Références bibliographiques Agence Française de Sécurité Sanitaire de produits de Santé (Afssaps) (2005). Prise en charge thérapeutique du patient dyslipidémique, mars 2005. www.afssaps.fr

Castro GR, Fielding CJ (1988). Early incorporation of cell-derived cholesterol into pre-beta-migrating hig density lipoprotein. Biochemistry, 27 : 25-29.

Agence Française de Sécurité Sanitaire de produits de Santé (Afssaps (2007). Rapport du contrôle de marché des dispositifs médicaux de diagnostic in vitro de dosage du cholestérol-HDL, juin 2007. www.afssaps.fr

Chapman MJ, Goldstein S, Lagrange D, Laplaud PM (1981). A density gradient ultracentrifugal procedure for the isolation of the major lipoprotein classes from human serum. J Lipid Res, 22 : 339-58.

Albers JJ, Marcovina SM, Kennedy H (1992). International Federation of Clinical Chemistry standardization project for measurements of apolipoproteins A-I and B. II. Evaluation and selection of candidate reference materials. Clin Chem, 38 : 658-662. Albers JJ, Wolfbauer G, Cheung MC, Day JR, Ching AFT, Tu AY (1995). Functional expression of human and mouse plasma phospholipid transfer protein : effect of recombinant and plasma PLTP on HDL subspecies. Biochim Biophys Acta, 1258 : 27-34. Assmann G, von Eckardstein A, Funke H (1994). High density lipoprteins, reverse cholesterol transport and coronary heart disease. Insights from mutations. Circulation, 87 (4 Suppl.) III 28-34. Asztalos BE, Roheim PS, Milani RL, Lefevre M, McNamara JR, Horvath KV, Schaefer EJ (2000). Distribution of apoA-I-containing HDL subpopulations in patients with coronary heart disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 20 : 2670-2676. Austin MA, Breslow JL, Hennekens CH, Buring JE, Willett WC, Krauss RM (1988). Low-density lipoprotein subclass patterns and risk of myocardial infarction. JAMA, 260 : 1917-1921. Bagdade JD, Ritter MC, Subbaiah PV (1991). Accelerated cholesteryl ester transfer in plasma of patients with hypercholesterolemia. J Clin Invest, 87 : 1259-1265. Barzilai N, Atzmon G, Schechter C, Schaefer EJ, Cupples AL, Lipton R, Cheng S, Shuldiner AR (2003). Unique lipoprotein phenotype and genotype associated with exceptional longevity. JAMA, 290 : 2030-2040. Bayer P, Veinberg F, Couderc R, Cherfils C, Cambillau M, Cosson C, Fradin S, Gillery P, Steinmetz J, Legrand A, Egloff M, Beucler I (2005). Évaluation multicentrique de quatre méthodes de dosage direct du cholesterol-LDL. Ann Biol Clin, 63 : 27-41.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Benlian P, Cansier C, Hennache G, Khallouf O, Bayer P, Duron F, Carrat F, Couderc R, Chazouillères O, Bardet J, Bouchrad P, Poupon R, Masliah J, Béréziat G (2000). Comparison of a new method for the direct and simultaneous assessment of LDL and HDL cholesterol with ultracentrifugation and established methods. Clin Chem, 46 : 493-505. Blades B, Vega GL, Grundy SM (1993). Activities of lipoprotein lipase and hepatic triglyceride lipase in postheparin plasma of patients with low concentration of HDL cholesterol. Arterioscler Thromb, 13 : 1227-1235. Blanche PJ, Gong EL, Forte TM, Nichols AV (1981). Characterization of human high-density lipoproteins by gradient gel electrophoresis. Biochim Biophys Acta, 665 : 408-419. Bos ES, van der Doelen AA, Denissen AE, Goverde BC, Magnani HN, Kostmer GM (1983). A novel assay for the quantitative determination of lipoprotein-X (LP-X) in serum. Clin Chim Acta, 127 : 383-390. Campos H, Genest JJ Jr, Blijlevens E, McNamara JR, Jenner JL, Ordovas JM, Wilson PW, Schaefer EJ (1992). Low density lipoprotein particle size and coronary artery disease. Arterioscler Thromb ; 12 : 187-195.

Chapman MJ, Laplaud PM, Luc G, Forgez P, Bruckert E, Goulinet S, Lagrange D (1988). Further resolution of the low density lipoprotein spectrum, in normal human plasma : physicochemical characteristics of discrete subspecies separated by gradient density ultracentrifugation. J Lipid Res, 29 : 42-458. Cheung MC, Albers JJ (1984). Characterization of lipoprotein particles isolated by immunoaffinitychromatography. J Biol Chem, 259 : 12201-12209. Couderc R, Legrand A (1996). Bilan lipidique en pratique médicale courante. In : Biologiste et Praticien, Fauchier P (Ed), 79 p. Couvert P, Giral P, Bonnefont-Rousselot D, Carrie A (2010). Les dyslipidémies héréditaires. Revue Francophone des Laboratoires, 425 : 73-85. Damen J, Regts J, Sherphof G (1982). Transfer of [14C]-phosphatidylcholine between liposomes and human plasma high density lipoprotein : partial purification of a transfer-stimulating plasma factor using a rapid transfer assay. Biochim Biophys Acta, 712 : 444-452. Dedoussis GV, Schmidt H, Genschel J (2004). LDL-receptor mutations in Europe. Hum Mutat, 24 : 443-459. Durlach V, Attia N, Zahouani A, Leutenegger M, Girad-Globa A (1996). Post-prandial cholesteryl ester transfer and high density lipoprotein composition in normotriglyceridemic non-insulino dependent diabetic patients. Atherosclerosis, 120 : 155-165. Duverger N, Rader D, Duchateau P, Fruchart JC, Castro G, Brewer BH Jr (1993). Biochemical characterization of the three major subclasses of lipoprotein A-I preparatively isolated from human plasma. Biochemistry, 32 : 12372-12379. Egloff M, Léglise D, Duvillard L, Steinmetz J, Boyer MJ, Ruelland A, Agher R, Beucler I (1999). Évaluation multicentrique sur différents automates d’analyses de trios méthodes de dosage direct du cholestérol-HDL. Ann Biol Clin, 57 : 561-572. Friedewald WT, Levy RI, Fredrickson DS (1972). Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge. Clin Chem, 18 : 499-502. Guérin M, Dolphin PJ, Chapman MJ (1993). Familial lecithin : cholesterol acyltransferase deficiency : further resolution of lipoprotein particle heterogeneity in the low density interval. Atherosclerosis, 104 : 195-212. Guyard-Dangremont V, Lagrost L, Gambert P, Lallemant C (1994). Competitive enzyme-linked immunosorbent assay of the human cholesteryl ester transfer protein (CETP). Clin Chim Acta, 231 : 147-160. Hansel B, Kontush A, Bonnefont-Rousselot D, Bruckert E, Chapman MJ (2006). Alterations in lipoprotein defenses against oxidative stress in metabolic syndrome. Curr Atheroscl Rep, 8 : 501-509. Haute Autorité de Santé. Place des dosages des apolipoprotéines A1 et B dans le bilan lipidique, septembre 2008 (www.has-sante.fr). Havel RJ, Eder HA, Bragdon JH (1955). The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins. J Clin Invest, 34 : 1345-1353.

161

4557_2_.book Page 162 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Hegele RA, Littel JA, Vezina C, Maguire GF, Tu L, Wolever TS, Jenkins DJA, Connelly PW (1993). Hepatic lipase deficiency : clinical, biochemical and molecular genetic characteristics. Arterioscler Thromb, 13 : 720-728. Hirano K, Yamashita S, Nakajima N, Arai T, Maruyama T, Yoshida Y, Ishigami M, Sakai N, Kameda-Takemura K, Matsuzawa Y (1997). Genetic cholesteryl ester transfer protein deficiency is extremely frequent in the Omagari area of Japan. Marked hyperalphalipoproteinemia caused by CETP gene mutation is not associated with longevity. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 17 : 1053-1059. Hooper AJ, van Bockxmeer FM, Burnett JR (2005). Monogenic hypocholesterolaemic lipid disorders and apolipoprotein B metabolism. Crit Rev Clin Lab Sci, 42 : 515-545. Hu Y, Ren Y, Luo RZ, Mao X, Li X, Cao X, Guan L, Chen X, Li J, Long Y, Zhang X, Tian H (2007). Novel mutations of the lipoprotein lipase gene associated with hypertriglyceridemia in members of type 2 diabetic pedigrees. J Lipid Res, May 2 [Epub ahead of print]. Inazu A, Jiang XC, Haraki T, Yagi K, Kamon N, Koizumi J, Mabuchi H, Takeda R, Takata K, Moriyama Y (1994). Genetic cholesteryl ester transfer protein deficiency caused by two prevalent mutations as major determinants of increased levels of high density lipoprotein cholesterol. J Clin Invest, 94 : 1872-1882. Krauss RM, Burke DJ (1982). Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteis in normal humans. J Lipid Res, 23 : 236-244. Kuivenhoven JA, Pritchard H, Hill J, Frohlich J, Assmann G, Kastelein J (1997). The molecular pathology of lecithin : cholesterol acyltransferase (LCAT) deficiency syndromes. J Lipid Res, 38 : 191-205. Lagrost L, Athias A, Gambert P, Lallemant C (1994). Comparative study of phospholipid transfer activities mediated by cholesteryl ester transfer protein and phospholipid transfer protein. J Lipid Res, 1994 ; 35 : 825-835. Lagrost L, Athias A, Herbeth B, Guyard-Dangremont V, Artur Y, Paille F, Gambert P, Lallemant C (1996). Opposite effects of cholesteryl ester transfer protein and phospholipid transfer protein on the size distribution of plasma high density lipoproteins. J Biol Chem, 271 : 19058-19065. Lalouel J, Wilson D, Iverius P (1992). Lipoprotein lipase and hepatic triglyceride lipase : molecular and genetic aspects. Curr Opin Lipidol, 3 : 86-95. Legrand A, Beucler I (2000). Les méthodes utilisées dans l’exploration des lipides et lipoprotéines : méthodes standardisées et recommandées. Revue du Biopathologiste, 2 : 23-28. Mackness MI, Durrington PN (1992). Lipoprotein separation and analysis for clinical studies. In : Lipoprotein analysis. A practical approach. Converse CA et Skinner (Eds), Oxford University Press. Marduel M, Carrié A, Sassolas A, Devillers M, Carreau V, Di Filippo M, Erlich D, Abifadel M, Marques-Pinheiro A, Munnich A, Junien C ; French ADH Research Network, Boileau C, Varret M, Rabès JP, Farnier M, Luc G, Lecerf JM, Bruckert E, Bonnefont-Rousselot D, Giral P, Kalopissis A, Girardet JP, Polak M, Chanu B, Moulin P, Perrot L, Krempf M, Zaïr Y, Bonnet J, Ferrières J, Ferrières D, Bongard V, Cournot M, Reznick Y, Schlienger JL, Fredenrich A, Durlach V (2010). Molecular spectrum of autosomal dominant hypercholesterolemia in France. Hum Mutat, 31 : E1811-E1824. McPherson R, Mann CJ, Tall AR, Hogue M, Martin L, Milne RW, Marcel Y (1991). Plasma concentrations of cholesteryl ester transfer protein in hyperlipoproteinemia : relation to cholesteryl ester transfer protein in hyperlipoproteinemia : relation to cholesteryl

162

ester transfer protein activity and other lipoprotein variables. Arterioscler Thromb, 11 : 797-804. Menzel HJ, Kladetzky R, Assmann G (1982). One-step screening method for the polymorphism of apolipoprotein A-I, A-II and A-IV. J Lipid Res, 23 : 915-922. Miller M, Zhan M (2004). Genetic determinants of low high-density lipoprotein cholesterol. Curr Opin Cardiol, 19 : 380-384. Murakami T, Michelagnoli S, Longhi R, Gianfranceschi G, Pazzucconi F, Calabresi L, Sirtori CR, Franceschini G (1995). Triglycerides are major determinants of cholesterol esterification/transfer and HDL remodelling in human plasma. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 15 : 1819-1828. Murakami T, Michelagnoli S, Longhi R, Gianfranceschi G, Pazzuconi F, Calabresi L, Sirtori CR, Franceschini G (1995). Triglycerides are major determinants of cholesterol esterificaton/transfer and HDL remodelling in human plasma. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 15 : 1819-1829. Nagano M, Yamashita S, Hirano K, Takano M, Maruyama T, Ishihara M, Sagehashi Y, Kujiraoka T, Tanaka K, Hattori H, Sakai N, Nakajima N, Egashira T, Matsuzawa Y (2004). Molecular mechanisms of cholesteryl ester transfer protein deficiency in Japanese. J Atheroscler Thromb, 11 : 110-121 Nikkilä EA (1983). Familial lipoprotein lipase deficiency and related disorders of chylomicon metabolism. In : Stanbury JB, Wyngaarden JB, Fredrickson DS, Goldstein JL, Brown MS (Eds). The metabolic basis of inherited disease. New York Mc Graw-Hill, 5th Ed, p. 622-642. Nilsson-Ehle P, Ekman R (1977). Rapid simple and specific assays for lipoprotein lipase and hepatic lipase. Artery, 3 : 194-209. Nomenclature des Actes de Biologie Médicale (2005). Chapitre 13, sous-chapitre 13-01, arrêté du 20 septembre 2005 (JO du 11 octobre 2005). Parra HJ, Mezdour H, Ghalim N, Bard JM, Fruchart JC (1990). Differential electroimmunoassay of human LpA-I lipoprotein particles on ready-to-use plates. Clin Chem, 36 : 1431-1435. Pease RJ, Milne RW, Jessup WK, Law A, Provost P, Fruchart JC, Dean RT, Marcel YL, Scott J (1990). Use of bacterial expression cloning to localize the epitopes for a series of monoclonal antibodies against apolipoprotein B100. J Biol Chem, 265 : 553-568. Petit E, Ayrault-Jarrier M, Pastier D, Robin H, Polonovski J, Aragon I, Hervaud E, Pau B (1987). Monoclonal antibodies to human apolipoprotein A-I : characterization and application as structural probes for apolipoprotein A-I and high density lipoprotein. Biochim Biophys Acta, 919 : 287-296. Planella T, Cortes M, Martineau-Bru C, Goncalves-Sastre F, OrdonezLlanos J (1997). Calculation of LDL-cholesterol by using apolipoprotein B for classification of nonchylomicronemic dyslipemia. Clin Chem, 43 : 808-815. Rader DJ, Castro G, Zech LA, Fruchart JC, Brewer B (1991). In vivo metabolism of apolipoprotéine A-I on high density lipoprotein particles LpA-I and Lp A-I : A-II. J Lipid Res, 32 : 1849-1859. Saïdi Y, Sich D, Federspiel MC, Aver C, Egloff M, Castro GR, Beucler I (1998). Rapid electrophoretic separation of pre-beta migrating high density lipoproteins using automated PhastSystemTM : application to analysis of lecithin : cholesterol acyltransferase-deficient plasma. Clin Chem Lab Med, 36 : 385-387. Samson-Bouma M, Berriot-Varoqueaux N, Aparicio T, Schmitz J, Aggerbeck LP (2009). Hypocholestérolémies génétiques : abêtalipoprotéinémie, hypobêtalipoprotéinémie familiale, maladie d’Anderson. EMC (Elsevier Masson SAS, Paris), Gastro-entérologie, 9-088C-60.

4557_2_.book Page 163 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Mise en évidence et exploration des dyslipoprotéinémies

Sassolas A, Cartier R (1999). Les hypocholestérolémies : causes et diagnostic. Ann Biol Clin, 57 : 555-560. Sich D, Saïdi Y, Giral P, Lagrost L, Dallongeville J, Federspiel MC, Cherfils C, Raisonnier A, Turpin G, Beucler I (1998a). Characterization of two HDL subfractions and LpA-I, LpA-I : A-II distribution profiles and clinical characteristics of hyperalphalipoproteinemic subjects without cholesterol ester transfer protein deficiency. Atherosclerosis, 138 : 351-360. Sich D, Saïdi Y, Giral P, Lagrost L, Egloff M, Auer C, Gautier V, Turpin G, Beucler I (1998b). Hyperalphalipoproteinemia : characterization of a cardioprotective profile associating increased high-density lipoprotein2 levels and decreased hepatic lipase activity. Metabolism, 47 : 965-973. Soutar AK, Naoumova RP (2007). Mechanisms of disease : genetic causes of familial hypercholesterolemia. Nat Clin Pract Cardiovasc Med, 4 : 214-225. Sprecher DL, Taam L, Brewer HB Jr (1984). Two-dimensional electrophoresis of human plsma apolipoproteins. Clin Chem, 30 : 20842092.

Von Eckardstein A, Jauiainen M, Huang Y, Metso J, Langer C, Pussinen P, Wu S, Ehnholm C, Assmann G (1996). Phospholipid transfer protein mediated conversion of high density lipoproteins generates preb1-HDL. Biochim Biophsy Acta, 1301 : 255-262. Warnick GR, Mayfield C, Albers JJ, Hazzard WR (1979). Gel isoelectric focusing method for specific diagnosis of familial hyperlipoproteinemia type 3. Clin Chem, 25 : 279-284. Whitfield AJ, Barrett PH, van Bockxmeer FM, Burnett JR (2004). Lipid disorders and mutations in the APOB gene. Clin Chem, 50 : 17251732. Widhalm K, Dirisamer A, Lindemayr A, Kostner G (2007). Diagnosis of families with familial hypercholesterolemia and/or ApoB-100 defect by means of DNA analysis of LDL-receptor gene mutations. J Inherit Metab Dis, 30 : 239-247. Zhong S, Sharp DS, Grove JS, Bruce C, Yano K, Curb JD, Tall AR. (1996). Increased coronary heart disease in Japanese-American men with mutation in the cholesteryl ester transfer protein gene despite increased HDL levels. J Clin Invest, 97 : 2917-2923.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Steinmetz J (1990). Cholestérol total. In : Références en biologie clinique, Siest G, Henny J, Schiele F (Eds.), Elsevier, Paris, 193-208.

Steinmetz J, Cacès E, Couderc R, Beucler I, Legrand A, Henny J (1997). Valeurs de référence des apolipoprotéines A-I et B. Contribution à la standardisation internationale. Travail collaboratif entre la SFBC et le SFRL. Ann Biol Clin, 55 : 451-454.

163

4557_2_.book Page 164 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4557_2_.book Page 165 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

10 Maladies cardiovasculaires : marqueurs de l’athérosclérose, de la maladie coronarienne et de l’accident vasculaire cérébral Philippe Gervois, Malika Balduyck, Thierry Brousseau

INTRODUCTION 1 ■■ PHYSIOPATHOLOGIE DE L’ATHÉROSCLÉROSE 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5.

Structure de la paroi artérielle saine Dysfonction endothéliale : initiation de la lésion d’athérosclérose Mécanisme de l’athérogenèse : composantes lipidiques et cellulaires Phase aiguë de l’inflammation et paroi artérielle Phase aiguë de thrombose

2 ■■ MARQUEURS DU RISQUE CARDIOVASCULAIRE ET MODALITÉS DE PRISE EN CHARGE 2.1. 2.2.

Notion de risque cardiovasculaire global Facteurs de risque cardiovasculaire modifiables et recommandations

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

3 ■■ MARQUEURS INNOVANTS DU RISQUE CORONARIEN 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8.

Protéine C-réactive Myéloperoxydase Molécules d’adhérence Interleukine-6 Métalloprotéases Endothélines Adiponectine Phospholipase A2

4 ■■ RATIONNEL POUR L’ÉVALUATION DES MARQUEURS NON LIPIDIQUES 5 ■■ MARQUEURS DE L’ACCIDENT VASCULAIRE CÉRÉBRAL 5.1. 5.2. 5.3.

Marqueurs diagnostiques de l’accident vasculaire cérébral Marqueurs innovants du risque d’AVC d’origine ischémique Marqueurs innovants du risque d’AVC d’origine hémorragique

CONCLUSION ET PERSPECTIVES Références bibliographiques 165

4557_2_.book Page 166 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4557_2_.book Page 167 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Maladies cardiovasculaires : marqueurs de l’athérosclérose, de la maladie coronarienne et de l’accident vasculaire cérébral

INTRODUCTION L’athérosclérose est une maladie chronique de la paroi artérielle, d’évolution lente, à l’origine d’événements ischémiques aigus fréquents en population tels que l’infarctus du myocarde, l’accident vasculaire cérébral ou l’artériopathie oblitérante des membres inférieurs. À l’origine d’une très forte morbimortalité en population et d’un coût socio-économique particulièrement lourd, l’athérosclérose et ses conséquences font l’objet d’une attention soutenue de la part de la communauté scientifique, du corps médical et des pouvoirs institutionnels. Une meilleure compréhension du mécanisme physiopathologique de l’athérogenèse, et l’introduction sur le marché de molécules thérapeutiques notablement actives pour la prise en charge de certains facteurs de risque cardiovasculaire fréquents comme l’hypertension artérielle, les dyslipidémies ou le diabète de type 2, ont largement ouvert la possibilité d’envisager des stratégies de prévention individualisées et applicables à l’échelle de la population. Ainsi, l’athérosclérose bénéficie-t-elle aujourd’hui de recommandations solidement étayées sur le plan scientifique mais en évolution constante. Le présent chapitre s’attache à présenter une synthèse des connaissances sur le mécanisme d’athérogenèse. Ces données permettent d’identifier les facteurs de risque cardiovasculaire les plus pertinents, repris dans les recommandations périodiquement éditées pour permettre une prévention dès à présent efficiente. Enfin, des marqueurs de risque innovants, issus de la recherche la plus récente dans le domaine, seront décrits. En cours d’évaluation épidémiologique, certains de ces marqueurs devraient être progressivement inclus dans les algorithmes décisionnels proposés au clinicien pour une prévention optimisée, notamment de la phase thrombotique aiguë de la maladie.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

1 ■■ PHYSIOPATHOLOGIE DE L’ATHÉROSCLÉROSE L’athérosclérose est une maladie de la paroi artérielle affectant les vaisseaux de gros et moyen calibres. Historiquement centrée sur l’accumulation pariétale de cholestérol et sur la sclérose, la description des mécanismes physiopathologique de l’athérosclérose, ou athérogenèse, évoque actuellement un processus très dynamique impliquant, de l’étape d’initiation aux stades les plus évolués des lésions de la paroi, de multiples interactions cellulaires et moléculaires et une composante inflammatoire abondamment documentée (Bonnet, 2005 ; Libby, 2002 ; Ross, 1993 ; Ross, 1999).

1.1.

Structure de la paroi artérielle saine

La paroi artérielle est composée de trois tuniques concentriques morphologiquement distinctes. À partir de la lumière du vaisseau, on distingue l’intima, la média, puis l’adventice. Dans la paroi artérielle saine, l’intima est fine, à peine visible en microscopie optique, et constituée successivement de l’endothélium, de la couche sous-endothéliale et de la limitante élastique interne.

L’endothélium correspond à la surface luminale de la paroi, en contact direct avec le sang circulant. Il est formé d’une monocouche continue de cellules endothéliales aplaties et jointives reposant sur une membrane basale. La couche sous-endothéliale de l’intima est formée de tissu conjonctif composé de fibres de collagène, de quelques fibres élastiques, de cellules musculaires lisses (CML) produisant les macromolécules de la matrice extracellulaire (MEC), et de nombreuses cellules du système immunitaire. La limitante élastique interne est composée d’une lame de fibres élastiques constituées d’élastine. Elle sépare l’intima de la média. La média est, dans la paroi artérielle saine, la tunique la plus épaisse. La composition de la média détermine les propriétés mécaniques des artères. Elle est essentiellement composée de CML, empilées de façon concentrique en couches perpendiculaires au flux sanguin, formant des unités lamellaires. Chaque unité lamellaire est constituée de CML entourées d’une MEC composée de protéines fibreuses et élastiques (collagène et élastine), et de protéoglycannes de la substance fondamentale. Une lame d’élastine, la limitante élastique externe, sépare la média de l’adventice. Cette limitante n’est retrouvée qu’au niveau des vaisseaux de gros calibre. Enfin, partant de la lumière, l’adventice est la tunique la plus externe de la paroi artérielle. Son épaisseur est extrêmement variable selon les territoires artériels. L’adventice est constituée d’un tissu conjonctif peu organisé, riche en collagènes fibrillaires et en fibres élastiques, et contenant des fibroblastes. Les éléments caractéristiques de l’adventice sont les nerfs et les microvaisseaux appelés vasa vasorum. Les vasa vasorum assurent, avec le sang circulant dans la lumière de l’artère, la nutrition de la paroi. Dans une artère saine, les vasa vasorum n’irriguent que l’adventice elle-même et la partie externe de la média. Quant aux fibres nerveuses vasomotrices de l’adventice, elles participent au contrôle du calibre vasculaire essentiellement dans les artères de petit calibre. L’athérosclérose concerne essentiellement l’intima et la média de l’artère. Ce processus chronique et évolutif est initié par l’installation d’une anomalie structurelle et/ou fonctionnelle de l’endothélium nommée dysfonction endothéliale.

1.2.

Dysfonction 1 endothéliale : initiation de la lésion d’athérosclérose

L’athérosclérose est une pathologie chronique inflammatoire qui se développe en réponse à des dommages affectant l’endothélium vasculaire. Elle est caractérisée par l’infiltration de leucocytes à travers l’intima, l’accumulation de lipides, la prolifération de cellules musculaires lisses et l’accumulation d’une matrice extracellulaire abondante. Dans les circonstances normales, les cellules endothéliales résistent à l’adhérence des cellules circulantes telles que les leucocytes. La dysfonction endothéliale est considérée comme l’étape d’initiation du processus athérogène. La dysfonction endothéliale se caractérise par une modification des propriétés physiologiques de l’endothélium se traduisant

1. Dysfonction ou dysfonctionnement.

167

4557_2_.book Page 168 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

notamment par une réduction de la vasodilatation endothéliumdépendante, et l’installation d’un état pro-inflammatoire et prothrombotique. Les causes de la dysfonction endothéliale regroupent de nombreux facteurs parmi lesquels on trouve l’hypercholestérolémie, l’inflammation chronique, l’hypertension artérielle, le diabète. L’identification et la compréhension de ces facteurs comme initiateurs potentiels de la dysfonction endothéliale ont largement guidé et motivé les stratégies de prévention des maladies cardiovasculaires. Suite aux dommages subits par l’endothélium, les cellules endothéliales sont activées pour initier une réponse défensive qui débute par une augmentation de l’expression de molécules d’adhérence des cellules vasculaires (VCAM-1 : Vascular Cell Adhesion Molecule-1 ; ICAM-1 : Intracellular Adhesion Molecule-1). Ces molécules interagissent de façon préférentielle avec deux classes de leucocytes : les monocytes et les lymphocytes T. Ces cellules peuvent alors pénétrer la paroi vasculaire pour se diriger vers le site d’agression.

1.3.

Mécanisme de l’athérogenèse : composantes lipidiques et cellulaires

L’initiation de l’athérogenèse fait intervenir des cellules inflammatoires et des cellules de la paroi vasculaire : monocytes/macrophages, lymphocytes, cellules endothéliales et cellules musculaires lisses. La première phase qui détermine la réponse endothéliale est l’infiltration des lipoprotéines de basse densité (LDL : Low Density Lipoproteins) dans l’espace intimal suivie de leur oxydation qui déclenche l’activation des cellules endothéliales. Après recrutement, les cellules inflammatoires pénètrent dans l’espace sousendothélial. La pénétration des monocytes adhérents et leur différenciation en macrophages est sous le contrôle de chimiokines telles que la protéine chimiotactique monocytaire MCP-1 (Monocyte Chemotactic Protein-1) et le facteur de stimulation de la colonisation monocytaire M-CSF (Monocyte-Colony Stimulating Factor). La différenciation des monocytes en macrophages est notamment illustrée par une augmentation de l’expression de récepteurs « scavengers » (SRA : Scavenger Receptor A ; CD36) qui permettent l’internalisation non-spécifique des LDL oxydées, et de leur contenu en cholestérol. Contrairement au récepteur spécifique des LDL (LDL-récepteur), les récepteurs scavengers ne sont pas régulés par le contenu intracellulaire en cholestérol. Par ailleurs, les macrophages ne sont pas capables de dégrader le cholestérol. L’internalisation des LDL oxydées par la voie des récepteurs scavengers conduit donc à une accumulation considérable et non contrôlée de cholestérol dans les macrophages de la paroi artérielle. Ces macrophages évoluent ainsi en cellules spumeuses qui, en se regroupant, forment les lésions précoces de l’athérosclérose nommées stries lipidiques. La persistance d’une hypercholestérolémie et d’un contexte pro-inflammatoire conduit à une expansion de la formation d’amas lipidiques sous-endothéliaux. Les macrophages pariétaux vont déclencher une réponse inflammatoire chronique par la sécrétion de facteurs de croissance, de cytokines pro-inflammatoires (TNF : Tumor Necrosis Factor ; IL-1 : interleukine-1) et d’enzymes de digestion de la matrice extracellulaire (MMPs :

168

« Matrix MetalloProteases »). Ces processus sont en partie équilibrés par la production de substances exerçant des actions opposées : l’IL-10 exerce une action anti-inflammatoire ; les MMPs peuvent être inhibées par les inhibiteurs de métalloprotéases (TIMP-1, TIMP-2 : « Tissue Inhibitors of MetalloProteases »). La décharge des facteurs inflammatoires exacerbe et amplifie la réponse inflammatoire locale au sein de la lésion (processus d’auto-amplification), et entretient la production d’espèces réactives de l’oxygène. L’ensemble de ces processus, associé à la surcharge lipidique, conduit à la mort des macrophages et des cellules spumeuses qui s’accompagne de la libération de corps apoptotiques et du contenu lipidique qui vont former le cœur lipidique, ou centre nécrotique, de la lésion d’athérosclérose. Le contexte pro-inflammatoire induit également la dédifférenciation, la prolifération et la migration des cellules musculaires lisses de la média vers l’intima. Ces cellules subissent une transition du phénotype contractile vers le phénotype sécrétoire à l’origine de la synthèse d’une matrice extracellulaire riche en éléments fibreux (collagène, élastine). La plaque d’athérome est ainsi formée d’un cœur nécrotique et lipidique recouvert, vers la face luminale de la lésion, par une chape fibreuse constituée de cellules musculaires lisses noyées dans une matrice extracellulaire fibreuse, plus ou moins abondante. La cohésion de la plaque et sa stabilité sont conditionnées par l’intégrité de la chape fibreuse. La lésion évolue de façon plus complexe. Elle progresse vers l’adventice et vers la lumière artérielle, convergeant vers un volume occlusif, tout en continuant d’accumuler lipides et macrophages.

1.4.

Phase aiguë de l’inflammation et paroi artérielle

L’inflammation aiguë systémique constitue une réponse défensive de l’organisme vis-à-vis d’agressions d’origines diverses : infections bactériennes, choc hémorragique, lésions tissulaires… En dehors du déclenchement de processus bien caractérisés (fièvre, hyperleucocytose, sécrétion de prostaglandines, d’ACTH, de cortisol), cette réponse associe des réactions cellulaires et biochimiques qui aboutissent à une libération accrue ou diminuée de nombreuses protéines Ces protéines, principalement d’origine hépatique, sont dites protéines de la phase aiguë de l’inflammation (APRP : « Acute Phase Response Proteins »). Les APRP dont les concentrations circulantes augmentent sont qualifiées de protéines positives de la phase aiguë de l’inflammation (CRP : Protéine C-réactive, SAA : Serum Amyloid A, fibrinogène, haptoglobine, orosomucoïde, α1-antitrypsine, α1-glycoprotéine, céruléoplasmine). À l’inverse celles dont les concentrations diminuent sont appelées protéines négative de la phase aiguë de l’inflammation (transferrine, albumine). L’inflammation aiguë provoque une augmentation brutale, rapide, mais transitoire, de la synthèse des APRP positives et une diminution modérée des APRP négatives, suivie d’une normalisation de ces protéines lorsque la réparation est complète. En revanche, l’inflammation chronique conduit à une altération constante du profil d’expression de certaines ces protéines, avec des concentrations maintenues respectivement élevées ou diminuées pour les APRP positives et négatives.

4557_2_.book Page 169 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Maladies cardiovasculaires : marqueurs de l’athérosclérose, de la maladie coronarienne et de l’accident vasculaire cérébral

Phase aiguë de l’inflammation et biomarqueurs des maladies cardiovasculaires

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Les facteurs qui stimulent la phase aiguë sont notamment représentés par les cytokines pro-inflammatoires TNF, IL-1β et IL-6, et par les endotoxines, en particulier le lipolysaccharide. Les cytokines pro-inflammatoires sont libérées dans la circulation principalement par les macrophages, les cellules endothéliales vasculaires et les fibroblastes, et agissent sur les organes cibles via l’interaction avec des récepteurs. Les données actuelles permettent de définir l’inflammation comme un processus déterminant dans la transformation des facteurs de risque en modification biologique au sein de la paroi vasculaire. Parmi les protéines de la phase aiguë de l’inflammation, plusieurs sont associés à l’athérosclérose en tant que « marqueurs de risque d’origine hépatique », la CRP étant la mieux caractérisée dans le contexte physiopathologique de l’athérosclérose et de ses complications. Dans le cadre de l’inflammation, la distinction entre marqueur et facteur de risque est souvent difficile à définir. Les travaux de laboratoire visant à étudier des cibles thérapeutiques de l’atténuation des facteurs de risque de maladie cardiovasculaire liés aux dyslipidémies et à l’inflammation se heurte à cette difficulté. L’étude des récepteurs PPAR (Peroxisome proliferator-Activated Receptor) en est une bonne illustration (Gervois et al., 2007 ; Gervois et al., 2004 ; Mansouri et al., 2008). Ces récepteurs des hypolipémiants de la classe des fibrates sont à la fois capables de corriger les dyslipidémies et de contrôler des voies de signalisation de l’inflammation. Ce dernier effet, basé sur un mécanisme de contrôle de l’expression des gènes, se répercute sur les protéines de l’inflammation sans l’évidence directe d’un effet bénéfique sur l’athérosclérose (Zambon et al., 2006). Ces travaux fondamentaux peuvent cependant permettre l’identification de futurs marqueurs utilisables dans un cadre diagnostique ou pronostique.

1.5.

Phase aiguë de thrombose

L’athérogenèse est un processus d’évolution très lente : plusieurs dizaines d’années d’évolution et de complication de la plaque d’athérome sont souvent nécessaires pour conduire de l’étape d’initiation à la constriction de la lumière artérielle, et donc à l’apparition de symptômes cliniquement détectables. Les lésions athéromateuses peuvent ainsi provoquer une sténose limitant le flux sanguin et conduisant à une ischémie d’effort (angor). Toutefois, le diamètre de la lumière du vaisseau doit être fortement réduit pour entraîner l’ischémie chronique. Plus important, une sténose modérée n’exclut pas la survenue d’épisodes ischémiques aigus, potentiellement péjoratifs, tels que l’angor instable ou l’infarctus du myocarde. La menace permanente de l’accident

vasculaire aigu lié à l’athérosclérose est, en effet, plus fréquemment associée au risque de rupture ou d’érosion de la plaque, à l’origine d’une thrombose aiguë d’apparition soudaine, plutôt qu’à la taille de la plaque. C’est donc en premier lieu la biologie de la plaque qui conditionne le risque de rupture et de thrombose, et plus accessoirement sa morphologie.

1.5.1. Facteurs de risque extrinsèques et intrinsèques de rupture de la plaque De nombreux travaux ont contribué à identifier les facteurs extrinsèques et intrinsèques à l’origine des complications thrombotiques des plaques d’athérosclérose. Parmi les facteurs extrinsèques, le rythme nycthéméral a une incidence sur le risque d’infarctus du myocarde, avec un pic matinal. La stimulation adrénergique associée au réveil favorise le pouvoir agrégant des plaquettes. En l’occurrence, l’administration d’aspirine abaisse le pic matinal de fréquence de l’infarctus du myocarde. La rupture de la plaque peut être également expliquée par un stress hémodynamique, lié à une poussée hypertensive ou à un effort violent. Toutefois, en conditionnant fortement sur la durée l’évolution d’une plaque d’athérome, les facteurs intrinsèques semblent les plus déterminants sur la stabilité ou la fragilité et la thrombogénicité d’une plaque. Les facteurs intrinsèques influencent la vulnérabilité de la plaque, en perpétuel remaniement structural. L’indicateur de vulnérabilité repose sur la composition relative de la plaque en termes de contenu en lipides, d’éléments fibreux et de cellules, et sur sa structure. Les plaques fragiles sont caractérisées par un centre lipidique important et une chape fibreuse relativement mince. En revanche, un centre lipidique de taille réduite et un épaississement de la chape fibreuse solidifient les plaques dites stables. La matrice extracellulaire de la chape fibreuse est produite par les cellules musculaires lisses qui ont proliféré dans la paroi vasculaire. La production de cette matrice est contrée par les macrophages qui favorisent sa dégradation par la production de métalloprotéases matricielles, augmentant ainsi la vulnérabilité de la plaque. Le nombre et l’activité des cellules musculaires lisses et des macrophages de la plaque sont donc des déterminants majeurs de la stabilité de la plaque. Néanmoins, d’autres facteurs jouent un rôle important dans la balance stabilisation/déstabilisation de la plaque parmi lesquels on peut citer la mort des cellules de la plaque (cellules endothéliales, cellules musculaires lisses, macrophages), la rupture des néo-vaisseaux de la plaque ou l’infection.

1.5.2. Érosion de la plaque La dénudation modérée de l’endothélium est associée à une accumulation de plaquettes à la surface de la plaque, même très avancée, qui peut conduire à l’exacerbation d’une thrombose. La formation de microthrombi (thrombose in situ), généralement sans manifestation clinique, peut contribuer significativement à promouvoir la croissance des lésions, de façon silencieuse. Par ailleurs, l’érosion endothéliale prononcée, notamment liée aux forces exercées par le torrent circulatoire, a pour conséquence l’exposition du tissu conjonctif sous-endothélial au flux sanguin. Elle a pour conséquence le relargage des constituants pariétaux

169

4557_2_.book Page 170 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

et l’adhérence des plaquettes. Ce processus représente 40 % des thromboses coronariennes qui surviennent sans rupture de plaque. L’érosion s’initie sans réaction inflammatoire. Ces accidents semblent plus fréquents chez des sujets jeunes, chez les femmes, les sujets diabétiques et chez des sujets sans anomalies lipidiques majeures.

1.5.3. Thrombose artérielle Les plaques d’athérosclérose ont un potentiel thrombotique élevé. Les lipides, la matrice extracellulaire, les cellules spumeuses, les cellules inflammatoires, les débris cellulaires et la richesse de la plaque en facteur tissulaire, notamment d’origine macrophagique, sont autant de facteurs qui conditionnent la thrombogénicité de la plaque. Les deux mécanismes prédominants qui expliquent le déclenchement d’une thrombose à partir des lésions athéromateuses sont l’érosion endothéliale et la fissuration de la plaque qui stimulent l’adhérence et l’agrégation plaquettaire, première phase de la thrombose. Les facteurs de coagulation permettent ensuite la structuration du thrombus. La thrombine catalyse la formation de fibrine insoluble à partir du fibrinogène. La fissuration de la plaque initie le contact entre le centre lipidique de la lésion et le sang artériel qui déclenche le processus thrombotique d’abord au sein de la lésion elle-même. Le sang entre en contact avec le cœur nécrotique riche en facteurs apoptotiques et en facteur tissulaire. Ce facteur s’associe au facteur VIIa pour initier une cascade enzymatique responsable de la formation de thrombine et des dépôts de fibrine. À ce niveau, la précipitation du processus de coagulation est insuffisamment contrôlée pour endiguer la formation du thrombus. Toutes les plaques ne présentent pas le même potentiel thrombogène. La gravité des manifestations cliniques dépend fortement de l’ampleur de la thrombose. Des ruptures silencieuses sont observées lors d’autopsies d’individus ayant succombé à des maladies d’origines autres que cardiovasculaires (Davies, 1996). L’échographie endocoronaire détecte des plaques rompues sans événement aigu associé. Dans ces contextes, l’étendue de la thrombose semble modérée localement, participe à la stabilisation du syndrome coronarien et permet d’échapper à l’infarctus. La cicatrisation conduit à l’intégration du thrombus dans la lésion.

1.5.4. Manifestions cliniques aiguës de l’athérosclérose L’athérosclérose est l’origine principale des maladies cardiovasculaires. Les manifestations cliniques, souvent sévères, dépendent de la localisation des plaques d’athérosclérose sur l’arbre artériel. L’évolution des plaques obstrue progressivement la lumière artérielle pour aboutir à une sténose significative lorsque la réduction de la lumière dépasse 50 %. La réduction des apports en oxygène en aval de la sténose deviennent cliniquement perceptibles plus fréquemment à l’effort, mais également en situation de stress, voire au repos. La rupture de plaque ou l’érosion endothéliale peuvent se compliquer par la thrombose. Les

170

coronaires sont majoritairement concernées par l’athérosclérose, suivi par les artères carotidiennes et les artères des membres inférieures. Les tableaux cliniques principaux de la maladie coronarienne sont l’angor stable et les syndromes coronariens aigus. L’angor résulte d’un déséquilibre entre demande et apports en oxygène au myocarde et représente la principale manifestation de l’insuffisance coronarienne chronique. Il se caractérise par une douleur thoracique traduisant une ischémie myocardique réversible. Le diagnostic de l’angor est la coronarographie qui permet de distinguer l’angor par athérosclérose de l’angor spastique ou de l’angor à coronaires saines. L’angor instable représente un haut risque d’évolution vers un syndrome coronarien aigu. Les syndromes coronariens aigus définissent une insuffisance coronarienne aiguë par ischémie myocardique. Ils regroupent l’angor instable et l’infarctus du myocarde et résultent d’un ou plusieurs mécanismes, opérant seuls ou en combinaison, et à des degrés variables : la rupture de plaque d’athérosclérose, l’érosion endothéliale, la thrombose ou la vasomotricité coronarienne et le spasme. La rupture de plaque est responsable de 60 % des syndromes coronariens aigus, l’érosion de 20 %, alors que les accidents avec plaques stables concernent seulement 20 % des cas. La thrombose est associée dans 70 % des cas. Quoique l’instabilité soit retrouvée dans de nombreuses plaques, une seule est responsable du syndrome aigu. L’accident vasculaire cérébral (AVC) se définit comme un déficit neurologique aigu, d’apparition soudaine, accompagné de symptômes et de signes variables selon les régions focales du cerveau concernées par l’épisode vasculaire. L’AVC peut être d’origine ischémique ou hémorragique. L’infarctus cérébral concerne 85 % des AVC. Les causes principales, qui expliquent près de 70 % des cas, sont l’athérosclérose, les maladies des petites artères cérébrales et les cardiopathies ischémiques. Les autres accidents sont inexpliqués ou d’origines très complexes. L’implication de l’athérosclérose est parfois difficile à démontrer car elle implique l’observation d’une sténose en amont de la zone ischémiée. L’absence de détection d’une sténose n’est cependant pas incompatible avec la rupture d’une plaque de taille modeste mais vulnérable, à l’origine d’une thrombose. Les AVC sont classés en accidents ischémiques et en accidents hémorragiques. Les accidents ischémiques définissent l’occlusion d’une artère cérébrale ou à destination cérébrale (carotides ou artères vertébrales) qui provoque l’infarctus cérébral. Le mécanisme peut s’expliquer par une thrombose d’origine athérogénique ou par un caillot formé localement, ou suite à une embolie cardiaque. Il peut également s’agir d’une déchirure de la paroi de l’artère ou de la compression par une tumeur. Les accidents hémorragiques sont liés à la rupture d’un vaisseau pathologique. Elle s’explique le plus fréquemment par une atteinte dégénérative des petites artères perforantes. La rupture d’anévrisme artériel provoque une hémorragie méningée dans les espaces sous-arachnoïdiens qui s’accompagne parfois d’un hématome intraparenchymateux.

4557_2_.book Page 171 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Maladies cardiovasculaires : marqueurs de l’athérosclérose, de la maladie coronarienne et de l’accident vasculaire cérébral

2 ■■ MARQUEURS DU RISQUE CARDIOVASCULAIRE ET MODALITÉS DE PRISE EN CHARGE Les mécanismes physiopathologiques de l’athérosclérose, à l’origine des maladies cardiovasculaires, confèrent à la maladie un caractère étiologique multifactoriel incontestable qu’il est nécessaire de prendre en compte dans la mise au point de stratégies de diagnostic et de prévention efficaces. Toutefois, pour être applicables à une population aussi large que possible, ces stratégies doivent reposer sur un nombre de facteurs limité et facilement mesurables. Un nombre considérable d’études épidémiologiques et d’essais thérapeutiques a contribué à identifier les marqueurs de risque cardiovasculaire les plus pertinents. Sur la base de ces travaux, les organismes institutionnels et les sociétés savantes directement concernées ont émis à l’échelon international et/ou national des recommandations pour la prise en charge des maladies cardiovasculaires. En France, l’Agence française de sécurité sanitaire des produits de santé (Afssaps) et l’Agence Nationale d’Accréditation et d’Évaluation en Santé (ANAES) ont édicté, à plusieurs reprises, des recommandations concernant la prise en charge du risque cardiovasculaire (Afssaps, 2005 ; Afssaps 2006 ; ANAES, 1999 ; ANAES, 2000a ; ANAES, 2000b ; HAS, 2006). Ces recommandations, dont nous présentons une synthèse, s’appuient sur des marqueurs solidement validés d’un point de vue épidémiologique. Néanmoins, les progrès accomplis dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques de l’athérogenèse, et notamment dans la composante inflammatoire de la maladie, conduit la communauté scientifique à proposer de nouveaux marqueurs du risque cardiovasculaires (tableau 1).

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

2.1.

Tableau 1

■

Facteurs de risque cardiovasculaire. Facteurs de risque majeurs

Âge Sexe masculin Consommation de tabac Hypertension artérielle Augmentation du cholestérol-LDL Diminution du cholestérol-HDL Diabète de type 2 Facteurs de risque prédisposants Antécédents familiaux précoces de maladie cardiovasculaire, facteurs génétiques Sédentarité Obésité androïde Ménopause Marqueurs de risque en évaluation ou discutés Hypertriglycéridémie LDL petites et denses Homocystéine Lp(a) Facteurs prothrombotiques Protéine C-réactive Molécules d’adhérence (sICAM-1, sVCAM-1) Interleukine-6 Métalloprotéases (MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9) Endothélines Adiponectine Protéine S100 NSE (Neuronal Specific Enolase) Agents infectieux bactériologiques ou viraux

Notion de risque cardiovasculaire global

Compte tenu du caractère multifactoriel de la maladie, la prévention de l’athérosclérose et des épisodes cardiovasculaires aigus qui lui sont attachés nécessite une évaluation et une prise en charge globale des facteurs de risque (tableau 1). Cette évaluation s’appuie sur des algorithmes décisionnels consistant à procéder à la sommation simple d’un nombre limité de facteurs de risque et permettant d’évaluer un risque absolu (ou global) de maladie cardiovasculaire à une échéance donnée, généralement 10 années. Certes critiquable à divers titres, la sommation présente l’intérêt d’être aisément utilisable en pratique clinique de routine. De façon générale, les manifestations cliniques concernées par la mesure du risque de maladies cardiovasculaires sont les maladies coronariennes (angor d’effort, angor instable, infarctus du myocarde, mort subite), les accidents vasculaires cérébraux (hémorragiques ou ischémiques, transitoires ou constitués), les atteintes vasculaires périphériques (artériopathie oblitérante des membres inférieurs, anévrisme aortique, insuffisance rénale par néphro-angiosclérose) et l’insuffisance cardiaque. Parmi les facteurs de risque retenus dans ces algorithmes, on relèvera systématiquement l’âge, le sexe masculin et les antécédents familiaux, d’origine génétique, de maladie cardiovasculaire. Ces facteurs de risque, quoique non modifiables, participent au calcul du risque et permettent d’affiner les stratégies de préven-

tion. La consommation de tabac est également un facteur de risque majeur pour lequel les recommandations se résument à une notion très simple, quoique d’application parfois délicate : l’arrêt de la consommation. D’autres facteurs de risque modifiables, fréquents en population, sont également pris en compte et font l’objet de recommandations plus détaillées. Il s’agit de l’hypertension artérielle, des dyslipidémies et du diabète de type 2.

2.2.

Facteurs de risque cardiovasculaire modifiables et recommandations

2.2.1. L’hypertension artérielle L’hypertension artérielle (HTA) est classiquement définie par une pression artérielle systolique (PAS) supérieure à 140 mmHg et/ou une pression artérielle diastolique (PAD) supérieure à 90 mmHg. Le diagnostic nécessite au minimum deux mesures par consultation (une mesure à chaque bras) au cours de trois consultations successives s’étalant sur une période de 3 à 6 mois. La prise en charge thérapeutique, hygiéno-diététique ou médicamenteuse, du patient hypertendu a pour objet majeur de réduire les chiffres de pression artérielle systolique et diastolique en deçà de 140/ 90 mmHg. Cette prise en charge doit permettre de prévenir,

171

4557_2_.book Page 172 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

dépister et traiter les complications de l’hypertension artérielle, dont les maladies cardiovasculaires. En 2000, l’ANAES a proposé une classification des sujets hypertendus en trois groupes sur la base de la sommation de facteurs de risque cardiovasculaire (ANAES, 2000a) : – Groupe A : sujets présentant une hypertension artérielle sans autre facteur de risque. – Groupe B : sujets présentant une hypertension artérielle et la présence concomitante de 1 ou 2 facteurs de risque. – Groupe C : sujets présentant une hypertension artérielle et 3 facteurs de risque ou plus ou la présence d’un diabète ou une atteinte d’un organe cible (accident ischémique transitoire ou accident vasculaire cérébral, angor, insuffisance cardiaque, artériopathie aorto-iliaque et des membres inférieurs, signes biologiques d’insuffisance rénale). Les facteurs de risque retenus pour l’application de cette classification sont les suivants : – Homme de plus 50 ans. – Femme de plus 60 ans ou ménopausée. – Antécédents familiaux (parent du 1 er degré) de maladie cardiovasculaire précoce (< 55 ans chez un homme ; < 65 ans chez une femme). – Consommation de tabac ou arrêt depuis moins de 3 ans. – Diabète traité ou non traité. – Cholestérol-HDL inférieur à 1,0 mmol/L (0,40 g/L) et/ou cholestérol-LDL supérieur à 4,1 mmol/L (1,60 g/L). D’autres paramètres peuvent être pris en compte : – Consommation excessive d’alcool. – Sédentarité. – Obésité androïde (périmètre abdominal supérieur à 102 cm chez l’homme ou 88 cm chez la femme). Au sein de chaque groupe, les valeurs des chiffres tensionnels permettent de qualifier le niveau de gravité de l’hypertension, exprimé en grade. Trois grades ont été ainsi définis : – Grade 1 : HTA légère, définie par une PAS comprise entre 140 et 159 mmHg et/ou une PAD comprise entre 90 et 99 mmHg. – Grade 2 : HTA modérée, définie par une PAS comprise entre 160 et 179 mmHg et/ou une PAD comprise entre 100 et 109 mmHg. – Grade 3 : HTA sévère, définie par une PAS supérieure ou égale à 180 mmHg et/ou une PAD supérieure ou égale à 110. La présence concomitante de facteurs de risque cardiovasculaire (groupes) et le grade de l’hypertension conditionnent fortement le niveau de risque cardiovasculaire. Ainsi, chez les sujets du groupe A, le risque cardiovasculaire est faible pour une HTA de grade 1, moyen pour une HTA de grade 2 et élevé lorsque l’HTA est de grade 3. En présence d’un facteur de risque concomitant (groupe B), le risque est moyen pour les grades 1 et 2, puis élevé pour les sujets présentant une HTA de grade 3. En revanche, le risque est systématiquement considéré comme élevé chez les sujets du groupe C, quelque soit le grade de l’HTA. Les critères de prise en charge thérapeutique de l’hypertension artérielle sont logiquement liés au niveau de risque global et au grade de l’hypertension. Les recommandations sont les suivantes : – Groupe 1 et HTA de grade 1 : Mesures hygiéno-diététiques durant 6 mois, puis traitement médicamenteux si l’objectif n’est pas atteint.

172

– Groupe 1 et HTA de grade 2 ou groupe 2 et HTA de grade inférieur à 3 : Mesures hygiéno-diététiques durant 1 à 3 mois, puis traitement médicamenteux si l’objectif n’est pas atteint. – Dans tous les autres cas, plus sévères, l’instauration d’emblée d’un traitement pharmacologique est justifiée, en accompagnement des mesures hygiéno-diététiques. Les mesures hygiéno-diététiques consistent en la pratique d’une activité physique régulière, l’arrêt de la consommation de tabac, la réduction de la surcharge pondérale en dessous de 25 kg/m2 (ou une réduction de 10 % du poids initial), la réduction de la consommation d’alcool, la réduction des apports sodés (5 à 6 g/j) et la réduction des apports alimentaires en lipides. La prise en charge médicamenteuse de l’hypertension artérielle consiste, de préférence et en première intention, en une prise unique et quotidienne du traitement, faisant appel soit à une monothérapie soit à une association fixe. Le choix de la (les) molécule(s) dépend du patient et des autres pathologies associées à l’hypertension.

2.2.2. Les dyslipidémies Le dépistage d’une dyslipidémie repose sur l’EAL (Exploration d’une anomalie lipidique) qui regroupe les dosages sériques de trois paramètres facilement réalisables dans une pratique clinique de routine : le cholestérol total, les triglycérides, le cholestérolHDL. Le dosage de ces paramètres permet le calcul du cholestérol-LDL (formule de Friedewald) autour duquel s’articulent les recommandations de l’Afssaps (2005) pour la prise en charge d’une dyslipidémie dans le contexte de la prévention cardiovasculaire (cf. chapitre 9). En effet, sur la base des résultats obtenus à partir des innombrables études épidémiologiques et essais thérapeutiques ayant porté sur le sujet, les concentrations sériques de cholestérol-LDL sont encore considérées comme le meilleur facteur prédictif de risque et d’évaluation d’efficacité d’un traitement hypolipidémiant. Il est toutefois raisonnable de penser que d’autres paramètres lipidiques, comme les concentrations de cholestérol-HDL, de triglycérides, ou les rapports cholestérol total/cholestérol-HDL ou ApoB/ApoAI, trouveront leur place, à l’avenir, dans les algorithmes décisionnels. L’EAL est réalisée chez le patient à jeun depuis plus de 12 heures. En cas de valeurs anormales, l’EAL doit être répétée sur un nouveau prélèvement. Chez le patient sans facteur de risque cardiovasculaire, l’EAL est considérée comme normale si les concentrations sériques de cholestérol-LDL sont inférieures à 4,1 mmol/L (1,60 g/L), si les concentrations de triglycérides sont inférieures à 1,7 mmol/L (1,50 g/L) et si les concentrations de cholestérol-HDL sont supérieures à 1,0 mmol/L (0,40 g/L). En l’absence de facteurs de risque concomitants, de modifications des habitudes alimentaires, d’une intervention médicamenteuse, d’un événement cardiovasculaire ou d’une augmentation de poids, il n’est pas justifié de répéter l’EAL plus d’une fois tous les 5 ans. Enfin, la réalisation d’une EAL de dépistage au-delà de l’âge de 80 ans n’est pas justifiée. En présence d’une dyslipidémie, trois niveaux de risque cardiovasculaire ont été proposés : • Risque faible : sujets présentant une dyslipidémie sans autre facteur de risque. • Risque intermédiaire : sujets présentant une dyslipidémie et au moins un facteur de risque concomitant.

4557_2_.book Page 173 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Maladies cardiovasculaires : marqueurs de l’athérosclérose, de la maladie coronarienne et de l’accident vasculaire cérébral

• Haut risque : sujets appartenant à l’une des catégories suivantes : – sujets présentant des antécédents de maladie cardiovasculaire avérée : angor stable ou instable, revascularisation, infarctus du myocarde, infarctus du myocarde silencieux documenté, AVC ischémique, artériopathie périphérique à partir du stade II. – sujets présentant un diabète de type 2 associé à une atteinte rénale ou à au moins deux facteurs de risque cardiovasculaire. – sujets présentant un risque, calculé à partir d’une équation de risque, supérieur à 20 % de faire un événement coronaire dans les 10 ans. Les facteurs de risque participant au calcul du score de risque global sont les suivants : – Homme de plus de 50 ans. – Femme de plus 60 ans. – Antécédents familiaux (parent du 1 er degré) d’infarctus du myocarde ou de mort subite précoces (< 55 ans chez un homme ; < 65 ans chez une femme). – Consommation de tabac actuelle ou arrêtée depuis moins de 3 ans. – Hypertension artérielle permanente ou non traitée. – Diabète de type 2 traité ou non traité. – Cholestérol-HDL inférieur à 1,0 mmol/L (0,40 g/L), quelque soit le sexe. – Une concentration de cholestérol-HDL supérieur à 1,5 mmol/L (0,60 g/L) est un facteur protecteur qui doit être déduit du score de risque. Le score de risque cardiovasculaire conditionne fortement le type de prise en charge et l’objectif thérapeutique constitué par la concentration sérique du cholestérol-LDL. En effet, si les recommandations concernant la prise en charge de l’HTA retiennent un objectif unique de pression artérielle (inférieure à 140/90 mmHg), les objectifs de la prise en charge d’une dyslipidémie sont plus complexes et graduées en fonction du risque global. Concrètement, chaque facteur de risque concomitant réduit de 0,8 mmol/L (0,30 g/l) la valeur cible de cholestérol-LDL. Les valeurs cibles sont les suivantes : – En l’absence de facteur de risque, les concentrations de cholestérol-LDL doivent être inférieures 5,7 mmol/L (2,20 g/L). – En présence d’1 facteur de risque, les concentrations de cholestérol-LDL doivent être inférieures à 4,9 mmol/L (1,90 g/L). – Il est toutefois important de noter que les recommandations de l’Afssaps préconisent que tout sujet présentant un cholestérolLDL supérieur à 4,1 mmol/L (1,60 g/l) ou au moins un facteur de risque cardiovasculaire doit bénéficier d’une prise en charge hygiéno-diététique. – En présence de 2 facteurs de risque, les concentrations de cholestérol-LDL doivent être inférieures à 4,1 mmol/L (1,60 g/L). – En présence de plus de 2 facteurs de risque, les concentrations de cholestérol-LDL doivent être inférieures à 3,4 mmol/L (1,30 g/L). – Enfin, chez le sujet à haut risque cardiovasculaire (cf. définition), les concentrations de cholestérol-LDL doivent être inférieures à 2,6 mmol/L (1,00 g/L). En prévention primaire et si le risque cardiovasculaire est faible ou intermédiaire, la prise en charge thérapeutique d’une dyslipidémie s’appuie en priorité sur des règles hygiéno-diététiques

Syndrome métabolique et risque cardiovasculaire global Outre la cholestérolémie, d’autres anomalies peuvent retenir l’attention du clinicien. Ainsi, si la triglycéridémie n’entre qu’indirectement dans l’appréciation du risque cardiovasculaire global, à travers le calcul du cholestérol-LDL, l’hypertriglycéridémie est-elle toutefois à prendre en charge dès qu’elle dépasse 1,7 mmol/L (1,5 g/L). Jusqu’au seuil de 4,6 mmol/L (4 g/L), il est proposé de favoriser l’approche diététique et la réduction de la consommation d’alcool. Le recours à l’administration de dérivés de l’acide fibrique ne devrait prendre place qu’au-delà de cette valeur. De la même manière, ces dernières années ont vu croître de façon exponentielle la prévalence du syndrome métabolique, défini par une augmentation du tour de taille, une hypertriglycéridémie, une diminution des concentrations de cholestérol-HDL, une élévation de la pression artérielle et l’installation d’une résistance périphérique à l’insuline. Le syndrome métabolique est par constitution une pathologie complexe à l’origine d’un risque cardiovasculaire élevé. À l’heure actuelle, aucune thérapeutique médicamenteuse ne permet de prendre en charge les multiples aspects clinico-biologiques du syndrome métabolique. L’approche thérapeutique consiste donc, par une intervention hygiéno-diététique éventuellement complétée par des traitements pharmacologiques, à prendre en charge individuellement chacune des composantes de ce syndrome.

proposées pour une période minimale de 3 mois. Concernant les aspects diététiques, on rappellera la limitation de la consommation de cholestérol et des acides gras saturés au profit des acides gras mono ou polyinsaturés (en particulier oméga-3), et l’augmentation de la consommation de fibres et de nutriments présents dans les fruits, légumes, et produits céréaliers. L’instauration d’une prise en charge médicamenteuse est envisagée lorsque l’approche hygiéno-diététique est insuffisante pour atteindre la valeur de cholestérol-LDL ciblée. Cette prise en charge médicamenteuse n’exclut pas le maintien des règles hygiénodiététiques. Le choix de la molécule thérapeutique est guidé par l’anomalie lipidique observée (hypercholestérolémie ou hypertriglycéridémie) et la posologie initiale est classiquement la plus faible.

2.2.3. Le diabète de type 2 Biologiquement, le diagnostic de diabète repose sur l’un des critères suivants : (i) une glycémie supérieure à 7,0 mmol/L (1,26 g/ L) après un jeûne de 8 heures, et vérifiée à deux reprises ; (ii) des symptômes de diabète (polyurie, polydipsie, amaigrissement) associée à une glycémie supérieure ou égale à 11,1 mmol/L (2,0 g/ L) ; (iii) une glycémie supérieure à 11,1 mmol/L (2,0 g/L) deux heures après une charge orale de 75 g de glucose (cf. chapitre 12).

173

4557_2_.book Page 174 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Traditionnellement décrit comme le diabète de l’âge mûr, par opposition au diabète de type 1 cliniquement parlant dès l’enfance, le diabète de type 2 ou diabète non-insulinodépendant, apparaît de plus en plus précocement, en association à l’obésité, en raison notamment de l’évolution des comportements alimentaires. Il associe l’hyperglycémie à une insulinorésistance périphérique. Le diabète de type 2 retient toute l’attention, en particulier dans la prévention des maladies cardiovasculaires où il constitue une priorité absolue. La prise en charge, hygiéno-diététique et/ou médicamenteuse, doit donc être systématique. Dans le cadre de la prévention et le traitement des macro-angiopathies du sujet diabétique, les objectifs de cette prise en charge sont les suivants : – La normalisation de la glycémie, attestée par une hémoglobine glyquée inférieure à 6,5 %. – Un contrôle tensionnel strict permettant d’atteindre une PAS inférieure à 130 mmHg et une PAD inférieure à 80 mmHg. – L’arrêt de la consommation de tabac. – L’obtention d’un cholestérol-LDL graduée en fonction du risque cardiovasculaire global (cf. chapitre précédent). – La pratique d’un exercice physique régulier. – Un indice de masse corporelle inférieur à 25 kg/m2. L’HAS prévoit pour février 2012, la publication des recommandations actualisées concernant la prise en charge médicamenteuse du diabète de type 2. Les recommandations en termes de prévention cardiovasculaire évoluent progressivement vers une meilleure cohérence entre les différentes sociétés savantes, notamment dans le choix des critères permettant d’estimer le risque. Par ailleurs, depuis plusieurs années, de nouveaux marqueurs de risque cardiovasculaires sont proposés. Si ces marqueurs ne sont pas actuellement retenus dans les recommandations nationales ou internationales, ils font néanmoins l’objet de nombreux travaux en vue d’une possible validation.

3 ■■ MARQUEURS INNOVANTS DU RISQUE CORONARIEN L’intense activité de recherche, mécanistique et clinique, développée autour de l’athérogenèse conduit à l’émergence de nouveaux marqueurs potentiels du risque coronarien. Le développement d’études épidémiologiques adaptées devrait permettre, à terme, une évaluation rigoureuse de ces marqueurs et leur prise en compte dans des algorithmes décisionnels adaptés aux populations auxquelles ils seront proposés.

3.1.

Protéine C-réactive

La CRP est une protéine de la phase aiguë de la réaction inflammatoire synthétisée par le foie sous l’action des cytokines, en particulier l’IL-1β, l’IL-6 et le TNF-α. Elle est considérée comme un excellent marqueur biologique précoce de l’inflammation systémique. Les études épidémiologiques à la recherche de facteurs indépendants prédictifs du risque cardiovasculaire ont accordé, ces dernières années, un grand intérêt à la CRP et ont conduit à

174

proposer l’augmentation des concentrations sérique de CRP comme marqueur prédictif du risque d’accident vasculaire (Lind, 2003). Deux hypothèses principales sont avancées pour expliquer l’augmentation de la CRP circulante dans la pathogenèse de l’athérosclérose (Francisco et al., 2006). La première hypothèse a trait à l’inflammation pariétale focalisée, stimulée par les LDL oxydées, qui conduit à la production de cytokines pro-inflammatoires. La seconde hypothèse concerne l’élévation chronique des protéines de l’inflammation au cours de diverses pathologies (hyperlipémies, diabètes, tabagisme…) qui participerait au développement de l’athérosclérose. Plusieurs travaux ont montré que la CRP a des effets qui contribuent à la progression de l’athérosclérose et de ses complications. La CRP ne serait donc pas seulement un biomarqueur du processus athéroscléreux, mais serait directement impliquée dans la pathogenèse de l’athérosclérose par le biais de plusieurs mécanismes. Ainsi a-t-il été montré que la CRP active le chimiotactisme des monocytes, favorise l’augmentation de l’expression des molécules d’adhérence VCAM-1 et ICAM-1 par les cellules endothéliales, active le système du complément aggravant les lésions tissulaires, stimule la capture du cholestérol-LDL par les macrophages et possède une activité procoagulante (Francisco et al., 2006). À ce titre, la CRP ne serait pas seulement le témoin de l’état inflammatoire de la paroi artérielle mais aussi un acteur de l’inflammation pariétale, un agent prothrombotique et jouerait un rôle direct dans la rupture de la plaque (Palazzuoli et al., 2006). Une étude de 2006 (Armstrong et al., 2006) a montré qu’une élévation significative de la CRP est observée chez les patients présentant un syndrome coronarien aigu. D’une manière générale, celle-ci est corrélée à l’élévation de la troponine circulante. Chez les patients présentant un infarctus du myocarde, les concentrations de CRP sont associées au risque de rupture de la plaque d’athérome. L’élévation de la CRP à l’admission pour infarctus du myocarde est aussi considérée comme un marqueur prédictif de récidive à long terme. Enfin, la concentration sérique de CRP est également augmentée lors des épisodes d’angor instable. Une méta-analyse récente a regroupé 54 études prospectives portant sur des sujets en situation de risque cardiovasculaire et d’AVC ischémique (Emerging Risk Factors Collaboration, 2010). Cette étude a révélé que le risque relatif de maladie cardiovasculaire, d’AVC et de mortalité est associé de façon linéaire à l’augmentation de la CRP. En outre, cette étude a montré que la mesure isolée de la CRP plutôt qu’en association avec celle des marqueurs conventionnels, semblait préférable et suffisante pour une évaluation prédictive et fiable de ce risque relatif. Par ailleurs, de nombreuses études réalisées ces dernières années ont démontré l’intérêt de la CRP qualifiée d’ultra-sensible (CRPus) comme marqueur du risque cardiovasculaire (Apple et al., 2007 ; Libby et al., 2006 ; Ridker P.M. et al., 2000). L’augmentation des concentrations de CRPus témoigne de la présence à bas bruit d’états inflammatoires chroniques. La CRPus permet d’identifier des sujets porteurs de réactions inflammatoires minimes mais suffisantes pour engendrer un risque pathologique. Dans le cadre de l’exploration du risque coronarien, l’interprétation d’un dosage de CRPus ne doit donc intervenir qu’en dehors de tout autre processus inflammatoire clinique ou biologique. Il est donc

4557_2_.book Page 175 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Maladies cardiovasculaires : marqueurs de l’athérosclérose, de la maladie coronarienne et de l’accident vasculaire cérébral

nécessaire d’associer la CRPus à d’autres marqueurs de l’inflammation, tels que l’orosomucoïde et l’haptoglobine. Dans le cas où un patient asymptomatique ne présente aucune élévation de ces marqueurs, la CRPus peut être interprétée comme marqueur de risque d’accidents cardiovasculaires en tant que marqueur d’instabilité de la plaque.

3.1.1. Dosage de la CRP et de la CRPus Le dosage de la CRP totale comme de la CRPus peut être réalisé par une méthode immunoturbidimétrique utilisant du latex sensibilisé pour un domaine de mesure qui s’échelonne de 0,175 à 10 mg/L et de 0,25 à 10 mg/L (limite de détection de 0,25 mg/ mL) respectivement. La CRPus doit être mesurée à deux reprises, à deux semaines d’intervalle, chez des sujets ayant un métabolisme stable (variabilité interindividuelle) sans syndrome inflammatoire ou infectieux. Différentes études recommandent l’utilisation de la CRPus comme facteur prédictif indépendant du risque cardiovasculaire (Ridker P.M., 2003). Selon les recommandations récentes de l’académie américaine de biochimie clinique (NACB : National Academy of Clinical Biochemistry), il est admis de façon consensuelle que la CRP constitue le marqueur de risque de référence en pratique clinique courante dans les pathologies cardiovasculaires et les AVC (Myers et al., 2009).

Les valeurs seuil de risque cardiovasculaire proposées pour les concentrations sériques de CRPus sont les suivantes (Pearson et al., 2003) : < 1 mg/L : Faible risque 1-3 mg/L : Risque modéré > 3 mg/L : Haut risque > 10 mg/L : Risque très élevé

myocardique et un remodelage ventriculaire anormal après infarctus du myocarde (Nicholls et al., 2005). Tout récemment, une étude prospective menée sur trois ans chez 1895 patients ayant subi une coronarographie sélective pour leur pathologie coronarienne, a révélé que la valeur de la concentration plasmatique de la MPO s’avère utile dans la prédiction à long terme d’événements cardiovasculaires majeurs (accidents vasculaires, accidents coronariens, infarctus du myocarde, infarctus cérébral, accidents hémorragiques, décès) (Tang et al., 2011). Chez ces patients, la concentration plasmatique médiane de MPO, mesurée par une méthode immunologique faisant appel à la chimioluminescence, est de 101 pmol/L (valeurs s’échelonnant de 68 à 187 pmol/L). Il a été montré que les patients qui ont une concentration plasmatique supérieure à 322 pmol/L ont un risque accru de développer des événements cardiovasculaires majeurs. De plus, il a été observé que les patients présentant une augmentation de la concentration circulante en CRPus avaient un risque moindre de développer ces événements cardiovasculaires quand la valeur de MPO est basse comparativement à ceux dont la valeur plasmatique de MPO est élevée.

3.3.

Molécules d’adhérence

L’adhérence des monocytes circulants à l’endothélium vasculaire, critique dans la phase d’initiation de l’athérogenèse, est assurée par un groupe de molécules d’adhérence qui inclut des sélectines, des intégrines, et des membres de la superfamille des immunoglobulines telles que ICAM-1 et VCAM-1. Les formes solubles de ICAM-1 et VCAM-1 (sICAM-1 et sVCAM-1) peuvent être libérées par clivage des formes membranaires, par les cellules endothéliales. Les concentrations plasmatiques de ces molécules d’adhérence sont proposées comme marqueurs du risque coronarien (Armstrong et al., 2006).

3.3.1. sICAM-1

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

3.2.

Myéloperoxydase

La myéloperoxydase (MPO) est une enzyme leucocytaire contenue dans les granulations azurophiles. Elle est présente dans plusieurs types cellulaires tels que les polynucléaires neutrophiles, les monocytes et certaines sous-populations de macrophages tissulaires. Sécrétée par activation leucocytaire, la MPO exerce une action catalytique qui conduit à la formation d’espèces réactives de l’oxygène (ERO). Elle contribue ainsi aux défenses naturelles de l’hôte. La MPO est reconnue en tant que facteur participant à la promotion et à la progression de l’athérosclérose ainsi qu’à la vulnérabilité de la plaque. En effet, la MPO est fortement impliquée dans la génération du stress oxydant. Celui-ci résulte soit de la surproduction d’ERO soit du dysfonctionnement des systèmes de défense antioxydante. En augmentant la production d’ERO, la MPO amplifie la peroxydation lipidique et les modifications posttraductionnelles des protéines, ce qui altère le fonctionnement normal de la cellule. Le stress oxydant est impliqué dans le stade d’initiation de l’athérosclérose en générant un dysfonctionnement endothélial et favorise également la progression des lésions athéromateuses. De plus, la MPO favorise le dysfonctionnement

ICAM-1 est une immunoglobuline transmembranaire exprimée en particulier par les cellules endothéliales, les leucocytes, les fibroblastes, les cellules musculaires lisses, les cardiomyocytes. Sa synthèse est augmentée lors des syndromes inflammatoires, ce qui favorise le recrutement local des leucocytes. À partir de la forme membranaire, la forme soluble d’ICAM-1 est libérée dans la circulation sous l’action de l’élastase leucocytaire et de métalloprotéases matricielles. Une élévation de la concentration de sICAM-1 est ainsi observée dans les dix heures qui suivent un accident coronarien aigu et peut persister pendant plusieurs mois (Armstrong et al., 2006). Bien que ce marqueur soit considéré comme un marqueur prédictif puissant de la survenue de maladie cardiovasculaire, certaines études ont suggéré que ce marqueur ne pouvait être utilisé, actuellement, de façon indépendante pour graduer le risque d’accident coronarien aigu.

3.3.2. sVCAM-1 VCAM-1 est une immunoglobuline transmembranaire exprimée par les cellules endothéliales activées et les cellules musculaires lisses. VCAM-1 se lie à une intégrine exprimée à la surface des

175

4557_2_.book Page 176 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

monocytes, ce qui favorise l’adhérence cellule-monocyte. Comme ICAM-1, VCAM-1 peut être libérée sous forme soluble. Les patients qui présentent un syndrome coronarien aigu ont des concentrations élevées de sVCAM-1 comparativement aux sujets sains ou aux patients présentant un angor stable. Des études préliminaires suggèrent que sVCAM-1 pourrait être un marqueur pertinent pour évaluer un risque de récidive à moyen ou à long terme chez les patients qui souffrent d’accidents coronariens. Cependant ce marqueur reste encore en évaluation.

3.4.

Interleukine-6

D’expression ubiquitaire, l’interleukine-6 est une cytokine proinflammatoire qui conditionne l’activation des leucocytes et des cellules endothéliales. Elle est exprimée dans les plaques d’athérome et contribue à l’instabilité de la plaque par sa capacité à stimuler des activités de type métalloprotéases, MCP-1 et TNF. L’IL-6 est fortement augmentée dans les 48 heures qui suivent l’hospitalisation des patients présentant un accident coronarien aigu. L’élévation de l’IL-6 (> 5 ng/L) semble être associée à la gravité et au risque de récidive d’un événement cardiovasculaire, et ceci de façon additive et indépendante des concentrations de troponine T. L’augmentation de la concentration d’IL-6 est un facteur pronostique péjoratif et permet d’identifier des patients à risque cardiovasculaire élevé, qui devraient donc bénéficier de stratégies de prévention agressives (Armstrong et al., 2006). Néanmoins, des travaux récents ont montré que la grande variabilité interindividuelle de ce paramètre limite la valeur potentielle des concentrations circulantes d’IL-6 en tant que marqueur prédictif de maladie coronarienne ainsi que dans l’évaluation du risque d’AVC ischémique (Patterson et al., 2010). L’IL-6 est mesurée dans le plasma par une technique ELISA (R&D systems). Les valeurs de référence sont comprises entre 2,20 et 7,20 nmol/L.

3.5.

Métalloprotéases

Les métalloprotéases matricielles sont des endoprotéases zincdépendantes exprimant une activité collagénase et/ou gélatinase. De façon générale, les MMPs sont impliquées dans les modifications et le remaniement de la matrice extracellulaire (Lelongt et al., 2002). À ce titre, elles jouent un rôle important dans de nombreux processus physiologiques comme le développement embryonnaire, la réparation tissulaire ou l’angiogenèse, mais sont aussi impliquées dans diverses pathologies comme l’athérogenèse et la survenue précoce d’accidents coronariens aigus (Apple et al., 2007 ; Armstrong et al., 2006 ; Palazzuoli et al., 2006). En effet, la dégradation des fibres de collagène par les MMPs compromet la stabilité de la plaque d’athérome et l’intégrité de la membrane basale endothéliale, ce qui prédispose les plaques d’athérome avancées à la rupture.

3.5.1. MMP-1, MMP-2 et MMP-9 La MMP-1 est une collagénase exprimée dans l’insterstitium. La MMP-2 est une gélatinase capable de dégrader le collagène de type IV, qui est la forme de collagène majoritaire dans la mem-

176

brane basale sous-endothéliale. La MMP-9 est une gélatinase largement impliquée dans le remodelage ventriculaire et le développement de l’insuffisance cardiaque. Ces MMPs sont fortement exprimées dans les plaques d’athérosclérose. Il a été montré que les patients présentant un syndrome coronarien aigu ont des concentrations plasmatiques élevées de ces métalloprotéases. Néanmoins, la lente élévation des MMPs au cours de la période post-infarctus et le manque de données sur le devenir clinique de ces patients ne permet pas d’affirmer actuellement l’intérêt des MMPs comme marqueurs pertinents pour une décision thérapeutique ou pour une évaluation du risque (gradation du risque) d’accident coronarien aigu. L’activité MMP est mesurée dans le plasma par des techniques ELISA, commercialisées sous forme de trousses prêtes à l’emploi.

3.5.2. MMP-7 La MMP-7 est produite dans les régions vulnérables de la plaque d’athérome. Par sa distribution distincte de celle de la MMP-9 au sein des lésions et par une spécificité de substrat différente, la MMP-7 jouerait un rôle propre dans la déstabilisation et la rupture de la plaque. Une étude récente a montré que la concentration plasmatique circulante de MMP-7 était augmenté chez les patients avec angor stable ou instable (Nilsson et al., 2006). La MMP-7 est mesurée par une technique ELISA commercialisée par R&D systems. Les valeurs moyennes, chez le sujet sain, sont de 3,2 ± 1,5 μg/L. De façon consensuelle, les MMPs sont exprimées et actives dans les lésions avancées notamment par une implication biologique importante dans la destabilisation de la plaque d’athérome et dans sa rupture. Cependant, des études dans des modèles expérimentaux et des études cliniques complémentaires sont nécessaires pour déterminer leur valeur clinique en tant que biomarqueurs de maladies cardiovasculaires et pour justifier l’intérêt de l’ensemble de ces métalloprotéases matricielles en tant que marqueurs indépendants des maladies cardiovasculaires.

3.5.3. PAPP-A La protéine plasmatique associée à la grossesse, appelée PAPP-A (« Pregnancy-Associated Plasma Protein-A »), a été décrite initialement comme un peptide de concentration spécifiquement augmentée au cours de la grossesse. Elle est ainsi souvent utilisée comme un outil de surveillance du premier trimestre de grossesse pour le dépistage d’anomalies chromosomiques. Sur le plan biochimique, il s’agit d’une métalloprotéase liant le zinc, qui active indirectement le facteur de croissance IGF (Insulin-like Growth Factor), considéré comme un puissant agent mitogène et chimiotactique pour les cellules musculaires lisses et favorisant la croissance de la plaque d’athérome. La PAPP-A favoriserait ainsi indirectement l’athérosclérose en augmentant l’activité de IGF. La PAPP-A est exprimée dans les plaques d’athérome. Une étude a montré que cette protéine n’est pas associée à une augmentation de troponine I ou de créatine kinase MB chez ces patients, ce qui suggère que la PAPP-A pourrait être d’un intérêt diagnostique pour identifier les patients avec syndrome coronarien aigu mais sans nécrose myocardique détectable (Mueller et al., 2006). D’après ces travaux, on peut considérer

4557_2_.book Page 177 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Maladies cardiovasculaires : marqueurs de l’athérosclérose, de la maladie coronarienne et de l’accident vasculaire cérébral

que la PAPP-A circulante pourrait être davantage associée à l’athérosclérose systémique chez les patients âgés. D’autres études suggèrent que la PAPP-A puisse définir un risque cardiovasculaire chez des patients avec angor instable mais sans élévation de la troponine. Le dosage de la PAPP-A sérique fait appel à une technique ELISA commercialisée par Dade Behring. La limite de détection est de 0,06 mU/L. Les valeurs de référence sont comprises entre 0,40 et 1,04 mU/L.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

3.6.

Endothélines

Les endothélines, nommées ET-1, ET-2, et ET-3, sont trois peptides de 21 acides aminés qui ont été découverts au travers de leur puissant effet vasoconstricteur (Pinet, 2004). Les endothélines sont présentes dans de nombreux tissus comme le rein, le cerveau, les poumons ou les tissus endocrines périphériques. Le rôle biologique principal des endothélines est la régulation du tonus vasculaire, mais elles assurent également des fonctions dans la réparation tissulaire et la restauration de la fonction cardiaque après la survenue d’un infarctus du myocarde. Ces peptides interagissent selon un mode autocrine/paracrine par l’intermédiaire de récepteurs spécifiques localisés sur de nombreuses cellules, notamment les cellules musculaires lisses, les myocytes et les fibroblastes. Les précurseurs des endothélines ET-1, ET-2 et ET-3 sont clivés en peptide actif par l’enzyme de conversion de l’endothéline. L’ET-1 est produite par les cellules endothéliales, épithéliales, les macrophages, les fibroblastes, les myocytes cardiaques, les neurones. In vivo, les cellules endothéliales sont la source majeure d’ET-1. L’ET-2 est exprimée par les cellules épithéliales de l’intestin et l’ET-3 par les neurones, les cellules épithéliales tubulaires du rein et les cellules de l’intestin. Chez les mammifères, le système endothéline est essentiel pour le développement embryonnaire et néonatal ; il joue un rôle dans l’homéostasie rénale, le maintien du tonus vasculaire, la réparation du tissu cardiaque, l’angiogenèse et la régulation de la respiration. Le système endothéline est impliqué de manière délétère dans l’athérosclérose, le remodelage cardiaque et l’hypertension pulmonaire. Ainsi, dans l’athérosclérose, l’ET-1 active-t-elle le récepteur ET-A présent sur les macrophages, les cellules musculaires lisses et les fibroblastes. La synthèse d’ET-1 est stimulée par les LDL oxydées dans les cellules endothéliales, les macrophages et les cellules musculaires lisses d’artères coronariens (Pinet, 2004). Une coexpression d’ET-1 et de l’enzyme de conversion de l’endothéline-1 (ECE-1), corrélée à l’évolution des plaques d’athérosclérose, a été observée dans les artères humaines (Ihling et al., 2001). Une étude clinique a montré une augmentation de la concentration de l’ET-1 dans la circulation coronarienne et systémique chez des patients présentant une dysfonction endothéliale coronarienne. Ces observations ont défini l’endothéline comme un marqueur précoce d’athérosclérose (Lerman et al., 1995). L’endothéline-1 plasmatique est dosée par une technique immuno-enzymatique (commercialisé par Biomedica). La valeur moyenne d’ET-1 plasmatique est de 0,34 fmol/mL et la limite de détection est de 0,05 fmol/mL.

3.7.

Adiponectine

Il est bien établi que le tissu adipeux sécrète des adipocytokines impliquées dans l’inflammation systémique et le métabolisme glucidique et lipidique. L’adiponectine, adipocytokine la plus abondante, est présente dans le plasma humain à des concentrations élevées. Elle est notamment diminuée dans l’obésité, le diabète de type 2 et les maladies coronariennes. Dans ce contexte, l’hypo-adiponectinémie a été associée à de faibles concentrations de cholestérol-HDL, à la présence des LDL petites et denses, et à une augmentation des marqueurs d’inflammation systémique. Une étude (von Eynatten et al., 2006) réalisée chez des patients présentant une maladie coronarienne a montré que l’adiponectine est associée à la présence d’une dyslipémie athéromateuse et pourrait jouer un rôle anti-athérogène en modulant les concentrations de cholestérol-HDL. La concentration plasmatique en adiponectine sérique est mesurée par une technique ELISA (Bio Vendor) et les valeurs de référence sont comprises entre 4,70 à 10,5 mg/l.

3.8.

Phospholipase A2

La phospholipase A2 (Lp-PLA2) est définie comme une lipase indépendante du calcium. La Lp-PLA2 est présente à 80 % dans les LDL, en particulier les LDL petites et denses réputées très athérogènes, et à 20 % dans les HDL. Cette enzyme monomérique catalyse l’hydrolyse des phospholipides oxydés en produits bioactifs qui peuvent potentialiser le processus inflammatoire impliqué dans l’athérogenèse. Dans ce contexte, la Lp-PLA2 hydrolyse les phospholipides oxydés des LDL, ce qui libère des acides gras oxydés et des lysophospholipides, notamment la lysophosphatidylcholine. Ce produit induit l’expression des molécules d’adhérence, participe à l’activation des lymphocytes T et promeut la prolifération des cellules musculaires lisses. Produite par le macrophage, son expression est fortement augmentée dans les lésions d’athérosclérose. Elle est considérée comme un marqueur prédictif de maladie cardiovasculaire. Elle a tout d’abord été identifiée en tant que facteur pro-athérogène. Une forte expression de Lp-PLA2 est détectée dans le centre nécrotique et les macrophages apoptotiques qui entourent les plaques vulnérables ou rompues (Kolodgie et al., 2006). Dès lors, la LpPLA2 peut constituer une cible anti-athérogène potentielle (voir chapitre « Marqueurs d’oxydation »). Parallèlement, des travaux ont uggéré des activités anti-inflammatoires pour cette lipase. Si les fonctions physiopathologiques de la phospholipase A2 restent donc controversées, l’activité de la Lp-PLA2 n’en reste pas moins un marqueur de risque de maladie coronarienne et d’ischémie cérébrale, indépendant du cholestérol et des marqueurs de l’inflammation. La mesure de l’activité, dépendante de la nature du substrat, n’est cependant pas standardisée actuellement et manque de spécificité en raison de l’interférence liée à la présence d’autres phospholipases plasmatiques. Le dosage de la Lp-PLA2 est basé sur la détermination des concentrations plasmatiques par méthode immunologique (Kit ELISA « PLAC assay », diaDexus).

177

4557_2_.book Page 178 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

4 ■■ RATIONNEL POUR L’ÉVALUATION DES MARQUEURS NON LIPIDIQUES L’athérosclérose est reconnue en tant que maladie inflammatoire chronique. Les facteurs de risque traditionnels incluant l’hypercholestérolémie (notamment les LDL oxydées) participent à l’initiation et à la progression du processus inflammatoire. En l’état actuel, les recommandations en matière de prévention ne préconisent pas le recours à la mesure des marqueurs inflammatoires en routine. De fait, l’étude INTERHEART (tableau 2) suggère que 90 % des cas d’infarctus aigu du myocarde peuvent être prédits par les facteurs de risques traditionnels. Cependant, de nombreux patients victimes d’accidents vasculaires ne présentent pas de modifications sévères des paramètres lipidiques et sont placés à un risque intermédiaire sur la base des facteurs de risque actuellement sélectionnés dans les algorithmes décisionnels. Par conséquent, il apparaît opportun de développer de nouvelles stratégies utilisant des biomarqueurs non lipidiques pour prédire et évaluer le risque cardiovasculaire de façon plus affinée. L’implication de nombreuses molécules de l’inflammation dans le processus athérogène et les résultats obtenus dans les études déjà disponibles justifient la combinaison de marqueurs inflammatoires en combinaison aux marqueurs classiques. Les candidats marqueurs restent pour autant assez nombreux et le problème du choix d’un nombre restreint de marqueurs pertinents reste posé. Les données actuelles supportent l’utilisation de la CRPus comme le biomarqueur à privilégier, sur la base d’une excellente caractérisation par de larges évaluations cliniques et expérimentales, et par des aspects techniques en adéquation avec une mesure accessible (stabilité de l’analyte, fiabilité, précision et disponibilité du test, disponibilité de standard fiable de calibration). En l’absence de processus inflammatoire

global, une inflammation vasculaire ou myocardique local et modérée peut survenir. La mesure de la CRPus prend alors tout son intérêt puisque des élévations de 3 à 10 mg/L de CRP ont été associées à un risque primaire de maladies cardiovasculaires. Néanmoins, l’interprétation se complique par le fait que l’infarctus du myocarde provoque lui-même une augmentation de la CRP au-delà de 10 mg/L. Toutefois, la CRP peut trouver une autre utilité dans une approche de combinaison des marqueurs inflammatoires destinée à établir une gradation (ou stratification) plus précise du risque cardiovasculaire. Les données cliniques actuelles ont révélé de nombreux marqueurs potentiellement utiles en complément de la CRP. Ces marqueurs, notamment les cytokines, les molécules d’adhérence et la Lp-PLA2 semblent des marqueurs prometteurs qui méritent des investigations plus approfondies. La combinaison de marqueurs d’inflammation ne peut être envisagée que sur la base de critères rigoureux parmi lesquels on peut citer : (1) un argumentaire documenté concernant le lien possible entre le marqueur et la physiopathologie des maladies cardiovasculaires ; (2) la stabilité du marqueur et la disponibilité du test (fiabilité, précision et accessibilité technique, disponibilité de standards fiables de calibrage) ; (3) la plus grande spécificité du marqueur pour l’athérosclérose ; (4) le minimum d’altération de la valeur prédictive par des agents thérapeutiques (anti-inflammatoires et autres drogues) administrés au moment de la mesure. Un tel test serait aussi bien utilisable en pratique clinique, pour la prédiction du risque, qu’en essais cliniques destinés à évaluer l’efficacité de drogues anti-athérogènes.

5 ■■ MARQUEURS DE L’ACCIDENT VASCULAIRE CEREBRAL

5.1. Tableau 2 ■ Principaux résultats de l’étude INTERHEART (Yusuf et al. 2004). Fraction de risque attribuable. Moyenne (intervalle de confiance à 95 %). Facteur de risque

Fraction de risque attribuable (%)

ApoB/ApoA1

49,2 (43,8 – 54,5)

Consommation de tabac

35,7 (32,5 – 39,1)

Diabète

9,9 (8,5 – 11,5)

Hypertension artérielle

17,9 (15,7 – 20,4)

Obésité abdominale

20,1 (15,3 – 26,0)

Facteurs psychosociaux

32,5 (25,1 – 40,8)

Consommation quotidienne de fruits et légumes

13,7 (9,9 – 18,6)

Activité physique

12,2 (5,5 – 25,1)

Consommation d’alcool régulière

6,7 (2,0 – 20,2)

Risque global

178

90,4 (88,1 – 92,4)

Marqueurs diagnostiques de l’accident vasculaire cérébral

Les AVC représentent, dans les pays industrialisés, la première cause de morbidité et la troisième cause de mortalité (130 000 cas par an en France). L’âge est le facteur de risque le plus important des accidents vasculaires cérébraux. Après 55 ans, le risque d’AVC est multiplié par deux après chaque décennie. Par ailleurs, le contrôle de l’hypertension artérielle réduit l’incidence des AVC à tous les âges. L’hypertension artérielle est, de fait, le facteur de risque principal d’AVC : le risque d’AVC est multiplié par quatre chez le sujet hypertendu lorsque l’hypertension est définie par des chiffres de pression artérielle systolique et/ou diastolique supérieurs à 160/95 mmHg. Le diabète est également un facteur de risque indépendant d’AVC : l’angiopathie diabétique joue un rôle dans la physiopathologie des AVC. Enfin, on relève dans la littérature un certain nombre de facteurs de risque modifiables telles que les dyslipémies ou la consommation de tabac, qui apportent une contribution substantielle au risque global (Qizilbash et al., 1992). Le diagnostic d’AVC est en général facilement évoqué cliniquement devant l’installation soudaine d’un déficit neurologique focal, accompagné ou non d’un trouble de la conscience. L’AVC peut être d’origine ischémique ou hémorragique. Avec l’appari-

4557_2_13_C10.fm Page 179 Vendredi, 19. août 2011 5:00 17

> STDI FrameMaker Couleur

Maladies cardiovasculaires : marqueurs de l’athérosclérose, de la maladie coronarienne et de l’accident vasculaire cérébral

tion de nouvelles techniques d’imagerie médicale, il est à présent possible d’analyser rapidement la nature d’un AVC et de mettre en place la conduite thérapeutique la plus adaptée. La place de l’imagerie est capitale puisqu’elle permet d’établir le diagnostic avec certitude et d’apprécier la gravité de l’accident. Par ailleurs, différents marqueurs biologiques ont été proposés. Ils pourraient contribuer à une meilleure évaluation du risque, notamment de récidive, après un accident vasculaire cérébral (Campbell et al., 2006 ; Sotgiu et al., 2006). Cependant, la caractérisation d’un marqueur circulant fiable s’avère difficile en raison d’une faible libération de protéines gliales et neuronales à travers la barrière hématoencéphalique après AVC ou lésion traumatique. Les marqueurs idéaux devraient posséder des caractéristiques qui incluent sensibilité, spécificité et différenciation entre AVC ischémique et hémorragique.

5.1.1. Marqueurs combinés

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Un premier test biologique rapide pour l’aide au diagnostic de l’AVC a été proposé mais reste encore, à ce jour, encore confidentiel. Ce test, dénommé Triage ® Stroke Panel™, combine la mesure de quatre marqueurs dont aucun à lui seul ne permettrait de diagnostiquer un AVC mais qui, lorsqu’ils sont associés, permettent d’estimer la probabilité qu’il s’agisse d’un AVC. Ces marqueurs sont le BNP, les D-dimères, la MMP-9 et la S100B. Le BNP (peptide natriurétique de type B), bien qu’étant en première intention un marqueur cardiaque, est fréquemment élevé dans les problèmes neurovasculaires associés à une modification de la pression cardiaque. Les concentrations plasmatiques des Ddimères, produits de dégradation de la fibrine, sont élevées aussi bien dans les formes d’AVC ischémiques que dans les formes hémorragiques. La MMP-9, métalloprotéase matricielle, est associée à l’inflammation et il a été montré qu’elle augmente dans les premières heures qui suivent le début d’un AVC. La S100B est une protéine présente en haute concentration dans les cellules gliales, qui est libérée à haute concentration après un AVC, la concentration étant associée à la taille de l’AVC. Pour l’interprétation des quatre mesures combinées, la firme a élaboré un score allant de 0 à 10 : si le résultat est inférieur à 1,3, la probabilité qu’il s’agisse d’un AVC est faible ; si il est supérieur à 5,9, la probabilité est très élevée. Néanmoins, ce test n’est pas validé actuellement par manque de résultats analytiques convaincants. À ce jour, une confirmation par imagerie reste nécessaire au diagnostic et à la détermination de l’origine ischémique ou hémorragique de l’AVC.

5.1.2. Diméthylarginine asymétrique Les méthylarginines sont synthétisées par méthylation post-traductionnelle de la L-arginine et sont libérées sous forme libre après protéolyse. La diméthylarginine asymétrique (« ADMA ; Asymetric DiMethylArginin ») et la diméthylarginine symétrique (« SDMA ; Symetric DiMethylArginin ») sont détectables dans le sang, l’urine et le LCR. L’ADMA est un inhibiteur puissant de la NO synthase ce qui favorise une dysfonction endothéliale globale. À ce titre, l’augmentation plasmatique de l’ADMA peut être considérée comme marqueur prédictif de risque d’AVC associé à des facteurs du syndrome métabolique (Meinitzer et al., 2011 ; Saenger et al., 2010).

L’ADMA peut être quantifiée par CLHP-SM/SM (chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse) qui permet de distinguer l’ADMA des autres isomères structuraux. La concentration circulante moyenne chez les sujets sains est de 0,98 μmol/L (Yoo et al., 2001). Une étude de population réalisée à Gothenburg chez 880 femmes a révélé que de petites augmentations (0,15 μmol/L) pendant une période de 24 ans était associée à une augmentation de 30 % d’AVC et d’infarctus du myocarde. Globalement, l’ADMA apparaît comme un nouveau marqueur lié à la mortalité cardiovasculaire en général, à la dysfonction endothéliale et au risque d’AVC. Cependant, son utilisation en pratique clinique (routine) nécessite une validation par des études complémentaires.

5.1.3. PARK7 PARK7, ou DJ-1, est une protéine initialement découverte comme oncogène également associée à la maladie de Parkinson (Bonifati et al., 2003). Elle jouerait un rôle réparateur dans le stress oxydant neurologique. Elle est mesurée par une technique ELISA. Une augmentation significative de sa concentration plasmatique est observée au cours des AVC dans les 30 minutes à trois heures après l’apparition des symptômes.

5.2.

Marqueurs innovants du risque d’AVC d’origine ischémique

Certains marqueurs sériques de type inflammatoire ont également été évalués dans les suites d’AVC d’origine ischémique. Les cellules gliales sont les premières cellules qui répondent à l’ischémie cérébrale par la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires comme le TNF-α, l’IL-1 et l’IL-6. Ces cytokines peuvent contribuer à la fois à la neurotoxicité et à la neuroprotection, soit localement, soit en passant dans la circulation à partir du tissu lésé. Une étude récente (Sotgiu et al., 2006) a montré que les concentrations circulantes de TNF-α, d’ICAM-1, de MMP-2 et de MMP-9 sont corrélées positivement avec la gravité et l’étendue de la lésion. En revanche, les concentrations d’IL-6 circulantes présentent une corrélation inverse avec l’atteinte neurologique et la taille de la lésion, ce qui suggère que l’IL-6, dans le contexte inflammatoire de l’AVC d’origine ischémique, participe à la neuroprotection plutôt qu’à la neurotoxicité. Enfin, les concentrations de molécules d’adhérence intercellulaire (ICAM-1) et de molécules d’adhérence des cellules vasculaires (VCAM-1) ont été associées à la taille de l’infarctus cérébral.

5.2.1. MMP-9 La surexpression de MMP-9 au niveau cérébral en réponse à un traumatisme cérébral révèle une fonction probable dans l’AVC via sa fonction de dégradation de protéines de la matrice extracellulaire nécessaires à l’homéostasie. Une augmentation des concentrations plasmatiques de MMP-9 est observée dans l’AVC ischémique et dans l’AVC hémorragique dès l’admission des patients hospitalisés en service d’urgence. Cela suggère une période relativement brève (quelques heures) entre la libération et l’accessibilité de la détection (Alvarez-Sabín et al., 2004 ; Montaner et al., 2001). De plus, l’élévation des concentrations circulantes en

179

4557_2_.book Page 180 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

MMP-9 est associée à la taille de l’infarctus cérébral, à la mauvaise évolution neurologique et aux complications hémorragiques. En outre, une augmentation aiguë de MMP-9 circulante est considérée comme un marqueur prédictif des complications hémorragiques secondaires au traitement par l’activateur tissulaire du plasminogène recombinant (rtPA ; recombinant tissue Plasminogen Activator). Ces données sont en faveur de l’utilisation future de la MMP-9 en tant que marqueur d’AVC.

5.3.

Marqueurs innovants du risque d’AVC d’origine hémorragique

5.3.1. S100B et NSE La famille S100 constitue un sous-groupe de protéines liant le calcium et impliquées notamment dans le cycle cellulaire et la différenciation cellulaire. Différents sous-types existent dans différents organes. La protéine S100B a d’abord été caractérisée dans les cellules gliales mais elle est également rencontrée dans d’autres types cellulaires tels que les mélanocytes, les adipocytes ou les cellules de la moelle osseuse. La durée de demi-vie plasmatique de la protéine S100B est de 30 à 60 minutes. Le terme S100 regroupe un ensemble de protéines dimériques comportant deux sous-unités de 10 kDa appelées α et β. Trois isoformes sont connues (α α), (α β), (β β). L’isoforme S100a (α β), exprimée dans les cellules gliales et les mélanocytes, S100b (β β), est présente à concentration élevée dans les cellules gliales et les cellules de Schwann du système nerveux central et périphérique comme dans les cellules de Langherans et les cellules de la glande pituitaire. S100a représente 5 % de la protéine S100 du cerveau, elle est majoritairement retrouvée dans d’autres tissus tels que le tissu cardiaque et le tissu rénal. L’énolase spécifique des neurones (NSE : Neuronal Specific Enolase) est un isoenzyme d’énolase intervenant dans la voie de la glycolyse. Elle est présente majoritairement dans les neurones et les cellules neuroendocrines. La demie-vie de la NSE sérique est de 48 heures (Oertel et al., 2006). La méthode de dosage de S100B (protéine S100 contenant au moins une sous-unité β) et de la NSE consiste en un radio-immunodosage à l’aide de kits commerciaux (DiaSorin, Allemagne) à partir du sang veineux. La valeur normale est inférieure à 0,12 μg/ L pour la S100 B et 12,5 ng/mL pour la protéine NSE (cf. chapitre 30)). Une étude clinique indique que des concentrations élevées de S100B ont été relevées chez des patients présentant une hémorragie sous-arachnoïdienne en l’absence de vasospasme (Oertel et al., 2006). La mesure de la S100B dans les trois jours qui suivent l’accident hémorragique apparaît utile pour prédire le vasospasme et l’évolution clinique. La mesure de la concentration sanguine de la protéine S100 de façon régulière dans les dix jours qui suivent l’ischémie cérébrale aide à prédire le volume de l’infarctus

180

et le devenir neurologique à long terme de façon plus précise que la mesure de la NSE circulante (Missler et al., 1997). La protéine S100B circulante constitue un marqueur utile pour définir la taille de l’infarctus cérébral. Néanmoins, comme cette protéine n’est pas spécifique de l’infarctus cérébral mais reflète, en réalité, tout dommage cellulaire dans le système nerveux, une élévation de la concentration sanguine de cette protéine ne constitue pas un élément de diagnostic de l’accident vasculaire cérébral aigu. Sa mesure pourrait être réservée à l’évaluation des lésions et traumatismes cérébraux (Saenger et al., 2010).

5.3.2. GFAP La protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) est une protéine monomérique spécifique des astrocytes cérébraux. Bien que sa fonction soit mal connue, elle est impliquée dans de nombreux processus neuronocellulaires, en particulier au sein de la barrière hématoencéphalique. Elle est mesurée dans le plasma par une méthode immunologique. Son élévation plasmatique permet de différencier un AVC par hémorragie intracérébrale d’un AVC ischémique (111,6 ng/L vs 0,4 ng/L) (Foerch et al., 2006). La GFAP peut être considérée comme un marqueur prometteur et spécifique de l’AVC hémorragique.

CONCLUSION ET PERSPECTIVES La mise à disposition du clinicien de procédures simples et intégrées d’évaluation du risque cardiovasculaire et les progrès réalisés dans la prise en charge des épisodes aigus de thrombose artérielle ont permis des gains très significatifs en termes de morbi-mortalité, en particulier dans les pays occidentaux. Toutefois, avec le souci d’améliorer la personnalisation des stratégies de prévention, l’effort doit être maintenu, notamment par l’introduction de paramètres innovants, directement issus d’une recherche fondamentale soulignant la composante inflammatoire et cellulaire de l’athérosclérose. Les outils actuellement disponibles permettent essentiellement de prévenir la phase chronique de la maladie. En dehors de l’information apportée par l’imagerie médicale, des avancées sont sans doute nécessaires pour permettre une meilleure évaluation du risque et une meilleure prévention de la survenue d’un épisode de thrombose artérielle, phase aiguë de la maladie directement à l’origine de l’essentiel de la morbi-mortalité cardiovasculaire. Enfin, les données fournies par l’épidémiologie descriptive soulignent la forte augmentation de l’incidence des maladies cardiovasculaires dans les pays à économie émergente, en pleine transition épidémiologique. Dans ce contexte, il devient impératif, voire urgent de procéder, par des études ad hoc, à une adaptation des stratégies d’évaluation et de prise en charge du risque cardiovasculaire dans ces populations.

4557_2_.book Page 181 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Maladies cardiovasculaires : marqueurs de l’athérosclérose, de la maladie coronarienne et de l’accident vasculaire cérébral

Références bibliographiques Afssaps (2005). Prise en charge thérapeutique du patient dyslipidémique. Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé. Saint-Denis, Afssaps : http ://afssaps.sante.fr

HAS (2006). Prise en charge des patients adultes atteints d’hypertension artérielle essentielle. Haute Autorité de Santé. Paris, HAS : http ://www.anaes.fr

Afsapps (2006). Traitement médicamenteux du diabète de type 2 – Actualisation. Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé. Saint-Denis, Afssaps.

Ihling C, Szombathy T, Bohrmann B, Brockhaus M, Schaefer HE, and Loeffler BM (2001). Coexpression of endothelin-converting enzyme-1 and endothelin-1 in different stages of human atherosclerosis. Circulation, 104 : 864-869.

Alvarez-Sabín J et al. (2004). Temporal profile of matrix metalloproteinases and their inhibitors after spontaneous intracerebral hemorrhage : relationship to clinical and radiological outcome. Stroke, 35 : 1316-1322. ANAES (1999). Traitement médicamenteux du diabète de type 2. Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé. Saint-Denis, Afssaps.

Lelongt B, Ronco P, and Piedagnel R (2002). Métalloprotéases matricielles : infidélités à la matrice extracellulaire. Medecine/Sciences, 18 : 519-521.

ANAES (2000a). Prise en charge des patients adultes atteints d’hypertension essentielle. Agence Nationale d’Accréditation et d’Évaluation en Santé. Paris, Anaes.

Lerman A, Holmes DR, Jr, Bell MR, Garratt KN, Nishimura RA, and Burnett JC, Jr (1995). Endothelin in coronary endothelial dysfunction and early atherosclerosis in humans. Circulation, 92 : 24262431.

ANAES (2000b). Stratégie de prise en charge du patient diabétique de type 2 à l’exclusion de la prise en charge des complications. Agence Nationale d’Accréditation et d’Évaluation en Santé. Paris, Anaes. Apple FS, Pearce LA, Chung A, Ler R, and Murakami MM (2007). Multiple biomarker use for detection of adverse events in patients presenting with symptoms suggestive of acute coronary syndrome. Clin Chem, 53 : 874-881. Armstrong EJ, Morrow DA, and Sabatine MS (2006). Inflammatory biomarkers in acute coronary syndromes : part II : acute-phase reactants and biomarkers of endothelial cell activation. Circulation, 113 : e152-155. Bonifati V et al. (2003). Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism. Science, 299 : 256-259. Bonnet J (2005). L’athérosclérose. Cardiologie, 11-605-A10 : 1-15. Campbell DJ et al. (2006). Soluble vascular cell adhesion molecule 1 and N-terminal pro-B-type natriuretic peptide in predicting ischemic stroke in patients with cerebrovascular disease. Arch Neurol, 63 : 60-65. Davies MJ (1996). Stability and instability : two faces of coronary atherosclerosis. The Paul Dudley White Lecture 1995. Circulation, 94 : 2013-2020.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Kolodgie FD et al. (2006). Lipoprotein-associated phospholipase A2 protein expression in the natural progression of human coronary atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 26 : 2523-2529.

Emerging Risk Factors Collaboration et al. (2010). C-reactive protein concentration and risk of coronary heart disease, stroke, and mortality : an individual participant meta-analysis. Lancet, 375 : 132-140. Foerch C et al. (2006). Serum glial fibrillary acidic protein as a biomarker for intracerebral haemorrhage in patients with acute stroke. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 77 : 181-184. Francisco G, Hernandez C, and Simo R (2006). Serum markers of vascular inflammation in dyslipemia. Clin Chim Acta, 369 : 1-16. Gervois P, Fruchart JC, and Staels B (2007). Drug Insight : mechanisms of action and therapeutic applications for agonists of peroxisome proliferator-activated receptors. Nat Clin Pract Endocrinol Metab, 3 : 145-156. Gervois P et al. (2004). Global suppression of IL-6-induced acute phase response gene expression after chronic in vivo treatment with the peroxisome proliferator-activated receptor-alpha activator fenofibrate. J Biol Chem, 279 : 16154-16160.

Libby P (2002). Inflammation in atherosclerosis. Nature, 420 : 868874. Libby P, and Ridker PM (2006). Inflammation and Atherothrombosis : From Population Biology and Bench Research to Clinical Practice. Journal of American Colloque of Cardiology, Suppl 1 : Pages A33A46. Lind L (2003). Circulating markers of inflammation and atherosclerosis. Atherosclerosis, 169 : 203-214. Mansouri RM, Bauge E, Staels B, and Gervois P (2008). Systemic and distal repercussions of liver-specific peroxisome proliferator activated receptor-alpha control of the acute phase response. Endocrinology, 149 : 3215-3223. Meinitzer A et al. (2011). Symmetrical and asymmetrical dimethylarginine as predictors for mortality in patients referred for coronary angiography : the Ludwigshafen Risk and Cardiovascular Health study. Clin Chem, 57 : 112-121. Missler U, Wiesmann M, Friedrich C, and Kaps M (1997). S100 protein and neuron-specific enolase concentrations in blood as indicators of infarction volume and prognosis in acute ischemic stroke. Stroke, 28 : 1956-1960. Montaner J et al. (2001). Matrix metalloproteinase expression after human cardioembolic stroke : temporal profile and relation to neurological impairment. Stroke, 32 : 1759-1766. Mueller T, Dieplinger B, Poelz W, and Haltmayer M (2006). Increased pregnancy-associated plasma protein-A as a marker for peripheral atherosclerosis : results from the Linz Peripheral Arterial Disease Study. Clin Chem, 52 : 1096-1103. Myers GL et al. (2009). National Academy of Clinical Biochemistry Laboratory Medicine Practice guidelines : emerging biomarkers for primary prevention of cardiovascular disease. Clin Chem, 55 : 378384. Nicholls SJ, and Hazen SL (2005). Myeloperoxidase and cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 25 : 1102-1111. Nilsson L, Jonasson L, Nijm J, Hamsten A, and Eriksson P (2006). Increased plasma concentration of matrix metalloproteinase-7 in patients with coronary artery disease. Clin Chem, 52 : 1522-1527. Oertel M, Schumacher U, McArthur DL, Kastner S, and Boker DK (2006). S100B and NSE : markers of initial impact of subarachnoid

181

4557_2_.book Page 182 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

haemorrhage and their relation to vasospasm and outcome. J Clin Neurosci, 13 : 834-840.

Ross R (1993). The pathogenesis of atherosclerosis : a perspective for the 1990s. Nature, 362 : 801-809.

Palazzuoli A et al. (2006). Brain natriuretic peptide and other risk markers for outcome assessment in patients with non-ST-elevation coronary syndromes and preserved systolic function. Am J Cardiol, 98 : 1322-1328.

Ross R (1999). Atherosclerosis – an inflammatory disease. N Engl J Med, 340 : 115-126.

Patterson CC, Smith AE, Yarnell JW, Rumley A, Ben-Shlomo Y, and Lowe GD (2010). The associations of interleukin-6 (IL-6) and downstream inflammatory markers with risk of cardiovascular disease : the Caerphilly Study. Atherosclerosis, 209 : 551-557. Pearson TA et al. (2003). Markers of inflammation and cardiovascular disease : application to clinical and public health practice : A statement for healthcare professionals from the Centers for Disease Control and Prevention and the American Heart Association. Circulation, 107 : 499-511. Pinet F (2004). What is the role of endothelin system ? Medecine/ Sciences, 20 : 339-345. Qizilbash N, Duffy SW, Warlow C, and Mann J (1992). Lipids arc risk factors for ischaemic stroke : overview and review. Cerebrovasc Dis, 2 : 127-136. Ridker PM (2003). Clinical application of C-reactive protein for cardiovascular disease detection and prevention. Circulation, 107 : 363-369. Ridker PM, Hennekens CH, Buring JE, and Rifai N (2000). C-reactive protein and other markers of inflammation in the prediction of cardiovascular disease in women. N Engl J Med, 342 : 836-843.

182

Saenger AK, and Christenson RH (2010). Stroke biomarkers : progress and challenges for diagnosis, prognosis, differentiation, and treatment. Clin Chem, 51 : 21-33. Sotgiu S et al. (2006). Inflammatory biomarkers in blood of patients with acute brain ischemia. Eur J Neurol, 13 : 505-513. Tang WH, Wu Y, Nicholls SJ, and Hazen SL (2011). Plasma myeloperoxidase predicts incident cardiovascular risks in stable patients undergoing medical management for coronary artery disease. Clin Chem, 57 : 33-39. von Eynatten M, Hamann A, Twardella D, Nawroth PP, Brenner H, and Rothenbacher D (2006). Relationship of adiponectin with markers of systemic inflammation, atherogenic dyslipidemia, and heart failure in patients with coronary heart disease. Clin Chem, 52 : 853859. Yoo JH, and Lee SC (2001). Elevated levels of plasma homocyst(e)ine and asymmetric dimethylarginine in elderly patients with stroke. Atherosclerosis, 158 : 425-430. Zambon A, Gervois P, Pauletto P, Fruchart JC, and Staels B (2006). Modulation of hepatic inflammatory risk markers of cardiovascular diseases by PPAR-alpha activators : clinical and experimental evidence. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 26 : 977-986.

4557_2_.book Page 183 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

11 Marqueurs de dysfonctionnement cardiaque Jacqueline Peynet, Monique Dehoux, Guillaume Lefèvre, Ivan Philip

1 ■■ L’INSUFFISANCE CARDIAQUE 1.1. 1.2. 1.3. 1.4.

Définition et classification de l’insuffisance cardiaque Physiopathologie de l’insuffisance cardiaque Biomarqueurs de l’insuffisance cardiaque Les peptides natriurétiques : le Brain Natriuretic Peptide

2 ■■ SYNDROMES CORONARIENS AIGUS 2.1. 2.2.

Définitions et rappels physiopathologiques Marqueurs d’ischémie et de nécrose

3 ■■ STRATÉGIE « MULTIMARQUEURS » DES SYNDROMES CORONARIENS AIGUS 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5.

Marqueurs de nécrose Marqueurs d’ischémie Marqueurs hémodynamiques Marqueurs d’inflammation Marqueur de stress : la copeptine

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Références bibliographiques

183

4557_2_.book Page 184 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

4557_2_.book Page 185 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs de dysfonctionnement cardiaque

urant la dernière décennie le développement de nouveaux dosages de biomarqueurs cardiaques, praticables en urgence, a révolutionné l’approche diagnostique et permis d’optimiser la prise en charge des syndromes coronariens aigus et de l’insuffisance cardiaque. Ainsi la cardiospécificité et la grande sensibilité des isoformes cardiaques des troponines I et T ont amené le Collège Américain de Cardiologie et la Société Européenne de Cardiologie (ACC/ESC) à redéfinir les critères de diagnostic de l’infarctus du myocarde en 2007 et l’intérêt des dosages des BNP et NT-proBNP a été bien établi dans le diagnostic étiologique d’une dyspnée et dans la stratification pronostique de l’insuffisance cardiaque. L’amélioration des connaissances sur les mécanismes physiopathologiques des syndromes coronariens aigus et de la dysfonction cardiaque ainsi que les développements méthodologiques ont favorisés l’émergence de nombreux autres biomarqueurs proposés comme outils diagnostiques, pronostiques, voire comme aide au traitement. Cependant certaines applications de ces tests, tels la place du BNP/NT-proBNP dans l’aide à la décision thérapeutique au cours de l’insuffisance cardiaque chronique ou l’intérêt d’une stratégie multimarqueurs au cours des syndromes coronariens, restent à définir et sont toujours en cours d’étude en 2011. De plus bien que les dosages de ces marqueurs aient bénéficié des progrès méthodologiques récents et soient devenus des examens de pratique courante, des problèmes liés à la complexité de leurs formes circulantes et à l’absence de standardisation des différentes méthodes demeurent et viennent compliquer l’interprétation des résultats par les cliniciens. Ces différents points sont exposés dans ce chapitre.

D

1 ■■ L’INSUFFISANCE CARDIAQUE

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

1.1.

Définition et classification de l’insuffisance cardiaque

L’insuffisance cardiaque est définie comme étant l’incapacité mécanique progressive du cœur à assurer les besoins hémodynamiques de l’organisme. L’inadéquation entre la fonction de la pompe cardiaque et les besoins entraîne une élévation des pressions d’amont (insuffisance cardiaque congestive), et/ou une diminution du débit d’aval (insuffisance cardiaque systémique). Il s’agit d’une maladie grave dont le pronostic reste sombre en dépit de nombreuses avancées thérapeutiques, avec un taux de mortalité de 50 % à 4 ans et de plus de 50 % à un an pour les formes sévères. Elle constitue un problème de santé publique car sa prévalence, estimée en 2005 à 10 millions de cas parmi les 900 millions de la population européenne, va s’accroître dans les deux prochaines décades en raison du vieillissement de la population avec une augmentation concomitante du nombre d’hospitalisations pour décompensation (Stewart et al., 2003). Le diagnostic de l’insuffisance cardiaque repose sur la présence de symptômes (dyspnée, fatigue en cours d’exercice ou au repos, œdèmes des chevilles) et l’existence objectivée (préférentiellement par échographie) d’une dysfonction cardiaque (systolique et/ou diastolique). L’évaluation de la sévérité de cet état nécessaire à l’optimisation de la prise en charge des patients repose sur la

Tableau 1 ■ Classification de l’insuffisance cardiaque par la New York Heart Association. Classe I

Pas de symptômes au repos Pas de limitation de l’activité physique

Classe II

Pas de symptômes au repos Limitation modérée d’activité physique : apparition de fatigue, dyspnée, douleur pour une activité ordinaire

Classe III

Pas de symptômes au repos Limitation marquée de l’activité physique : apparition de symptômes pour une activité inférieure à l’activité ordinaire

Classe IV

Symptômes présents au repos Aggravation par toute activité même minimale

classification établie par la New York Heart Association (NYHA) utilisant des critères cliniques permettant de chiffrer l’importance du handicap (tableau 1). Cependant l’absence de spécificité de symptômes comme l’essoufflement ou la fatigue et la part de subjectivité de leur appréciation rendent délicats le diagnostic et l’estimation de la sévérité de la dysfonction cardiaque, particulièrement chez les sujets âgés (Swedberg, 2005). De plus selon la vitesse de constitution de l’insuffisance cardiaque, le patient peut rester asymptomatique pendant longtemps. La gravité de cette pathologie a donc conduit à intensifier les efforts pour développer des moyens permettant son diagnostic à un stade précoce et facilitant la stratification du risque pour la prise en charge des patients.

1.2.

Physiopathologie de l’insuffisance cardiaque

1.2.1. Les mécanismes initiateurs L’insuffisance cardiaque est une conséquence finale commune de la plupart des atteintes cardiaques, myocardiques, valvulaires et autres. Il est possible de distinguer très schématiquement les insuffisances cardiaques avec altération de la fonction systolique (défaut d’éjection), les plus fréquentes, et celles avec altération de la fonction diastolique (défaut de remplissage). Les premières sont liées soit à une surcharge mécanique du ventricule, volumétrique (augmentation du volume télédiastolique ventriculaire par exemple en cas de valvulopathies) ou barométrique (augmentation de la post-charge due à l’hypertension artérielle, à un rétrécissement aortique…), soit à un défaut de contractibilité myocardique (postinfarctus, cardiomyopathie, carence d’apport en oxygène…), et les secondes sont observées lorsqu’il existe une gêne à l’expansion diastolique du ventricule (obstacle auriculo-ventriculaire gênant l’écoulement sanguin intracardiaque, péricardite…).

1.2.2. Les mécanismes d’adaptation La réponse à l’agression myocardique entraîne des mécanismes d’adaptation visant à maintenir le débit systémique : stimulation neuro-hormonale, redistribution périphérique du débit, remodelage ventriculaire (Jackson et al., 2000). La stimulation noradréner-

185

4557_2_.book Page 186 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

gique via les barorécepteurs a des effets inotrope et chronotrope positifs contribuant au maintien du débit cardiaque malgré la diminution du volume d’éjection, l’activation du système rénine-angiotensine-aldostérone (RAA) entraîne une vasoconstriction et une augmentation du volume plasmatique par rétention hydrosodée. Une augmentation de la sécrétion des peptides natriurétiques, ANP (Atrial natriuretic peptide) et BNP (Brain natriuretic peptide ou B-type natriuretic peptide), se produit en réponse à l’expansion volumique et à l’élévation de la pression cardiaque. Le remodelage ventriculaire se traduit par des modifications de structure : dilatation ventriculaire caractérisant les surcharges volumétriques et les cardiopathies ischémiques, hypertrophie ventriculaire par prolifération des sarcomères, en cas de surcharge barométrique. De plus l’activité sympathique active au niveau tissulaire des voies conduisant à l’apoptose et à la nécrose des cardiomyocytes. Cependant les effets de la stimulation neurohormonale, entraînant une augmentation de la consommation en oxygène du myocarde, les modifications des protéines contractiles et le développement d’une fibrose myocardique, rendent limité à terme le bénéfice de ces phénomènes d’adaptation car ils contribuent à aggraver l’insuffisance cardiaque, créant ainsi un cercle vicieux.

1.3.

Biomarqueurs de l’insuffisance cardiaque

Les progrès réalisés dans la connaissance de la pathogénèse de l’insuffisance cardiaque ont permis d’identifier un large panel de marqueurs circulants susceptibles d’aider au diagnostic et au pronostic de l’insuffisance cardiaque et d’améliorer la prise en charge des patients. Ils comprennent des indicateurs de l’activation neurohormonale, des marqueurs de l’atteinte des cardiomyocytes ou du remodelage cardiaque (Lee et Vasan, 2005).

1.3.1. Biomarqueurs neurohormonaux L’élévation des concentrations plasmatiques en noradrénaline, rénine, aldostérone, endothéline 1, Big endothéline, BNP a été mise en évidence au cours de l’insuffisance cardiaque. Parmi ces marqueurs, seuls la noradrénaline et les peptides natriurétiques se sont avérés avoir une bonne valeur prédictive (Latini et al., 2004). Cependant, le dosage des catécholamines nécessite la mise en œuvre de méthodes chromatographiques et la détermination de la noradrénaline n’est pas réalisée en pratique usuelle. En revanche, les efforts se sont intensifiés au cours des dernières années pour développer des procédés adaptés à l’urgence pour doser le BNP dont l’intérêt diagnostique et pronostique au cours de l’insuffisance cardiaque s’est révélé être supérieur à ceux de tous les autres marqueurs biologiques.

1.3.2. Marqueurs d’atteinte cardiomyocytaire Les mécanismes conduisant à la mort myocytaire au cours de l’insuffisance cardiaque ne sont pas encore totalement élucidés mais cette mort est objectivée chez un assez grand nombre de patients par des élévations plasmatiques de différents marqueurs cardiomyocytaires. Il a été ainsi montré que des concentrations détectables de troponines I ou T sont associées à une progres-

186

sion plus rapide de la dysfonction ventriculaire gauche et à une augmentation du risque de mortalité (Horwich et al., 2003). Une élévation de la protéine cardiaque de transport des acides gras (h-FABP), positivement corrélée avec les classes de la NYHA, a été décrite au cours de l’insuffisance cardiaque (Arimoto et al., 2005).

1.3.3. Marqueurs de remodelage ventriculaire Des élévations des concentrations circulantes du propeptide amino-terminal du collagène de type III (PIIINP), de métalloprotéases matricielles et de leurs inhibiteurs tissulaires ont été rapportées au cours de l’insuffisance cardiaque. Cependant si ces marqueurs, non cardiospécifiques, témoignent du remodelage ventriculaire au cours de la progression de la maladie ils ne sont pas utilisés actuellement pour aider au diagnostic et au pronostic de cette pathologie.

1.4.

Les peptides natriurétiques : le Brain Natriuretic Peptide

1.4.1. Présentation des peptides natriurétiques Le peptide natriurétique de type B (BNP), initialement isolé du cerveau de porc, appartient au système des peptides natriurétiques comprenant également l’atrial natriuretic peptide (ANP) sécrété par l’oreillette, le C-type natriuretic peptide (CNP) d’origine endothéliale, l’urodilatine sécrétée par le rein et le DNP (dendroaspis natriuretic peptide) isolé du venin d’un serpent mamba. Ils présentent une structure similaire caractérisée par un anneau de 17 acides aminés formé par un pont disulfure, avec une grande homologie entre les deux peptides cardiaques ANP et BNP (figure 1). ■ Synthèse et métabolisme des peptides natriurétiques cardiaques

L’ANP et le BNP sont synthétisés sous forme de préprohormones, codées par des gènes distincts, et sécrétées en réponse à des stimuli dont le principal est l’étirement des cardiomyocytes. Les régulations de leur synthèse, leur sécrétion et leur clairance diffèrent, suggérant des rôles physiologiques distincts (D’Souza et al., 2004 ; Hall, 2004). L’ANP est synthétisé sous forme d’une préprohormone de 151 acides aminés (AA) dont la protéolyse intracellulaire conduit au proANP de 126 AA, stocké dans des granules des myocytes de l’oreillette. Lors de sa sécrétion une sérine-protéase, la corine, scinde le proANP en ANP (28 AA) actif et en NT-ANP (98 AA). La concentration en ANP plasmatique s’élève rapidement en réponse à un stimulus par libération à partir des granules de stockage. L’expression de ce peptide, largement prépondérante dans l’oreillette dans des conditions physiologiques, peut être augmentée au niveau du ventricule gauche au cours de l’insuffisance cardiaque. Le gène codant le BNP est situé sur le chromosome 1 (1p36.2) et code une protéine de préproBNP (134 AA). Après clivage du peptide signal, sa synthèse conduit au proBNP (108 AA), peptide O-glycosylé (Schellenger et al., 2006), qui est ensuite clivé au moment de sa sécrétion par la furine et/ou la corine en BNP (32 AA) actif et en NT-proBNP (76 AA) inactif. À la différence de

4557_2_.book Page 187 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs de dysfonctionnement cardiaque

H2N

Surcharge

H2N Gl

Gl

Pb Cy

Pb Cy

ANP Cy Gl

COOH

Ag Ag

BNP

Ile

BNP Le Gl Se

COOH

Récepteur NPR-C endopeptidase neutre

H2N Gl

Gl

Pb Cy

Ag Ag

CNP

Pb Cy

Ile

Inhibition du SRAA Catabolisme

Cy Gl

Vasodilatation

COOH

Formes actives des peptides natriurétiques.

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

ANP : atrial natriuretic peptide ; BNP : brain natriuretic peptide ; CNP : C-type natriuretic peptide ; DNP : dendroapsis natriuretic peptide.

l’ANP le BNP n’est pas stocké et est synthétisé et sécrété de façon constitutive. Les peptides natriurétiques sont sécrétés par les cardiomyocytes en réponse à l’étirement des fibres myocardiques mais d’autres stimuli de sécrétion du BNP ont été rapportés : transforming growth factor b, tumor necrosis factor a, interleukine-1, lipopolysaccharides, et hypoxie cellulaire. L’oreillette semble être la principale source de production de ces deux peptides dans des conditions physiologiques mais leur sécrétion ventriculaire est activée dans des conditions pathologiques. Si l’expression des gènes de l’ANP et du BNP augmente de façon coordonnée en réponse à certains stimuli elle peut en revanche être dissociée au cours d’autres situations, par exemple au cours de l’infarctus du myocarde, ce qui suggère une régulation différente de l’activité de leurs promoteurs. De plus l’induction du gène du BNP est beaucoup plus rapide que celle de l’ANP. Lors de l’insuffisance cardiaque l’expression des gènes est stimulée au niveau ventriculaire de façon plus importante pour le BNP que pour l’ANP, ce qui a amené à considérer de façon très simplifiée l’ANP comme un peptide auriculaire et le BNP comme un peptide ventriculaire. La régulation moléculaire de l’expression du gène du BNP s’avère complexe, impliquant différents éléments du promoteur selon la nature des stimuli et des voies de signalisation activées (La Pointe, 2005, revue ; Ma et al., 2005). ■ Effets physiologiques

La plupart des effets biologiques des peptides natriurétiques s’exercent via la fixation à des récepteurs membranaires activant la guanylyl cyclase, les natriuretic peptide receptors (NRP) A et B largement distribués dans le système cardiovasculaire, préférentiellement le NPR-A pour l’ANP et le BNP. À l’état basal le NPR-A se trouve sous forme phosphorylée et la fixation du peptide est responsable d’une déphosphorylation levant la répression de l’activité guanylate cyclase avec production de GMP cyclique (D’Souza et al., 2004, revue). Ces systèmes entraînent une vasodilatation avec une diminution de la pression pulmonaire et des résistances périphériques

↑

■

Filtration glomérulaire inhibition de la réabsorption de l’eau

Le Gl Se

↑

Le Gl Se

Figure 1

Récepteurs NRP-A et NRP-B

Ag Ag

DNP

Ile

Cy Gl

Appétence en sel besoin en eau

Ile

Cy Gl Le Gl Se

H2N

↑

Ag Ag

Volémie

Figure 2

■

Effets du BNP au cours de l’insuffisance cardiaque.

en s’opposant aux effets vasoconstricteurs du système RAA, du système sympathique et de l’endothéline. Ils exercent au niveau rénal des effets directs tubulaires et vasculaires entraînant une excrétion d’eau et de sodium (figure 2). Le BNP présente également des propriétés anti-remodelage cardiaque en inhibant la fibrose et l’hypertrophie induite par les facteurs de croissance, vraisemblablement en s’opposant aux effets de l’activation des systèmes sympathique et RAA. Son rôle protecteur a également été mis en évidence au cours de l’ischémie-reperfusion cardiaque, contribuant à limiter la taille de la zone infarcie. L’association de la rétention hydrosodée et de l’augmentation des peptides natriurétiques au cours de l’insuffisance cardiaque congestive peut donc apparaître paradoxale. Il a été suggéré qu’au cours de l’insuffisance cardiaque l’activation de la transcription du BNP au niveau du ventricule, dépourvu de granules de stockage et exprimant les protéases nécessaires à la libération de la forme active différemment de l’oreillette, favoriserait la sécrétion de formes non matures biologiquement inactives (Goetze et al., 2003). Le proBNP (1-108) a en effet une action 6 à 8 fois moins importante que le BNP (1-32) vis-à-vis des récepteurs du BNP. La présence prépondérante de proBNP dans le plasma de patients classés stade IV de la NYHA a été confirmée depuis (Hawkridge et al., 2005 ; Seferian, 2007). ■ Formes circulantes et clairance

On retrouve au niveau plasmatique l’ANP et le BNP ainsi que les peptides N terminaux des prohormones, NT-proANP et NT-proBNP. La clairance des formes actives s’effectue par endocytose médiée par le natriuretic peptide receptor de type C (NRP-C) exprimé au niveau vasculaire, par protéolyse sous l’action d’une métalloprotéase extracellulaire liée à la membrane des cellules endothéliales, la neutral endopeptidase-2.4.11 (NEP), et pour une moindre part par le rein. Le rôle de la NEP dans la clairance du BNP est discuté car ce peptide s’est avéré être plus résistant que l’ANP à l’action de cette enzyme. En revanche, la clairance du

187

4557_2_.book Page 188 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

NT-proBNP est essentiellement rénale. La demi-vie plasmatique du BNP est de 20 minutes alors que celle de l’ANP n’est que de quelques minutes ; celle du NT-proBNP est de 120 minutes. D’autres formes circulantes de BNP ont également été identifiées : la forme intacte du précurseur proBNP (1-108), plus ou moins O-glycosylée sur la partie N-terminale de la molécule a été mise en évidence dans la population générale, et constitue la forme circulante principale chez les patients en insuffisance cardiaque (Goetze et al., 2006 ; Seferian et al., 2007). La concentration du proBNP semble varier parallèlement à celle du BNP en fonction de l’âge, du sexe, de l’index de masse corporelle et augmente en fonction du degré d’insuffisance cardiaque (Lam et al., 2007). ProBNP, BNP et NT-proBNP peuvent circuler sous formes tronquées N et C-terminales (Ala-Kopsala et al., 2004). Le BNP (1-32) et le proBNP (1-108) peuvent être facilement clivés en BNP (3-32 ou des Ser-Pro BNP) et en pro-BNP (3-108) par perte de leurs sérine et proline N terminaux lors de l’incubation du sérum ou par action de la dipeptidyl-peptidase IV (DDPIV), enzyme agissant sur des peptides ayant une proline en deuxième position N terminale. De plus, le BNP peut être protéolysé par une enzyme présente en grande quantité dans le rein, la méprine A, conduisant à la dégradation du BNP(1-32) en BNP(7-32). Ces enzymes agiraient également sur le NT-proBNP. Ces formes tronquées peuvent apparaître in vivo aussi bien chez des sujets ayant une insuffisance cardiaque chronique ou une dysfonction ventriculaire asymptomatique que chez des sujets sains (Lam et al., 2007), et au cours de la phase préanalytique. La caractérisation des formes présentes au cours de diverses situations pathologiques et de leur reconnaissance par les anticorps des méthodes commerciales devrait permettre une meilleure compréhension des divergences inter-méthodes et explique les difficultés de standardisation de ces marqueurs.

1.4.2. Dosage des peptides natriurétiques ■ Méthodes de dosage

Il s’agit d’immunodosages qui diffèrent par la nature du produit dosé (forme active ou produit N-terminal), des anticorps et du calibrateur utilisés, du type de détection. L’ANP et le NT-proANP

Tableau 2

■

Caractéristiques des méthodes de dosage du BNP.

Fournisseur Shionogi

Analyseur

ADVIACentaur

Olympus

AU3000i

Alere-Biosite

Triage Access DXL 800 Axsym

Abbott Architect * MC = anticorps monoclonal.

188

Anticorps reconnaissant

IRMA manuel

Siemens

Beckman

ne sont pas dosés en pratique courante car leurs performances diagnostiques se sont révélées être inférieures à celles du BNP et du NT-proBNP. Les premières méthodes commercialisées pour le dosage du BNP, comme celle de Shionogi distribuée en France par Schering-CisBio, utilisaient une détection isotopique (iode 125). Ces méthodes étaient peu utilisables en urgence et une méthode avec détection fluorométrique réalisable sur sang total au chevet du patient (point of care test POCT). Triage fut ensuite mise au point par la société Biosite (Alere). Depuis, plusieurs autres méthodes de type sandwich ont été développées sur les automates avec des temps d’analyse compatibles avec l’urgence, dosant soit le BNP (Axsym et Architect Abbott, Centaur Siemens, Olympus AU 3000i, Access et DxL BeckmanCoulter) soit le NT-proBNP (Elecsys, E170 et appareil délocalisé Cardiac reader Roche, RXL, SCS, Vista et Immulite Siemens, Vitros ECI OCD, RAMP All Diag, Vidas Biomérieux), avec des détections fluorimétriques ou par chimiluminescence. Les méthodes de dosage du BNP combinent des anticorps monoclonaux reconnaissant des épitopes différents : partie Cterminale (résidus 27-32), séquence de la boucle (14-21), pont disulfure (Ruppé et al., 2005) (tableau 2). Les dosages de NT-proBNP commercialisés en France utilisent les mêmes anticorps polyclonaux ou monoclonaux mais il faut noter que d’autres anticorps ont été commercialisés dans d’autres pays. L’immunoréactivité de ces couples d’anticorps vis-à-vis des diverses formes circulantes ou pouvant apparaître au cours de la conservation de l’échantillon varie selon les systèmes (tableau 3) (Rawlins et al., 2005), ce qui explique en partie l’hétérogénéité des résultats de BNP obtenus pour certains patients et lors des études de stabilité in vitro. Il faut également noter que les méthodes de dosage du BNP reconnaissent le BNP recombinant (nesiritide) utilisé dans certains pays pour le traitement de l’insuffisance cardiaque. De plus il a été montré que le proBNP (1-108), pouvant constituer la forme circulante majeure au cours de l’insuffisance cardiaque sévère, est plus ou moins reconnu par différents systèmes commercialisés (Liang et al., 2007). Il est donc probable que le proBNP (1-108) et sa forme dégradée proBNP (3-108), contribuent à l’hétérogénéité des résultats des différents systèmes

Détection Iode 125

Résidus C-terminaux (27-32) (MC*) Résidus de la boucle (14-21) (MC)

Chimiluminescence Chimiluminescence Immunoenzymatique et fluorescence

Pont disulfure (5-13) (MC) Boucle + ? (« omniclonaux »)

Pont disulfure (5-13) (MC) Résidus C-terminaux (MC)

Chimiluminescence Immunoenzymatique et fluorescence Chimiluminescence

4557_2_.book Page 189 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs de dysfonctionnement cardiaque

Tableau 3 ■ Immunoréactivité de peptides dérivés du BNP (1-32) (d’après Rawlins et al., 2005). Méthode Peptide Access2

ADVIA Centaur

AxSYM

1-32

82

126

106

3-32

69

126

118

4-32

159

175

164

10-32

50 %) pour être significatives (Wu, 2006). ■ Performances des dosages de BNP et NT-proBNP

Il faut rappeler que la performance d’un test dépend des méthodes de dosage et de la prévalence de la pathologie dans les populations étudiées. La comparaison des performances des dosages de BNP et de NT-proBNP de la littérature n’est donc pas aisée car les études ont été conduites avec des méthodes différentes, sur des cohortes de patients d’âges différents, ayant des fonctions rénales plus ou moins altérées, et avec des prévalences variables de la dysfonction ventriculaire, elle-même plus ou moins marquée. Il ressort néanmoins de toutes les études conduites en se rapportant à l’échocardiographie qu’une fonction ventriculaire

anormale est associée à des valeurs élevées de BNP/NT-proBNP. Le BNP présente une bonne valeur prédictive négative mais une valeur prédictive positive médiocre lorsque la prévalence du dysfonctionnement ventriculaire est faible (5 à 10 %) et sa valeur prédictive positive s’améliore alors que sa valeur prédictive négative diminue lorsque la prévalence est élevée (40 à 60 %) (Rodeheffer, 2004). Deux études portant sur un grand nombre de patients, la Breathing Not Properly (BNP) Multinational Study réalisée avec le système Triage Biosite (Maisel et al., 2002) et la NT-Pro-BNP Investigation of Dyspnea in the Emergency Department Study (PRIDE) (Januzzi et al., 2004), ont fait référence pour la détermination des seuils décisionnels de ces marqueurs pour le diagnostic d’insuffisance cardiaque symptomatique (tableau 7). Les valeurs de consensus retenues pour le BNP sont de 100 ng/L pour le seuil d’exclusion, car cette valeur présente une très bonne valeur prédictive négative quelles que soient les méthodes de dosage, et de 500 ng/L pour le seuil d’inclusion car cette valeur permet de diagnostiquer une insuffisance cardiaque congestive avec une très forte probabilité. Pour le NT-proBNP les seuils d’exclusion et d’inclusion sont de 300 et 900 ng/L pour tout patient mais les variations liées à l’âge des patients amènent à utiliser des valeurs spécifiques à plusieurs tranches d’âge. Pour le BNP comme pour le NT-proBNP les valeurs situées entre les seuils d’exclusion et d’inclusion constituent une zone d’incertitude car elles peuvent être observées chez des patients n’ayant pas d’insuffisance cardiaque. Des facteurs prédictifs de ces élévations modérées ont été identifiés. Ils comprennent, outre le déclin de la filtration glomérulaire avec l’âge, la fibrillation auriculaire, la cardiomégalie, la diminution de la concentration sanguine en hémoglobine, les problèmes hémodynamiques (Knudsen et al., 2005). Les performances diagnostiques du BNP et du NT-proBNP, supérieures à celles du proBNP (Lam et al., 2007), sont très voisines. Cependant si la comparaison de leurs performances ne

Tableau 7 ■ Seuils d’exclusion et d’inclusion du BNP et NT-proBNP pour le diagnostic de l’insuffisance cardiaque aiguë de la Breathing Not Properly Multinational Study et de l’étude PRIDE. Valeurs seuils Sensibilité Spécificité VPP VPN (ng/L) (%) (%) (%) (%) BNP Exclusion Tout patient Inclusion Tout patient NT-proBNP Exclusion Tout patient Inclusion Tout patient < 50 ans ≥ 50-75 ans > 75 ans

100

90

76

79

89

400

63

91

86

74

300

99

68

62

99

900 450 900 1 800

90 93 91 85

85 95 80 73

76 67 77 92

94 99 92 55

VPP : valeur prédictive ; VPN : valeur prédictive négative.

191

4557_2_.book Page 192 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

montrent pas de différences fondamentales lors de l’étude de populations, l’analyse au cas par cas révèle des discordances individuelles montrant que ces deux marqueurs ne sont pas complètement équivalents en pratique clinique quotidienne (Mair et al., 2007). Enfin il faut remarquer que les valeurs seuils ont été établies pour l’aide au diagnostic d’insuffisance cardiaque dans des services d’accueil d’urgences et que des travaux visant à établir des seuils décisionnels appropriés aux autres situations cliniques (dépistage chez un patient asymptomatique, pronostic, prise en charge thérapeutique) doivent être développés.

Patient présentant une dyspnée Examen clinique, radiologique Dosage du BNP ou NT-proBNP

BNP < 100 ng/L NT-proBNP < 300 ng/L

BNP 100-500 ng/L NT-proBNP < 50 ans : 300-450 ng/L ≥ 50-75 ans : 450-900 ng/L > 75 ans : 900-1 800 ng/L

BNP > 500 ng/L NT-proBNP < 50 ans : > 450 ng/L ≥ 50-75 ans : > 900 ng/L > 75 ans : > 1 800 ng/L

Insuffisance cardiaque très peu probable

Zone d’incertitude

Insuffisance cardiaque très probable

1.4.3. Intérêt clinique des dosages des BNP et NT-proBNP ■ Aide au diagnostic • Diagnostic étiologique chez un patient symptomatique

Il est maintenant bien établi que le dosage du BNP/NT-proBNP pour l’aide au diagnostic d’insuffisance cardiaque chez des patients présentant des symptômes non spécifiques telle une dyspnée aiguë permet de réduire de façon sensible l’imprécision diagnostique avec pour conséquence une meilleure prise en charge des patients et un moindre coût du traitement (Rodeheffer, 2004, revue). Ainsi dans le sous-groupe de patients de la Breathing Not Properly (BNP) Multinational Study pour lequel la probabilité pré-test était incertaine l’addition du BNP à l’appréciation clinique a permis de classer correctement 74 % des patients ayant une insuffisance cardiaque (McCullough et al., 2002). L’intérêt essentiel du dosage des peptides natriurétiques réside dans l’excellente valeur prédictive négative du seuil de 100 ng/L pour le BNP et de 300 ng/L pour le NT-proBNP, permettant d’exclure l’origine cardiogénique d’une dyspnée, aussi bien en milieu hospitalier qu’en situation ambulatoire. Cette notion a amené la Société européenne de cardiologie à les intégrer dès 2001 comme tests d’exclusion dans l’algorithme décisionnel de diagnostic de l’insuffisance cardiaque aiguë et chronique (Swedberg, 2005). Des valeurs supérieures à 500 ng/L pour le BNP et à 450, 900 et 1 800 ng/L selon l’âge pour le NT-proBNP ont une forte valeur prédictive positive d’insuffisance cardiaque, mais il faut souligner que ces valeurs constituent une aide s’ajoutant à l’examen clinique et non un substitut en cas d’incertitude du diagnostic. L’interprétation des résultats selon ces seuils, établis de façon consensuelle (figure 5), doit également prendre en compte les facteurs influençant les valeurs : variations interméthodes, variations liées à l’état du patient (âge surtout pour les femmes, obésité, fonction rénale, fibrillation auriculaire, anémie). Il faut également noter que des faux négatifs peuvent être observés en cas d’œdème pulmonaire aigu « flash », d’arrivée extrêmement brutale, en raison du temps de latence nécessaire à la synthèse et à la sécrétion du BNP (1 à 2 heures). D’autres situations peuvent modifier les valeurs de BNP ou NTproBNP et compliquer leur interprétation, particulièrement dans la zone d’incertitude : – Le BNP est également synthétisé par le ventricule droit et des augmentations, le plus souvent situées dans la zone d’incertitude, sont observées au cours de pathologies pulmonaires

192

Figure 5

■ Dosages du BNP et du NT-proBNP : aide au diagostic de l’insuffisance cardiaque chez un patient symptomatique.

provoquant une dysfonction du ventricule droit : embolie pulmonaire, broncho-pneumopathie chronique obstructive, hypertension artérielle pulmonaire primitive ou secondaire (Brenden et al., 2006). – L’augmentation du BNP/NT-proBNP est également observée au cours d’états inflammations sévères et de sepsis, résultant en partie d’une induction par les cytokines. Elle semble d’ailleurs constituer un marqueur précoce de dysfonction cardiaque et de pronostic au cours du choc septique (Roch et al., 2005). Une prescription raisonnée de ces marqueurs est indispensable. Ainsi la National Academy of Clinical Laboratory Medecine Practice (NACB) souligne que les dosages de BNP/NT-proBNP ne se sont pas recommandés pour le diagnostic d’insuffisance cardiaque lorsque les signes cliniques sont évidents et qu’ils ne doivent pas remplacer l’examen clinique et l’évaluation du degré des anomalies ventriculaires structurales et fonctionnelles par les procédés de référence (échocardiographie) (Wilson Tang et al., 2007). • Dépistage d’une dysfonction ventriculaire

Les recherches se sont intensifiées depuis une dizaine d’années pour détecter la dysfonction ventriculaire à un stade précoce de façon à retarder son évolution vers l’insuffisance cardiaque symptomatique par une prise en charge thérapeutique. L’échocardiographie permet ce diagnostic mais ne peut malheureusement pas être appliquée à un dépistage de masse. L’intérêt du BNP et du NT-proBNP, examens moins coûteux et d’exécution aisée, a donc été évalué pour dépister la dysfonction ventriculaire, systolique et/ou diastolique. Ils augmentent avec la sévérité de la dysfonction ventriculaire systolique et même diastolique avec fonction systolique préservée (Rademaker, 2005). Cependant, comme l’a montré l’étude conduite sur la cohorte de Framingham (Vasan et al., 2002), leur valeur diagnostique s’avère limitée pour dépister une dysfonction systolique ou une hypertrophie ventriculaire gauche en raison de la faible prévalence de ces états dans les populations faisant l’objet de dépistage de masse. De plus l’utili-

4557_2_.book Page 193 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs de dysfonctionnement cardiaque

sation de ces marqueurs nécessiterait d’établir des seuils discriminants spécifiques variant avec l’âge et le sexe. Les peptides natriurétiques semblent donc plus efficaces pour dépister des désordres cardiaques subcliniques qu’un niveau spécifique de dysfonction ventriculaire systolique ou diastolique. Ainsi chez des patients asymptomatiques présentant une hypertension artérielle les seuils de 17 ng/L pour le BNP (Axsym® Abbott) et de 39 ng/L pour le NT-proBNP (Elecsys® Roche) permettent de dépister un problème cardiaque avec une sensibilité de 90 % et une spécificité de 29 % et de 32 % (Mueller et al., 2005). L’intérêt du BNP et du NT-proBNP est donc modeste dans ce contexte de dépistage, sauf dans des populations très ciblées, relativement jeunes et sans comorbidité importante, car les valeurs discriminantes sont basses. ■ Valeur pronostique

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

• Insuffisance cardiaque chronique

Les BNP et NT-proBNP sont également des marqueurs pronostiques de morbidité et de mortalité, quelles que soient les étiologies de l’insuffisance cardiaque. Ils sont corrélés à la capacité fonctionnelle et sont prédictifs de l’aggravation de l’insuffisance cardiaque chronique et des risques de réhospitalisations et de décès des patients (Rademaker et Richards, 2005). Plusieurs analyses multivariées ont montré qu’ils s’avèrent plus puissants que les autres paramètres, cliniques et biologiques, lors du suivi des patients pour apprécier la gravité de l’insuffisance cardiaque et guider le traitement. Les performances pronostiques du BNP et NT-proBNP sont très voisines. Des différences subtiles ont été trouvées entre ces performances dans l’étude réalisée sur l’importante cohorte de patients de la Valsartan Heart Failure Trial (Val-HeFT) ayant une insuffisance cardiaque chronique stable mais il a été suggéré qu’elles pourraient être plus liées à des différences entre les performances analytiques des méthodes utilisées (Elecsys ® Roche pour NT-proBNP et IRMA Shionogi manuelle pour le BNP) qu’à la nature même des marqueurs (Masson et al., 2006). La valeur du BNP à la sortie d’un patient hospitalisé pour insuffisance cardiaque congestive décompensée s’est révélée fortement prédictive du devenir à court terme du patient, avec un risque relatif augmenté par 5 et 15 pour des valeurs comprises respectivement entre 350 et 700 ng/l et > 700 ng/L (Logeart, 2004). Elle constitue l’un des critères permettant d’identifier les patients à très haut risque de réhospitalisation, de décès, et devant bénéficier d’une transplantation cardiaque (Price et al., 2006). C’est pourquoi, la réalisation d’un dosage à l’admission comme aide au diagnostic et un dosage à la sortie du patient à visée pronostique est proposée dans la prise en charge de l’insuffisance cardiaque aiguë, les dosages quotidiens n’apportant pas de renseignements complémentaires. • Syndromes coronariens aigus

L’augmentation du BNP/NT-proBNP au cours de l’infarctus du myocarde permet également d’identifier les patients à risque de dysfonction ventriculaire gauche, d’insuffisance cardiaque et de décès, indépendamment de l’âge et des événements cardiovasculaires antérieurs. Le pic de BNP/NT-proBNP est observé 24 heures après l’apparition des symptômes mais la performance

pronostique de ces marqueurs est maintenue lorsque les dosages sont réalisés deux à sept jours après l’accident ischémique (Rademaker et Richards, 2005). La comparaison des résultats de BNP dosés au moment de la prise en charge des patients et quatre mois après le syndrome coronarien aigu est également informative (Morrow et al., 2005). • Chirurgie cardiaque

La concentration en BNP/NT-proBNP s’élève chez la plupart des patients après chirurgie cardiaque, avec un lent retour à la normale, vers la troisième semaine. Plusieurs facteurs, dont la circulation extracorporelle et l’ischémie cardiaque induite par le clampage, ont été incriminés dans cette élévation mais il semble que les résultats varient également selon la nature de la cardiopathie opérée, ischémique ou valvulaire, avec dans ce dernier cas une modulation due à la variation de la post-charge induite par le remplacement valvulaire. Dans ces conditions, bien qu’une association entre les variations péri-opératoires de BNP/NT-proBNP et la survenue de complications post-opératoires ait été retrouvée par plusieurs équipes, l’utilisation de ces marqueurs s’avère délicate en pratique quotidienne (Provenchère et al., 2006). En postopératoire le BNP/NT-proBNP constitue un excellent marqueur prédictif de survie à distance chez les transplantés (Rademaker et Richards, 2005). • Chirurgie non cardiaque

L’existence d’une dysfonction ventriculaire gauche ou d’une insuffisance cardiaque augmente le risque per-opératoire d’une chirurgie majeure non cardiaque. Des concentrations élevées des peptides natriurétiques en préopératoire représenteraient un facteur prédictif indépendant de complications cardiaques postopératoires (Yeh et al., 2005). ■ Suivi et ajustement du traitement de l’insuffisance cardiaque

L’excellente valeur prédictive des peptides natriurétiques et la diminution de leur concentration sous l’effet des thérapeutiques validées dans le traitement de l’insuffisance cardiaque chronique a conduit à évaluer leur intérêt pour guider la prise en charge des patients et ajuster leur traitement. Des études préliminaires ont montré que la répétition du dosage de BNP ou de NT-proBNP lors d’une hospitalisation pour décompensation incitant le clinicien à renforcer le traitement ou le suivi immédiat du patient a pour conséquence une diminution des événements cardiovasculaires et les réhospitalisations. Ceci a été confirmé par l’étude randomisée multicentrique française STARS réalisée chez des patients présentant une insuffisance cardiaque classée II à III NYHA, suivis en ambulatoire et ayant à chaque consultation un dosage de BNP, avec indication à majorer le traitement en cas de résultat supérieur à 100 ng/L (Jourdain et al., 2007). Des résultats comparables ont été obtenus avec le NT-proBNP, mais dans le groupe des sujets âgés de plus de 75 ans, l’intérêt du marqueur dans le suivi thérapeutique n’a pas été confirmé. En conclusion, l’intérêt des dosages de BNP et de NT-proBNP pour le diagnostic de l’insuffisance cardiaque aiguë et chronique a été largement démontré durant ces dernières années. Une récente méta-analyse a conclu qu’il n’existe pas de différence significative entre les performances diagnostiques et pronostiques de ces deux marqueurs (Clerico et al., 2007). En revanche

193

4557_2_.book Page 194 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

des travaux doivent être développés pour clarifier les problèmes posés par la diversité des formes circulantes, en particulier par le proBNP, qui représenterait la principale forme circulante reconnue par les méthodes de dosages actuelles (BNP et NT-proBNP).

1 – Le peptide natriurétique de type-B (Brain Natriuretic Peptide, BNP) est une molécule synthétisée par le cœur lors de l’étirement des myocytes ventriculaires. Le BNP possède des propriétés vasodilatatrices, inhibitrices des systèmes vasoconstricteurs, et natriurétiques Des travaux récents suggèrent qu’il exerce également des effets protecteurs au cours de l’ischémie-reperfusion et anti-prolifératif. 2 – La sécrétion du BNP peut être évaluée en dosant le BNP physiologiquement actif ou sa fraction NT-terminale inactive. Cependant il existe plusieurs autres formes circulantes, dont le précurseur proBNP, plus ou moins reconnues par les systèmes de dosage de ces deux analytes. 3 – Les concentrations de BNP/NT-proBNP doivent être interprétées en fonction de l’âge, du sexe, de l’IMC et de la fonction rénale (surtout pour le NT-proBNP) des patients. La variabilité intra-individuelle de ces marqueurs est élevée. 4 – En cardiologie il a été démontré que les concentrations sanguines des BNP/NT-proBNP sont étroitement corrélées avec les classes d’insuffisance cardiaque établies par la NYHA, l’existence et le degré d’une dysfonction ventriculaire et le pronostic des patients. 5 – Aux Urgences, les dosages de BNP/NT-proBNP permettent, grâce à l’avènement de techniques rapides, d’établir le diagnostic étiologique des dyspnées (cardiaque ou non cardiaque) avec une excellente pertinence diagnostique, en complément de l’examen clinique et d’examens complémentaires simples. Il faut noter que les valeurs des seuils décisionnels n’ont été validées que pour cette situation. 6 – Les BNP/NT-proBNP sont des marqueurs pronostiques de morbidité et de mortalité de l’insuffisance cardiaque. Leurs concentrations ont une forte valeur prédictive du devenir à court terme des patients. Elles évoluent en fonction de la réponse au traitement. Cependant en raison de grandes variabilités intraindividuelles, les variations des concentrations de BNP/NTproBNP doivent être importantes pour être significatives. 7 – Par contre, la place des BNP/NT-proBNP dans le dépistage de l’insuffisance cardiaque asymptomatique reste à définir. 8 – Les concentrations des BNP et NT-proBNP s’élèvent également au cours d’autres situations cliniques : infarctus, SCA, embolie pulmonaire et ont une valeur pronostique.

myocarde (IDM) était passée de 8,3 % à 4,3 % entre 1995 et 2005. En marge des progrès de la thérapeutique cardiovasculaire, de l’imagerie et des techniques, les progrès de la biologie ont permis, entre autre, l’avènement de dosages de « marqueurs cardiaques » qui ont révolutionné la cardiologie au cours de la dernière décennie. En particulier, la possibilité de doser les formes circulantes de troponine cardiaque, totalement spécifiques du cœur, avec des techniques sensibles, a permis de reconsidérer globalement la définition des syndromes coronariens aigus, de mieux préciser les différentes entités physiopathologiques qui les caractérisent et d’améliorer le diagnostic.

2.1.

Définitions et rappels physiopathologiques

2.1.1. Définitions des syndromes coronariens aigus Le terme de syndromes coronariens aigus (SCA) regroupe l’ensemble des syndromes cliniques caractérisés par une ischémie aiguë du myocarde : angor instable, infarctus du myocarde ou mort subite. Les critères classiques (douleur prolongée, modifications électriques typiques et élévations « enzymatiques ») ont été modifiés à plusieurs reprises. La définition des SCA proposée en 2000 et améliorée en 2007 par les sociétés savantes de cardiologie américaines et européennes (ACC et ESC) repose sur des données cliniques, des altérations caractéristiques de l’électrocardiogramme (ECG) et sur la détection dans le sang de marqueurs biologiques de lésion et nécrose du myocarde (Alpert et al., 2000 ; Morrow et al., 2007). Les signes cliniques induits par l’ischémie myocardique sont extrêmement polymorphes. Le signe classique de l’IDM est une douleur thoracique constrictive, irradiant dans le bras gauche. Cependant, ce signe n’est pas retrouvé chez tous les patients faisant un IDM. Outre les nombreuses variantes de la douleur angineuse, une proportion non négligeable des IDM reste silencieux et ne sont détectés que par l’ECG et/ou les marqueurs biochimiques. C’est pourquoi, en cas de suspicion clinique d’ischémie myocardique, les SCA ont été classifiés en fonction de l’ECG (présence ou absence d’un sus décalage persistant du segment ST) et de la présence ou non d’un marqueur de nécrose myocardique (de préférence, la troponine). Les SCA sont donc actuellement subdivisés en infarctus du myocarde avec sus-décalage persistant du segment ST (IDM ST+) et en SCA sans sus-décalage du segment ST (SCA ST–) incluant l’angor instable et les infarctus du myocarde (IDM ST–) identifiés par un marqueur biochimique de nécrose myocardique : la troponine (figure 1). La nouvelle définition de l’IDM (Thygesen, 2007) précise les mécanismes physiopathologiques et les approches thérapeutiques qui en découlent (tableau 8).

2 ■■ SYNDROMES CORONARIENS AIGUS

2.1.2. Physiopathologie

Les maladies cardio-vasculaires sont responsables de plus de 4 millions de décès par an en Europe et représentent un véritable problème de santé publique dans les pays industrialisés. L’amélioration de la prise en charge des patients a permis de montrer que la mortalité à 5 ans des patients après un infarctus du

Le SCA représente un continuum physiopathologique de l’ischémie réversible jusqu’à la nécrose cellulaire. L’étiologie la plus fréquente à l’origine des SCA est l’athérosclérose, processus inflammatoire associé à la formation d’une plaque d’athérome dans l’intima de la paroi artérielle. Les mécanismes impliqués dans la formation de cette plaque sont détaillés dans le chapitre

194

4557_2_.book Page 195 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs de dysfonctionnement cardiaque

Tableau 8

■

Les 5 types d’infarctus du myocarde (Thygesen, 2007).

Classification

Définition

Type 1

Infarctus spontané secondaire à l’érosion, la rupture, la fissuration ou la dissection de la plaque

Type 2

Infarctus secondaire à une augmentation de la demande en oxygène ou à une diminution de l’offre (spasme, embolie coronaire, anémie, arythmie, hyper ou hypotension)

Type 3

Mort subite (arrêt cardiaque précédé de symptômes suggérant une ischémie myocardique avec ou sans modification du segment ST ou bloc de branche de novo ou thrombus à l’angiographie et/ou autopsie) mais sans documentation de la présence ou d’une augmentation des marqueurs de nécrose

Type 4a

Infarctus associé à une angioplastie

Type 4 b

Infarctus associé à une thrombose de stent documentée par angioplastie ou à l’autopsie

Type 5

Infarctus associé à un pontage coronaire

Syndromes Coronariens Aiguës (SCA)

gine des SCA existent comme l’obstruction mécanique progressive des coronaires, les angors instables fonctionnels (observés au cours des anémies sévères ou de l’hyperthyroidie, par exemple) ou les obstructions dynamiques (spasmes coronaires). Quelle qu’en soit l’étiologie, l’ischémie fait le lien entre la maladie coronaire et la dysfonction myocardique. Elle provoque dans le myocarde une souffrance cellulaire directe via l’hypoxie, mais également indirecte, via la reperfusion, l’activation de cascades intracellulaires et la génération d’un stress oxydant responsable de nombreuses modifications structurales. Après ischémie prolongée, cette souffrance cellulaire conduit au final à la mort (nécrose) des cardiomyocytes. Les zones myocardiques nécrosées sont responsables de troubles de la contraction segmentaire (akinésie ou hypokinésie) pouvant évoluer vers une insuffisance cardiaque. Au-delà de 45 % de territoire nécrosé, apparaît un état de choc cardiogénique en général fatal. Afin d’éviter ces complications majeures, il apparaît essentiel d’identifier mieux et plus tôt, de stratifier le risque et d’optimiser la prise en charge thérapeutique des SCA. Pour atteindre ces objectifs, plusieurs marqueurs biochimiques faisant référence aux mécanismes physiopathologiques impliqués dans les SCA sont utilisables : marqueurs de risque, d’ischémie, de nécrose et de dysfonction cardiaque. Une stratégie multimarqueurs fondée sur l’association de plusieurs marqueurs est également proposée afin d’améliorer les performances diagnostiques et pronostiques de chacun des marqueurs pris isolement.

Électrocardiogramme

2.2. SCA ST – Troponine

– Angor instable

Confirmation

+ IDM ST –

+ IDM ST +

IDM : infarctus du myocarde ST + : présence d’un sus-décalage du segment ST à l’électrocardiogramme

Figure 6

■ Classification des syndromes coronariens aigus (Alpert et al., 2000).

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Marqueurs d’ischémie et de nécrose

IDM ST

traitant des biomarqueurs de maladies cardiovasculaires. L’événement initial du processus ischémique est la rupture de la plaque d’athérome, entraînant le contact du sang avec les structures sous-endothéliales, hautement thrombogènes. L’activation plaquettaire et l’initiation de la coagulation induisent la formation d’un thrombus intra coronaire. L’obstruction provoquée par le thrombus peut être minimale sans modification de la perfusion coronaire jusqu’à totale et persistante, aboutissant à l’infarctus du myocarde. Les infarctus du myocarde ST+ (ou apparition d’un bloc de branche gauche) correspondent le plus souvent à l’occlusion d’un gros tronc épicardique. En l’absence de revascularisation, une onde Q de nécrose signe l’IDM à l’ECG. À l’opposé, les infarctus du myocarde ST– sont le plus souvent secondaires à une occlusion transitoire liée à un thrombus essentiellement plaquettaire, au niveau d’une plaque instable. D’autres causes à l’ori-

2.2.1. De l’ischémie à la mort cellulaire Les marqueurs biologiques, témoins de la nécrose myocardique, sont des protéines libérées par les cardiomyocytes après mort cellulaire et nécrose. Les caractéristiques principales des différents marqueurs de nécrose après un IDM sont présentées dans le tableau 9. L’ischémie du myocarde est en fait, observée dès que la perfusion coronaire devient insuffisante pour répondre aux besoins en oxygène mais cet événement peut être transitoire et n’est pas forcément suivi de nécrose. Quelques secondes après un épisode d’ischémie, l’augmentation du métabolisme anaérobie conduit à un dysfonctionnement cardiomyocytaire particulièrement des systèmes de transports transmembranaires, entraînant l’accumulation de petites molécules osmotiquement actives avec pour conséquence une entrée d’eau dans la cellule et un gonflement cellulaire. Durant cette phase, réversible, du matériel intracytoplasmique peut passer dans la circulation sanguine. La quantité des protéines ainsi libérées est très faible. Au-delà d’une quinzaine de minutes d’ischémie, la mort cellulaire apparaît avec des lésions irréversibles et une perte d’intégrité de la membrane cellulaire. Environ 80 % des protéines libérées passent immédiatement dans la circulation sanguine après nécrose, par transport direct dans les microvaisseaux, et 20 % des protéines sont transportées par le système lymphatique avec un délai d’apparition dans la circulation d’environ 20 minutes. Il est actuellement admis que tous les marqueurs protéiques solubles apparaissent en même temps dans l’espace interstitiel indépendamment de leur

195

4557_2_.book Page 196 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Tableau 9

Marqueurs biochimiques de nécrose myocardique.

■

Masse moléculaire – kDa

Spécificité cardiaque

Myoglobine

18

–

Sensibilité et VPN élevées Diagnostic précoce des IDM

Faible spécificité en présence de lésions musculaires et d’insuffisance rénale

h FABP

15

+

Diagnostic précoce des IDM

Faible spécificité en présence de lésions musculaires et d’insuffisance rénale

CK MB (dosage pondéral)

85

++

Capacité à détecter un réinfarctus

Spécificité diminuée en présences de lésions musculaires

cTnT

37

++++

Outil de stratification du risque positive jusqu’à deux semaines

Marqueur peu précoce (dosages classiques)

cTnI

24

++++

Outil de stratification du risque positive jusqu’à deux semaines

Marqueur peu précoce (dosages classiques) Problème de standardisation du dosage

Marqueur

Avantages

masse moléculaire dès que la membrane plasmique est lésée. La taille et la distribution subcellulaire des marqueurs déterminent à quelle vitesse ils apparaissent dans la circulation sanguine. Les petites protéines ainsi que celles à localisation cytoplasmique (telles que la myoglobine) apparaissent donc en premier. Les protéines à localisation mitochondriale ou nucléaire (comme la CKMB) apparaissent ensuite. Les protéines structurelles du tissu contractile (comme la troponine) apparaissent plus tardivement car leur libération dépend de la dégradation de la matrice. Ainsi, la myoglobine apparaît très précocement après nécrose (1-3 h), atteint un maximum moins de 10 h après l’événement ischémique et retourne à son niveau basal à 24 h. La CK-MB commence à augmenter 3-4 h après le début de la nécrose, est maximale à 10-24 h et retourne à un niveau basal à 48-72 h. Les troponines dosées par des techniques conventionnelles ont une cinétique comparable à celle de la CK-MB mais peuvent rester augmentées jusqu’à 10 jours suivant l’agression cellulaire. L’augmentation initiale des troponines est en relation avec l’existence d’un pool cytosolique de ces protéines (figure 7).

Multiple du seuil décisionnel Troponine 20 10 5

CK-MB

2

Valeurs de référence

Myoglobine

1 0

Jours 0

Figure 7

196

■

1

2

3

4

5

Cinétique des marqueurs myocardiques après IDM.

Inconvénients

2.2.2. Qualités du marqueur cardiaque idéal Un marqueur cardiaque doit avoir idéalement les caractéristiques suivantes : – être cardiospécifique et sensible ; il ne doit être synthétisé et libéré que par le cœur et absent (ou en faible concentration) dans le sang des sujets sains ; – apparaître très tôt dans la circulation, permettant ainsi la reconnaissance précoce des infarctus ou des patients à risque de développer un infarctus ; – avoir une demi-vie suffisamment longue pour permettre les diagnostics tardifs ; – présenter des augmentations corrélées au pronostic ; – pouvoir être dosé à l’aide d’une méthode adaptée à l’urgence, rapide, facilement praticable et standardisable, et possédant une bonne sensibilité et précision analytiques. À ce jour, aucun des marqueurs proposés ne remplit l’ensemble de ces objectifs. Le marqueur le plus proche de cet « idéal » est la troponine (isoformes cardiaques T et I), marqueur proposé pour la première fois par l’équipe d’A Jaffé en 1993 (Adams et al., 1993). L’avantage des troponines cardiaques sur les autres marqueurs de nécrose a été clairement établi dans de nombreuses études. Ce marqueur remplace avantageusement les « enzymes cardiaques » (CK, AST, LDH) qui manquent totalement de cardiospécificité, et qui ne sont plus recommandées dans le diagnostic des SCA. L’isoenzyme cardiaque de la CK (CK-MB), a longtemps été considéré comme le « gold standard » des marqueurs cardiaques avant l’utilisation des troponines. Le dosage « pondéral » possède une bonne sensibilité et une bonne précision. Cependant, si la sensibilité clinique de la CK-MB est correcte, sa spécificité est affectée par sa présence dans le muscle squelettique. Le dosage de la CK-MB n’est encore recommandé que si celui des troponines n’est pas disponible (Morrow et al., 2007). Les troponines sont actuellement considérés comme les marqueurs de référence de la nécrose myocardique sur la base de leur excellente sensibilité et de leur cardiospécificité.

4557_2_.book Page 197 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Marqueurs de dysfonctionnement cardiaque

2.2.3. Les marqueurs de référence : les troponines I et T ■ Structure, fonction

Les troponines sont des protéines qui interviennent dans la régulation de la contraction musculaire, aussi bien dans les muscles striés que dans le muscle cardiaque. L’interaction entre l’actine et la myosine responsable de la contraction musculaire est régulée par les modifications de la concentration intracellulaire en calcium et dépend d’un complexe protéique associé au filament d’actine, le complexe troponine-tropomyosine. Dans ce complexe, un dimère de tropomyosine est associé à un hétérotrimère formé de trois molécules différentes de troponine : une molécule de troponine C (TnC), une molécule de troponine I (TnI) et une molécule de troponine T (TnT). La TnI inhibe l’activité ATPase de la myosine, la TnC fixe le calcium et la TnT permet l’ancrage des TnI et TnC sur la tropomyosine. La contraction musculaire est déclenchée par la fixation du calcium sur la TnC. Cette fixation entraîne un changement de configuration du complexe troponine-tropomyosine bloquant l’effet inhibiteur de la TnI vis-à-vis de l’ATPase de la myosine, moteur moléculaire de la contraction (figure 8). Dans le génome humain, 8 gènes codent les troponines exprimées dans le muscle squelettique et le muscle cardiaque. Les gènes TNNI3 et TNNT2 codent respectivement les isoformes cardiaques des troponines I (cTnI) et T (cTnT), présentes uniquement dans le muscle cardiaque chez l’adulte. Le gène TNNC1 code non seulement l’isoforme cardiaque de la TnC mais également une isoforme de la TnC exprimée dans les fibres lentes des muscles squelettiques. De ce fait la cTnC ne peut être utilisée comme marqueur cardiaque. Chez l’adulte la cTnI est composée de 209 acides aminés (dont la séquence des 32 acides aminés sur l’extrémité N-terminale est cardiospécifique) avec une masse

Tropomyosine Actine

TnT

© Lavoisier – La photocopie non autorisée est un délit

Tnl TnC

Complexe des troponines

moléculaire de 24 kDa, et la cTnT de 287 acides aminés avec une masse moléculaire de 37 kDa. La troponine existe sous 2 formes majeures dans les cardiomyocytes : une forme cytosolique libre ou « pool soluble » qui correspond à 3-8 % de la troponine totale et une forme structurale, le complexe lié aux protéines du système contractile (complexe troponine-tropomyosine). Dans le myocarde, les troponines (cTnI et cTnT) peuvent subir plusieurs modifications post-traductionnelles entraînant des modifications de leurs propriétés fonctionnelles. Elles possèdent plusieurs sites de phosphorylation sur des sérines et des thréonines, et peuvent exister in vivo sous formes déphosphorylées ou phosphorylées sous l’action de plusieurs protéines kinases. Enfin, la structure de la cTnI peut être modifiée sous l’influence d’un épisode ischémique, en l’absence de nécrose : plusieurs formes correspondant à différents degrés de protéolyse ont ainsi été identifiées dans le myocarde humain. La partie N-terminale cardiospécifique de la cTnI est particulièrement sensible à cette protéolyse (Capolaghi et al., 2005). ■ Formes circulantes

Toute lésion du myocarde, quelle qu’en soit la cause, pourra entraîner une libération de troponines dans la circulation sanguine. Lors d’une nécrose, le pool soluble des troponines peut être immédiatement libéré dans la circulation. La mort cellulaire induit une diminution du pH intracellulaire et l’activation d’enzymes protéolytiques qui contribuent à la dissociation du complexe des troponines avant leur libération dans la circulation. Les différentes formes circulantes de troponines ont été essentiellement étudiées dans les SCA mais il est actuellement suggéré que les formes libérées pourraient être différentes en fonction de la pathologie considérée. Dans les SCA, la cTnI circulante est majoritairement sous forme binaire : cTnI-cTnC. Une petite proportion de cTnI circule sous forme de complexe ternaire : cTnI-cTnCcTnT (masse moléculaire d’environ 77 kDa). Ces différentes formes peuvent être plus ou moins modifiées par protéolyse, phosphorylation, N-acétylation. De plus, la cTnI possède deux résidus cystéine susceptibles de former un pont disulfure et peut être libérée sous forme réduite et oxydée. La cTnT est libérée majoritairement sous forme libre et sous forme de complexe ternaire cTnI-cTnC-cTnT. Des études suggèrent cependant la présence de produits de dégradation par protéolyse de la cTnT après passage dans la circulation. L’ensemble de ces données sur les formes circulantes de la troponine souligne la complexité du choix des anticorps utilisés dans les trousses de dosage et les difficultés de la standardisation (Apple et al., 2007). ■ Méthodes de dosage

Figure 8

■

Le complexe myofibrillaire.

L’arrivée sur le marché de méthodes de dosage de la troponine cTnI ou cTnT a constitué un progrès majeur dans la détection biochimique des SCA. L’offre industrielle est devenue très large et continue d’évoluer. Un seul fournisseur propose le dosage de la cTnT. En revanche, il existe une grande hétérogénéité du dosage des cTnI, qui est due à la fois au choix des couples ou mélanges d’anticorps utilisés et donc des épitopes reconnus et dans les performances des plateformes analytiques, des calibrants utilisés, et des systèmes de détection utilisés.

197

4557_2_.book Page 198 Mercredi, 17. août 2011 1:48 13

> STDI FrameMaker Couleur

Biochimie médicale – Marqueurs actuels et perspectives

Réponse relative 12 Test 1 Test 2 Test 3 Test 4

10 8 6 4 2 0 I-ox I-red CIT IC-ox IC-red IT-ox IT-red Différences de réponse entre les dosages de cTnl

Figure 9

■ Immunoréactivité des différentes formes circulantes de cTnI (d’après Wu et al., 1998).

Comme recommandé par les sociétés savantes, la plupart des fournisseurs utilise des anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre des épitopes situés dans la partie centrale de la molécule entre les acides aminés 30 et 110, partie la plus stable de la cTnI. Cependant, de nombreuses différences existent en termes de reconnaissance. Les couples d’anticorps ne reconnaissent pas de manière équimolaire les différentes formes circulantes de cTnI quelles soient libres ou complexées expliquant des réponses relatives pouvant aller de 1 à 5 (figure 9). Ces différences intertechniques peuvent être diminuées par l’emploi de calibrant commun. Cette réponse relative peut évoluer en fonction de l’épisode initial, suite aux modifications des formes circulantes. Les résidus 22/23 et 41/43 sont des sites de phosphorylation de la cTnI. La reconnaissance des épitopes situés dans ces zones peut donc être modifiée par ces modifications post-traductionnelles. C’est pourquoi il existe une grande hétérogénéité des résultats et qu’il est si difficile de standardiser ce dosage. Afin d’éclairer le choix des utilisateurs les sociétés savantes françaises et internationales de biologie insistent sur la connaissance des épitopes reconnues par les anticorps des différentes trousses du marché. Différents systèmes analytiques mesurant la troponine en 2010 sont présentés dans le tableau 10. La standardisation de la troponine I est un problème actuellement non résolu. Les étapes de la standardisation nécessitent de définir un « mesurande » cliniquement représentatif. Un étalon international a été défini d’un point de vue chimique, le complexe ternaire I-C-T SRM 2921 mais ce matériau ne se comporte pas en solution comme les échantillons biologiques de TnI, 50 % des méthodes restant non harmonisées après utilisation de ce calibrant. Actuellement, un étalon secondaire est proposé, basé sur un sérum de patient présentant un infarctus et un calibrateur commun proche en composition du NIST 2921. Les tests commerciaux doivent reconnaître une partie commune à toutes les

198

formes possibles de la troponine I : cette équimolarité des différentes formes n’est pas toujours validée. Actuellement, la partie centrale de la molécule (acides aminés 30-41) semble l’épitope retenu pour tous les dosages (Tate, 2010). Le problème de la standardisation de la cTnT se pose de manière moins aiguë puisqu’elle est distribuée par un seul fournisseur. Contrairement aux premières générations de ce dosage, les générations actuelles offrent une bonne sensibilité analytique et la cardiospécificité de la cTnT n’est plus remise en cause notamment en cas d’insuffisance rénale. Les recommandations des sociétés savantes de cardiologie américaines et européennes établissent la troponine comme marqueur de choix dans le diagnostic des SCA. Le seuil diagnostique proposé est la valeur du 99e percentile d’une population de référence, avec une imprécision totale qui doit rester inférieure à 10 % (coefficient de variation analytique inférieur à 10 %). Tout patient suspect de SCA ayant une troponine supérieure à ce seuil est classé parmi les IDM (Alpert et al., 2000 ; Morrow et al., 2007). Cette valeur très basse, est le plus souvent proche voire inférieure à la limite de détection des systèmes analytiques disponibles. La précision du dosage est donc rarement acceptable dans cette zone (Panteghini et al., 2004). Le seuil retenu par défaut est alors la valeur la plus basse ayant un CV inférieur ou égal à 10 %, déterminée à l’aide d’un profil de précision. Les techniques de dosage de la troponine I ou T les plus récentes se caractérisent par une quantification plus précise des formes circulantes, Il n’y a pas actuellement de définition consensuelle des dosages de troponine (dites hypersensible, ultrasensible, de 4e génération, etc.). Ce sont soit des tests déjà commercialisés (TnT hs Roche, TnIc us Siemens) ou en développement (TnI us Beckman, hs TnI Singulex). Les deux caractéristiques communes de ces dosages sont d’une part une imprécision de 10 % ou inférieure à 10 % au seuil décisionnel du 99e percentile, d’autre part une quantification de la troponine chez les sujets sains (Christenson, 2011). Ces tests reconnaissent les mêmes épitopes que les dosages classiques. Seules les conditions d’analyse sont optimisées : augmentation de la prise d’essai, optimisation du signal, réduction du bruit de fond, diminution des interférences immunologiques etc. Les concentrations observées avec les troponines de « haute sensibilité » sont de l’ordre de la dizaine de ng/L, soit 10 à 100 fois moins que les dosages classiques. À ces concentrations, il est possible de mettre en évidence des atteintes cardiaques a minima, plus fréquemment qu’avec les dosages classiques. Ainsi, certains auteurs ont montré qu’avec ces dosages, la troponine augmenterait avec l’âge et qu’il existerait une différence homme femme des valeurs de la troponine chez le sujet sain. Les conséquences de l’utilisation de ces nouveaux dosages sont multiples : diminution des valeurs des seuils, détection plus fréquentes des atteintes cardiaques d’origine ischémique ou non isché