Bacteriologie de L'eau [PDF]

Zitiervorschau

Analyses bactériologiques 1. Introduction : Il est aujourd’hui évident que l’eau est essentielle à bien des égards. Disposer d’une eau potable et évacuer des eaux usées les moins polluées possibles constituent deux problèmes majeurs de l’hygiène urbaine mais aussi de la plupart des industries alimentaires. Les eaux destinées à l’alimentation humaine (boissons, préparation d’aliments etc.) ont des origine diverses (eaux souterraines ou de surface). La flore microbienne présente dans l’eau est très variée et dépend de l’origine de l’eau (eau de captage ou de distribution, eau résiduaire etc.). Parmi les principaux microorganismes susceptibles de se trouver dans l’eau on rencontre essentiellement des germes normalement aquatiques, des germes telluriques et des germes d’origine intestinale : • Les bactéries vivant normalement dans l’eau sont surtout représentées par des bacilles ou des vibrions Gram - (Vibrio, Pseudomonas, Acinetobacter, bactéries sulfato-réductrices ou ferrugineuses, etc...) des bactéries Gram + (Streptomyces, Micrococcus, Corybacterium). Bon nombre des bactéries typiquement aquatiques sont difficiles à cultiver au laboratoire et requièrent des milieux très dilués ne cultivent pas ou peu sur les milieux ordinaires) et ont des températures optimales de croissance de 20°C ou moins. • Les germes telluriques sont surtout représentés par des germes sporulés comme par exemple Clostridium, Bacillus ou des germes des genres Enterobacter ou Streptomyces. • Les germes de contamination intestinale humaine ou animale sont souvent pathogènes (Streptocoques D, entérobactéries dont Salmonella, Clostridium, Vibrio etc...). Ces bactéries ne se multiplient pas dans l’eau “peu chargée” en matières organiques. Ces germes sont “blessés” dans l’eau et leur culture nécessite souvent la revivifivation. En dehors de ces microorganismes on peut signaler la présence éventuelle dans l’eau : • d’algues microscopiques, de protozoaires et d’autres parasites animaux ou humains, des virus (virus de la poliomyélite, hépatite virale, entérovirus, etc.). La présence de microorganismes pathogènes dans l’eau est généralement la résultante d’une contamination de la nappe ou de la rivière ou encore du lac. Une contamination “secondaire” de l’eau de distribution peut intervenir avec des installations détériorées. Ces germes pathogènes sont généralement peu résistants en milieu aqueux et leur survie n’est pas bonne : les problèmes sanitaires qu’ils posent résultent alors de leur présence en nombre limité. 2. Les techniques de numérotation utilisées En microbiologie alimentaire l’intérêt de l’étude à la fois quantitative et qualitative de la flore présente dans un aliment est considérable. Bien que de nombreuses techniques de numération soient utilisables, il n’existe pas à l’heure actuelle de technique parfaite. Certaines méthodes ne permettent pas de différentier les germes vivants des germes morts, d’autres s’avèrent incapables de compter individuellement les cellules microbiennes lorsque celles-ci sont associées (Staphylococcus, Streptococcus , mycélium etc..) et permettent d’évaluer des unités formant colonies (UFC) ou des unités formant trouble (UFT) ou de donner un nombre estimé à partir de la table de Makcrady dans le

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2.1 Technique du nombre le plus probable : NPP La technique du NPP fait appel à la méthode de fermentation en tubes multiples, au cours de laquelle au moins trois dilutions décimales de l'échantillon sont ensemencées dans des éprouvettes de bouillon et incubées à une température précise, pendant une période donnée. La méthode du NPP, dérivée des études de Mac Grady, consiste à interpréter les résultats en comparant les trois essais et leurs résultats. Il s’agit d’une interprétation probabiliste. 2.2 Méthode de filtration sur membrane Cette méthode consiste à faire passer un certain volume d’échantillon ou de ses dilutions au travers d’une membrane filtrante, dont la porosité moyenne est de 0,45 mm à 0,22 μm, sur laquelle sont retenus les microorganismes recherchés. Après filtration, on rince l’entonnoir supérieur avec de l’eau distillée afin de récupérer la totalité des germes et d’éliminer du filtre lui-même d’éventuels agents microbicides. Le filtre est alors posé sur la surface sur un milieu gélosé spécifique du germe à rechercher, face portant les micro-organismes vers le haut. Après incubation, comme dans le cas de la numération en milieu gélosé, on compte les colonies formées à la surface du filtre. 3. Méthodes de recherche et dénombrement des micro-organismes dans l’eau brute et l’eau traité. 3.1 Recherche et dénombrement des germes revivifiables La recherche et le dénombrement des germes revivifiables se réalise à deux températures différentes afin de cibler à la fois les micro-organismes à tendance psychrophiles soit à 20° et ceux franchement mésophiles soit 37°C. A partir de l’eau à analyser, porter aséptiquement 2 fois 1ml dans deux boites de Pétri vides préparées à cet usage et numérotées comme l’indique le schéma n°1. Compléter ensuite chacune des boites avec environ 20 ml de gélose TGEA fondue puis refroidie à 45±1°C. Faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de « 8 » pour permettre à l’inoculum de se mélanger à la gélose, puis laisser solidifier sur paillasse. Incubation :  La première boite sera incubée, couvercle en bas à 20°C,  La seconde sera incubée couvercle en bas à 37°C, pendant 72 heures avec : - première lecture à 24 heures , - deuxième lecture à 48 heures , et - troisième lecture à 72 heures . Lecture : Les germes revivifiables se présentent dans les deux cas sous forme de colonies lenticulaires poussant en masse. Dénombrement : Il s’agit de dénombrer toutes les colonies, en tenant compte deux remarques suivantes : 1. Ne dénombrer que les boites contenant entre 30 et 300 colonies, 2. Le résultat sera exprimé par millilitre d’eau à analyser à 22° et à 37°C.(UFC/ml)

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Recherche et dénombrement des germes revivifiables

Eau à Analyser

1 ml

1ml

Ajouter environ 20 ml de gélose TGEA Laisser solidifier sur paillasse Ajouter une double couche ( 5 ml )

Incuber à 37°C pendant 72 heures

Dénombrer les colonies lenticulaires en masse

Schéma n°1

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2.2 Recherche et dénombrement des Coliformes totaux et fécaux en milieux liquides dans les eaux brutes Les coliformes se présentent sous forme de Bacilles Gram négatifs (BGN), non sporogènes, oxydase négative, aéro-anaérobies facultatifs, capables de croître en présence de sels biliaires et capables de fermenter le lactose avec production d’acides et de gaz, en 24 à 48 heures à 37°C. Les coliformes sont considérés comme indices de contamination fécale.  Technique en milieu liquide de Bouillon Lauryl Sulfate de Tryptose La technique en milieu liquide fait appel à deux tests consécutifs à savoir :  le test de présomption : réservé à la recherche des Coliformes totaux.  le test de confirmation : encore appelé test EC medium et réservé à la recherche des Coliformes fécaux à partir des tubes positifs du test de Présomption.  Test de présomption. A partir de l’eau à analyser, porter aséptiquement :   

3 fois 10 ml dans 3 tubes contenant 10 ml de milieu Bouillon Lauryl Sulfate de Tryptose D/C muni d’une cloche de Durham 3 fois 1 ml dans 3 tubes contenant 10 ml de milieu Bouillon Lauryl Sulfate de Tryptyse S/C muni d’une cloche de Durham 3 fois 0,1 ml dans 3 tubes contenant 10 ml de milieu Bouillon Lauryl Sulfate de Tryptose S/C muni d’une cloche de Durham, comme l’indique le schéma n° 2.

Chassez le gaz présent éventuellement dans les cloches de Durham et bien mélanger le milieu et l’inoculum. Incubation : L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures. Lecture : Sont considérés comme positifs les tubes présentant à la fois :  un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche),  La fermentation du lactose, qui se traduit par l’apparition de gaz dans les cloches de Durham en moins de 48 heures, indique la présence de coliformes. Ces deux caractères étant témoins de la fermentation du lactose dans les conditions opératoires décrites. La lecture finale se fait selon les prescriptions de la table du NPP qui figure en annexe.  Test de confirmation Le test de confirmation ou test de Mackensie est basé sur la recherche de Coliformes, coliformes thermo tolérantes parmi lesquels on redoute surtout la présence d’Escherichia coli. Les coliformes thermotolérants ont les mêmes propriétés de fermentation que les coliformes mais à 44°C. Escherichia coli est un coliforme thermo tolérante qui entre autre :

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produit de l’indole à partir du tryptophane à 44°C, donne un résultat positif à l’essai au rouge de méthyl, ne produit pas de l’acéthyl méthyl carbinol, n’utilise pas le citrate comme source unique de carbone.

Pour les coliformes totaux le test de confirmation est effectué en milieu vert brillant : Le bouillon lactosé bilié au vert brillant est utilisé pour les recherche et dénombrement des coliformes, des coliformes thermotolérants et d’Escherichia coli (Test de Mackenzie) dans les eaux d’alimentation. La fermentation du lactose, qui se traduit par l’apparition de gaz dans les cloches de Durham) en moins de 48 heures, indique la présence de coliformes. Les tubes de milieu Bouillon Lauryl Sulfate de Tryptose trouvés positifs lors du dénombrement des Coliformes totaux feront l’objet d’un repiquage à l’aide d’une anse bouclée dans tube contenant le milieu EC medium muni d’une cloche de Durham, et aussi dans un tube contenant le BLBVB comme l’indique le schéma n°3. Chasser le gaz présent éventuellement dans les Cloches de Durham et bien mélanger le milieu et l’inoculum. Incubation : L’incubation se fait cette fois-ci au bain marie à 44°C pendant 24 heures, pour les coliformes fécaux et à 37°C pendant 48 heures pour les coliformes totaux. Lecture : Sont considérés comme positifs, les tubes présentant à la fois :  un dégagement gazeux, et  un anneau rouge en surface, témoin de la production d’indole par Escherichia Coli après adjonction de 2 à 3 gouttes du réactif de Kowacs. La lecture finale s’effectue également selon les prescriptions de la table du NPP en tenant compte du fait qu’Escherichia Coli est à la fois producteur de gaz et d’indole à 44°C .

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Colimétrie en milieu liquide : Test de présomption

Eau à Analyser

3 X10 ml

3 X 1 ml

BLST D/C

BLST D/C

3 X 0,1ml

BLST S/C

37°C, 24 à 48 heures

+

+ 3

+

+

+ 2

-

-

-

-

0

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Colimétrie : Test de confirmation

Ensemencement des tubes positifs Repiquage sur milieu EC medium pour Coliformes fécaux

+

-

1

Repiquage sur milieu BLBVB Coliformes totaux

+

-

1

Même chose : Dénombrement des tubes positifs (troubles+ gaz)

Lecture sur la table de Mac craddy NPP/100ml

Schéma n°3

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2.3 Recherche et dénombrement des bactéries coliformes et d’E coli dans les eaux traitées La colimétrie par filtration est une méthode rapide, simple, normalisée mais nécessitant la disponibilité d’une rampe de filtration.   

Tout d’abord, il faudrait stériliser un entonnoir à l’aide d’un bec bunsen. Le refroidir soit avec l’eau à analyser ou bien avec de l’eau distillée stérile. Mettre en place de façon aseptique une membrane de 0,45 µ entre la membrane poreuse et l’entonnoir à l’aide d’une pince stérile.  Fixer ce dernier avec la pince correspondante.  Test présomptif : Recherche des bactéries coliformes    

Remplir de façon aseptique l’entonnoir avec 100 ml d’eau à analyser. Actionner la pompe à vide pour permettre le passage de l’eau à travers la membrane. Retirer ensuite la membrane à l’aide d’une pince stérile et la placer dans une boite de Pétri de 45 mm de diamètre contenant de la gélose TTC. Cette membrane sera incubée à 37°C, pendant 24 heures et servira à la recherche des bactéries coliformes.

Recherche d’E coli.    

Remplir par la suite l’entonnoir avec 100 ml d’eau à analyser. Actionner de la même façon la pompe à vide pour permettre le passage de l’eau à travers la membrane. Retirer ensuite la membrane à l’aide d’une pince stérile et la placer dans une boite de Pétri de 45 mm de diamètre contenant de la gélose TTC. Cette deuxième membrane sera incubée à 44°C, pendant 24 heures et servira à la recherche d’E. coli.

Lecture et interprétation    

Après 24 heures d’incubation, les bactéries coliformes et E coli apparaissent sous forme de petites colonies jaunes ou orangées, lisses, légèrement bombées. Etant donné le caractère sélectif de la gélose TTC ; ne pousseront théoriquement que les coliformes. Ne dénombrer que les boites refermant entre 30 et 300 colonies. Le nombre de colonies trouvées sera exprimé dans 100 ml d’eau à analyser.

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Colimétrie par filtration : Test de présomption

Filtration de 100 ml d’eau Eau à Analyser

Entonnoir Membrane 0,45µ Rampe de filtration à 3 postes

Pompe

37°C

44°C

24 heures

Colonies typiques et les colonies atypiques Après 24 heures d’incubation : - à 37°C, en ce qui concerne la recherche des bactéries coliformes, - à 44°C, en ce qui concerne la recherche d’E. coli. Procéder au dénombrement de toutes les colonies typiques (jaunes avec halo jaune) et les colonies atypiques (différentes couleurs morphologiques) et rapporter ce nombre à 100 ml d’eau à analyser.  Test confirmatif Isolement sur milieu TSA Après dénombrement des colonies caractéristiques, on procèdeà un isolement sur la gélose TSA, qui est un milieu riche permettant le développement de la plupart des micro-organismes susceptibles d’être rencontrés dans un aliment. Sa formule comprend une peptone riche en

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acide aminés libres et de l’extrait de levure. L’association de ces 2 constituants fournie au milieu de nombreux facteurs de croissance. Incubation L’incubation se fait à 37°C pendant 12 heures. Pour Ecoli  Ensemencement sur eau peptonnée exempte d’indole L’eau peptonée exempte d’indole permet la culture des germes ne présentant pas d’exigences particulières. Ce milieu est surtout employé au cours du test de Mackenzie pour l’i dentification d’Escherichia coli par la production d’indole.  Incubation L’incubation se fait cette fois-ci au bain marie à 44°C pendant 21 heures.  Lecture Après incubation des tubes inoculés, la présence d’indole est indiquée par l’apparition d’une couleur rouge dans la phase alcoolique du réactif de Kovacs, ajouté à raison de 0,5 ml par tube. Pour les bactéries coliformes :  Etalement d’une aliquote de la culture sur un papier filtre imbibé de 2 gouttes du réactif à l’oxydase.  L’appariation d’une coloration bleue/violet foncée dans les 30 secondes indique une réaction positive,  les colonies suspectes ne présentent pas cette coloration car elles sont oxydase-.

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Colimétrie par filtration : Test confirmatif

Colonies typiques et les colonies atypiques

Isolement sur milieu TSA Et incubation à 37°C/24 heures

Pour E coli :

Pour les bactéries coliformes : Etalement d’une partie de la culture sur un papier imprégné avec 2 gouttes du réactif de l’oxydase

Ensemencement sur eau peptonée exempte d’indole Incubation à 44°C/24heurs

Réaction de Kovacs

Coloration rouge è la surface de l’eau Confirme la présence d’E coli

l’absence d’une coloration bleu/violet Confirme la présence des bactéries Coliformes. Nombre de colonies confirmés en UFC/100 ml

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2.4 Recherche et dénombrement des Streptocoques fécaux en milieux liquides dans les eaux brutes Les Streptocoques fécaux ou Streptocoques du groupe D de la classification de Lancefield , se présentent sous forme de coccie à Gram + , shériques à ovoïdes formant des chaînettes , ne possédant pas de catalase mais possédant l’antigène du groupe D. Ils sont capables de se développer en 24 à 48 heures à 37°C sur un milieu sélectif à l’azoture de sodium en donnant des colonies caractéristiques réduisant le TTC et qui de plus hydrolysent l’esculine en 48 heures à 44°C après repiquage d’une colonie sur une gélose biliée à l’esculine. Leur recherche et leur dénombrement peut se faire de la même manière que pour les coliformes, c’est à dire à l’aide de deux méthodes distinctes selon la disponibilité ou non d’une rampe de filtration et seuls les milieux de culture changent. Méthode de recherche en milieu liquide Tout comme la méthode de recherche des coliformes en milieu liquide, celle de la recherche et le dénombrement des Streptocoques fécaux fait appel à deux tests consécutifs à savoir :  le test de présomption  le test de confirmation : réservé à la confirmation réelle des Streptocoques fécaux à partir des tubes positifs du test de présomption .  Test de présomption . A partir de l’eau à analyser, porter aséptiquement :   

10 ml dans un flacon contenant 10 ml de milieu ROTHE D/C, 3 fois 1 ml dans 3 tubes contenant 10 ml de milieu ROTHE S/C, 3 fois 0,1 ml dans 3 tubes contenant 10 ml de milieu ROTHE S/C, comme l’indique le schéma n° 5.

Bien mélanger le milieu et l’inoculum . Incubation : L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures . Lecture : Sont considérés comme positifs les tubes présentant un trouble microbien, seulement ces derniers : - ne doivent en aucun cas faire l’objet de dénombrement - doivent par contre, absolument faire l’objet d’un repiquage sur milieu LITSKY EVA dans le but d’être confirmés.

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 Test de confirmation . Le test de confirmation est basé sur la confirmation des Streptocoques fécaux éventuellement présents dans le test de présomption. Les tubes de ROTHE trouvés positifs feront donc l’objet d’un repiquage à l’aide d’une öse bouclée dans tube contenant le milieu LITSKY EVA, comme l’indique le schéma n°6. Bien mélanger le milieu et l’inoculum . Incubation : L’incubation se fait cette fois-ci à 37°C, pendant 24 heures . Lecture : Sont considérés comme positifs , les tubes présentant à la fois :  un trouble microbien, et  une pastille violette (blanchâtre) au fond des tubes. La lecture finale s’effectue également selon les prescriptions de la table du NPP qui figure en annexe.

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Streptométrie : Test de présomption

Eau à Analyser

3 X 10 ml

ROTHE D/C

3 X 1 ml

ROTHE S/C

3 X 0,1 ml

ROTHE S/C

37°C, 24 à 48 heures

Schéma n°5.

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Streptométrie : Test de confirmation

Repiquage sur milieu Eva -litsky

Repiquage sur milieu Eva-litsky

37°C , 24 heures

+

+ 2

-

+ 1

0

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Schéma n°6

2.5 Recherche et dénombrement des entérocoques intestinaux dans les eaux traitées La streptométrie par filtration est tout comme la colimétrie par filtration une méthode rapide, simple, normalisée mais nécessitant la disponibilité d’une rampe de filtration. 

 Test de présomption Tout d’abord, il faudrait stériliser un entonnoir à l’aide d’un bec bunsen.



Le refroidir soit avec l’eau à analyser ou bien avec de l’eau distillée stérile.



Mettre en place de façon aseptique une membrane de 0,45 µ entre la membrane poreuse et l’entonnoir à l’aide d’une pince stérile.



Fixer ce dernier avec la pince correspondante.



Remplir de façon aseptique l’entonnoir avec 100 ml d’eau à analyser.



Actionner la pompe à vide pour permettre le passage de l’eau à travers la membrane.



Retirer ensuite la membrane à l’aide d’une pince stérile et la placer dans une boite de Pétri de 45 mm de diamètre contenant de la gélose SLANETZ et BARTLEY.



Cette membrane sera incubée à 37°C, pendant 24 heures.

Lecture et interprétation 

Après 24 heures d’incubation, les streptocoques fécaux apparaissent sous forme de petites colonies rouges, marron ou roses, lisses, légèrement bombées.



Etant donné le caractère sélectif de la gélose SLANETZ ; ne pousseront théoriquement que les streptocoques fécaux.



Ne dénombrer que les boites refermant entre 15 et 300 colonies.



Le nombre de colonies trouvées sera exprimé dans 100 ml d’eau à analyser.

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Streptométrie par filtration : Test de présomption

Filtration de 100 ml d’eau Eau à Analyser

Entonnoir Membrane 0,45µ Rampe de filtration à 3 postes

Pompe

37°C, 24 heures

Colonies rouge, marron ou roses Schéma n°7

 Test de confirmation. Le test de confirmation est basé sur la confirmation des entérocoques intestinaux éventuellement présents dans le test de présomption. S’il y a des colonies typiques sur les membranes utilisées pour le dénombrement de la gélose de Slanetz et Bartley, transférer celles-ci avec les colonies sur des boîtes de milieu BEA, préchauffé à 44°C. Incubation :

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L’incubation se fait cette fois-ci à 44°C, pendant 2 heures. Lecture : Considérer comme positives, toutes les colonies donnant une couleur brune à noire dans le milieu. Les compter comme entérocoques intestinaux, et rapporter le total des colonies à 100 ml d’eau à analyser (Nombre de colonies typiques confirmées en/100ml)

Streptométrie par filtration : Test de présomption

Colonies typiques

Transfert de la membrane sur boite contenant le milieu BEA

Incubation à 44°C/2 heure Dénombrement des colonies noir brun

Nombre de colonies confirmés en UFC/100 ml

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2.6 Recherche et dénombrement des spores d’Anaérobies Sulfito-Réducteurs Les anaérobies sulfito-réducteurs (ASR) se présentent sous forme de bactéries Gram +, se développant en 24 à 48 heures sur une gélose Viande Foie en donnant des colonies typiques réduisant le sulfite de sodium (Na2SO3) qui se trouve dans le milieu, en sulfure qui en présence de Fe2+ donne FeS (sulfure de fer ) de couleur noire. Les spores des ASR constituent généralement des indices de contamination ancienne. A partir de l’eau à analyser :        

prendre environ 25 ml dans un tube stérile, qui sera par la suite soumis à un chauffage de l’ordre de 80°C pendant 8 à 10 minutes, dans le but de détruire toutes les formes végétatives des ASR éventuellement présentes. Après chauffage, refroidir immédiatement le tube en question, sous l’eau de robinet. Mettre en place de façon aseptique une membrane de 0,2 µ entre la membrane poreuse et l’entonnoir à l’aide d’une pince stérile. Fixer ce dernier avec la pince correspondante. Remplir de façon aseptique l’entonnoir avec 100 ml d’eau à analyser. Actionner la pompe à vide pour permettre le passage de l’eau à travers la membrane. Retirer ensuite la membrane à l’aide d’une pince stérile et la placer renversée dans une boite de Pétri de 45 mm de diamètre. Verser sur la membrane 18 ml du milieu liquéfié entier (avec supplément Dcyclosérine) préalablement refroidie à 50°C.

Lecture :  Les entérocoques se présentent sous forme de petites colonies translucides entourées d’un halo noir. Les staphylocoques et les levures peuvent donner des colonies opaques sans halo noir. Il est indispensable d’identifier les microorganismes suspects, notamment pour écarter toute confusion avec les Listeria qui peuvent donner des colonies similaires à celles des entérocoques.  Dénombrer toute colonie noire de 0,5 mm de diamètre, poussant en masse. Interprétation des résultats . Il est donc impératif de repérer et de dénombrer toutes les colonies noires poussant en masse et de rapporter le total des colonies à 20 ml d’eau à analyser. N = UFC/100ml = nombre de colonies dénombrées et confirméesx100 Volume de l’échantillon analysé en ml

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CSR Par filtration

Chauffage à 80°C, 10 minutes au bain marie. Refroidissement brutal sous l’eau de robinet Puis Filtration de 100 ml d’eau Eau à Analyser

Entonnoir Membrane 0,2µ Rampe de filtration à 3 postes

Pompe

Placer la membrane renversée dans une boite de pétri stérile Ajouter environ 15 ml de gélose BEA fondue puis refroidie à 45  1°C Laisser solidifier puis incuber à 37°C, pendant 24 heures et 48 heures

Clostridium Sulfito-reducteurs

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