Annick ROUESSAC, Francis ROUESSAC - Techniques Instrumentales D'analyse Chimique en 23 Fiches (2011) [PDF]

Zitiervorschau

30/04/2019

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Francis ROUESSAC Professeur honoraire à l’IUT du Mans

Techniques instrumentales d’analyse chimique en 23 fiches

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© Dunod, Paris, 2011 ISBN 978-2-10-056616-7

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Avant-propos Fiche 1 Fiche 2 Fiche 3 Fiche 4 Fiche 5 Fiche 6 Fiche 7 Fiche 8 Fiche 9 Fiche 10 Fiche 11 Fiche 12 Fiche 13 Fiche 14 Fiche 15 Fiche 16 Fiche 17 Fiche 18 Fiche 19 Fiche 20 Fiche 21 Fiche 22 Fiche 23

IV

Chromatographie– Généralités Chromatographie enphase liquide (CLHP) Chromatographie enphase gazeuse (CPG) Chromatographie d’exclusion stérique Chromatographie – Analysequantitative Chromatographie surcouche mince (CCM) Électrophorèse capillaire Spectrométrie del’UV‑Visible et du trèsproche infrarouge Analyses dans l’UV etdosages colorimétriques Spectrométrie infrarouge Infrarouge – Applicationsqualitatives Infrarouge quantitatif Fluorimétrie et chimiluminescence Fluorescence X Spectrométrie d’absorption atomique Spectrométrie d’émissionatomique Photométrie de amme Spectrométrie demasse –Partie1 Spectrométrie de masse – Partie2 Spectrométrie de masse –Partie3 Méthodes par marquageradioactif Dosages potentiométriques Analyseurs spéciques

1 8 16 24 30 36 41 49 55 62 66 74 80 87 94 101 108 114 121 127 134 140 146

Quelques constantes physico-chimiques

152

Index

153

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A B C D E F G H I K L M N O P R S T V W

Ta b l e d e s m a t i è r e s

III

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L’analyse chimique correspond à un domaine très vaste qui englobe un ensemble de techniques et de méthodes pour déterminer la nature et la compo‑ sition, voire la structure d’échantillons variés. On la rencontre dans de nombreux secteurs qui vont des plus traditionnels comme ceux de la chimie ou de la parachimie, aux secteurs de la biochimie, de l’agroalimentaire, du diagnostic médical, de l’environ‑ nement ou de la sécurité (police scientique, fraudes…). Pour en faire une sorte de panorama représentatif, à défaut d’être exhaustif, les auteurs ont développé dans ce livre 23 ches de 6 à 8 pages. Chacune a pour thème une méthode importante, abondamment utilisée en analyse chimique. Dans ce but, la che se com‑ pose de quelques lignes sur l’objectif de la méthode décrite puis d’un rappel des points essentiels agrémentés d’exercices d’application ou d’exemples de dosages, suivis de leurs corrections détaillées. Le niveau mathématique requis rend le contenu accessible aux étudiants de premier cycle universitaire, des IUT ou des BTS. Il va de soi que les calculs d’analyse demandés dans les exercices n’ont qu’un but pédagogique, les ins‑ truments actuels comportant presque toujours les outils informatiques qui dispensent l’opérateur de ces tâches. Ce livre constitue un complément de l’ouvrage des auteurs sur , publié chez le même éditeur. Annick Rouessac Francis Rouessac Le Mans, Février 2011

IV

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La chromatographie est une méthode qui permet de séparer les constituants d’un mélange en phase homogène liquide ou gazeux. Elle tient une place très importante en analyse chimique pour identier et quantier, même à l’état de traces, toutes sortes de composés présents dans des échantillons les plus divers. Son champ d’application s’étend aussi aux échantillons à l’état solide ou hétérogènes à condition de disposer d’un solvant pour les mettre sous forme d’une solution homogène.

Le principe de la chromatographie consiste à entraîner l’échantillon à l’aide d’un éluant (gazeux ou liquide) appelé ici phase mobile (PM), qui se déplace au contact d’une seconde phase xée sur un support (colonne ou surface plane). Celle‑ci, dite station‑ naire (PS), est insoluble dans la première. Si les différents composés de l’échantillon (les solutés) présentent des afnités différentes pour le couple PM/PS, ils vont être plus ou moins ralentis dans leur progression par la phase stationnaire. Sous l’effet anta‑ goniste des forces de rétention soluté/PS et des forces d’entraînement soluté/PM, ces composés vont pouvoir être recueillis séparément à l’issue de cette migration (chacun en solution dans la PM utilisée). Chaque composé est caractérisé par son coefcient de distribution de Nernst (appelé également coefcient de partition) déni comme suit:

Ce paramètre quantie le rapport de concentration de chaque composé entre les deux phases en présence. Plus sa valeur est élevée, plus le soluté est retenu. dépend de la température et de trois forces d’interaction: PS/soluté, PM/soluté et PM/PS.



1–Chromatographie – Généralités

1

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Tous les instruments, appelés chromatographes, comportent une colonne renfermant la phase stationnaire ainsi qu’un détecteur situé en aval pour repérer les changements de composition de la phase mobile au cours de son élution. À chaque séparation correspond un enregistrement appelé . Le passage de chaque composé au niveau du détecteur se traduit par un pic sur cet enre‑ gistrement. Sur la gure1.1, la courbe de gauche correspond à une image isochrone de la concentration d’un composé en cours de migration sur la colonne et la courbe de droite au chromatogramme correspondant, lorsque le composé a traversé la colonne puis le détecteur. Cette courbe est tracée en fonction du temps ( R représente le temps de rétention du composé).

Les chromatographes actuels permettent de contrôler de manière très précise tous les paramètres pouvant inuer sur la migration (température, débits, composition des phases mobile et stationnaire). On atteint ainsi une parfaite reproductibilité des temps de migration pour un soluté donné au cours d’analyses successives même s’il est présent dans des échantillons différents. De ce fait, la chromatographie est devenue en soi une méthode d’analyse en se basant uniquement sur pour les identier. L’identication d’un composé se fait par comparaison de son temps de rétention avec celui d’un composé authentique étudié dans les mêmes conditions. Cette méthode comporte néanmoins une part aléatoire, l’identication à partir du seul chromatogramme n’étant pas absolue. Aussi, la pratique actuelle consiste à choisir un détecteur permettant de recueillir des informations complémentaires sur le composé

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1 élué. On regagne ainsi, outre le temps de rétention, des informations indépendantes (données spectrales caractéristiques par exemple) qui vont permettre de déterminer avec certitude la nature et la composition de mélanges complexes, à partir de quantités qui, souvent, ne dépassent pas quelques nanogrammes (analyses de conrmation).

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Un pic d’élution idéal a le même aspect que la représentation graphique de la courbe de Gauss. En chromatographie, désigne la largeur à mi‑hauteur ( = 2,35 ) et 2 la variance du pic. La largeur dite «à la base» du pic, , est mesurée à 13,5% de la hau‑ teur, point où, la courbe étant gaussienne, on a = 4 par dénition (gure1.2). L’aire ainsi délimitée correspond à 95,4% de l’aire du pic.

La fonction «densité de probabilité»

permet de modéliser un

pic d’élution parfait; retrouver les valeurs numériques reportées sur la gure1.2.

Si

=0, on trouve =0,399.

Pour



=+ou –1,

est calculé à l’ordonnée du point d’inexion. . Pour =2, on trouvera =0,054.

1–Chromatographie – Généralités

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, largeur du pic à mi‑hauteur, correspond donc à dans l’expression

=0,1995. On doit donc trouver

ce qui donne

= 1,177. Par suite

Pour dénir chaque composé et comparer les performances des colonnes ou des sépa‑ rations, on utilise divers paramètres en plus des temps de rétention R: • Efcacité : correspond au de la colonne en rappel du modèle de la théorie des plateaux. Il s’agit d’un paramètre relatif qui dépend du composé et des conditions opératoires.

• La hauteur équivalente à un plateau théorique (ou HEPT): pour une colonne de longueur , elle vaut / • Volume d’élution (ou de rétention) R : désigne le volume de phase mobile néces‑ saire pour faire migrer le soluté choisi d’une extrémité à l’autre de la colonne. • Volume mort M: correspond au volume de phase mobile dans la colonne (volume interstitiel accessible aux composés chromatographiés). • Volume de phase stationnaire S : volume occupé, dans la colonne, par la phase stationnaire. • Rapport de phase : rapport entre le volume mort de la colonne et le volume de phase stationnaire. Caractéristique essentielle de toute colonne.

• Facteur de rétention (ou de ) : correspond au rapport de la quantité xée ( S ) sur la phase stationnaire et de celle restée dans la phase mobile ( M). Ce para‑ mètre rend compte de la capacité plus ou moins grande de la colonne à retenir un soluté. Il correspond également au rapport des temps passés dans ces deux phases, S (pour PS) et M(pour PM):

sachant que globalement

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(encore appelé «temps réduit»)

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ou encore • Sélectivité : correspond au rapport des facteurs de rétention de la colonne à séparer deux composés.  est toujours >1.

Précise l’aptitude

• Facteur de résolution : traduit la plus ou moins bonne séparation entre deux composés. On peut y accéder à partir du chromatogramme.

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À partir du chromatogramme de la gure1.3, calculer pour les composés 1 et 2 à l’origine des pics correspondants: 1. le volume mort de la colonne et les volumes de rétention, 2. les facteurs de rétention, le facteur de sélectivité, 3. la hauteur d’un plateau théorique pour le composé 2 et le facteur de résolution entre les composés 1 et 2. 4. écrire la relation qui lie aux facteurs de distribution 1 et 2 de 1 et 2

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1–Chromatographie – Généralités

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1. Pour déterminer le volume mort, on considérera que le premier pic, à 4 min, corres‑ pond à un composé non retenu. . Connaissant le débit de phase mobile délivré par l’appareil (1 mL min–1), le volume mort est donc de 4mL. Les temps de rétention des composés 1 (16,3 min) et 2, (20 min) conduisent par appli‑ cation de , à 16,3mL et 20mL. 2. Par application de la relation conduisant au facteur de capacité, la lecture du chroma‑ et

togramme conduit à:

Le facteur de sélectivité entre les deux composés est de

3. Le calcul de l’HEPT ( ), impose de connaître l’efcacité (2) de la colonne pour le composé 2. Pour ce calcul, la largeur à mi‑hauteur et le temps de rétention R(2) doivent être exprimés dans la même unité. En s’aidant, ici, d’un double‑décimètre, on trouve mm. On a donc: mm. Avec cette même unité plateaux théoriques. Par suite, mm, soit 46µm. Pour le calcul de la résolution , il faut pouvoir évaluer les largeurs «à la base» des pics (soit 1 et 2). La mesure n’étant pas toujours précise, on transformera la formule classique an de faire apparaître la largeur à mi‑hauteur . Sachant que

, on peut écrire:

En prenant 5mm comme valeur commune pour les largeurs à mi‑hauteur des pics 1 et 2, on a: Lorsque >1,5, on considère que la séparation est totale. 4. En faisant apparaître masses et volumes dans l’écriture de , on a:

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par suite pour les deux composés, le rapport

M / S étant

le même,

Pour faire apparaître les principaux facteurs qui inuent sur le facteur de résolution ou utilise souvent l’expression approchée suivante:

Retrouver cette relation en admettant que

1

=

2.

Si la relation de base donnant se simplie. Sachant que le numérateur devientégal à D’autre part, l’expression donnant l’efcacité donc

ou bien on aboutit à la relation cherchée.

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enn sachant que

peut s’écrire

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Les techniques chromatographiques faisant appel à une phase mobile liquide sont parmi les plus nombreuses. Parmi celles‑ci gure la CLHP qui recouvre un large champ d’applications. Tant par le choix des phases en présence que par la conduite des opérations, cette technique permet d’agir de manière très ne sur les facteurs de sélec‑ tivité dans le but d’améliorer les séparations.

La chromatographie liquide haute performance (CLHP — HPLC en anglais) est, en analyse, l’aboutissement de la chromatographie classique sur colonne dont les perfor‑ mances se sont trouvées grandement améliorées par: • la miniaturisation, rendue possible par les progrès technologiques; • la mise au point de nombreuses phases stationnaires. Celles‑ci permettent de réaliser des colonnes garnies très compactes, mais imposent l’emploi de pompes hautes pression pour assurer un débit sufsant de la phase mobile dans la colonne; • l’usage de colonnes de petits diamètres internes – moins de 1mm ( ou CLHP), ce qui permet d’économiser les quantités de phase mobile nécessaires aux séparations. comporte plusieurs modules spécialisés (pompes, injecteur, colonne, détecteur), reliés entre eux par l’intermédiaire de cana‑ lisations de très faible diamètre et qui apparaissent soit séparés, soit intégrés dans un même châssis (gure2.1). L’injecteur est conçu autour d’une vanne à boucle pour permettre l’introduction de l’échantillon sous très forte pression. Le détecteur est choisi en fonction des applications projetées. Ce peut être un réfractomètre différen‑ tiel ou un spectrophotomètre (UV, IR, Fluorimètre) ou encore un spectromètre de masse.

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2 La température de la colonne est un facteur important de la séparation. Elle intervient dans l’expression de la constante de l’équilibre que l’on exprime par: / Comme

varie dans le même sens que , on écrit également /

Quand on augmente la température, on réunit divers avantages:

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• la viscosité de la PM diminue, donc la perte de charge dans la colonne; • le temps d’analyse diminue ainsi que l’asymétrie des pics; • un gradient de température permet de remplacer un gradient de solvant (PM).

On dispose de deux colonnes de même longueur, de même taux de remplissage ( S/ M ) et contenant la même phase stationnaire. L’une (A) a un diamètre interne de 4,6mm et l’autre (B) est un capillaire pour lequel =300µm. On décide de les utiliser avec le même chromatographe et dans des conditions identiques. 1. Sachant que le débit conseillé pour la colonne A, est de 1mL min–1 , calculer la valeur de ce débit pour obtenir avec la colonne B, la même vitesse linéaire de phase mobile. 2. Quand on passe de A à B, le volume de rétention (ou d’élution) d’un même com‑ posé est‑il modié ? 3. Si la sensibilité du détecteur n’a pas été modiée entre les deux expériences, les intensités des pics correspondants seront‑elles différentes ?

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1. Pour assurer la même vitesse linéaire, il faut que les débits soient dans le même rapport que celui des sections des deux colonnes (de la forme ). On a: et

soit

Le débit dans la colonne B sera de 1/235 =0,004mL min–1 (soit 4µL min–1). 2. Oui, il est dans le rapport précédent. Pour la colonne B, la quantité de phase mobile nécessaire sera 235 fois moins importante. Par exemple, pour un composé élué en 12 minutes, il faudra 12mL pour Aet 48µL seulement (1 goutte) pour B. 3. Si la quantité injectée est la même, le signal détecté sera 235 fois plus intense avec la colonne B, le composé étant moins dilué dans la phase mobile.

Les matériaux à usage de phases stationnaires se présentent sous forme soit de micro‑ sphères mono‑disperse (diamètre de 1 à 12µm) soit de solides poreux de type monolithe. Ils comportent des (quelques µm) permettant à la PM de circuler et des (quelquesnm) qui créent la grande surface de contact (plusieurs centaines de m2 par gramme) an de favoriser les mécanismes de partition avec les solutés. Les colonnes monolithes, macroporeuses, sont plus perméables que celles obtenues par tassement des particules sphériques. Dans l’élaboration des phases stationnaires actuelles, le gel de silice continue à tenir une place prépondérante en tant que matériau précurseur de beaucoup d’entre elles. est un solide amorphe ayant pour formule de composition SiO2(H2 O)n (avec n très proche de 0). Il est tout à fait différent de la silice natu‑ relle cristalline (SiO2 ) qui sert à le fabriquer. C’est un polymère inorganique réticulé, porteur de groupements silanols (Si–OH), responsables des propriétés catalytiques acides de ce matériau très polaire (Si–OH a un pK de 10, comme le phénol par ex.). Ses propriétés dépendent de nombreux paramètres : , (dimension et répartition des pores), , et . Les gels de silice courants comportent quelques groupes silanols par nm 2. Le mécanisme d’action du gel de silice repose sur (gure2.2), phéno‑ mène qui consiste en l’accumulation d’un composé à l’interface entre deux phases à la différence de l’ .

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Le gel de silice ainsi décrit permet un certain nombre d’applications en , mais il présente une polarité jugée excessive pour de nombreuses séparations. Pour la diminuer, on le rend essentiellement hydrophobe en mettant à prot la réactivité des fonctions silanols pour greffer, par des liaisons covalentes, des molé‑ cules organiques à la polarité choisie. La surface du gel de silice devient assimilable à un liquide immobilisé si bien que la séparation met en jeu les et non plus les . Les applications de la à polarité de phase inversée (par rapport au gel de silice initial) sont très nombreuses. Les gels de silice greffés sont soit polyvalents (Phase RP‑8, RP‑18, aux greffons alkyles), soit adaptés à des familles de composés (greffons nitrile, cyanopropyle, aminopropyle, benzyle ou encore cyclodextrines et polysaccharides pour séparer les composés chiraux).

Un gel de silice pour chromatographie a une surface spécique de 370m2 g–1. Pour évaluer le nombre moyen de groupes silanols accessibles par nm2 , on prélève 0,2g de gel de silice que l’on met en présence d’un excès de méthyllithium (CH 3Li), dans un montage approprié. On recueille 12,5mL de méthane (cond. norm. de et ). Calculer la concentration moyenne des groupes silanols résiduels par nm2 .

Au cours de ce traitement les fonctions silanols en surface du gel de silice génèrent du méthane selon la réaction Gel–SiOH+CH3 Li Gel–SiOLi+CH4 12,5mL de méthane (issus de 0,2g de gel de silice, donc 74m2) correspondent pour 1m2 à mole, et pour 1nm2 , soit une surface 1018 fois moindre, à: mole. Compte tenu du nombre d’Avogadro, le nombre moyen de silanols est donc de par nm2 .

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2  –  C h r o m a t o g r a p h i e e n p h a s e l i q u i d e (C L H P

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Lors du greffage des gels de silice, il subsiste environ 1 ou 2 groupes silanols non transformés. Ils sont éliminés dans une étape complé‑ mentaire dite de « » au moyen de réactifs particuliers.

Les chromatogrammes A et B de la gure2.3 correspondent à la séparation d’un mélange avec une colonne de polarité de phase inversée, réalisée à deux pH diffé‑ rents (pH=3 et pH=8). La phase mobile est un mélange méthanol/eau 20: 80 au pH tamponné. Lequel de ces chromatogrammes a été obtenu à pH 3?

Le mélange étudié comporte un composé très polaire (l’uracile), deux composés basiques (les deux amines) et un acide faible (le phénol). Selon le pH et les pKA ou pK B de ces composés, ils seront sous forme ionisée ou non, comme le rappelle la rela‑ tion . On voit que le pH n’a pas beaucoup d’inuence sur l’uracile, espèce neutre, qui reste dans la phase mobile. Par contre, pour la benzylamine (pKA=4,7), la forme protonée sera prépondérante à pH3, et sera donc vite entraînée par la phase mobile polaire. L’effet se manifeste aussi sur la diméthylbenzylamine. L’effet du pH est opposé pour le phénol, acide faible (pKA=10), dont l’espèce non ioni‑ sée, plus retenue, est la seule à pH=3. La comparaison des chromatogrammes permet d’afrmer que A a été obtenu à pH =3.

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2 En chromatographie en phase normale (phase stationnaire polaire), on choisit une phase mobile peu polaire. Inversement avec une phase inversée peu polaire («RP‑HPLC») la phase mobile (polaire) est le plus souvent constituée d’un mélange d’eau et d’un modiant tel le méthanol ou l’acétonitrile. En changeant sa composition et en ajoutant des additifs (ex. acide triuoroacétique) pour améliorer la résolution des composés non‑neutres, on modie les coefcients de partage, donc les facteurs de rétention des composés. Avec une phase stationnaire peu polaire de type RP: • l’ordre d’élution est opposé à celui obtenu avec les phases stationnaires polaire; • les composés peu polaires migrent d’autant plus lentement que l’éluant est polaire; • en additionnant à la phase mobile un sélecteur chiral, ou en choisissant une phase stationnaire chirale (PSC), il est possible de séparer les énantiomères; • les composés polaires sont peu retenus sur les phases de type RP, donc difciles à séparer entre eux. Pour y parvenir, on réalise des gradients d’élution particuliers (voir exercice page 15).

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Pour améliorer la séparation des composés porteurs de charges sur colonne de type RP, on ajoute à l’éluant un réactif de charge opposée; expliquer pourquoi.

Le but est de neutraliser la charge portée par les analytes et de favoriser leur réten‑ tion sur la colonne pour ralentir leur migration et donc d’accroître la résolution. Deux familles de réactifs sont disponibles: • pour les anions, une amine quaternaire avec une longue chaîne alkyle; • pour les cations, un groupement sulfonique avec également une chaîne alkyle. Le réactif ajouté sert de contre‑ion et se lie aux analytes de forme ionique opposée. Il se crée ainsi une espèce globalement moins polaire dont la migration est ralentie par la présence de la chaîne alkyle.

Un composé pur possédant 1 seul carbone asymétrique conduit avec une colonne chirale au chromatogramme A (gure2.4). Un second composé (métolachlore pur), à l’état de racémique, conduit sur colonne chirale au chromatogramme B.

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1. Calculer la pureté optique ou excès énantiomérique ( ), du composé A en utilisant la relation ci‑dessous où R et S désignent les aires des pics des deux énantiomères. Pour le calcul, on se basera sur les hauteurs des pics. 2. Expliquer, compte tenu de la structure du composé B, la présence de ces 4 pics.

1. Par application directe de la relation rappelée dans l’énoncé, on a:

Le composé A a une pureté optique de 45% (précision de quelques%!) en l’énantio‑ mère . 2. Le métolachlore, herbicide désormais interdit en France, possède 1 carbone asy‑ métrique (repéré par (*) sur la gure2.4). Seul l’isomère est actif sur les plantes. Si on étudie un échantillon de métolachlore racémique avec une colonne chirale, on doit normalement distinguer les isomères et Cependant pour cette molécule, il s’y ajoute un autre type d’isomérie appelée qui provient de l’existence d’une barrière d’origine stérique, qui gêne la rotation autour de la liaison CN reliant le cycle aromatique à l’atome d’azote. Avec une colonne chirale performante et dans de bonnes conditions d’analyse, on arrive à dédoubler chaque énantiomère ce qui, au nal, donne 4 pics sur le chromatogramme: , , , .

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2 Comment séparer efcacement des composés très polaires en CLHP ou CCM?

Trois solutions existent: ( ). On utilise un gel de silice (colonne ou plaque) non transformé, donc très polaire et une PM organique conte‑ nant très peu d’eau. Ce procédé est préféré quand les analytes doivent être étudiés par spectrométrie de masse après séparation; • ( ). On utilise une phase de polarité inversée (apolaire) et on ajoute dans la PM un sel concentré pour diminuer la solubi‑ lité des analytes polaires dans la PM aqueuse. On diminue ensuite progressivement la concentration saline. Méthode utilisée pour les protéines ou oligonucléotides; • Si les composés sont partiellement ionisés, on ajoute à la PM un composé ionique de polarité inverse et porteur d’une chaîne carbonée peu polaire, de façon à créer des paires d’ions pratiquement neutres, qui vont avoir plus d’afnité pour la PS. •

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Le temps mort M , auquel on accède quand on ajoute à l’échantillon un marqueur non retenu par la phase stationnaire, peut être également estimé sans l’aide d’un chromatogramme. Il existe, pour les colonnes actuelles de CLHP de forme cylindrique, une formule empirique qui donne le volume de phase mobile M contenu dans la colonne de longueur et de diamètre C. Connaissant le débit de phase mobile, D, on en déduit / Par ailleurs, en comparant le volume M au volume interne de la colonne , on en déduit que la phase mobile occupe 64% de ce volume interne et la phase stationnaire dont la colonne est complètement remplie, 36% seulement.

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La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une technique dans laquelle l’échantillon doit être porté à l’état de vapeur avant de parcourir la colonne. C’est la raison pour laquelle la CPG se limite aux composés sufsamment volatils et thermi‑ quement stables. Néanmoins, sa grande sensibilité, sa polyvalence et la rapidité de mise au point de nouvelles analyses en font une technique irremplaçable.

Toute installation de CPG présente deux particularités: la phase mobile qui est un gaz (dihydrogène, hélium ou diazote) et la présence d’une enceinte thermostatée an de pouvoir porter la colonne jusqu’à plus de 350°C dans certaines applications. À l’aide d’une microseringue, l’échantillon est introduit sous forme liquide ou gazeuse dans l’injecteur, qui a pour fonction de le porter à l’état de vapeur et de l’amener en tête de la colonne. Celle–ci se présente comme un tube de faible section enroulé sur lui‑ même, de 1 à plus de 100m de longueur et contenant la phase stationnaire. La phase gazeuse traverse enn un détecteur situé en aval de la colonne. En CPG quatre paramètres sont ajustables pour une phase stationnaire donnée: • • • •

, longueur de la colonne; , vitesse linéaire de la phase mobile (qui conditionne ); température de la colonne (facteur de modication important); , rapport de phase ( conditionne ).

Les différents réglages du chromatographe permettent d’agir sur et sur , donc sur et . Sachant qu’il n’existe pratiquement pas d’interaction entre gaz et solutés, la nature du gaz vecteur modie peu les valeurs des coefcients des différents solutés. En revanche, la viscosité et la vitesse du gaz vecteur agissent sur l’efcacité de la colonne, le dihydrogène étant le gaz qui permet les séparations les plus rapides, à performances égales (gure3.1).

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3 Sachant qu’en CPG, les temps de rétention obéissent à la relation , prévoir le temps de rétention d’un composé X à 150°C sachant qu’il est de 4,3min à 180°C et de 7,1min à 160°C. Le temps mort de la séparation est de 1min, et représente la température absolue.

La relation indiquée dans l’énoncé, déduite des lois de la thermodynamique (voir p.9), permet de calculer et par la résolution du système d’équations suivantes:

On trouvera

=2616,6 et

Pour 150°C, soit

=‑ 5,26, en conséquence K,

R

=9,4min.

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La vitesse de la phase mobile dans la colonne, qui dépend de son débit, inuence la qualité de la séparation en cours. Cet effet général, observable quel que soit le type de chromatographie, est traduit en CPG par une relation entre la hauteur d’un plateau théo‑ rique ( ) et la vitesse linéaire moyenne du gaz vecteur. Pour une colonne remplie elle prend le nom d’équation de Van Deemter:

, et sontettrois expérimentaux reliésopératoires. aux paramètres physico‑chimiques des solutés de lacoefcients colonne ainsi qu’aux conditions Le terme est nul pour une colonne capillaire (gure3.1). La courbe représentative de l’équation ci‑dessus est une branche d’hyperbole passant par un minimum ( min ) pour: .

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Proposer une méthode pour accéder, de manière approchée, aux constantes et d’une et trouver l’expression donnant min pour le composé testé.

On effectue plusieurs injections du composé test à des débits élevés. Sachant que la courbe de nature hyperbolique admet pour asymptote la droite , un calcul par régression conduira à une valeur approchée de . De même, mais avec de faibles débits, il sera possible, connaissant , de trouver .

• Injecteurs Il en existe plusieurs types, choisis en fonction des applications ou des colonnes utili‑ sées. Ils permettent des modes d’injection différents. • C’est le modèle le mieux adapté à l’analyse quanti‑ tative pour colonne remplie et colonne capillaire «530µm» (p. 19). • ). Réservé aux colonnes capillaires, il comporte une vanne de fuite qui divise le débit du gaz vecteur en deux fractions, dont seule la plus petite pénètre dans la colonne. Le rapport de division ( ) peut varier entre 20 et 500. Cet injecteur peut également fonctionner en mode . Cependant, pour certains échantillons la composition de la fraction passant dans la colonne peut différer de celle de l’échantillon (phénomène de ).

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3

/ •

. L’échantillon est injecté directement à l’intérieur de la colonne capillaire, sa vaporisation se faisant après dépôt.

• Détecteurs

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Ils reposent sur des principes de détection très variés. On choisit un modèle approprié aux applications envisagées. Certains sont , c’est‑à‑dire sensibles à tous les solutés, alors que d’autres dits ne détectent que des catégories particulières de composés. Les plus performants reposent sur des méthodes spectrales, ou sur la spectrométrie de masse, ce qui permet de disposer, en plus du chromatogramme, d’une empreinte spectrale (voir ches 11, 18 et 20).

• Colonnes Il en existe trois types dont les performances diffèrent: • de 1 à 3m de long, en acier ou en verre et d’un diamètre de 1/8 ou 1/4d’ (3,18 ou 6,35mm). Elles contiennent un support poreux et inerte sur lequel un grand nombre de phases stationnaires peuvent être xées par greffage ou imprégnation. • , généralement en silice fondue (diamètre interne entre 75 et 250µm et longueur de 10 à 100m). La phase stationnaire recouvre la paroi interne sur une épaisseur comprise entre 0,05 et 5µm. Elle est greffée par l’intermédiaire des fonctions silanols présentes sur la paroi de silice. • également en silice, d’un diamètre particulier de 530µm et de 5 à 50m de long. Greffées comme les précédentes, leurs performances restent néanmoins inférieures. Pour comparer ou prévoir le comportement des colonnes capillaires, on détermine le rapport de phase . En posant , diamètre interne de la colonne et f , épais‑ seur du lm déposé, un calcul approché conduit à: 4

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1. Retrouver l’expression précédente pour une colonne capillaire. 2. Montrer, pour un composé donné, que l’on peut déterminer son coefcient de par‑ tage, à partir de son facteur de rétention et de . 3. Montrer, à partir du rapport entre le volume du capillaire et sa surface, qu’on améliore les échanges des analytes entre les 2 phases en diminuant . 4. La valeur de est généralement de plusieurs centaines. Pourquoi?

1. Pour une colonne capillaire de longueur , on a De même, on a , ce qui conduit à

2. À partir des caractéristiques physiques de la colonne ( et f ) on accède à , et sachant que , on a , et par substitution, . 3. La surface de la PS est celle du capillaire . Il en résulte que le rapport 4 diminue proportionnellement au diamètre de la colonne. 4. La valeur est généralement très grande (1000 par exemple), du fait que l’une des 2phases en présence est un gaz. • Phases stationnaires Elles sont considérées comme des liquides immobilisés par le support (ici, est le coefcient de partage). Pour les colonnes remplies, on choisit, pour imprégner le rem‑ plissage, des composés organiques peu volatils. Pour les colonnes capillaires ont été sélectionnés des polymères appartenant à quelques types peu nombreux: les et les , auxquels on peut rattacher des phases particulières pour l’étude des composés optiquement actifs. • Les polysiloxanes (huiles et gommes silicones) correspondent à la répétition d’un motif de base comportant diverses compositions de chaînes alkyle ou aryle (méthyle ou phényle) pouvant comporter en plus des fonctions (ex. cyanopropyle, triuoropro‑ pyle). Grâce à leur gamme de température très étendue, ce sont, pour les colonnes capillaires, les phases les plus utilisées. • Les polyéthylèneglycols (PEG). Les représentants les plus connus de cette famille sont les Carbowax®, polymères polaires (M =1500 à 20000 – pour le Carbowax 20M) • Les phases stationnaires chirales. Conçues pour séparer les isomères optiques (ou énantiomères) entre eux par un procédé direct.

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3 • Les phases stationnaires solides. À base d’adsorbants divers: silice ou alumine, tamis moléculaires, polymères poreux, carbone graphité. On les utilise pour séparer les composés gazeux ou très volatils. , hydrocarbure saturé (C 30H 62), a été sélectionné comme phase station‑ naire de référence ayant par dénition une polarité nulle. Sur cette phase utilisable entre 20 et 120°C, les composés sont élués dans l’ordre de leur température d’ébul‑ lition croissante.

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Le système des sert à caractériser tout composé par une grandeur plus générale que son temps de rétention. • Droite de Kovats. Quand on injecte une série homologue de ‑alcanes sur une colonne maintenue en régime isotherme, le chromatogramme est tel que où R(n) représente le temps de rétention de l’alcane ayant atomes de carbone et M le temps mort ; et sont des coefcients numériques. La pente de la droite obtenue dépend de la colonne et des conditions de réglage du chromatographe. • Calcul de l’indice de rétention de Kovats d’un composé X. Sans changer les condi‑ tions de réglage de l’appareil, on co‑injecte le composé X avec la série des ‑alcanes. Le nouveau chromatogramme obtenu va permettre de calculer X , indice de réten‑ tion de Kovats de X sur la colonne considérée: celui‑ci est égal au produit par 100 du nombre apparent d’atomes de carbone de l’«alcane théorique» ayant le même temps de rétention réduit. Deux méthodes sont utilisées pour trouver le nombre X de carbones équivalents de X : ou bien on part de l’équation de la droite précédente obtenue par étalonnage, ou bien on calcule X à partir des temps de rétention réduits ( ) des deux ‑alcanes (à et +1 C) qui encadrent X sur le chromatogramme:

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À partir du chromatogramme et des indications de la gure3.2: 1. Quel est, dans cette expérience, le temps mort? 2. Évaluer le débit en mL min–1 du gaz vecteur en sortie de colonne. 3. Calculer l’efcacité de cette séparation mesurée sur le pic 7 (la largeur à mi‑hau‑ teur est de 0,056 min). 4. Calculer le rapport de phase de cette colonne. 5. Quel est le coefcient de partage du composé 7? 6. Retrouver l’indice de rétention de Kovats de l’undécanol, en s’aidant des positions des pics du décane et du pentadécane, hydrocarbures linéaires à 10 et 15 atomes de carbone.

1. Connaissant la longueur de la colonne (25 m) et la vitesse linéaire moyenne (31,2cm s–1), on aura min. 2. La section de la colonne est cm2. Le débit correspond au volume de gaz sortant de la colonne en 1 min, on a:

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3

mL min–1. 3. Par application de la relation liant l’efcacité théorique et la largeur à mi‑hauteur du pic correspondant, on aura:

4. Le diamètre interne de la colonne est =0,22mm, soit 220µm, le lm a une épais‑ seur de 0,25µm. On aura: / et connaissant la relation liant , et : 5. Sachant que Facteur de rétention du composé 7: soit . 6. On ne dispose que de deux hydrocarbures saturés (10 et 15 atomes de carbone) de part et d’autre de l’undécanol. L’expression de base doit être adaptée. Ici on aura:

soit:

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À la différence de la droite de Kovats, les indices de rétention ne dépendent que de la phase stationnaire et non des conditions de réglage du chromatographe.

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La chromatographie d’exclusion stérique (CES) permet de séparer les molécules suivant leur volume en solution. Elle convient ainsi à l’étude de mélanges compor‑ tant à la fois des polymères, des macromolécules et des molécules de faible masse. La CES sert également, en choisissant des détecteurs appropriés, à dénir diverses carac‑ téristiques physico‑chimiques des polymères. Elle est rarement employée en analyse quantitative. La CES est quelquefois désignée par quand la phase stationnaire est hydrophile (associée à une phase mobile aqueuse) et par (« ) quand elle est hydrophobe (la phase mobile est alors un solvant organique).

La phase stationnaire comporte des pores dont le diamètre est comparable à celui des espèces à séparer, ce qui a pour effet de retarder plus ou moins la progression dans la colonne des différents analytes, suivant leur (gure4.1) Le volume total M de phase mobile dans la colonne se compose: • du volume interstitiel I (extérieur aux pores). C’est le volume de phase mobile dis‑ ponible pour transporter une grosse molécule supposée exclue des pores; • du volume des pores p dont la totalité est accessible aux petites molécules. La plage de séparation est donc dénie par le volume des pores p .

Les volumes d’élution

e sont

donc compris entre

I

et

M.

En écrivant:

soit

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4 on dénit , coefcient de diffusion. Il représente le degré de pénétration d’une espèce dissoute dans le volume P . Sa valeur est comprise entre 0 et 1 (0 2500. 2. S’aider des intensités des pics isotopiques.

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La spectrométrie de masse a de nombreuses applications en analyse quantitative. • Un spectromètre de masse placé en aval de la colonne d’une installation de chromatographie constitue non seulement un détecteur permettant d’obtenir le chromatogramme mais il permet d’identier de manière absolue les analytes. Cette méthode couplée CPG (ou CLHP)/SM est devenue indispensable dans plusieurs domaines d’analyses de traces (contrôle anti‑dopage, police scientique, substances illicites, surveillance alimentaire). • Un spectromètre de masse peut être également utilisé seul, en analyse quantitative, par introduction directe de l’échantillon.

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On utilise la méthode CPG/SM pour doser la caféine d’une boisson. Sachant que l’extraction préalable de la caféine ne peut être quantitative, on ajoute avant extraction une quantité connue de «caféine‑d3», caféine dont les 3 atomes d’hydrogène d’un groupement méthyle sont remplacés par 3 deutérium (g.20.1). La sensibilité de la détection pouvant être différente pour ces deux isotopomères, on prépare une solution de standardisation an de déterminer le coefcient de réponse relatif de la caféine‑d3 par rapport à la caféine normale (voir che chromato‑ graphie quantitative). Deux solutions mères A et B sont préparées: A: on dissout 51,1mg de caféine dans 50mL de méthanol. B: on dissout 27,8mg de caféine‑d3 dans 25mL de méthanol.  S : on prépare 200µL de cette solution en mélangeant 100µL de solution A et 100µL de solution B. On injecte 1µL de cette solution dans le chromatographe et on repère le pic d’élu‑ tion de la caféine (les deux caféines, marquée et non marquée ont le même temps de rétention). On compare ensuite les aires des deux pseudo‑chromatogrammes obtenus l’un à partir de l’intensité du pic moléculaire de la caféine et l’autre à partir de celui de la caféine‑d3. On obtient respectivement 420625 et 366100 (unités arbitraires).

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2 0 – S p e c t ro mé tr i e d e ma s s e –

P a r t ie 3

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1. Quelles sont les masses nominales de la caféine et de la caféine‑d3? 2. Calculer les concentrations en caféine et caféine‑d3des solutions A, B en g L–1, puis la concentration de la solution S exprimée en µg mL–1. 3. Calculer le coefcient de réponse relatif d3/caf de la caféine‑d3 par rapport à la caféine. On prélève 1mL de boisson à doser dans laquelle on ajoute 50µL de la solution B. Après mélange, on extrait les deux caféines sur une cartouche en phase solide (SPME). On récupère dans un peu de méthanol une partie du mélange de caféines que l’on injecte en CPG. Le même processus que celui décrit pour le calcul du coefcient de réponse conduit aux intensités suivantes: caféine 248112, caféine‑d3, 115360. 4. En déduire la quantité de caféine dans la bouteille de coca‑cola (330mL).

1. Caféine: C8 H10N4 O2 soit 194u; Caféine‑d3: C8H 7D3 N4O 2 soit 197u. mg L–1 ou 1,022g L–1. 2. A : conc. en caféine: mg L–1 ou 1,112g L–1. B : conc. en caféine‑d3: S : dans les 0,2mL, il y a 102,2µg de caféine et 111,2µg de caféine‑d3. Il y µg mL–1 de caféine et µg mL–1 de caféine‑d3. a donc 3. Calcul du coefcient 3/ (voir che chromatographie quantitative).

4. Dans 50µL de B, il y a 50/10 6 1,112 = 55,6 10–6g soit 55,6µg de caféine‑d3. La relation donnant accès au coefcient de réponse relatif va servir cette fois pour cal‑ culer la masse de caféine présente dans la prise d’essai de 1mL:

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20

Pour une bouteille (soit 330mL) la quantité de caféine est donc égale à: mg.

Les rapports (ou ratios) isotopiques des composés du règne vivant peuvent varier de quelques millièmes suivant leur origine géographique. De nombreux dosages reposent sur cette observation. Les mesures de ces «signatures isotopiques» sont effectuées avec l’aide de spectro‑ mètres de masses spécialisés (SMRI).

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On désigne par la différence relative des référence, évaluée en millièmes (le

entre l’échantillon et la ). Exemple:

Le ratio isotopique 18 O/16 O de référence est celui de l’eau des océans. Sa valeur est la même que celle que l’on peut calculer à partir des données du tableau18.1. Pour calculer le ratio isotopique 13C/ 12C de l’élément carbone, on provoque la combustion de l’échantillon et on calcule le rapport des intensités des pics 13C16 O ( =45) et 12 C16O 2 ( =44) que l’on compare, après correc‑ 2 tions, à celui d’un carbonate de calcium, désigné par PDB, dont la valeur 13C/ 12C =1,12372×10 –2 est très grande.

Calculer le à 2,045 10–3 ?

de l’isotope 18 O d’un composé pour lequel le ratio 18O/16O est égal

En prenant pour références les abondances des isotopes de l’oxygène données dans le tableau18.1, soit un rapport de 0,203/99,759 =2,035 10–3, on aura:



20–Spectrométrie de mas s e – P artie 3

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Quand on est en présence d’un mélange de deux espèces A et B dont les valeurs de sont respectivement A et B, la valeur résultante M pour tout mélange de A et de B découle de la combinaison pondérée de A et de B. Inversement, connaissant A , B et M , on peut retrouver les pour‑ centages de A et B. Si désigne la fraction de B et (1– ) la fraction de A: soit

Pour mesurer le de l’élément carbone d’un échantillon de sirop d’érable authentique ( ), on utilise un appareil de SMRI disposant d’une double ligne d’introduction permettant de comparer les ratios isotopiques du CO2 de l’échantillon et d’un CO2 servant d’étalon de travail et dont la déviation isotopique déterminée par rapport au PDB (standard international désormais épuisé) est . Le résultat après traitement des données par l’appareil est Sachant que dans ces conditions, le d’un échantillon est calculé par applica‑ tion de la formule: 1. Montrer le bien‑fondé de cette formule. 2. Calculer pour le sirop d’érable authentique. 3. Un second échantillon de sirop d’érable, de provenance incertaine, conduit à un facteur , En supposant qu’il ait été supplémenté soit avec un sirop de maïs, pour lequel = , soit avec un sirop de betterave pour lequel = , quel est le sucre apporté par les fraudeurs et quel en est le pourcentage ajouté? 4. Cette conclusion peut‑elle être mise en défaut?

1. Posons: ratio 13 C/12C échantillon = ; ratio PDB = .

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13 C/12C

référence = et ratio 13C/ 12C

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20

On doit vérier que les deux membres de l’expression suivante sont identiques:

le second membre peut s’écrire:

c’est‑à‑dire: 2

2

Le second membre est donc bien équivalent au premier. Ainsi l’abondance naturelle de l’échantillon est accessible à partir de son abondance relative, calculée à partir d’une référence de travail si l’on connaît l’abondance naturelle (par rapport au PBD) de celle‑ci. 2. A. Num.

= –18,1 – 5,0 + (18,1 5,0) /1000 =

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3. La valeur indiquée pour ce second sirop d’érable montre bien une valeur anormale, plus élevée que celle du sirop authentique (en accord avec un métabolisme en C‑3, comme le sucre de betterave par exemple). Il y a donc eu ajout de sucre de maïs (méta‑ bolisme C‑4). Par application de la relation se rapportant au calcul de la composition des mélanges binaires, on peut conclure que vraisemblablement il s’agit d’un mélange contenant 60% de sirop d’érable et 40% de sirop de maïs.

4. Il ne s’agit que d’une hypothèse, les fraudeurs ayant pu ajouter un mélange des deux sucres, de maïs et de betterave, dont les ratios isotopiques se compensent. Pour établir les abondances naturelles précises basées sur le car‑ bone, les appareils SMRI sont munis d’un triple détecteur pour connaître les intensités ioniques à =44, 45 et 46. Il est en effet nécessaire de tenir compte de l’isotope 17 de l’oxygène qui contribue à l’intensité du pic =45 pour établir une valeur plus exacte du ratio 13C/12C. Le problème, plus complexe qu’il n’apparaît, a donné lieu à plusieurs algorithmes de cor‑ rection ( ou ) choisis en fonction du travail envisagé. Les corrections doivent être d’autant meilleures que la précision des appareils augmente.

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20–Spectrométrie de mas s e – P artie 3

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1. Écrire les différentes compostions isotopiques possibles du dioxyde de carbone et calculer les probabilités des pics =44 et 45 en adoptant les valeurs du tableau16.1. 2. En quoi est‑ce utile de connaître l’intensité ionique à =46? 3. Proposer une méthode approchée de correction de l’intensité ionique de m/z=45).

1. Pour =44 on est en présence de 12C16O2 13C 16O 12 C17 O16 O pour =45 2 13 C17 O16 O et pour =46 12C18O16O

12C17O

2

Parmi ces possibilités, les isotopomères et ont des probabilités négligeables. On admet donc que le pic 46 est dû au seul isotopomère Probabilité de la forme : 0,9889 0,99762 = 0,9842 Probabilité de la forme : 0,0111 0,99762 = 0,0110 Probabilité de la forme : 0,9889 0,9976 0,00037 2=0,00074 2. En calculant /( + ) on voit que la forme ( ) contribue pour 6,3% à =45. Le pic =46 permet, par comparaison avec le pic 44, de connaître le ratio 18O/16O expérimental (l’oxygène utilisé pour l’analyse). 3. Il faut donc retrancher de l’intensité totale du pic 45, la contribution de la combinai‑ son due à l’oxygène 17, que l’on peut évaluer en première approximation à partir du ratio 18O/ 16O auquel on accède par comparaison des pics =46 et 44.

Pour doser, avec une installation ICP/SM, le gallium (Ga) dans les efuents d’une usine de semi‑conducteurs, on a choisi une méthode d’ajout, basée sur la dilution isotopique. Le dosage repose sur la mesure des intensités des signaux des 2 isotopes stables de cet élément 69Ga (68,9257 u) et 71 Ga (70,9249 u). Le rapport des ions 69/71 de l’eau à doser est de 1,5125. On prépare par ailleurs une solution d’ajout A comme suit: on prépare 100mL d’une solution contenant 100mg de gallium enrichi en 71Ga. On prélève 10mL de cette solution que l’on complète à 100mL avec de l’eau. Le rapport des ions 69/71 de cette solution A est de 0,4782. On ajoute à 100mL de l’eau à doser 200µL de solution A. Après mélange le rapport des 2 ions 69/71 est de 1,2304. Calculer la concentration (ppm) du gallium dans l’eau analysée.

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20 L’appareil donne le rapport des abondances ioniques, donc du nombre d’ions, et non pas les abondances en masse. Pour les atteindre, il faut tenir compte des masses atomiques respectives des 2 ions. Les rapports corrigéssont: Eau à doser: ( la valeur standard est de 1,4643 en masse) Solution d’ajout: Mélange nal: Soit la quantité (en g) de gallium contenue dans les 100mL de prise d’essai, répartie en (g) de l’isotope 69Ga et (g) de l’isotope 71Ga. On a: et Quantité de gallium présente dans les 200µL ajoutés : la solution initiale étant à 1000mg L–1, la solution A est donc à 100mg L–1 et 200µL contiennent 20µg de gallium. Répartition des 2 isotopes: soit la quantité de69Ga et celle de71Ga. En posant et on obtient =6,345µg et =13,655µg. Enn pour le mélange nal on écrira: et sachant

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que , on obtient =53,493µg et =36,392µg, soit 89,88µg au total. L’eau à doser contient donc 898,8µg L–1, soit environ 0,9ppm (en m vol–1).

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20–Spectrométrie de mas s e – P artie 3

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Pour doser un analyte présent dans un échantillon, on ajoute à la prise d’essai une quantité connue de son homologue sous forme marquée, c’est à dire porteur d’une sorte d’étiquette. Celle‑ci a pour but de pouvoir le distinguer de l’analyte réellement présent dans l’échantillon de départ. On récupère ensuite une fraction de ce mélange dont la composition permet de calculer la quantité d’analyte initialement présente. À partir de ce principe plusieurs méthodes ont été développées dont font partie les analyses isotopiques décrites ci‑après.

• Pour doser un élément chimique, on ajoute comme traceur un de ses isotopes radioactifs (dilution isotopique directe). • Pour une molécule le principe reste le même. On ajoute son homologue marqué c’est‑à‑dire la même espèce moléculaire, dont l’un des atomes a été remplacé par un de ses isotopes radioactifs. À une masse précise d’échantillon contenant l’analyte X à doser, on ajoute une masse * de X sous forme marquée. Soit l’activité spécique de ce standard (activité en Bq par unité de masse) et l’activité spécique après dilution. est inférieure à puisque la quantité de standard mise en œuvre se retrouve mélangée avec la quantité du composé non marqué. En revanche l’activité globale est conservée: ce qui conduit à:

Si

est beaucoup plus petit que

1

on peut écrire:

À partir de ainsi obtenu, et de la masse d’échantillon utilisé, on peut accéder à la concentration de X dans l’échantillon. La méthode précédente prend le nom de dilution isotopique inverse lorsque l’analyte est le composé marqué et que la dilution se fait avec un composé non marqué.

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21

Quand l’analyte est en très faible quantité, donc impossible à récupérer sous sa forme initiale par un procédé traditionnel, la méthode décrite précédemment doit être adaptée. Pour cela, on prépare un dérivé insoluble du composé à doser après dilution isotopique an d’en récupérer une petite partie. On fait de même sur le standard marqué seul (blanc analytique), pour obtenir le même dérivé. Cette méthode, dite sous‑ (ou sub‑)stœchio‑ métrique, prégure une autre méthode, dite immunochimique, pour le dosage de traces.

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Pour isoler une fraction du mélange des formes marquée et non marquée, on ajoute un anticorps spécique du composé à doser an qu’il se xe indistinctement sur ces deux formes, ce qui va permettre de les récupérer dans le même rapport molaire qu’en solution. On sépare ensuite le mélange complexé par précipitation avant de procéder à la mesure de son activité, l’anticorps ayant été ajouté en quantité sous‑stœchiométrique. La radio‑immunologie a reçu peu d’appli‑ cations pour le dosage des molécules de faibles masses moléculaires. En revanche, la méthode est couramment appliquée aux petites molécules marquées avec une enzyme, notamment pour des d’applications dans le domaine environnemental.

An de doser le fer dans une solution aqueuse on utilise la méthode de dilution et ,  = 44,5 jours). La concentration de la isotopique par le 59Fe, (émetteur solution aqueuse de chlorure ferrique (FeCl3) servant de traceur est 0,1M en fer (M=56g mol–1), dont une inme proportion est constituée de 59Fe. Dans un tube à centrifuger A, on introduit 3mL d’eau et 1mL de la solution de traceur. Dans un second tube B on introduit 3mL d’eau, 1mL de la solution à doser et 0,5mL de la solution servant de traceur. On ajoute ensuite dans les deux tubes une solution d’ammoniaque (NH 4 OH)6N an de précipiter le fer sous forme d’hy‑ droxyde ferrique. On récupère une fraction de chacun des 2 précipités. Après avoir été lavées et séchées, on mesure l’activité de l’hydroxyde ferrique (valeurs moyennes sur plu‑ sieurs mesures) de ces deux fractions. Provenant de A :460 dps, pour 25mg et provenant de B: 86dps pour 35 mg. Calculer la concentration en fer de la solution analysée.

Activité spécique (pour 1g) de l’hydroxyde issu de la solution d’ajout (A): dps.



2 1 – M ét h o d e s p a r ma r q u ag e r a d i o ac t i f

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Activité spécique de l’hydroxyde issu de la solution B:

Cette activité provient de 0,5mL de la solution d’ajout. La solution mère étant à 5,6 g L–1, la quantité de fer est de 2,8mg. Par application de la relation vue précédemment, 1 soit

mg mL–1 de solution ou

18,2g L–1. Plusieurs dosages d’ions (ex. SO 42‑) ou d’éléments sont pos‑ sibles avec cette méthode, à condition de disposer des radio‑isotopes correspondants (35S, 32P, 131 I..), cependant l’inconvénient majeur reste l’uti‑ lisation des radioéléments: il en résulte qu’en analyse chimique ils sont pratiquement abandonnés.

Cette méthode permet l’analyse d’une soixantaine d’éléments. Elle impose de les trans‑ former en radio‑isotopes par irradiation au moyen de neutrons lents. Cette (NAA) est caractérisée par: • une très grande sensibilité; • une réponse indépendante de la forme chimique de l’élément. On fait appel aux ux intenses de neutrons disponibles dans les réacteurs nucléaires ou bien on utilise des sources de neutrons constituées de quelques µg de 241Am ou de 124Sb, émetteurs , encapsulés dans une enveloppe de béryllium:

La capture d’un ou plusieurs neutrons transforme le noyau cible en isotopes de masses supérieures (l’élément reste le même dans un premier temps), dont certains sont ins‑ tables et vont se décomposer par radioactivité de type – .

La radioactivité totale, qui provient des analytes et de tous les autres éléments pré‑ sents dans la matrice de l’échantillon, conduit à un spectre d’émission complexe. La radioactivité de l’échantillon correspond à la somme des activités individuelles des radioisotopes dont chacune décroît de manière exponentielle.

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Le spectre , étant continu en énergie, ne permet pas de reconnaître la nature des éléments par son simple examen. Tout dosage par NAA repose donc sur l’émission qui accompagne la radioactivité de tout nucléide et dont l’énergie est caractéristique de chaque radionucléide formé. On choisit une raie spécique sur laquelle on fait une opération de comptage.

Le nombre d’atomes radioactifs * qui s’accumulent dans l’échantillon au cours de l’ir‑ radiation tend vers une limite, quand s’équilibrent la vitesse de formation des noyaux * (considérée comme constante, le nombre de noyaux cible étant très grand) et celle de leur décomposition fonction de leur constante de décroissance radioactive. Le calcul de l’activité induite conduit à l’expression:

représente le ux de neutrons, la constante de décroissance radioactive du radioiso‑ tope formé, la section efcace de chaque atome cible dont le nombre est .

Dans l’expression ci‑dessus, le terme entre crochets est appelé facteur de saturation. Montrer que pour =6 , on atteint pratiquement la limite d’activation.

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Sachant que

, l’activité induite devient pour =6 :

Le facteur de saturation est alors: L’activité atteint plus de 98% de la valeur limite. Pratiquement on ne dépasse jamais un temps de 4 ou 5 périodes du radioélément apparu. On préfère réserver cette méthode aux radioéléments de courtes périodes.

L’inhomogénéité du ux de neutrons et ses uctuations au cours du temps sont à l’origine de la principale cause d’erreur. La quantication se fait donc par comparai‑ son entre les activités mesurées de l’échantillon et d’un externe qui contient un élément de référence servant de comparaison, ou bien d’un élément présent dans l’échantillon et servant de référence interne.



2 1 – M ét h o d e s p a r ma r q u ag e r a d i o ac t i f

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L’activité totale étant proportionnelle à la masse de l’élément X, on écrira: . . La relation précédente n’est valable que si le rayonnement induit est simple, ou si l’on dispose d’un appareil de comptage permettant d’isoler le rayonnement dû à l’analyte recherché. Pour cette raison, il faut respecter un délai entre la n de l’irradiation et le comptage an d’éliminer toutes les interférences dues à des émetteurs de courte durée de vie.

Le zirconium métal (Zr) contient des quantités variables d’hafnium (Hf) que l’on se propose de doser par NAA. Les échantillons sont irradiés dans un réacteur pro‑ duisant un ux de neutrons thermiques de 5 1017 n m–2 –1 s . Parmi les différentes réactions d’activation qui apparaissent, par suite des nombreux isotopes de ces 2 élé‑ ments, on choisit les réactions ainsi symbolisées: 94Zr( , 95 ) Zr (724keV, émetteur , =64jours) et180 Hf( , )181Hf (482 keV, émetteur , =42,4jours). Rappel de quelques éléments: 40 Zr, 41Nb, 72 Hf, 73 Ta, 74W. 1. Écrire ces réactions sous forme explicite. 2. Montrer que le tantale par réaction ( ) et le tungstène par réaction ( ) peuvent conduire à surestimer la concentration en hafnium de l’échantillon. 3. Dans le protocole de dosage, l’échantillon de zirconium est mis en solution par digestion acide (H2 SO 4), puis placé dans un acon en polyéthylène (C n H2n+2) pour l’étape d’irradiation. Les éléments H, C, O, S, sont donc aussi irradiés. Peut‑il y avoir un risque de confusion des spectres  de tous ces éléments? 4. Indiquer une autre méthode utilisable pour doser l’hafnium dans ce type d’échantillon. 5. On prépare 50mL d’une solution à 25mg L–1 de zirconium à doser. On sépare cette solution en deux parties égales A et B. On ajoute dans la solution B, 100µL d’une solution à 25mg L–1 de Hafnium. On irradie successivement les 2 solutions durant 10min et on mesure l’activité résiduelle après 3 jours. A: raie 724keV: 41000 kBq; raie 482keV: 167kBq. B: raie 724keV: 40000 kBq; raie 482keV: 335kBq. Calculer le pourcentage d’hafnium dans l’échantillon de zirconium.@

1. Les neutrons peuvent conduire à plusieurs réactions sur les éléments présents dans l’échantillon. L’énoncé permet de les préciser:

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Te c h n i q u e s i n s t r u m e n t a l e s d ’ a n a l y s e c h i m i q u e e n 2 3 f i c h e s

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. La raie pagne la radioactivité : pagne la radioactivité

à 724keV accom‑

(période de 64j.) qui transforme le 95 Zr en niobium (41Nb). . La raie

à 482keV accom‑

(période 42,4j.) qui transforme le 181 Hf en tantale (73 Ta).

2. Le tantale est formé presque exclusivement de l’isotope 181Ta. Par réaction ( ), qui correspond à l’expulsion d’un proton après l’impact du neutron, on a: ; il apparaît donc l’isotope sur lequel le dosage est fondé. De même, le principal isotope du tungstène (184W) conduit lui aussi par une réaction de type ( ), à ce même 181Hf: . Dans

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la pratique, ces réactions sont négligeables car elles exigent des neutrons rapides. 3. Les éléments légers donnent peu de raies . De plus, elles ont des énergies beaucoup plus faibles que les deux raies sélectionnées ici. 4. Le dosage serait possible par ICP‑SM. L’hafnium existe sous la forme de plusieurs isotopes stables (entre 176 et 180 nucléons) dont 178 Hf et 179Hf pour lesquels il n’y a pas d’interférences avec d’autres éléments, à la différence du176 Hf (avec Lu) et 180Hf (avec W ou Ta). Un appareil avec une résolution sufsante pourrait également différentier les isotopes. 5. A: contient µg d’échantillon (Zr + µg de Hf). B: la quantité d’hafnium ajoutée est de µg. Les solutions A et B contiennent la même quantité de zirconium. On peut se servir de l’intensité de la raie 724keV pour normaliser la valeur de la raie 482keV due à l’hafnium. On établit la droite d’ajout qui passe par les deux points (0; 167/41 000) et (2,5; 335/40000). Cette droite a pour équation: ce qui donne pour =0, =2,37µg d’hafnium dans la solution B, laquelle contient 625µg d’échantillon soit % d’hafnium. Le lecteur trouvera d’autres informations sur le site http:// www.wise‑uranium.org/rnac.html



2 1 – M ét h o d e s p a r ma r q u ag e r a d i o ac t i f

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L’électrochimie a donné naissance à de nombreuses applications dans le domaine de l’analyse. On distingue deux groupes de méthodes les unes dites basées sur des mesures de courants et les autres dites basées sur des mesures de différence de potentiel, ne s’accompagnant d’aucune circulation de courant, donc d’électrolyse. Parmi les applications de ce second groupe de méthodes, gure l’usage d’électrodes à membranes sélectives pour doser des espèces chimiques particu‑ lières, dont cette che illustre quelques exemples.

Plusieurs méthodes potentiométriques comprennent dans leur circuit de mesure une électrode ionique sélective (EIS) dont le potentiel dépend de l’ de l’espèce pour laquelle elle a été conçue, et dans le cas favorable à sa L’aspect quanti‑ tatif est résumé par la formule de Nernst:

dans laquelle est le potentiel de l’électrode, la concentration de l’analyte, 0 son potentiel pour =0 et le facteur de pente de l’électrode (il dépend de la valence de l’ion spécique). La cellule de mesure est complétée avec une électrode de référence, chaque électrode constituant une demi‑pile. Deux manières co‑existent pour effectuer ces dosages: • dosage direct. On trace la courbe d’étalonnage en mesurant la réponse de l’ d’une série de solutions contenant des concentrations connues de l’analyte et une quantité identique du tampon de force ionique recommandé. Cette courbe sert ensuite à déterminer la concentration de l’analyte dans la solution échantillon; • dosage par ajouts dosés. Après avoir mesuré le potentiel de l’ de la solution échantillon, on ajoute un volume connu d’une solution de concentration connue en analyte à doser et on mesure à nouveau le potentiel: par calcul, en utilisant la rela‑ tion de Nernst, on accède à la concentration de l’analyte dans l’échantillon. Cette

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seconde méthode est préférable dans le cas de matrices complexes ou pour des ana‑ lyses occasionnelles. Calcul de la valeur du facteur de pente pour l’ion chlorure à 25°C. sachant que =96487 C mol–1 et =8,314 J–1 mol–1. On a

avec ici

=–1 et

=298K.

V ou –59,1 mV.

Les résultats sont précis à condition que le rapport concen‑ tration/activité reste constant tout au long du dosage. On opère donc en présence d’un tampon particulier appelé TISAB ( ) pour éviter les uctuations de la force ionique. En outre, les mesures doivent être effectuées à la suite les unes des autres et à la même température (dérive possible de 0). La seconde méthode dont les mesures concernent une plage plus étroite de concentrations est considérée comme plus able.

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Pour doser le calcium dans un lait de soja supplémenté en cet élément, une ana‑ lyse contrôle‑qualité fait appel à la méthode d’ionométrie directe, avec une électrode ionique sélective à l’ion calcium. On commence par préparer, à partir d’une solution étalon 0,1 M en calcium (Ca=40,078g mol–1 que l’on arrondira ici à 40g mol–1), deux solutions standard A et B respectivement à 0,40 et 0,04g L–1 en ion Ca2+ . Quant au lait de soja, il est dilué 10fois avec de l’eau avant la mesure. 1. Combien de mL de solution étalon doit‑on utiliser pour préparer 100mL de cha‑ cune des solutions A et B? Ces 2 solutions doivent également contenir 2mL de tampon TISAB (tampon ionique et contrôle du pH). 2. Pour ces 3 solutions, le millivoltmètre utilisé indique les valeurs suivantes: A: –28,2mV; B: –56,0mV; échantillon: –42,6mV. Calculer la concentration en g L–1 du lait de soja initial.

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22–Dos ages potentiométriques

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1. La solution étalon est à 4g L–1 en Ca 2+. A: prélever 10mL de solution étalon, ajouter 2mL de TISAB et compléter à 100mL avec de l’eau. B: prélever 10mL de solution A, ajouter 1,8mL de TISAB et compléter à 100mL avec de l’eau. : prélever 10mL du lait de soja et ajouter 2mL de TISAB avant de compléter à 100mL avec de l’eau. 2. On considère dans ce type de dosage que la réponse du millivoltmètre suit la formule de Nernst (la courbe d’étalonnage est une droite pour une plage en concentrations de 5ou 6 décades). La gure donne la manière de calculer la concentration:

soit

Par suite soit

g L–1 après dilution et 1,20g L–1 dans le lait de soja enrichi.

Les ionomètres modernes dispensent de ces calculs. L’addition des standards est même quelquefois automatisée. Il suft d’entrer les don‑ nées et l’appareil calcule de lui‑même la concentration de l’analyte.

Pour doser le cuivre présent dans une eau (1< x